專利名稱：乳桿菌深凍產(chǎn)品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌的深凍干粉制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
深凍發(fā)酵劑產(chǎn)品存在生產(chǎn)成本低、活力強、穩(wěn)定性好、貯存期長的優(yōu)點。需要克服的技術(shù)難題是如何增加前期高密度培養(yǎng)的活 菌數(shù)和后期深凍的存活率。針對上述技術(shù)難題，本發(fā)明專利采用分子營養(yǎng)、發(fā)酵過程參數(shù)和深凍菌體保護優(yōu)化技術(shù)優(yōu)化出高密度培養(yǎng)基的組成、發(fā)酵過程參數(shù)控制模式和菌體深凍保護劑的組成和控制模式，有效的解決了上述技術(shù)難題。嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌都屬于乳酸菌，革蘭氏染色陽性、無芽孢桿菌，在其凍干制劑的生產(chǎn)中，存在菌體死亡率較高及穩(wěn)定性能差的缺點，致使產(chǎn)品中活菌含量少、用量大、發(fā)酵效果差，制造和使用成本均較高。本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其深凍產(chǎn)品的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
具體技術(shù)方案一特別優(yōu)選的一種培養(yǎng)基，一種在制備嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品過程中使用的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由以下組分及用量配制而成80-120g的脫脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25-30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸 丐、2. Omg的核黃素及1. Omg鹽酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;其中，優(yōu)選尿嘧啶和黃嘌呤的比例為1:2 ;生物素和葉酸的比例為1:1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為1:3，培養(yǎng)基中的NaCl是在發(fā)酵進行到8h時添加到發(fā)酵液中的；上述配比帶來了難以預(yù)料的技術(shù)效果。普通常規(guī)培養(yǎng)基也適用于本發(fā)明。具體技術(shù)方案二 深凍保護劑，其組成及配制25g的脫脂乳粉、2g的斯盤60、IOg的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1. 5g的維生素C，5g的甘油、O. 5g的細胞松弛素B，將上述保護劑的干粉和液體直接加入到發(fā)酵液中，上述保護劑中的干粉采用輻照的方式進行滅菌，液體采用濕熱的方式滅菌，將此混合物在Γ Ο 的環(huán)境中放置12h。具體技術(shù)方案三嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品的制備方法，按以下步驟進行1、高密度培養(yǎng)
將經(jīng)過活化的菌株以2%的接種量接種于滅菌的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中PH采用兩段式，總發(fā)酵時間10h，第一階段將發(fā)酵液的pH用質(zhì)量濃度10%的氨水控制在6. 0-6. 5，發(fā)酵7. Oh ;第二階段不控制發(fā)酵液的pH，發(fā)酵3. Oh ;發(fā)酵過程中采用變溫培養(yǎng)模式，第一階段將發(fā)酵溫度控制在42. 5-45°C，發(fā)酵3. 5h ;第二階段將發(fā)酵溫度控制在35-37°C，發(fā)酵3. 5h ;第三階段將發(fā)酵溫度控制在37-40°C，發(fā)酵3h ;其中所述培養(yǎng)基為80-120g的脫脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25-30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸 丐、2. Omg的核黃素及1. Omg鹽酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在發(fā)酵過程中攪拌速度為120rpm，直至發(fā)酵結(jié)束。此外，培養(yǎng)基中的NaCl是在發(fā)酵進行到8h時添加到發(fā)酵液中的。2、洗脫
