專利名稱：乳桿菌凍干產(chǎn)品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌的凍干粉制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌都屬于乳酸菌，革蘭氏染色陽性、無芽孢桿菌，在其凍干制劑的生產(chǎn)中，存在菌體死亡率較高及穩(wěn)定性能差的缺點，致使產(chǎn)品中活菌含量少、用量大、發(fā)酵效果差，制造和使用成本均較高。此外，高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組分及用量配制不合理，缺乏針對性，不利于高密度發(fā)酵，不利于凍干制品的制備。本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供ー種適合嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或 鼠李糖乳桿菌高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其凍干產(chǎn)品的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
具體技術(shù)方案之一特別優(yōu)選的ー種培養(yǎng)基，一種適用于嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由以組分配制而成，80_120g的脫脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、O. 50-0. 70g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧唳和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黃素、I. Omg鹽酸硫胺素、O. Olg的甲酸、20g的乳糖和50g的麥芽汁加入蒸餾水并定容至IOOOmL ;其中，優(yōu)選的，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為I :2 ;生物素和葉酸的比例為I :1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為I :3，這些配比帶來了難以預(yù)料的技術(shù)效果。普通常規(guī)培養(yǎng)基也適用于本發(fā)明。具體技術(shù)方案之ニ 深凍保護劑，其組成及配制將150g的脫脂乳粉、20g的斯盤60、80g的海藻糖、50g的鹿糖糖蜜和15g的維生素C加入蒸懼水并定容至1000mL。具體技術(shù)方案之三嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌凍干產(chǎn)品的制備方法，按以下步驟進行
一、高密度培養(yǎng)
將按常規(guī)方法活化的菌株以2%的接種量接種于滅菌的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中PH采用兩段式，總發(fā)酵時間10h，第一階段將發(fā)酵液的pH用質(zhì)量濃度10%的氨水控制在6. 0-6. 5，發(fā)酵7. Oh ;第二階段不控制發(fā)酵液的pH，發(fā)酵3. Oh ;發(fā)酵過程中采用三段式變溫培養(yǎng)模式，第一階段將發(fā)酵溫度控制在42. 5-45. (TC，發(fā)酵3. 5h ;第二階段將發(fā)酵溫度控制在35-37°C，發(fā)酵3. 5h ;第三階段將發(fā)酵溫度控制在37-40°C，發(fā)酵3h ;其中所述培養(yǎng)基為80-120g的脫脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、O. 50-0. 70g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸鈣、
2.Omg的核黃素、I. Omg鹽酸硫胺素、O. Olg的甲酸、20g的乳糖和50g的麥芽汁加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在發(fā)酵過程中攪拌速度為120rpm,直至發(fā)酵結(jié)束；其中；其中，優(yōu)選,尿!1密啶和黃嘌呤的比例為I :2 ;生物素和葉酸的比例為I :1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為I :3。ニ、洗脫發(fā)酵液在O 20°C時,加入與發(fā)酵液等重量的質(zhì)量濃度為15%的朽1檬酸鈉溶液或質(zhì)量濃度為15%的磷酸鈉溶液對發(fā)酵液進行蛋白洗脫。三、富集
洗脫結(jié)束后，將發(fā)酵液的溫度降至4°C，依次采用膜過濾、連續(xù)式離心進行濃縮，具體膜濃縮操作為用孔徑為100 200nm、面積為I. 0m2的陶瓷膜，在跨膜壓カ為150KPa進行膜濃縮處理，至發(fā)酵液的濃縮倍數(shù)達到3 ;離心濃縮具體為以30kg/min的進料量用連續(xù)自動出料離心機式進行離心濃縮，控制出料量為5kg/min ；
