殼聚糖酶的純化、基因克隆及其酶學特性的鑒定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明殼聚糖酶的純化、基因克隆及其酶學特性的鑒定是從被污染的酵母培養(yǎng)液中分離到一菌株，經(jīng)鑒定為一種革蘭氏陽性桿菌，其所分泌的主要蛋白產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定了它的N-端氨基酸序列，與已知的幾種內(nèi)切殼聚糖酶十分類同。根據(jù)其同源DNA序列，通過PCR方法克隆了其全長基因。該菌株生長極快，其組成型分泌產(chǎn)物主要為內(nèi)切殼聚糖酶。該酶通過疏水層析和分子篩兩步即得到純化。進一步研究了該酶的酶學性質(zhì)及其催化殼聚糖降解為殼寡糖的條件。提高該殼聚糖酶的產(chǎn)率后，有望用于殼寡糖的生產(chǎn)，有實際應(yīng)用價值。
【專利說明】殼聚糖酶的純化、基因克隆及其酶學特性的鑒定
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株革蘭氏陽性桿菌，該菌分泌一種殼聚糖酶，特別涉及對該殼聚糖酶的純化、基因克隆及其酶學特性的鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002]幾丁質(zhì)(chitin)主要是N-乙酰葡萄糖胺通過β-1，4_糖苷鍵形成的鏈狀多聚物，主要存在于水生甲殼動物、軟體動物和節(jié)肢動物的外殼中(如蝦、蟹等)，每年產(chǎn)量超過10億噸，僅次于纖維素，是一類豐富的自然資源。但幾丁質(zhì)不溶于常用溶劑，直接利用非常困難。將丁質(zhì)用堿液處理后得到脫乙?；a(chǎn)物(脫乙酰度為65%~99%，以70%~80%最常見)，即殼聚糖(chitosan)。殼聚糖在自然界中也存在，主要在一些真菌和一些綠藻的細胞壁中。但目前生產(chǎn)中應(yīng)用的殼聚糖基本上是幾丁質(zhì)的脫乙?；a(chǎn)物。與幾丁質(zhì)相比，殼聚糖可溶于酸性溶劑并帶正電荷，可用于食品、制藥、紡織、污水處理等行業(yè)。殼聚糖可進一步通過化學法或酶法降解成殼寡糖(一般由幾個到十幾個糖殘基組成)。殼寡糖的水溶性好，而且具有多種生物活性，例如可以抑制細菌和真菌生長，具有抗腫瘤與調(diào)節(jié)免疫活性，可增強植物抗病性等。所以殼寡糖的研究近年來受到越來越多的重視，可能成為一個新興產(chǎn)業(yè)。
[0003]殼聚糖酶(chit0SanaSe，EC 3.2.1.123)可以水解殼聚糖中的β_1，4_糖苷鍵，將殼聚糖降解。已發(fā)現(xiàn)的殼聚糖酶絕大部分為內(nèi)切酶，可以將殼聚糖降解為殼寡糖。目前研究最多的是來源于細菌和真菌的殼聚糖酶。相對于化學水解法，利用殼聚糖酶酶解生產(chǎn)殼寡糖有其獨特的優(yōu)勢，例如殼寡糖的得率高，對環(huán)境污染小等。但其前提是要開發(fā)出廉價的殼聚糖酶，所以尋找合適的殼聚糖酶對酶解法生產(chǎn)殼寡糖非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于得到了一株革蘭氏陽性桿菌，該菌分泌一種殼聚糖酶，能夠降解殼聚糖得到殼聚二糖和殼聚三糖。
[0005]我們從被污染的酵母培養(yǎng)液中分離到一雜菌，為革蘭氏陽性桿菌，其分泌的主要蛋白產(chǎn)物，經(jīng)分離純化后，測定其N-端氨基酸序列與已知的幾種殼聚糖酶極相似，據(jù)此克隆了其全長基因，并研究其酶學性質(zhì)。該酶能快速高效地將殼聚糖降解為殼寡糖，由于該桿菌生長快，主要分泌產(chǎn)物為殼聚糖酶，有望用于殼寡糖的生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1:Bacillus sp.ΤΚ-02 革蘭氏染色。
[0007]圖2 =SDS-PAGE分析發(fā)酵上清(A)和純化產(chǎn)物(B):M為蛋白分子量標準；