發(fā)酵液在O 20°C時,加入與發(fā)酵液等重量的質(zhì)量濃度為15%的朽1檬酸鈉溶液或質(zhì)量濃度為15%的磷酸鈉溶液對發(fā)酵液進行蛋白洗脫。3、富集
洗脫結(jié)束后，將發(fā)酵液的溫度降至4°C，依次采用膜過濾、連續(xù)式離心進行濃縮，具體膜濃縮操作為用孔徑為100 200nm、面積為1. Om2的陶瓷膜，在跨膜壓力為150KPa進行膜濃縮處理，至發(fā)酵液的濃縮倍數(shù)達到3 ;離心濃縮具體為以30kg/min的進料量用連續(xù)自動 出料離心機式進行離心濃縮，控制出料量為5kg/min ；
4、菌體的深凍保護
將上述獲得的發(fā)酵液與深凍保護劑以質(zhì)量比為10 Γ10 2進行混合，然后進行冷貯。保護劑的組成為25g的脫脂乳粉、2g的斯盤60、IOg的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1. 5g的維生素C，5g的甘油、O. 5g的細胞松弛素B，將上述保護劑的干粉和液體直接加入到發(fā)酵液中，上述保護劑中的干粉采用輻照的方式進行滅菌液體采用濕熱的方式滅菌，將此混合物在4 10°C的環(huán)境中放置12h。5、菌體的深凍
將混合物以3°C /min的降溫速率于4°C降至_20°C，保持5min ;將混合物以4°C /min的降溫速率于_20°C降至_60°C，保持20min。6、菌體的包裝、貯藏與運輸
將深凍產(chǎn)品在_60°C的粉碎機中粉碎后包裝于滅菌的鋁箔袋中，于_80°C的環(huán)境中貯藏，運輸時采用充有液氮或干冰的保溫箱進行運輸。對于乳酸菌的高密度培養(yǎng)而言，要想獲得較高的活菌數(shù)，需要對主要發(fā)酵過程參數(shù)溫度和PH進行優(yōu)化，單獨使用兩段式的溫度控制模式而不對pH進行優(yōu)化控制會導(dǎo)致在發(fā)酵過程中出現(xiàn)代謝產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致乳酸菌的生長和繁殖受到抑制。單獨使用兩段式的PH控制模式而不對溫度進行優(yōu)化控制會導(dǎo)致由于溫度不是菌體細胞的最佳生長模式，而造成乳酸菌的生長率過高或過低。此外，PH和溫度不是兩個孤立的因素，而是相互影響的因素。因此單獨使用獨立的兩種培養(yǎng)模式均達不到理想的效果。申請人:先前研究了單一溫度培養(yǎng)模式和變溫培養(yǎng)模式對乳酸菌發(fā)酵活力和生物量的影響，結(jié)果表明采用采用兩階段的溫度控制方式，發(fā)酵初期高溫進行發(fā)酵，后期低溫進行發(fā)酵，與單一溫度發(fā)酵相比，乳酸菌的最大細胞生物量和最高發(fā)酵活力均有所提高。但是，發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)變溫發(fā)酵雖然提高了細胞生物量和最高發(fā)酵活力，但是受PH影響很大，而且在該菌冷凍干燥后發(fā)酵活力和細胞生物量有明顯下降，影響凍干制劑質(zhì)量、提聞了使用成本。在高密度培養(yǎng)過程中，往往通過控制培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的pH值，以解除酸對菌體生長的抑制作用，促進菌株生長。但是該方法當(dāng)菌體濃度達一定的數(shù)量時，中和反應(yīng)將不起作用。因此，本發(fā)明專利采用兩段式的pH控制方式，此外第二階段不控制pH，使菌體細胞處于應(yīng)激的狀態(tài)，從而產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，增加了菌體抵御不良條件的抗性和凍干存活率。最適溫度隨著菌體生長階段變化而改變。溫度通過影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能、細胞結(jié)構(gòu)如細胞膜的流動性和完整性以及胞內(nèi)酶的活性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。較低的接種溫度導(dǎo)致活菌數(shù)量緩慢增加，有利于延長乳酸菌的對數(shù)期和穩(wěn)定期，較高的培養(yǎng)溫度將增加菌體細胞的生長速度。因此，本發(fā)明專利發(fā)酵初期采用較高的發(fā)酵溫度以縮短遲滯期使其快速進行對數(shù)生長期，當(dāng)進入對數(shù)生長期時采用較低的發(fā)酵溫度以延長乳酸菌的對數(shù)生長期，當(dāng)?shù)竭_對數(shù)生長期末期時，采用相對適中的溫度以縮短到達穩(wěn)定期的時間。