四、凍干保護
將獲得的菌體濃縮物與凍干保護劑以質(zhì)量比為I :1_1 :2進行混合，然后進行冷貯；其中凍干保護劑的組成將150g的脫脂乳粉、20g的斯盤60、80g的海藻糖、50g的蔗糖糖蜜和 15g的維生素C加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;將此混合物在4_15°C的環(huán)境中放置20h。五、菌體的干燥
將步驟四得到的混合物以2°C /min的降溫速率降至_50°C，保持30min ;在真空度為
O.05MPa的條件下，以1°C /min的速率升溫至_35°C，并維持此溫度至真空度達到O. OlMPa完成主干燥階段；以5°C /min的速率升溫至10°C并維持此溫度至真空度達到O. 03MPa完成解析干燥階段，取出后用顆粒機粉碎，再用無菌鋁箔紙盒包裝并置于_20°C的環(huán)境中貯藏。申請人:先前研究了単一溫度培養(yǎng)模式和變溫培養(yǎng)模式對乳酸菌發(fā)酵活力和生物量的影響，結(jié)果表明采用兩階段的溫度控制方式，發(fā)酵初期高溫進行發(fā)酵，后期低溫進行發(fā)酵，與単一溫度發(fā)酵相比，乳酸菌的最大細胞生物量和最高發(fā)酵活力均有所提高。但是，發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)變溫發(fā)酵雖然提高了細胞生物量和最高發(fā)酵活力，但是受PH影響很大，而且在該菌冷凍干燥后發(fā)酵活力和細胞生物量有明顯下降，影響凍干制劑質(zhì)量、提高了使用成本，単獨使用兩段式的溫度控制模式而不對PH進行優(yōu)化控制會導(dǎo)致在發(fā)酵過程中出現(xiàn)代謝產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致乳酸菌的生長和繁殖受到抑制。単獨使用兩段式的PH控制模式而不對溫度進行優(yōu)化控制會導(dǎo)致由于溫度不是菌體細胞的最佳生長模式，而造成乳酸菌的生長率過低。在高密度培養(yǎng)過程中，往往通過控制培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的pH值，以解除酸對菌體生長的抑制作用，促進菌株生長。但是該方法當菌體濃度達一定的數(shù)量吋，中和反應(yīng)將不起作用。因此，本發(fā)明專利采用兩段式的pH控制方式，此外第二階段不控制pH，使菌體細胞處于應(yīng)激的狀態(tài)，從而產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，増加了菌體抵御不良條件的抗性和凍干存活率。最適溫度隨著菌體生長階段變化而改變。溫度通過影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能、細胞結(jié)構(gòu)如細胞膜的流動性和完整性以及胞內(nèi)酶的活性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。較低的接種溫度導(dǎo)致活菌數(shù)量緩慢增加，有利于延長乳酸菌的對數(shù)期和穩(wěn)定期，較高的培養(yǎng)溫度將增加菌體細胞的生長速度。本發(fā)明專利發(fā)酵初期采用較高的發(fā)酵溫度以縮短遲滯期使其快速進行對數(shù)生長期，當進入對數(shù)生長期時采用較低的發(fā)酵溫度以延長乳酸菌的對數(shù)生長期，當?shù)竭_對數(shù)生長期末期時，采用相對適中的溫度以縮短到達穩(wěn)定期的時間。本發(fā)明高密度培養(yǎng)基是針對嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌特別配制的，本發(fā)明專利在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入的甜菜糖蜜和玉米淀粉糖漿中含有的甜菜堿和多種糖類有效的緩解了菌種在增殖過程中由于高的滲透壓對菌體細胞帶來的損傷并為其生長提供了大量優(yōu)質(zhì)的碳源；尿嘧啶和黃嘌呤直接快速的為乳桿菌合成遺傳物質(zhì)提供了基本成分；生物素、葉酸、尼克酸、泛酸鈣、核黃素和鹽酸硫胺素是乳桿菌生長過程中重要酶的輔助因子，為乳桿菌在增殖過程中快速有效的合成蛋白和脂肪提供了有力的物質(zhì)保障。增菌培養(yǎng)基中同時增加了黃嘌呤和尿嘧啶的使用量，為后續(xù)凍干產(chǎn)品的制備過程中増加了功能性益生性乳桿菌的存活率。黃嘌呤和尿嘧啶的用量比2:1效果好，可明顯提高存活率。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出效果
