專利名稱：高產(chǎn)葉黃素轉(zhuǎn)基因小球藻及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種高產(chǎn)葉黃素轉(zhuǎn)基因小球藻及其制備方法。
背景技術(shù)：
葉黃素是一種含氧類胡蘿卜素，其在生物體內(nèi)起著十分重要的作用。葉黃素具有抗氧化活性，能夠預(yù)防癌癥、心血管疾病和年齡相關(guān)黃斑變性等疾病。此外，作為一種天然色素，葉黃素可作為食品、醫(yī)藥和保健品的色素添加劑。目前，葉黃素主要來(lái)源于萬(wàn)壽菊，然而由于勞動(dòng)力和土地成本提高，從萬(wàn)壽菊獲取葉黃素受到一定限制。小球藻中含有豐富的葉黃素，而且小球藻具有生長(zhǎng)速度快、可異養(yǎng)培養(yǎng)、易于進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)和藻種改良的優(yōu)點(diǎn)，利用小球藻合成葉黃素越來(lái)越受人們的關(guān)注。目前，應(yīng)用于小球藻轉(zhuǎn)基因的方法有電轉(zhuǎn)化法、基因槍法、PEG-CaCl2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法。其中，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法具有轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)單、成本低，能夠?qū)⒋笃蔚腄NA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，且以低拷貝的形式整合和重組等特點(diǎn)。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)成功應(yīng)用于小球藻Chlorella vulgaris、衣藻、雨生紅球藻、杜氏鹽藻、裂壺藻和微擬球藻等微藻中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因小球藻的方法。本發(fā)明提供的方法，為將IPP異構(gòu)酶編碼基因?qū)肽康男∏蛟逯?，得到轉(zhuǎn)基因小球藻，所述轉(zhuǎn)基因小球藻的葉黃素產(chǎn)量大于所述目的小球藻；所述IPP異構(gòu)酶的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述方法中，所述IPP異構(gòu)酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第545-1093位核苷酸。上述方法中，所述IPP異構(gòu)酶編碼基因以IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒的形式導(dǎo)入目的小球藻；所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒包括CAMV35S啟動(dòng)子、IPP異構(gòu)酶編碼基因和CYCl終止子；所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒的核昔酸序列具體為序列表中的序列I。上述方法中，所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒通過(guò)重組載體導(dǎo)入目的小球藻；所述重組載體為將所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體中得到的載體；所述表達(dá)載體具體為PCAMBIA2301 ;所述重組載體具體為將序列表中序列I插入PCAMBIA2301載體的HindIII和BamH I酶切位點(diǎn)間得到的載體。上述方法中，所述重組載體通過(guò)重組農(nóng)桿菌導(dǎo)入目的小球藻；所述重組農(nóng)桿菌為將所述重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中得到的重組菌。上述目的小球藻為小球藻STI002CGMCC No. 6951。由上述方法得到的轉(zhuǎn)基因小球藻也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
小球藻STI002已于2012年11月30日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCNo. 6951,建議的分類命名為 Chlorella vulgaris。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組載體。本發(fā)明提供的重組載體，為將IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體中得到的載體；所述表達(dá)載體具體為PCAMBIA2301 ；所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒包括CAMV35S啟動(dòng)子、IPP異構(gòu)酶編碼基因和CYCl終止子；所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒的核昔酸序列具體為序列表中的序列I。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌，為將上述的重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中得到的重組菌。上述的轉(zhuǎn)基因小球藻、上述的重組載體或上述的重組菌在制備葉黃素中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)葉黃素的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)無(wú)水乙醇超聲破碎由上述方法得到的轉(zhuǎn)基因小球藻或上述的轉(zhuǎn)基因小球藻，再加入KOH水溶液后超聲皂化，得到溶液A ；2)將所述溶液 A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到葉黃素。上述方法具體如下I)無(wú)水乙醇超聲破碎轉(zhuǎn)基因小球藻30min ;再加入20% (質(zhì)量百分含量)KOH水溶液超聲皂化(超聲功率70%，溫度35°C ) IOmin ;得到溶液A ；2)將溶液A加入二氯甲烷和蒸餾水萃取，收集二氯甲烷相，即得到葉黃素。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒導(dǎo)入野生型小球藻中，得到轉(zhuǎn)基因小球藻，該轉(zhuǎn)基因小球藻的葉黃素含量和野生型小球藻相比最高提高30. 95% ；葉黃素產(chǎn)量和野生型相比最高提高36. 77%，為高產(chǎn)葉黃素小球藻。


