專利名稱：可用于檢測與冠心病相關(guān)的pla2g7基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助診斷冠心病的檢測試劑盒，尤其是涉及ー種可用于檢測與冠心病相關(guān)的基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應用。
背景技術(shù)：
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease, CHD)簡稱冠心病，是心血管疾病的重要組成部分。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)報道，CHD是世界上致死和致殘的主要原因之一，在2008年，約有1730萬人死于CHD，在2030年之前，據(jù)估計將有2360萬人將死于CHD。CHD癥狀表現(xiàn)為胸腔中央發(fā)生ー種壓榨性的疼痛，并可遷延至頸、頜、手臂、后背及胃部。發(fā)作的其他癥狀可能有眩暈、氣促、出汗、寒顫、惡心及昏厥。嚴重患者可能因為心カ衰竭而死亡。CHD是ー種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而引起的復雜性疾病，尋找其相關(guān)基因進而闡明冠心病發(fā)病的遺傳機制已經(jīng)成為目前研究的熱點。雖然有越來越多的醫(yī)學研究機構(gòu)重視并開展冠心病的相關(guān)研究，但研究多集中于相關(guān)候選基因的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)與冠心病的關(guān)聯(lián)性上，其發(fā)病機理仍未被完全闡釋清楚，這無疑妨礙了冠心病病理機制的理解和預防治療水平的提聞。基因PLA2G7的功能是編碼脂蛋白磷脂酶A2 (Lp-PLA2), Lp-PLA2能夠催化產(chǎn)生各種致炎因子，水解氧化磷脂以形成溶血磷脂膽堿，還能氧化脂肪酸。已有文獻報道Lp-PLA2的高活性以及量的増加能提高冠心病的風險。目前國內(nèi)外已有不少研究報道了基因單核苷酸多態(tài)性與CHD發(fā)病的關(guān)系。但是，目前國內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于冠心病相關(guān)的基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒的相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供ー種可用于檢測與冠心病相關(guān)的基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應用，其中基因甲基化水平與冠心病的患病率在男性中呈負相關(guān)，在女性中呈正相關(guān)，并且檢測效率高，針對性強。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為ー種可用于檢測與冠心病相關(guān)的PLA2G7基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒，其特征在于ー對PLA2G7基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物及其甲基化特異性測序引物，其中所述的甲基化特異性擴增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示
5’ -GTTTTGGGGAGGGTGTTG-3’ ；
所述的甲基化特異性擴增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示
5’ -Biotin-ACCAACCCCTATCCCCCTAACTA-3’ ；
所述的甲基化特異性測序引物如SEQ ID NO. 3所示
5’ -AGTAITAITAGGGGAGGA-3’。
ー種可用于檢測與冠心病相關(guān)的基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒的應用，其特征在干在外周血檢測中，該試劑盒可用于冠心病輔助檢測、診斷或藥物治療中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明首次公開了可用于檢測與冠心病相關(guān)的基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應用，在男性中，啟動子區(qū)域的低甲基化水平導致基因的高表達，從而影響脂蛋白磷脂酶A2的轉(zhuǎn)錄與翻譯，最后導致冠心病的發(fā)生和發(fā)展；而在女性中，啟動子區(qū)域的高甲基化水平將導致冠心病的發(fā)展和發(fā)生。而且基因啟動子區(qū)域甲基化水平可通過外周血檢測得到，因此測定外周血中基因
啟動子區(qū)域的甲基化水平，為檢測冠心病的進展以及人群篩查和藥物開發(fā)提供了新視野。綜上所述，以基因啟動子區(qū)域甲基化水平為基礎(chǔ)的診斷試劑盒可以方便 快捷地在分子水平上實現(xiàn)對冠心病的檢測，同時，以基因啟動子區(qū)域DNA甲基化為靶點的藥物有望成為冠心病輔助診斷、檢測和篩選的ー種新手段。


圖1為被檢測序列所在區(qū)域(具體位置為Chr6:46703038-46703274)，以及所檢測的4個CpG點之間的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果(因為4個CpG島之間相關(guān)系數(shù)r均大于0. 8，存在顯著相關(guān)，所以取平均值代表整體甲基化水平);