(I)發(fā)明人將影響細菌發(fā)酵的兩個關(guān)鍵因素相結(jié)合，創(chuàng)造性地在高密度發(fā)酵過程中采用兩段式pH、三段式變溫相結(jié)合的方式進行發(fā)酵，最大細胞生物量和最高發(fā)酵活力較單獨的兩階段的溫度或単獨的兩段式PH控制方式，得到明顯提高，同時得到的凍干制劑中活菌數(shù)高、穩(wěn)定性好。(2)本發(fā)明高密度培養(yǎng)基是針對嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌特別配制的，在先前研究的基礎(chǔ)上，特別加入了 O. Olg的甲酸、20g的乳糖和50g的麥芽汁，甲酸是乳酸桿菌的促生長因子，乳糖是乳酸桿菌生長的優(yōu)質(zhì)碳源，麥芽汁中含有豐富的氨基酸和維生素，三者協(xié)同作用，為提供高質(zhì)量的高密度培養(yǎng)基做出重要貢獻，優(yōu)選配制的培養(yǎng)基與兩段式pH、三段式變溫發(fā)酵的方式相結(jié)合產(chǎn)生了預(yù)料不到的技術(shù)效果。另外，使用其他常規(guī)的培養(yǎng)基，同時采用本申請中所述的兩段式pH、三段式變溫相結(jié)合的方式進行發(fā)酵，也能夠取得好的技術(shù)效果。(3)凍干保護劑也是針對深凍產(chǎn)品配制的，是特別優(yōu)選的。本發(fā)明專利充分的利用了乳蛋白對菌體細胞的包埋作用、斯盤60對細胞膜的保護作用、海藻糖防止大冰晶的形成和保水作用、甜菜糖蜜降低滲透壓作用及維生素C保持適合的氧化還原電勢的作用，上述保護體系増加了冷凍干燥對菌體的損傷，此外，在冷凍干燥前將菌體置于低溫下，使菌體產(chǎn)生抗凍蛋白，也有效的提高了菌體的凍干存活率。其它常規(guī)凍干保護劑也可以被用于本發(fā)明。(4)本專利技術(shù)產(chǎn)品在凍藏的條件下可保存I年，活菌數(shù)不低于IX 1012cfu/g。(5)上述乳酸菌在優(yōu)化的単一溫度(42. 5°C)和pH (6. 2)的條件下培養(yǎng)的活菌數(shù)為2. 2X108CFU/mL。兩段式變溫培養(yǎng)第一階段(42. 5-45. (TC )，第二階段(35_37°C )的條件下培養(yǎng)的活菌數(shù)為8. 7X 108CFU/mL。與単一的溫度和pH培養(yǎng)模式相比，活菌數(shù)増加了
3.9倍。然而，本申請中的兩段式pH、三段式變溫相結(jié)合的發(fā)酵方式中進行乳酸菌的高密度培養(yǎng)，乳酸菌的活菌數(shù)為7. 6X 109CFU/mL。與単一的培養(yǎng)模式相比活菌數(shù)増加了 34. 5倍，與兩段式變溫培養(yǎng)模式相比活菌數(shù)増加了 8. 7倍。兩段式pH、三段式變溫相結(jié)合的發(fā)酵方式與“兩段式變溫”的培養(yǎng)模式及常規(guī)單ー溫度和PH的培養(yǎng)模式的活菌數(shù)相比差異顯著(P < O. 001)。
具體實施例方式 實施例I、一種適用于嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由以組分配制而成，80g的脫脂乳粉，50g的甜菜糖蜜，40g的玉米淀粉糖漿、
O.50g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸·丐、2. Omg的核黃素、I. Omg鹽酸硫胺素、O. Olg的甲酸、20g的乳糖和50g的麥芽汁加入蒸餾水并定容至IOOOmL ;其中，。實施例2、一種適用于嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由以組分配制而成，120g的脫脂乳粉，70g的甜菜糖蜜，60g的玉米淀粉糖漿、O. 70g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸·丐、2. Omg的核黃素、I. Omg鹽酸硫胺素、O. Olg的甲酸、20g的乳糖和50g的麥芽汁加入蒸餾水并定容至IOOOmL ;其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為I :2 ;生物素和葉酸的比例為I :1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為I :3。實施例3、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌凍干產(chǎn)品的制備方法，按以下步驟進行
I、高密度培養(yǎng)
將經(jīng)過活化的菌株以2%的接種量接種于滅菌的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中pH采用兩段式，總發(fā)酵時間10h，第一階段將發(fā)酵液的pH用質(zhì)量濃度10%的氨水控制在6. 0，發(fā)酵7. Oh ;第二階段不控制發(fā)酵液的pH，發(fā)酵3. Oh ;發(fā)酵過程中采用三段式變溫培養(yǎng)模式，第一階段將發(fā)酵溫度控制在42. 5°C，發(fā)酵3. 5h ;第二階段將發(fā)酵溫度控制在35°C，發(fā)酵