本發(fā)明專利在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入的甜菜糖蜜和玉米淀粉糖漿中含有的甜菜堿和 多種糖類有效的緩解了乳桿菌在增殖過程中由于高的滲透壓對菌體細胞帶來的損傷并為其生長提供了大量優(yōu)質(zhì)的碳源；尿嘧啶和黃嘌呤直接快速的為乳桿菌合成遺傳物質(zhì)提供了基本成分；生物素、葉酸、尼克酸、泛酸鈣、核黃素和鹽酸硫胺素是乳桿菌生長過程中重要酶的輔助因子，為乳桿菌在增殖過程中快速有效的合成蛋白和脂肪提供了有力的物質(zhì)保障。本發(fā)明專利充分的利用了乳蛋白對菌體細胞的包埋作用、斯盤60對細胞膜的保護作用、海藻糖防止大冰晶的形成和保水作用、甜菜糖蜜降低滲透壓作用及維生素C保持適合的氧化還原電勢的作用，
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出效果
(I)發(fā)明人將影響細菌發(fā)酵的兩個關(guān)鍵因素相結(jié)合，在高密度發(fā)酵過程中采用兩段式pH、三段式變溫相結(jié)合的方式進行發(fā)酵，最大細胞生物量和最高發(fā)酵活力較單獨的兩階段的溫度或單獨的兩段式PH控制方式，得到明顯提高，同時得到的凍干制劑中活菌數(shù)高、穩(wěn)定性好。(2)本發(fā)明更突出的是，在高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加了 25g的NaCl、5g的谷胱甘肽，鹽刺激可以提高乳酸菌脅迫的抗性，因此在發(fā)酵后期向發(fā)酵液中加入一定濃度的NaCl可以有效的增強乳酸菌的抗凍能力，從而增加其深凍期間的存活率。隨著細胞的代謝，自由基可連續(xù)不斷地產(chǎn)生，給細胞帶來一定的損傷，如細胞膜及細胞內(nèi)亞結(jié)構(gòu)成分的膜等。因此，谷胱甘肽作為一種良好的生物抗氧化劑可以有效的增加菌體細胞的深凍期間的存活率。增菌培養(yǎng)基中同時增加了腺嘌呤和尿嘧啶的使用量，為后續(xù)凍干產(chǎn)品的制備過程中增加了功能性益生性乳桿菌的存活率。優(yōu)選配制的培養(yǎng)基與兩段式pH、三段式變溫發(fā)酵的方式相結(jié)合產(chǎn)生了預(yù)料不到的技術(shù)效果。另外，使用其他常規(guī)的培養(yǎng)基，同時采用本申請中所述的兩段式pH、三段式變溫相結(jié)合的方式進行發(fā)酵，也能夠取得好的技術(shù)效果。特別優(yōu)選的深凍保護劑是經(jīng)過通過特定的組分并采用特定的配比，為深凍過程提供有效保護，甘油是常用的冷凍保護劑組分，對菌體細胞在冷凍過程中有很強的保護作用，但是其在冷凍干燥過程中不容易干燥，因此，更適合于作為不需要干燥的深凍保護劑。在上述保護體系的基礎(chǔ)上為了進一步增強菌體細胞的抗凍性能，本發(fā)明專利還向保護體系中加入了對菌體細胞具有良好保護作用的甘油和對菌體細胞骨架具有保護作用的細胞松弛素B。上述保護體系減輕了低溫深凍對菌體的損傷，此外，在發(fā)酵后期向發(fā)酵液中加入一定濃度的NaCl并在低溫深凍前將菌體置于低溫下，使菌體產(chǎn)生應(yīng)激蛋白和抗凍蛋白，也有效的提高了菌體的深凍存活率。細胞骨架是位于細胞核和細胞膜內(nèi)側(cè)面的一種纖維狀蛋白基質(zhì)，提高細胞骨架在玻璃化冷凍過程中的穩(wěn)定性將有可能提高乳酸菌冷凍的存活率以及生長繁殖潛力。細胞松弛素B是一種細胞骨架穩(wěn)定劑，可以阻止細胞內(nèi)蛋白的聚集，因此有效的提高了細胞的冷凍存活率和活性。其它常規(guī)深凍保護劑也可以被用于本發(fā)明。所得深凍產(chǎn)品產(chǎn)品，經(jīng)測試其中活菌數(shù)為5.2X10nCFU/g，本專利技術(shù)產(chǎn)品在凍藏的條件下可保存I年，活菌數(shù)不低于lX10ncfU/g。在高密度培養(yǎng)過程中，上述乳酸菌在優(yōu)化的單一溫度(42. 5°C)和pH (6. 2)的條件下培養(yǎng)的活菌數(shù)為2. 2X 108CFU/mL。兩段式變溫培養(yǎng)pH(6. 2)。第一階段(42. 5-45. 0°C),第二階段(35-37°C)的條件下培養(yǎng)的活菌數(shù)為8. 7X 108CFU/mL。與單一的溫度和pH培養(yǎng)模式相比,活菌數(shù)增加了 3. 9倍。本申 請中的兩段式pH、三段式變溫相結(jié)合的發(fā)酵方式中進行乳酸菌的高密度培養(yǎng)，乳酸菌的活菌數(shù)為7. 6X 109CFU/mL。與單一的培養(yǎng)模式相比活菌數(shù)增加了 34. 5倍，與兩段式變溫培養(yǎng)模式相比活菌數(shù)增加了 8. 7倍。兩段式pH、三段式變溫相結(jié)合的發(fā)酵方式與“兩段式變溫”的培養(yǎng)模式及常規(guī)單一溫度和PH的培養(yǎng)模式的活菌數(shù)相比差異顯著(P < O. 001)。
