專利名稱：一種小麥胚芽脂肪酶的固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小麥胚芽脂肪酶的固定化方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脂肪酶(EC 3.1.1. 3)是一種重要的水解酶類，在食品、藥品、化工等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。脂肪酶種類很多，其中絕大多數(shù)來(lái)自于微生物，少數(shù)來(lái)自于動(dòng)物，而極少數(shù)來(lái)自于植物。小麥胚芽脂肪酶是一種存在于小麥中的脂肪酶，由于其熱穩(wěn)定性以及在小麥發(fā)芽中的重要性，為大家所關(guān)注。一般認(rèn)為小麥胚芽當(dāng)中富含多種酶類，有α-淀粉酶、脂肪酶、酯酶、脂肪氧化酶和蛋白酶等，其中主要是脂肪酶以及酯酶；尤其是在發(fā)芽后所顯示的酶活主要是脂肪酶酶活。小麥胚芽脂肪酶的存在對(duì)小麥胚芽的保藏是十分不利的，它能短時(shí)間內(nèi)水解油月旨，使其脂肪酸值大幅度升高，引起麥胚酸敗變質(zhì)；同時(shí)，微生物生長(zhǎng)繁殖快，也會(huì)導(dǎo)致麥胚出現(xiàn)結(jié)塊、霉變和發(fā)酵等變質(zhì)現(xiàn)象。所以，目前對(duì)小麥胚芽脂肪酶的研究大多集中在該酶在小麥胚芽中的穩(wěn)定性以及如何快速降低其水解活性，防止麥胚酸化變質(zhì)。對(duì)小麥胚芽脂肪酶用于催化生物反應(yīng)過(guò)程研究相對(duì)較少，主要集中在手性拆分和油脂工業(yè)方面。據(jù)報(bào)道，小麥胚芽脂肪酶在立體選擇性方面并 不符合Kazlauskas規(guī)則，呈現(xiàn)為反K氏規(guī)則，是現(xiàn)有唯一天然來(lái)源的反K氏規(guī)則的脂肪酶，這在手性拆分和脂肪酶催化分子機(jī)理解析方面具有重要的意義。在油脂催化方面，目前認(rèn)為，小麥胚芽脂肪酶只對(duì)短鏈的甘油三酯具有催化作用，而對(duì)長(zhǎng)鏈甘油三酯幾乎沒(méi)有作用。總體而言，相對(duì)于其它脂肪酶，小麥胚芽脂肪酶穩(wěn)定性和活性都較低。通過(guò)某種手段改善小麥胚芽脂肪酶的不穩(wěn)定性和低活性，是拓寬其應(yīng)用范圍的一大研究方向。固定化酶技術(shù)是通過(guò)物理或化學(xué)的方法，將酶束縛在載體上，使其既保持酶的天然活性，又便于與反應(yīng)液分離，可以重復(fù)使用。固定化酶與游離酶相比，主要有下列優(yōu)點(diǎn)
(I)產(chǎn)物不易被酶污染，簡(jiǎn)化后續(xù)的分離提純工藝；(2)在大多數(shù)情況下，酶在固定化后穩(wěn)定性會(huì)得到提高并可重復(fù)使用，從而便于連續(xù)化生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本；(3)固定化酶具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可以采用攪拌或裝柱的方式使用，便于生產(chǎn)過(guò)程實(shí)現(xiàn)管道化、連續(xù)化和自動(dòng)化。酶固定化技術(shù)的顯著優(yōu)勢(shì)使得該領(lǐng)域的研究一直受到廣泛關(guān)注，工業(yè)化應(yīng)用的例子也越來(lái)越多。因此，通過(guò)酶固定化方法提高小麥胚芽脂肪酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用次數(shù)是降低使用成本和簡(jiǎn)化分離純化工序的一種有效手段。小麥胚芽脂肪酶經(jīng)固定化之后載體對(duì)其具有保護(hù)和緩沖作用，在催化反應(yīng)過(guò)程中大大降低了反應(yīng)環(huán)境對(duì)其影響，如在有機(jī)溶劑反應(yīng)中，可減輕有機(jī)溶劑對(duì)其的失活作用。此外，在固定化的過(guò)程中，可對(duì)酶分子進(jìn)行一定的化學(xué)修飾作用，使脂肪酶分子α螺旋“蓋子”處于開(kāi)啟狀態(tài)，有助于底物分子進(jìn)入袋型結(jié)構(gòu)與酶分子催化三聯(lián)體結(jié)合，提高酶與底物之間的傳質(zhì)作用，加快反應(yīng)的進(jìn)行
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服游離小麥胚芽脂肪酶穩(wěn)定性和重復(fù)利用性差的缺點(diǎn)，提出一種化學(xué)法固定小麥胚芽脂肪酶的方法。該方法采用價(jià)格低廉的載體，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的幾步反應(yīng)就達(dá)到了固定化目的。在固定化過(guò)程中，反應(yīng)條件溫和、所用試劑毒性均較低，對(duì)人體和環(huán)境危害小。酶經(jīng)固定化之后結(jié)合牢固，不易從載體脫落，大大提高了重復(fù)利用次數(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種小麥胚芽脂肪酶的固定化方法，包括以下步驟