圖1為重組質(zhì)粒pCAMBIA2301_idi的構(gòu)建過(guò)程示意2為基因工程小球藻的表型鑒定結(jié)果左圖為小球藻原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后涂布于篩選培養(yǎng)基有藻落長(zhǎng)出，右圖為小球藻原生質(zhì)體未與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)涂布于篩選培養(yǎng)基沒(méi)有藻落長(zhǎng)出圖3為基因工程小球藻在篩選培養(yǎng)基中進(jìn)一步鑒定圖4為PCR驗(yàn)證基因工程小球藻中idi基因的插入情況圖5為PCR驗(yàn)證基因工程小球藻中NPTII基因的插入情況圖6為基因工程小球藻和野生型小球藻的生物量示意7為基因工程小球藻和野生型小球藻的葉黃素含量示意8為基因工程小球藻和野生型小球藻的葉黃素產(chǎn)量示意圖
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特別說(shuō)明，均購(gòu)自常規(guī)生化試劑商店?？寺≥d體pBluescript II SK+ Stratagene, Catalog Number#212205o雙兀載體pCAMBIA2301 CAMBIA, Canberra, Australia。質(zhì)粒pGAPZ a A :1nvitrogen, Catalog Number V205-20。農(nóng)桿菌菌株LBA4404 :1nvitrogen, Catalog Number 18313-015。酶處理液由溶質(zhì)和溶劑組成；溶劑為20mM磷酸鹽緩沖液(pH5. 8);溶質(zhì)及其濃度如下2% (質(zhì)量百分比)纖維素酶,2% (質(zhì)量百分比)蝸牛酶和O. 2M KCl0FC培養(yǎng)基由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其終濃度如下葡萄糖10g/L，胰蛋白胨2g/L，牛肉浸膏 lg/L，酵母浸膏 lg/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 2mg/L。TYNG培養(yǎng)基由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其終濃度如下10g/L蛋白胨、5g/L牛肉浸膏、5g/葡萄糖、O. 2g/L 的 MgSO4 · 7H20，其余為水；pH7. 5。頂培養(yǎng)基由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其終濃度如下=NaCl O. 15g/L、MgSO4 · 7H200. 25g/L、Κ2ΗΡ042· 28g/L、KH2PO4L 36g/L、CaCl2 · H2O 0. 078g/L、FeSO4O. 0025g/L、(NH4) 2S040. 53g/L、葡萄糖1. 98g/L、甘油 0. 54g/L、MES 7. 808g/L ；pH5. 3。篩選培養(yǎng)基由FC培養(yǎng)基、KC1、G418、氨芐青霉素和頭孢霉素組成，KCl的濃度為O. 2mol/L, G418的濃度為450ug/mL，氨芐青霉素的濃度為300ug/mL，頭孢霉素的濃度為300ug/mL。實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pCAMBIA2301_idi的構(gòu)建一、大腸桿菌idi基因的克隆及相關(guān)載體的構(gòu)建1、大腸桿菌idi基因的克隆以大腸桿菌DH5 α為材料，用酚-氯仿法提取大腸桿菌DH5 α基因組；具體如下取500uL DH5a菌液，12000r離心5min，獲得菌體。加650uL裂解液，振蕩2min，放入65°C水浴鍋直至裂解澄清。加入等體積的平衡酚氯仿異戊醇(25:24:1)，振蕩混勻，13000r離心15min。吸上清輕移至新管中，再用等體積的氯仿異戊醇(24:1)抽提一次，13000r離心15min。吸上清移至新管中，加入1/10體積的NaAcJP 2倍體積的無(wú)水乙醇，-20°C放置30min，13000r離心15min，棄上清。用700uL 75%的乙醇洗兩次，室溫開(kāi)蓋放置5min，讓剩余的乙醇揮發(fā)完全。加20uL水溶解，后加O. 5uL RNase，放置于37°C 10分鐘以除去RNA，-20°C保存。根據(jù)genebank公布的大腸桿菌idi基因序列(如序列表的序列I自5’末端第545-1093位核苷酸)，設(shè)計(jì)兩端引物id1-F :5’-GGAATTCATGCAAACGGAACACGTC-3’ ；id1-R :5’-AACTGCAGTTATTTAAGCTGGGTAAATGC-3’。以大腸桿菌DH5 α基因組為模板，id1-F和idi_R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，58°C退火Imin，72°C延伸lmin30s，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)后，72°C延伸15min。得到549bp的PCR產(chǎn)物，即為idi基因。2、重組質(zhì)粒pBS-1di的構(gòu)建I)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Pst I雙酶切上述I得到的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；2)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Pst I雙酶切克隆載體pBluescript IISK+，回收296 Ibp載體骨架；3)將步驟I)的酶切產(chǎn)物和步驟2)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBS-1di。二、重組質(zhì)粒 pCAMBIA2301-1di 的構(gòu)建(I)啟動(dòng)子CAMV35S的獲得設(shè)計(jì)兩端引物CAMV35S-F :5’-CCCAAGCTTCATGGAGTCAAAGATTCA-3’ ；CAMV35S-R :5’-GGAATTCAGTCCCCCGTGTTCTCT-3’。