具體實施例方式
實施例1、一種在制備嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品過程中使用的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由以下組分及用量配制而成80g的脫脂乳粉，50g的甜菜糖蜜，40g的玉米淀粉糖漿、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黃素及1. Omg鹽酸硫胺素加入蒸餾水并定容至IOOOmL ;其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為1:2 ;生物素和葉酸的比例為1:1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為1:3，培養(yǎng)基中的NaCl是在發(fā)酵進行到8h時添加到發(fā)酵液中的。實施例2 —種在制備嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品過程中使用的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由以下組分及用量配制而成120g的脫脂乳粉，70g的甜菜糖蜜，60g的玉米淀粉糖楽；、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿喃唳和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黃素及1. Omg鹽酸硫胺素加入蒸餾水并定容至IOOOmL ;其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為1:2 ;生物素和葉酸的比例為1:1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為1:3，培養(yǎng)基中的NaCl是在發(fā)酵進行到8h時添加到發(fā)酵液中的。實施例3、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品的制備方法，按以下步驟進行
一、高密度培養(yǎng)
將經(jīng)過活化的菌株以2%的接種量接種于滅菌的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中pH采用兩段式，總發(fā)酵時間10h，第一階段將發(fā)酵液的pH用質(zhì)量濃度10%的氨水控制在6. 0，發(fā)酵7. Oh ;第二階段不控制發(fā)酵液的pH，發(fā)酵3. Oh ;發(fā)酵過程中采用變溫培養(yǎng)模式，第一階段將發(fā)酵溫度控制在42. 5°C，發(fā)酵3. 5h ;第二階段將發(fā)酵溫度控制在35°C，發(fā)酵3. 5h ;第三階段將發(fā)酵溫度控制在37°C，發(fā)酵3h ;其中所述培養(yǎng)基為80-120g的脫脂乳粉，50_70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25_30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿卩密唳和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黃素及1. Omg鹽酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在發(fā)酵過程中攪拌速度為120rpm,直至發(fā)酵結(jié)束。此外，培養(yǎng)基中的NaCl是在發(fā)酵進行到8h時添加到發(fā)酵液中的。二、洗脫
發(fā)酵液在O 20°C時,加入與發(fā)酵液等重量的質(zhì)量濃度為15%的朽1檬酸鈉溶液或質(zhì)量濃度為15%的磷酸鈉溶液對發(fā)酵液進行蛋白洗脫。三、富集
洗脫結(jié)束后，將發(fā)酵液的溫度降至4°C，依次采用膜過濾、連續(xù)式離心進行濃縮，具體膜濃縮操作為用孔徑為100 200nm、面積為1. 0m2的陶瓷膜，在跨膜壓力為150KPa進行膜 濃縮處理，至發(fā)酵液的濃縮倍數(shù)達到3 ;離心濃縮具體為以30kg/min的進料量用連續(xù)自動出料離心機式進行離心濃縮，控制出料量為5kg/min ；