(1)用環(huán)氧氯丙烷活化載體，使載體帶上環(huán)氧基；
(2)用一種帶氨基的化合物將步驟(I)已活化載體上的環(huán)氧基團(tuán)打開(kāi)，使載體帶上連接
基團(tuán)氣基;
(3)步驟(2)獲得的載體通過(guò)連接物與小麥胚芽脂肪酶共價(jià)連接。本發(fā)明中在步驟(I)環(huán)氧氯丙烷活化過(guò)程中引入一定體積的水溶性助溶劑，一方面有助于解決環(huán)氧氯丙烷在水中的溶解度有限，造成其在載體中擴(kuò)散通量較低，活化反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)的問(wèn)題；另一方面，可抑制環(huán)氧基在堿性條件下發(fā)生水解反應(yīng)，提高修飾密度。水溶性助溶劑的種類可以是二甲亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、二氧六環(huán)、乙腈、丙酮、正己烷中的一種或一種以上的混合物，其中二甲亞砜效果最佳。助溶劑加入量占總體系體積的5%-40%，較佳地選擇10%-20%。環(huán)氧化時(shí)間對(duì)最終環(huán)氧基密度影響很大。反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，載體上羥基未能全部被取代；反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易使載體環(huán)氧化之后，環(huán)氧基發(fā)生水解反應(yīng)，降低環(huán)氧基密度。因此，在環(huán)氧化反應(yīng)過(guò)程中，要嚴(yán)格控制好時(shí)間l_8h。較優(yōu)地，將時(shí)間控制在2-4h。環(huán)氧氯丙烷活化載體的溫度為30-50°C，較優(yōu)的，將溫度控制在40°C。

本發(fā)明中，所用載體為帶有羥基的天然或人工合成的聚合物。優(yōu)先選擇價(jià)格低廉，性能穩(wěn)定的硅膠、瓊脂糖、殼聚糖、葡聚糖、聚乙二醇中的一種或一種以上的混合物。載體在使用前需經(jīng)濃鹽酸浸泡后，用大量去離子水洗滌，抽濾干燥后待用。步驟(2)中，化合物為帶有氨基的化合物，加入氨基化合物的目的是使環(huán)氧基在堿性條件下發(fā)生水解，形成氨基。所述帶有氨基的化合物選用氨水、1，2-二氨基乙烷、3，3’- 二氨基二丙烷、乙二胺1，6-己二胺、6-氨基己酸中的一種；體系中氨基化合物濃度并不需嚴(yán)格控制，加入的氨基化合物能使體系中pH大于12即可。氨基化合物與環(huán)氧基摩爾比為1-100:1，氨基化溫度為30-50°C，控制轉(zhuǎn)速為100-200rpm，反應(yīng)時(shí)間為12_24h。本發(fā)明步驟(3)中控制好溫度和pH對(duì)提高酶吸附量十分關(guān)鍵。碳化二亞胺(EDC)對(duì)溫度和PH較為敏感。所述連接物為碳化二亞胺EDC、碳化二亞胺EDC與N-羥基琥珀酰亞胺NHS混合物、碳化二亞胺EDC與N-羥基硫代琥珀酰亞胺Sulfo-NHS混合物中的一種；
連接物與小麥胚芽脂肪酶的摩爾比為1-100:1，交聯(lián)溫度為4-25°C，交聯(lián)的pH為5. 0-9. 0，交聯(lián)時(shí)間為2-24h。較佳地，交聯(lián)過(guò)程中控制溫度選擇4-10°C，pH控制在5-8。在本發(fā)明的第二方面提供了一種固定化小麥胚芽脂肪酶，其特點(diǎn)是，由上述的小麥胚芽脂肪酶固定化方法制備而成。本發(fā)明的有益效果在于1、本發(fā)明涉及的一種小麥胚芽脂肪酶的固定化方法通過(guò)用一種活化基團(tuán)修飾載體；再用一種化合物將活化載體上的活化基團(tuán)打開(kāi)，載體帶上連接基團(tuán)；最后通過(guò)連接物與小麥胚芽脂肪酶共價(jià)連接，實(shí)現(xiàn)小麥胚芽脂肪酶的固定化。本發(fā)明使用廉價(jià)的固定化材料，利用簡(jiǎn)單的幾步化學(xué)修飾，巧妙地將小麥胚芽脂肪酶與載體共價(jià)連接。整個(gè)固定化過(guò)程反應(yīng)條件溫和，使用的試劑價(jià)格低廉、安全低毒，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。2、本發(fā)明中使用的小麥胚芽脂肪酶可以從廢棄的麥麩中提取獲得，不但酶的來(lái)源廣泛，而且實(shí)現(xiàn)了廢物的回收再利用，變廢為寶。將提取得到的酶液固定在載體上，大大提高了酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用次數(shù)，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化操作。