3.5h ;第三階段將發(fā)酵溫度控制在37°C，發(fā)酵3h ;其中所述培養(yǎng)基為80-120g的脫脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、O. 50-0. 70g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿P密唳和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黃素、I. Omg鹽酸硫胺素、O. Olg的甲酸、20g的乳糖和50g的麥芽汁加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在發(fā)酵過程中攪拌速度為120rpm，直至發(fā)酵結(jié)束；其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為I :2 ;生物素和葉酸的比例為I :1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為I :3。2、洗脫
發(fā)酵液在O 20°C時,加入與發(fā)酵液等重量的質(zhì)量濃度為15%的朽1檬酸鈉溶液或質(zhì)量濃度為15%的磷酸鈉溶液對發(fā)酵液進行蛋白洗脫。3、富集
洗脫結(jié)束后，將發(fā)酵液的溫度降至4°C，依次采用膜過濾、連續(xù)式離心進行濃縮，具體膜濃縮操作為用孔徑為100 200nm、面積為I. 0m2的陶瓷膜，在跨膜壓カ為150KPa進行膜濃縮處理，至發(fā)酵液的濃縮倍數(shù)達到3 ;離心濃縮具體為以30kg/min的進料量用連續(xù)自動出料離心機式進行離心濃縮，控制出料量為5kg/min ；
4、凍干保護
將獲得的菌體濃縮物與凍干保護劑以質(zhì)量比為I :1_1 :2進行混合，然后進行冷貯；其中凍干保護劑的組成將150g的脫脂乳粉、20g的斯盤60、80g的海藻糖、50g的蔗糖糖蜜和15g的維生素C加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;將此混合物在4_15°C的環(huán)境中放置20h。5、菌體的干燥
將步驟四得到的混合物以2°C /min的降溫速率降至_50°C，保持30min ;在真空度為
O.05MPa的條件下，以1°C /min的速率升溫至_35°C，并維持此溫度至真空度達到O. OlMPa完成主干燥階段；以5°C /min的速率升溫至10°C并維持此溫度至真空度達到O. 03MPa完成解析干燥階段，取出后用顆粒機粉碎，再用無菌鋁箔紙盒包裝并置于_20°C的環(huán)境中貯藏。實施例4、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌凍干產(chǎn)品的制備方法，按以下步驟進行
I、高密度培養(yǎng)
將經(jīng)過活化的菌株以2%的接種量接種于滅菌的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中pH采用兩段式，總發(fā)酵時間10h，第一階段將發(fā)酵液的pH用質(zhì)量濃度10%的氨水控制在6. 5，發(fā)酵7. Oh ;第二階段不控制發(fā)酵液的pH，發(fā)酵3. Oh ;發(fā)酵過程中采用三段式變溫培養(yǎng)模式，第一階段將發(fā)酵溫度控制在45. (TC，發(fā)酵3. 5h ;第二階段將發(fā)酵溫度控制在37°C，發(fā)酵
3.5h ;第三階段將發(fā)酵溫度控制在40°C，發(fā)酵3h ;其中所述培養(yǎng)基為80-120g的脫脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、O. 50-0. 70g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿P密唳和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黃素、I. Omg鹽酸硫胺素、O. Olg的甲酸、20g的乳糖和50g的麥芽汁加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在發(fā)酵過程中攪拌速度為120rpm，直至發(fā)酵結(jié)束；其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為I :2 ;生物素和葉酸的比例為I :1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為I :3。2、洗脫
發(fā)酵液在O 20°C時,加入與發(fā)酵液等重量的質(zhì)量濃度為15%的朽1檬酸鈉溶液或質(zhì)量濃度為15%的磷酸鈉溶液對發(fā)酵液進行蛋白洗脫。
、
3、富集
洗脫結(jié)束后，將發(fā)酵液的溫度降至4°C，依次采用膜過濾、連續(xù)式離心進行濃縮，具體膜濃縮操作為用孔徑為100 200nm、面積為I. 0m2的陶瓷膜，在跨膜壓カ為150KPa進行膜濃縮處理，至發(fā)酵液的濃縮倍數(shù)達到3 ;離心濃縮具體為以30kg/min的進料量用連續(xù)自動出料離心機式進行離心濃縮，控制出料量為5kg/min ；
4、凍干保護
將獲得的菌體濃縮物與凍干保護劑以質(zhì)量比為I :1_1 :2進行混合，然后進行冷貯；其中凍干保護劑的組成將150g的脫脂乳粉、20g的斯盤60、80g的海藻糖、50g的蔗糖糖蜜和15g的維生素C加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;將此混合物在4_15°C的環(huán)境中放置20h。5、菌體的干燥