四、菌體的深凍保護
將上述獲得的發(fā)酵液與深凍保護劑以質(zhì)量比為10 Γ10 2進行混合，然后進行冷貯。保護劑的組成為25g的脫脂乳粉、2g的斯盤60、IOg的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1. 5g的維生素C，5g的甘油、O. 5g的細胞松弛素B，將上述保護劑的干粉和液體直接加入到發(fā)酵液中，上述保護劑中的干粉采用輻照的方式進行滅菌液體采用濕熱的方式滅菌，將此混合物在4 10°C的環(huán)境中放置12h。五、菌體的深凍
將混合物以3°C /min的降溫速率于4°C降至_20°C，保持5min ;將混合物以4°C /min的降溫速率于_20°C降至_60°C，保持20min。六、菌體的包裝、貯藏與運輸
將深凍產(chǎn)品在_60°C的粉碎機中粉碎后包裝于滅菌的鋁箔袋中，于_80°C的環(huán)境中貯藏，運輸時采用充有液氮或干冰的保溫箱進行運輸。實施例4、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品的制備方法，按以下步驟進行
一、高密度培養(yǎng)
將經(jīng)過活化的菌株以2%的接種量接種于滅菌的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中pH采用兩段式，總發(fā)酵時間10h，第一階段將發(fā)酵液的pH用質(zhì)量濃度10%的氨水控制在6. 5，發(fā)酵7. Oh ;第二階段不控制發(fā)酵液的pH，發(fā)酵3. Oh ;發(fā)酵過程中采用變溫培養(yǎng)模式，第一階段將發(fā)酵溫度控制在45°C，發(fā)酵3. 5h ;第二階段將發(fā)酵溫度控制在37°C，發(fā)酵3. 5h ;第三階段將發(fā)酵溫度控制在40°C，發(fā)酵3h ;其中所述培養(yǎng)基為80-120g的脫脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25_30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿卩密唳和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黃素及1. Omg鹽酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在發(fā)酵過程中攪拌速度為120rpm,直至發(fā)酵結(jié)束。此外，培養(yǎng)基中的NaCl是在發(fā)酵進行到8h時添加到發(fā)酵液中的。二、洗脫
發(fā)酵液在O 20°C時,加入與發(fā)酵液等重量的質(zhì)量濃度為15%的朽1檬酸鈉溶液或質(zhì)量濃度為15%的磷酸鈉溶液對發(fā)酵液進行蛋白洗脫。三、富集洗脫結(jié)束后，將發(fā)酵液的溫度降至4°C，依次采用膜過濾、連續(xù)式離心進行濃縮，具體膜濃縮操作為用孔徑為100 200nm、面積為1. 0m2的陶瓷膜，在跨膜壓力為150KPa進行膜濃縮處理，至發(fā)酵液的濃縮倍數(shù)達到3 ;離心濃縮具體為以30kg/min的進料量用連續(xù)自動出料離心機式進行離心濃縮，控制出料量為5kg/min ；
四、菌體的深凍保護
將上述獲得的發(fā)酵液與深凍保護劑以質(zhì)量比為10 Γ10 2進行混合，然后進行冷貯。保護劑的組成為25g的脫脂乳粉、2g的斯盤60、10g的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1. 5g的維生素C，5g的甘油、O. 5g的細胞松弛素B，將上述保護劑的干粉和液體直接加入到發(fā)酵液中，上述保護劑中的干粉采用輻照的方式進行滅菌液體采用濕熱的方式滅菌，將此混合物在4 10°C的環(huán)境中放置12h。
五、菌體的深凍
將混合物以3°C /min的降溫速率于4°C降至_20°C，保持5min ;將混合物以4°C /min的降溫速率于_20°C降至_60°C，保持20min。六、菌體的包裝、貯藏與運輸
將深凍產(chǎn)品在_60°C的粉碎機中粉碎后包裝于滅菌的鋁箔袋中，于_80°C的環(huán)境中貯藏，運輸時采用充有液氮或干冰的保溫箱進行運輸。實施例5、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品的制備方法，按以下步驟進行
一、高密度培養(yǎng)