圖1硅膠對(duì)小麥胚芽脂肪酶最大靜態(tài)吸附量圖。
具體實(shí)施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明，其目的僅在于更好理解本發(fā)明的內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1
稱取40目大孔硅膠48g，用去離子水清洗2遍，真空抽干。在IOOOmL的藍(lán)蓋瓶中，力口入經(jīng)清洗干凈的硅膠、78mL環(huán)氧氯丙烷(與硅膠的摩爾比為2:1 )、125mL 二氧六環(huán)和300mL、1. OM的氫化化鈉溶液，密閉后，在30°C，200rpm搖床中振蕩反應(yīng)2. Oh。反應(yīng)結(jié)束后，硅膠用去離子水不斷沖洗，直至砂 芯漏斗下方流出水的PH為中性。將活化后的載體真空抽干5min，隨后稱取O. 5g硅膠于50mL磨口三角瓶中，加入5mL、l. 3mol/L的硫代硫酸鈉和50 μ L中性紅指示劑。30°C、160rpm下振蕩反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束為的溶液用O. 1M、HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。直至溶液顏色由亮橙色變?yōu)榧t色為止。根據(jù)消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，測(cè)定出環(huán)氧基密度。經(jīng)以上步驟可獲得帶有環(huán)氧基的硅膠。實(shí)施例2
稱取聚乙二醇2000 (國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)40g，加入環(huán)氧氯丙烷32mL、75mL丙酮和143mL、1. OM氫氧化鈉溶液，密閉后，在50°C、200rpm搖床中振蕩反應(yīng)6. Oh。反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定環(huán)氧基密度，測(cè)定方法同實(shí)施例1。實(shí)施例3
稱取實(shí)施例1中環(huán)氧氯丙烷活化后硅膠36g，加入36%-38%氨水IOOmL,再加入去離子水150mL。調(diào)節(jié)pH為12，在30°C、160rpm反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水沖洗，使砂芯漏斗流出液體PH為中性為止。準(zhǔn)確稱量氨基化后的硅膠Ig于50mL磨口三角瓶中，加入5mL去離子水和50 μ L甲基紅指示劑，用O.1M鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其氨基密度。實(shí)施例4
稱取實(shí)施例2中經(jīng)環(huán)氧基活化的聚乙二醇2000 30g，加入50mL乙二胺，再加入75mL去離子水，調(diào)節(jié)pH為13，于30°C、160rpm反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定其氨基密度，測(cè)定方法同實(shí)施例3。實(shí)施例5
稱取實(shí)施例3中經(jīng)氨基化的硅膠20g于50mL離心管中，加入小麥胚芽脂肪酶粗酶粉5g(含酶質(zhì)量1. 32g，摩爾量為3. 14X 10_5mol)，再加入20mL pH為5. O的磷酸緩沖液和456mg EDC(摩爾量為2. 38X1(T3 mol，EDC與酶的摩爾比為76:1)，混合均勻后，取O.1mL上清測(cè)定吸附前蛋白濃度C1，然后于旋轉(zhuǎn)混合培養(yǎng)器中旋轉(zhuǎn)吸附，轉(zhuǎn)速為30rpm，吸附溫度為40C，吸附時(shí)間為8h。吸附結(jié)束后，取O.1mL上清，測(cè)定其蛋白濃度C2,然后倒去上清，用O.1MPH為7. O的磷酸緩沖液清洗載體表面未吸附的酶，然后真空抽濾得到干燥的固定于硅膠上的小麥胚芽脂肪酶(固定化WGLl )。準(zhǔn)確稱取固定化WGLl 50mg測(cè)定其水解酶活。酶活通過(guò)酶對(duì)三乙酸甘油酯的水解能力來(lái)表征。測(cè)定方法為稱取34. 15g三乙酸甘油酯，加入500mL pH為7. 4的25mM磷酸緩沖液，用高速勻漿機(jī)IOOOOrpm混勻成微乳液，向50mL具塞三角瓶中加入5mL微乳液，7. 5mL緩沖液，預(yù)熱lOmin，后加入50mg固定化WGL1，于37°C、200rpm下反應(yīng)Ih后，用95%乙醇終止反應(yīng)，然后用O. 05M NaOH滴定產(chǎn)生的酸量。酶活大小定義為每克固定化酶Ih內(nèi)產(chǎn)生乙酸的μ mol數(shù)。實(shí)施例6