將步驟四得到的混合物以2°C /min的降溫速率降至_50°C，保持30min ;在真空度為O. 05MPa的條件下，以1°C /min的速率升溫至_35°C，并維持此溫度至真空度達到O. OlMPa完成主干燥階段；以5°C /min的速率升溫至10°C并維持此溫度至真空度達到O. 03MPa完成解析干燥階段，取出后用顆粒機粉碎，再用無菌鋁箔紙盒包裝并置于_20°C的環(huán)境中貯藏。實施例5
嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌凍干產(chǎn)品的制備方法，按以下步驟進行
I、高密度培養(yǎng)
將經(jīng)過活化的菌株以2%的接種量接種于滅菌的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中pH采用兩段式，總發(fā)酵時間10h，第一階段將發(fā)酵液的pH用質(zhì)量濃度10%的氨水控制在6. 2，發(fā)酵7. Oh ;第二階段不控制發(fā)酵液的pH，發(fā)酵3. Oh ;發(fā)酵過程中采用三段式變溫培養(yǎng)模式，第一階段將發(fā)酵溫度控制在43. (TC，發(fā)酵3. 5h ;第二階段將發(fā)酵溫度控制在36°C，發(fā)酵
3.5h ;第三階段將發(fā)酵溫度控制在38°C，發(fā)酵3h ;其中所述培養(yǎng)基為80-120g的脫脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、O. 50-0. 70g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿P密唳和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黃素、I. Omg鹽酸硫胺素、O. Olg的甲酸、20g的乳糖和50g的麥芽汁加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在發(fā)酵過程中攪拌速度為120rpm，直至發(fā)酵結(jié)束；其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為I :2 ;生物素和葉酸的比例為I :1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為I :3。2、洗脫發(fā)酵液在O 20°C時,加入與發(fā)酵液等重量的質(zhì)量濃度為15%的朽1檬酸鈉溶液或質(zhì)量濃度為15%的磷酸鈉溶液對發(fā)酵液進行蛋白洗脫。3、富集
洗脫結(jié)束后，將發(fā)酵液的溫度降至4°C，依次采用膜過濾、連續(xù)式離心進行濃縮，具體膜濃縮操作為用孔徑為100 200nm、面積為I. 0m2的陶瓷膜，在跨膜壓カ為150KPa進行膜濃縮處理，至發(fā)酵液的濃縮倍數(shù)達到3 ;離心濃縮具體為以30kg/min的進料量用連續(xù)自動出料離心機式進行離心濃縮，控制出料量為5kg/min ；
4、凍干保護
將獲得的菌體濃縮物與凍干保護劑以質(zhì)量比為I :1_1 :2進行混合，然后進行冷貯；其中凍干保護劑的組成將150g的脫脂乳粉、20g的斯盤60、80g的海藻糖、50g的蔗糖糖蜜和 15g的維生素C加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;將此混合物在4_15°C的環(huán)境中放置20h。5、菌體的干燥
將步驟四得到的混合物以2°C /min的降溫速率降至_50°C，保持30min ;在真空度為
O.05MPa的條件下，以1°C /min的速率升溫至_35°C，并維持此溫度至真空度達到O. OlMPa完成主干燥階段；以5°C /min的速率升溫至10°C并維持此溫度至真空度達到O. 03MPa完成解析干燥階段，取出后用顆粒機粉碎，再用無菌鋁箔紙盒包裝并置于_20°C的環(huán)境中貯藏。
權(quán)利要求
1.一種在制備嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品過程中使用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由以下組分及用量配制而成，80-120g的脫脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g 的玉米淀粉糖漿、O. 50-0. 70g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸|丐、2· Omg的核黃素、L Omg鹽酸硫胺素、O. Olg的甲酸、20g 的乳糖和50g的麥芽汁加入蒸餾水并定容至IOOOmL ;其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為1:2 ； 生物素和葉酸的比例為I :1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為I :3。