將經(jīng)過活化的菌株以2%的接種量接種于滅菌的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中pH采用兩段式，總發(fā)酵時間10h，第一階段將發(fā)酵液的pH用質(zhì)量濃度10%的氨水控制在6. 3，發(fā)酵7. Oh ;第二階段不控制發(fā)酵液的pH，發(fā)酵3. Oh ;發(fā)酵過程中采用變溫培養(yǎng)模式，第一階段將發(fā)酵溫度控制在43. 5°C，發(fā)酵3. 5h ;第二階段將發(fā)酵溫度控制在36°C，發(fā)酵3. 5h ;第三階段將發(fā)酵溫度控制在38°C，發(fā)酵3h ;其中所述培養(yǎng)基為80-120g的脫脂乳粉，50_70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25-30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿卩密唳和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黃素及1. Omg鹽酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在發(fā)酵過程中攪拌速度為120rpm,直至發(fā)酵結(jié)束。此外，培養(yǎng)基中的NaCl是在發(fā)酵進行到8h時添加到發(fā)酵液中的。二、洗脫
發(fā)酵液在O 20°C時,加入與發(fā)酵液等重量的質(zhì)量濃度為15%的朽1檬酸鈉溶液或質(zhì)量濃度為15%的磷酸鈉溶液對發(fā)酵液進行蛋白洗脫。三、富集
洗脫結(jié)束后，將發(fā)酵液的溫度降至4°C，依次采用膜過濾、連續(xù)式離心進行濃縮，具體膜濃縮操作為用孔徑為100 200nm、面積為1. 0m2的陶瓷膜，在跨膜壓力為150KPa進行膜濃縮處理，至發(fā)酵液的濃縮倍數(shù)達到3 ;離心濃縮具體為以30kg/min的進料量用連續(xù)自動出料離心機式進行離心濃縮，控制出料量為5kg/min ；
四、菌體的深凍保護
將上述獲得的發(fā)酵液與深凍保護劑以質(zhì)量比為10 Γ10 2進行混合，然后進行冷貯。保護劑的組成為25g的脫脂乳粉、2g的斯盤60、IOg的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1.5g的維生素C，5g的甘油、O. 5g的細胞松弛素B，將上述保護劑的干粉和液體直接加入到發(fā)酵液中，上述保護劑中的干粉采用輻照的方式進行滅菌液體采用濕熱的方式滅菌，將此混合物在4 10°C的環(huán)境中放置12h。五、菌體的深凍
將混合物以3°C /min的降溫速率于4°C降至_20°C，保持5min ;將混合物以4°C /min的降溫速率于_20°C降至_60°C，保持20min。六、菌體的包裝、貯藏與運輸
將深凍產(chǎn)品在_60°C的粉碎機中粉碎后包裝于滅菌的鋁箔袋中，于_80°C的環(huán)境中貯藏，運輸時采用充有液氮或干冰的保溫箱進行運輸。
權(quán)利要求
1.一種在制備嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品過程中使用的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由以下組分及用量配制而成將80-120g的脫脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖漿、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25_30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸鈣、2. Omg的核黃素及1. Omg鹽酸硫胺素加入蒸餾水并定容至IOOOmL ;其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為1:2 ;生物素和葉酸的比例為1:1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為1:3，培養(yǎng)基中的NaCl是在發(fā)酵進行到8h時添加到發(fā)酵液中的。