稱取實(shí)施例4中經(jīng)乙二胺活化后的聚乙二醇20g，加入小麥胚芽脂肪酶粗酶粉15g (含酶3. 96g，摩爾量為9. 42X10_5mol)，并加入20mL磷酸緩沖溶液和22. 80mg EDC (摩爾量為1·19Χ1(Γ4 mol，EDC 與酶的摩爾比為1. 3:1)和 20. 44mg NHS (摩爾量為 9· 42X l(T5mol，與酶的摩爾比為1:1)，然后于旋轉(zhuǎn)混合培養(yǎng)器中旋轉(zhuǎn)吸附，轉(zhuǎn)速為30rpm，吸附溫度為25°C，吸附時(shí)間為24h。。吸附結(jié)束后，測(cè)定其蛋白吸附量和固定于聚乙二醇上小麥胚芽脂肪酶(固定化WGL2)的水解酶活，測(cè)定方法同實(shí)施例5。上述實(shí)施例中測(cè)得到的硅膠對(duì)小麥胚芽脂肪酶的最大靜態(tài)吸附量、以及固定化載體和固定化酶的參數(shù)分別如圖1、表I和表2所示。表I固定化載體相關(guān)參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種小麥胚芽脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟為 (1)用環(huán)氧氯丙烷活化載體，活化時(shí)添加水溶性助溶劑，使載體帶上環(huán)氧基； 所述載體為硅膠、瓊脂糖、殼聚糖、葡聚糖、聚乙二醇中的一種或幾種的混合物；載體在使用前需經(jīng)濃鹽酸浸泡后，用大量去離子水洗滌，抽濾干燥后待用； 所述水溶性助溶劑選用二甲亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、二氧六環(huán)、乙腈、丙酮、正己烷中的一種或幾種的混合物；環(huán)氧氯丙烷與載體的摩爾比為1-20:1 ;助溶劑加入量占總體系體積的5%-40%，環(huán)氧氯丙烷活化載體的溫度為30-50°C，活化時(shí)間為l_8h ； 載體與小麥胚芽脂肪酶的質(zhì)量比為1-100:1 ; (2)用一種帶有氨基的化合物將步驟(I)已活化載體上的環(huán)氧基打開(kāi)，使載體帶上連接基團(tuán)，即使環(huán)氧基在堿性條件下發(fā)生水解，形成氨基； 所述帶有氨基的化合物選用氨水、1，2- 二氨基乙烷、3，3’- 二氨基二丙烷、1，6-己二胺、6-氨基己酸中的一種； 氨基化合物與環(huán)氧基摩爾比為1-100:1，氨基化溫度為30-50°C，控制反應(yīng)pH為12-14，控制轉(zhuǎn)速為100-200rpm ； (3)步驟(2)獲得的載體通過(guò)連接物與小麥胚芽脂肪酶共價(jià)連接； 所述連接物為碳化二亞胺EDC、碳化二亞胺EDC與N-羥基琥珀酰亞胺NHS混合物、碳化二亞胺EDC與N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)混合物中的一種； 連接物與小麥胚芽脂肪酶的摩爾比為1-100:1，交聯(lián)溫度為4-25°C，交聯(lián)的pH為5.0-9. 0，交聯(lián)時(shí)間為2-24h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥胚芽脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟(I)中，選用的助溶劑為二甲亞砜，其效果最佳，助溶劑加入量占總體系體積的10%-15% ;環(huán)氧氯丙烷活化載體溫度為40°C ;活化時(shí)間控制在2-4h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥胚芽脂肪酶的固定化方法，其特征在于步驟(3)中，連接物與小麥胚芽脂肪酶的交聯(lián)溫度控制在4-10°C，pH控制在5-8。
4.一種固定化小麥胚芽脂肪酶，其特征在于，由權(quán)利要求1、2或3之一所述的小麥胚芽脂肪酶固定化方法制備而成。
全文摘要
一種小麥胚芽脂肪酶的固定化方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括以下步驟(1)用環(huán)氧氯丙烷活化載體，使載體帶上環(huán)氧基；(2)用一種化合物將(1)中載體上的活化基團(tuán)打開(kāi)，載體帶上連接基團(tuán)；(3)將步驟(2)獲得的載體通過(guò)連接物與小麥胚芽脂肪酶共價(jià)連接。本發(fā)明中固定化載體修飾和載體與酶共價(jià)結(jié)合條件溫和，過(guò)程簡(jiǎn)單。通過(guò)該固定化方法大大提高了小麥胚芽脂肪酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用次數(shù)，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N11/10GK103045580SQ20121056090
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者夏小樂(lè), 辛瑜, 溫小榮, 楊繼國(guó), 王武 申請(qǐng)人:江南大學(xué)