[0008]Sup為發(fā)酵上清；1為初步純化產(chǎn)物；2為二次純化產(chǎn)物。
[0009]圖3 =HPLC進行純度鑒定結(jié)果。
[0010]圖4:電噴霧質(zhì)譜進行分子質(zhì)量測定結(jié)果?！揪唧w實施方式】:
[0011]實施例1:
[0012]殼聚糖酶生產(chǎn)菌株的培養(yǎng):我們從被污染的酵母培養(yǎng)液中分離到一雜菌，革蘭氏染色以及形態(tài)觀察表明它是一種革蘭氏陽性桿菌(圖1)，暫命名為Bacillussp.TK-02。該菌株先在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜(30°C )，然后挑取單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中于30°C震蕩培養(yǎng)24h。將菌液離心(5000g，IOmin)，收集上清。
[0013]實施例2:
[0014]殼聚糖酶的純化與N-端氨基酸序列測定:該菌發(fā)酵液上清組成相對簡單，分泌表達產(chǎn)物主要為該殼聚糖酶(圖2A)。將培養(yǎng)液上清濃縮后進行分離純化，首先用疏水層析的方法將該殼聚糖酶從大體積的發(fā)酵液上清中分離出來，SDS-PAGE鑒定表明該步純化得到的殼聚糖酶主要含有一種分子質(zhì)量較大的雜蛋白(圖2B，lane I)。據(jù)此，再通過分子篩進行純化，便得到了高純度的殼聚糖酶(圖2B，lane2)。該殼聚糖酶的純度進一步用C3反相HPLC進行鑒定。如圖3所示，該酶在HPLC上只有一個峰，其純度大于95%。洗脫的殼聚糖酶用電噴霧質(zhì)譜測定其分子質(zhì)量(圖4):測定的分子質(zhì)量(44017U)與預(yù)期的分子質(zhì)量(45780U)有較大出入，測定的分子質(zhì)量比理論值小1763u。分析該殼聚糖酶的C端序列發(fā)現(xiàn)其含有雙堿性氨基酸(KK)，推測純化到的該殼聚糖酶在該雙堿性氨基酸處被剪切，由此得到的殼聚糖酶的理論分子質(zhì)量為44040U，與測定的分子質(zhì)量基本相符，誤差僅千分之一左右。[0015]在SDS-PAGE上得到單一蛋白條帶，其測定的N-端氨基酸序列為:AAAKEMKPFPQQ。通過網(wǎng)上蛋白質(zhì)序列檢索(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST),找到11條相同的序列，它們都是殼聚糖酶，而且全部來源于桿菌屬(Bacillus)。根據(jù)殼聚糖酶活力測定，我們推測純化到的蛋白是一種殼聚糖酶。
[0016]實施例3:
[0017]殼聚糖酶基因的克隆:根據(jù)其它殼聚糖酶的DNA序列，取其信號肽前及終止信號TAA的保守基因序列,設(shè)計引物如下:Primer I:
[0018]5， _tta_aaaggagctgacaacataat3， ；Primer 2:5， —ttaatatcgtatccttcataaattgca-3’。以菌體基因組DNA為模版，用上述引物進行PCR擴增。擴增出一約1.3kb的序列，再克隆到T-載體后進行DNA序列測定。通過網(wǎng)上檢索(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)其序列與其它11種殼聚糖酶有高度同源，達96 %~98 %，它們在GenBank的編號分別是:AAQ 75085、ZP00240544、AAK 07481、YP 084010、NP 832437、NP845032、BAB 19277、AAQ 75084, AAQ 19679、AA049750和AAQ 19678。它們都屬于糖苷水解酶8家族，而且全部來源于桿菌屬(Bacillus)。該基因編碼453個氨基酸，其中N-端46個殘基為前導(dǎo)肽，在分泌的成熟酶中被切除。
[0019]實施例4:
[0020]殼聚糖酶最適溫度和最適pH的測定:對該殼聚糖酶在不同溫度下的反應(yīng)速度進行了測定。如圖6所示，該酶在65°C活性最高，但在50°C的活性也達到了最大活力的70%。綜合考慮活力與熱穩(wěn)定性，該酶的其它活力測定均在50°C進行，此時該酶既保持較高的活力又比較穩(wěn)定。此外，該殼聚糖酶在ρΗ4.5~ρΗ6.0活力最高，pH低于4.5時活力迅速下降。在PH高于6.0時，由于殼聚糖的溶解度降低，所以測得的酶活力也隨之降低。該酶在酶解反應(yīng)緩沖液中(0.1moI/LNaAc-HAc, pH4.5)于60°C時半衰期很短，只有幾分鐘(雖然在該溫度下活力高)，而在50°C比較穩(wěn)定，半衰期約3h。在室溫下(23°C )，該酶在反應(yīng)緩沖液中(0.lmol/L NaAc-HAc,pH4.5)可保存數(shù)天而活力不喪失。該酶的底物飽和曲線達到最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度約為0.04mg/ml。酶活力測定在不同溫度下進行，底物為
0.5mg/ml殼聚糖(溶于0.lmol/L NaAc-HAc, ρΗ4.5)。殼聚糖酶活力測定在50°C進行，殼聚糖溶解在0.lmol/L NaAc-HAc (pH4.5)緩沖液中。
[0021]測定最適溫度時，將0.5mg/ml殼聚糖溶于0.lmol/L NaAc-HAc，pH4.5緩沖液中作為底物，測定該酶在不同溫度下的反應(yīng)速度。測定最適PH時，先將殼聚糖溶解在0.lmol/LHA c中(0.5mg/ml)，然后用4mol/L NaOH調(diào)到所需pH值。酶解反應(yīng)在50°C下測定。
[0022]實施例5:
[0023]內(nèi)切殼聚糖酶活性的鑒定:內(nèi)切或外切殼聚糖酶活性通過測定殼聚糖溶液黏度判斷，溶液黏度用烏氏黏度計測定。將10mg/ml殼聚糖溶液(溶于0.1moI/LNaAc-HAc, pH4.5)加入到烏氏黏度計中，于50°C水浴預(yù)熱。隨后加入純化的殼聚糖酶，混勻，殼聚糖溶液的粘度迅速下降，30nim內(nèi)下降超過70% ;而此時還原糖的產(chǎn)生量卻很少，約I %。因此可確定該殼聚糖酶為內(nèi)切酶。酶解反應(yīng)在50°C進行，于不同時間測定溶液黏度變化，并在不同時間取樣測定還原糖的生成量。
[0024]實施例6:
[0025]殼聚糖水解產(chǎn)物 的薄層層析分析:于10mg/ml殼聚糖溶液(溶于0.1mol/LNaAc-HAc, pH4.5)中加入一定量的殼聚糖酶(Img殼聚糖酶水解200g殼聚糖)，50°C下保溫反應(yīng)，于不同反應(yīng)時間取樣在硅膠薄板上層析。薄層層析用正丙醇:30%氨水(體積比2: I)展開，用0.1%印三酮(溶于正丙醇飽和水中)顯色。
[0026]該酶水解殼聚糖得到的最終產(chǎn)物為二糖和三糖，而不是單糖。這也進一步說明它是內(nèi)切殼聚糖酶。通過控制酶解時間，可以得到不同鏈長的殼寡糖混合物，即該酶可以用來把殼聚糖轉(zhuǎn)化為殼寡糖，可有望用于殼寡糖的生產(chǎn)。
【權(quán)利要求】
1.一株革蘭氏陽性桿菌，暫命名為Bacillus sp.TK-02。
2.如權(quán)利要求1所述的桿菌(Bacillussp.TK-02),其特征在于 1)該菌生長快； 2)其分泌的主要蛋白產(chǎn)物N-端氨基酸序列與已知的幾種殼聚糖酶極相似； 3)其核酸序列與其它11種殼聚糖酶有高度同源，達96%~98%； 4)能夠非誘導(dǎo)性分泌胞外殼聚糖酶； 5)能夠分泌胞外殼聚糖酶，降解殼聚糖得到二糖和三糖； 6)該酶的反應(yīng)溫度為50°C，在PH4.5~PH6.0時活力最高。
3.一種降解殼聚糖生產(chǎn)二糖和三糖的方法，其特征在于利用生物殼聚糖酶降解殼聚糖。
4.一種以內(nèi)切的方式降 解殼聚糖做種產(chǎn)生殼聚二糖和殼聚三糖。
【文檔編號】C12N1/20GK103881943SQ201210563604
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月24日
【發(fā)明者】楊艷菊, 何勝祥 申請人:蘇州中同生物科技有限公司