2.嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品的制備方法，按以下步驟進行 一、高密度培養(yǎng) 將按常規(guī)方法活化的嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌以2%的接種量接種于滅菌的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵過程中PH采用兩段式，總發(fā)酵時間10h，第一階段將發(fā)酵液的PH用質(zhì)量濃度10%的氨水控制在6. 0-6. 5，發(fā)酵7. Oh ;第二階段不控制發(fā)酵液的PH，發(fā)酵3. Oh ;發(fā)酵過程中采用變溫培養(yǎng)模式，第一階段將發(fā)酵溫度控制在42. 5-45°C,發(fā)酵3. 5h ;第二階段將發(fā)酵溫度控制在35-37°C，發(fā)酵3. 5h ;第三階段將發(fā)酵溫度控制在37-40°C，發(fā)酵3h ;其中所述培養(yǎng)基為80-120g的脫脂乳粉，50_70g的甜菜糖蜜，40_60g的玉米淀粉糖漿、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25_30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黃嘌呤、O. 005mg的生物素和葉酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黃素及1. Omg鹽酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在發(fā)酵過程中攪拌速度為120rpm,直至發(fā)酵結(jié)束；其中，尿嘧啶和黃嘌呤的比例為1:2 ;生物素和葉酸的比例為1:1 ;尼克酸和泛酸鈣的比例為1:3，培養(yǎng)基中的NaCl是在發(fā)酵進行到8h時添加到發(fā)酵液中的；此外，培養(yǎng)基中的NaCl是在發(fā)酵進行到8h時添加到發(fā)酵液中的； 二、洗脫 三、富集 四、菌體的深凍保護 將步驟三獲得的菌體濃縮物與深凍保護劑以質(zhì)量比為10 Γ10 2進行混合，將此混合物在Γ Ο 的環(huán)境中放置12h ;其中深凍保護劑的組成為25g的脫脂乳粉、2g的斯盤60、IOg的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1. 5g的維生素C，5g的甘油、O. 5g的細胞松弛素B，將深凍保護劑中的各組分滅菌后直接加入到發(fā)酵液中； 五、菌體的深凍 將步驟四獲得的混合物以3°C /min的降溫速率于4°C降至_20°C，保持5min ;將混合物以4°C /min的降溫速率于-20°C降至_60°C，保持20min ； 六、菌體的包裝、貯藏與運輸 將深凍產(chǎn)品在_60°C的粉碎機中粉碎后包裝于滅菌的鋁箔袋中，于_80°C的環(huán)境中貯藏，運輸時采用充有液氮或干冰的保溫箱進行運輸；
3、根據(jù)權(quán)利要求2任一項所述的方法，其中所述的洗脫步驟具體為發(fā)酵液在O 20°C時，加入與發(fā)酵液等重量的質(zhì)量濃度為15%的檸檬酸鈉溶液或質(zhì)量濃度為15%的磷酸鈉溶液對發(fā)酵液進行蛋白洗脫；
4、根據(jù)權(quán)利要求3任一項所述的方法，其中所述的富集步驟具體為洗脫結(jié)束后，將發(fā)酵液的溫度降至4°C，依次采用膜過濾、連續(xù)式離心進行濃縮，具體膜濃縮操作為用孔徑為100 200nm、面積為1. Om2的陶瓷膜，在跨膜壓力為150KPa進行膜濃縮處理，至發(fā)酵液的濃縮倍數(shù)達到3 ;離心濃縮具體為以30kg/min的進料量用連續(xù)自動出料離心機式進行離心濃縮，控制出料量為5kg/min ；
5、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌的深凍產(chǎn)品，按權(quán)利要求1-4任一項所述的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌的深凍制品的制備方法；提供了一種在制備嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌深凍產(chǎn)品過程中使用的培養(yǎng)基；發(fā)明人將影響細菌發(fā)酵的兩個關(guān)鍵因素相結(jié)合，創(chuàng)造性地在高密度發(fā)酵過程中采用兩段式pH、三段式變溫相結(jié)合的方式進行發(fā)酵，最大細胞生物量和最高發(fā)酵活力較單一方式得到明顯提高，同時得到的凍干制劑中活菌數(shù)高、穩(wěn)定性好。還提供了一種優(yōu)良的深凍保護劑。
文檔編號C12N1/04GK103013832SQ20121056105
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者張?zhí)m威, 馮鎮(zhèn), 韓雪, 杜明, 易華西, 張莉麗, 張英春, 單毓娟, 范榮波 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)