圖2為甲基化水平檢測結(jié)果示例(如圖示CpGl到CpG4的甲基化程度分別為6%，12%，8%，7%);圖中陰影部分顯示的是對應CpG位點的信號強度，結(jié)合該位點附近堿基種類可分析得到其甲基化水平(即陰影框?qū)纳戏綌?shù)字)。圖3為年齡與甲基化程度的相關(guān)性研究(男性樣本相關(guān)系數(shù)r為-0. 365，女性樣本相關(guān)系數(shù)r為0. 373)。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進ー步詳細描述。
具體實施例1、研究對象的收集
募集愿意參加研究的志愿者，根據(jù)冠心病的國際診斷標準，將志愿者分為病例組和對照組，并采用調(diào)查表的形式調(diào)查志愿者的一般情況，同時采取靜脈血，進行一般血生化檢測，具體如下
從某醫(yī)院收集冠心病患者，排除心源性休克、重度心カ衰竭、嚴重室性心律失常、伴有其他嚴重疾病如惡性腫瘤、嚴重肝腎疾病等，將冠脈造影結(jié)果嚴重于ー支主要動脈狹窄^ 50%歸為病例組，將相對應的冠脈造影結(jié)果輕于ー支主要動脈狹窄〈50%歸為對照組。最后確定冠心病病人36例(18男；18女)，同時收集性別匹配、年齡相仿的36名正常者作為對照((18男；18女)。對所有研究對象空腹抽血檢測血脂、血糖等一般生化指標，同時抽取靜脈血3ml入EDTA抗凝管中，_80°C低溫儲存，以備用于標本統(tǒng)ー提取基因組DNA。2、基因組DNA的提取
應用全自動核酸提取儀(中國廈門，致善/zeesan，Lab-Aid 820)提取樣本的全血基因組DNA,再通過超核酸紫外測定儀(Wilmington, USA, Thermo scitif ic, NanoDrop 1000)檢測所得DNA的濃度，以供基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平的檢測。3、DNA甲基化水平測定
本研究采用重亞硫酸鹽焦磷酸測序技術(shù)對基因啟動子區(qū)的4個CpG位點(如圖1)進行了 DNA甲基化水平檢測。此技術(shù)的基本原理用重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應用聚合酶鏈反應(PCR)擴增，可使發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)堿基保持不變，而使未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變成了尿嘧啶(U)，然后通過測序引物進行PCR測序，從而得到哪個位點發(fā)生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design軟件進行引物設(shè)計,用于實驗的PCR擴增引物和測序引物如下
(1)甲基化特異性上游引物(Forwardprimer) 5’ -GTTTTGGGGAGGGTGTTG-3’ (SEQ ID NO.1),
(2)甲基化特異性上游引物(Reverseprimer):5’ -Biotin-ACCAACCCCTATCCCCCTAACTA-3，(SEQ ID NO. 2)，
(3)甲基化特異性測序引物(Sequencingprimer)
5’ -AGTATTATTAGGGGAGGA-3’ (SEQ ID NO. 3)。具體實驗步驟如下
A.采用 QIAGEN EpiTect 亞硫酸氫鹽處理試劑盒(EpiTech Bisulfite Kits;Qiagen; #59104)對樣本DNA進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。B.取步驟A中轉(zhuǎn)化過的DNA樣本20ng加入到Pyromark PCR試劑盒(PyromarkPCR Kit; Qiagen; #978703)，并加入上述ー對a -內(nèi)收蛋白基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物，進行PCR擴增，擴增條件首先95°C 15min的變性；接著95°C 15s, Tm 30s, 72 °C20s，共50個循環(huán)的退火反應；然后延伸反應72°C 5min。(注Tm在實驗中根據(jù)跑PCR梯度溫度確定)
C.焦磷酸測序的前期準備在PSQ96板中預先加入45iU含有0. 3iiM上述甲基化特異性測序引物的退火緩沖液(PyroMark Annealing Buffer;產(chǎn)品貨號Qiagen; #979009)；將需要使用的混勻的瓊脂糖珠總量(每樣本3iU)轉(zhuǎn)移到ー個Eppendorf 管中；在瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩沖液(PyroMark Binding Buffer;產(chǎn)品貨號Qiagen; #979006),使得平均每個樣品約有50 u I的體積，將混合物混勻；將以上混合物加入PCR產(chǎn)物(50 u I反應體積)中，每樣本50 Ul ;將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合；在真空預備工作站中，四個樣品板中依次加入180ml的高純水、70%こ醇、洗滌緩沖液(PyroMark WashBuffer;產(chǎn)品貨號Qiagen; #979008)和 120ml 的變性緩沖液(PyroMark DenaturationSolution; Qiagen;產(chǎn)品貨號#979007);打開真空預備工作站的泵，將真空準備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準備工具(PyroMark