2.嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌凍干產(chǎn)品的制備方法，按以下步驟進一、高密度培養(yǎng)將按常規(guī)方法活化的嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌以2%的接種量接種于滅菌的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中pH采用兩段式，總發(fā)酵時間10h，第一階段將發(fā)酵液的PH用質(zhì)量濃度10%的氨水控制在6. 0-6. 5，發(fā)酵7. Oh ;第二階段不控制發(fā)酵液的pH，發(fā)酵3. Oh ;發(fā)酵過程中采用三段式變溫培養(yǎng)模式，第一階段將發(fā)酵溫度控制在42. 5-45. (TC， 發(fā)酵3. 5h ;第二階段將發(fā)酵溫度控制在35-37°C，發(fā)酵3. 5h ;第三階段將發(fā)酵溫度控制在 37-40°C，發(fā)酵3h ;其中所述培養(yǎng)基為80-120g的脫脂乳粉，50_70g的甜菜糖蜜，40_60g的玉米淀粉糖漿、O. 50-0. 70g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸|丐、2· Omg的核黃素、I. Omg鹽酸硫胺素、O. Olg的甲酸、20g的乳糖和50g的麥芽汁加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在發(fā)酵過程中攪拌速度為120rpm,直至發(fā)酵結(jié)束；其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為I :2 ;生物素和葉酸的比例為I :1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為I :3 ;二、洗脫三、富集四、凍干保護將獲得的菌體濃縮物與凍干保護劑以質(zhì)量比為I :1_1 :2進行混合，然后進行冷貯；其中凍干保護劑的組成將150g的脫脂乳粉、20g的斯盤60、80g的海藻糖、50g的蔗糖糖蜜和 15g的維生素C加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;將此混合物在4_15°C的環(huán)境中放置20h ；五、菌體的干燥將步驟四得到的混合物以2°C /min的降溫速率降至_50°C，保持30min ;在真空度為O.05MPa的條件下，以1°C /min的速率升溫至_35°C，并維持此溫度至真空度達到O. OlMPa 完成主干燥階段；以5°C /min的速率升溫至10°C并維持此溫度至真空度達到O. 03MPa完成解析干燥階段，取出后用顆粒機粉碎，再用無菌鋁箔紙盒包裝并置于_20°C的環(huán)境中貯藏。
3.根據(jù)權(quán)利要求2任一項所述的方法，其中的所述的洗脫步驟具體為發(fā)酵液在O 20°C時，加入與發(fā)酵液等重量的質(zhì)量濃度為15%的檸檬酸鈉溶液或質(zhì)量濃度為15%的磷酸鈉溶液對發(fā)酵液進行蛋白洗脫。
4.根據(jù)權(quán)利要求3任一項所述的方法，其中所述的富集步驟具體為洗脫結(jié)束后，將發(fā)酵液的溫度降至4°C，依次采用膜過濾、連續(xù)式離心進行濃縮，具體膜濃縮操作為用孔徑為100 200nm、面積為I. Om2的陶瓷膜，在跨膜壓力為150KPa進行膜濃縮處理，至發(fā)酵液的濃縮倍數(shù)達到3 ;離心濃縮具體為以·30kg/min的進料量用連續(xù)自動出料離心機式進行離心濃縮，控制出料量為5kg/min。
5.嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌的凍干產(chǎn)品，按權(quán)利要求1-4任一項所述的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌的凍干粉制劑的制備方法，提供了一種在制備嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌凍干產(chǎn)品過程中使用的培養(yǎng)基；發(fā)明人將影響細菌發(fā)酵的兩個關(guān)鍵因素相結(jié)合，創(chuàng)造性地在高密度發(fā)酵過程中采用兩段式pH、三段式變溫相結(jié)合的方式進行發(fā)酵，最大細胞生物量和最高發(fā)酵活力較單一方式得到明顯提高，同時得到的凍干制劑中活菌數(shù)高、穩(wěn)定性好；同時還提供了一種優(yōu)良的凍干保護劑。
文檔編號C12N1/04GK102978143SQ201210560900
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者張?zhí)m威, 韓雪, 馮鎮(zhèn), 易華西, 杜明, 張英春, 張莉麗, 單毓娟, 焦月華 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)