Vacuum Prep Filter Probes;產(chǎn)品貨號Qiagen; #979010)移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠(在磁珠與PCR產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此操作);拿起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準備工具上；將真空準備工具放入70%こ醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5 —10秒；關(guān)掉栗；將真空準備工具放入含有測序引物的板中，搖動，釋放瓊脂糖珠(測序引物也可最后加入)；使用高純水清洗真空準備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫，即可進行焦磷酸測序反應；D.焦磷酸測序在PyroMark Q24焦磷酸測序儀上,采用Pyromark Gold Q24試劑盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)對步驟 C 中的 PSQ96 板中的樣本進行測序，然后應用PyroMark CpG軟件對結(jié)果進行甲基化分析(甲基化水平檢測結(jié)果示例見圖2)。4、數(shù)據(jù)分析
本次研究采用SPSS 16. 0對數(shù)據(jù)進行整理分析，我們發(fā)現(xiàn)被檢測的4個CpG位點之間存在顯著關(guān)聯(lián)(相關(guān)系數(shù)r > 0.8，P < 0.01，說明4個CpG之間存在顯著相關(guān)，見圖1)，所以后期我們選擇取4個CpG甲基化的平均值來代表 整體的甲基化水平。在總樣本的病例對照比較中，我們得到了甲基化程度的顯著性差異(P=O. 026，P〈0. 05說明樣本存在顯著性差異)，所以我們做了性別的分層分析，在性別分組的病例對照差異對比中，我們發(fā)現(xiàn)女性樣本中的DNA甲基化差異(P=O. 003)比男性樣本(P=O. 096)更顯著(見表I)?；虻腄NA甲基化水平還與樣本對象的抽煙，糖尿病，高血壓情況有夫。另外，在年齡和甲基化程度的相關(guān)性研究中，我們發(fā)現(xiàn)男性樣本中年齡與甲基化程度呈負相關(guān)(r=-0. 365，圖3)，這與男性吸煙、喝酒等生活習慣導致的環(huán)境因素相關(guān)；而在女性樣本中，年齡與甲基化程度呈正相關(guān)(r=0. 373，圖3)，這與女性絕經(jīng)期后激素水平變化而導致冠心病風險提升有夫。與其他傳統(tǒng)的冠心病檢測技術(shù)相比，此試劑盒技術(shù)具有準確可靠、靈活快速和經(jīng)濟節(jié)約的優(yōu)點。本發(fā)明本發(fā)明采用上述試劑盒對基因啟動子區(qū)甲基化水平進行檢測，能夠快速可靠地為冠心病的輔助診斷、檢測或篩查藥物提供借鑒。表1.總體與性別分組對各項指標的分析(n=72)
權(quán)利要求
1.一種可用于檢測與冠心病相關(guān)的/^^^7基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒，其特征在于一對/^^^7基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物及其甲基化特異性測序引物，其中所述的甲基化特異性擴增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示5’ -GTTTTGGGGAGGGTGTTG-3’ ； 所述的甲基化特異性擴增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示5’ -Biotin-ACCAACCCCTATCCCCCTAACTA-3’ ； 所述的甲基化特異性測序引物如SEQ ID NO. 3所示5’ -AGTATTATTAGGGGAGGA-3’。
2.一種如權(quán)利要求1所述的可用于檢測與冠心病相關(guān)的基因/^^^7啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒的應用，其特征在于在外周血檢測中，該試劑盒可用于冠心病輔助檢測、診斷或藥物治療中。
全文摘要
本發(fā)明公開了可用于檢測與冠心病相關(guān)的PLA2G7基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應用，特點是該試劑盒包括一對PLA2G7基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物及一個甲基化特異性測序引物，其中上游引物具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，甲基化特異性測序引物如SEQIDNO.3所示，優(yōu)點是該診斷試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實現(xiàn)對冠心病的檢測，檢測效率高，針對性強，同時，以PLA2G7基因啟動子區(qū)甲基化為靶點的藥物有望成為冠心病輔助診斷、檢測和篩選的一種新手段。
文檔編號C12Q1/68GK103014165SQ20121056087
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者蔣丹捷, 段世偉, 吳莎莎 申請人:寧波大學