以質(zhì)粒pCAMBIA2301為模板，以CAMV35S-F和CAMV35S-R為模板，PCR擴(kuò)增，得到538bpPCR產(chǎn)物，即為啟動(dòng)子CAMV35S。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)后，72 °C延伸15min。(2)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoR I雙酶切(I) PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoR I雙酶切上述一得到的重組質(zhì)粒pBS_idi，回收4372bp載體骨架。(4)將步驟(2)的酶 切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBS-CAMV35S-1di0(5 )終止子CYCl的獲得以質(zhì)粒pGAPZ a A為模板，CYCl-F和CYCl-R為引物，PCR擴(kuò)增得到318bpPCR產(chǎn)物，即為終止子CYCl。設(shè)計(jì)兩端引物CYCl-F :5’-AACTGCAGCACGTCCGACGGCGGCC-3’ ;CYCl-R:5’-CGGGATCCAGCTTGCAAATTAAAGCCT-3’PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)后，72 °C延伸15min。(6)用限制性內(nèi)切酶Pst I和BamH I雙酶切(5)得到的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(7)用限制性內(nèi)切酶Pst I和BamH I雙酶切(4)得到的重組質(zhì)粒pBS-CAMV35S-1di,回收 4907bp 載體骨架。(8)將步驟(6)的酶切產(chǎn)物和步驟(7)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒PBS-CAMV35S -1d1-CYCl。(9)用限制性內(nèi)切酶HindIII和BanH I雙酶切重組質(zhì)粒pBS_CAMV35S -1d1-CYCl,回收1418bp酶切產(chǎn)物(idi基因表達(dá)盒CAMV35S -1d1-CYCl)；(10)用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamH I雙酶切雙元載體pCAMBIA2301，回收11608bp載體骨架。(11)將步驟(9)的酶切產(chǎn)物和步驟(10)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-1di。重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-1di的結(jié)構(gòu)示意圖及構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖1。將重組質(zhì)粒pCAMBIA2301_idi送去測(cè)序，結(jié)果該質(zhì)粒為將序列表中序列I插入PCAMBIA2301載體的HindIII和BamH I酶切位點(diǎn)間得到的載體。序列表中序列I (idi基因表達(dá)盒CAMV35S -1d1-CYCl)自5’末端第1-538位核苷酸為啟動(dòng)子CAMV35S，自5’末端第545-1093位核苷酸為基因idi，自5’末端第1100-1418位核苷酸為終止子CYCl。實(shí)施例2、高產(chǎn)葉黃素的轉(zhuǎn)idi小球藻的獲得一、轉(zhuǎn)idi小球藻的獲得采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)小球藻的轉(zhuǎn)化，具體如下( I)小球藻原生質(zhì)體的制備小球藻STI002已于2012年11月30日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCNo. 6951,建議的分類命名為 Chlorella vulgaris。挑取小球藻STI002 (CGMCC 6951 ;也稱為野生型小球藻)單藻落接種于FC培養(yǎng)基中，28 °C搖床培養(yǎng)至藻體長(zhǎng)出。以1%的接種量轉(zhuǎn)接于50mL新鮮的FC培養(yǎng)基，28°C搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。以4000rpm的轉(zhuǎn)速4°C離心7min收集藻細(xì)胞，用遇冷的無(wú)菌水洗滌藻細(xì)胞一次后，用預(yù)處理劑(預(yù)處理劑由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶劑為20mM磷酸鹽緩沖液配制(pH5. 8);所述溶質(zhì)及其濃度為50mmol/L EDTA, 25mmol/L DTT)處理 30min。

4000rpm的轉(zhuǎn)速離心7min收集藻細(xì)胞，加入IOmL酶處理液，28 °C搖床消化14小時(shí)，得到小球藻原生質(zhì)體。(2)重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-1di通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌 LBA4404/pCAMBIA2301-1di (HindIII 和 BamH I 酶切，得到 1418bp 的為陽(yáng)性)。(3)挑取重組農(nóng)桿菌LBA4404/pCAMBIA2301-1di至TYNG培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。離心收集菌體，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基頂培養(yǎng)基重懸，調(diào)整農(nóng)桿菌濃度為0D600=0. 6-0. 8加入終濃度為150umol/L的乙酰丁香酮，25°C預(yù)誘導(dǎo)5小時(shí)，收集菌液。(4)離心收集步驟(I)的原生質(zhì)體，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基頂培養(yǎng)基重懸后，加入步驟(3)得到的菌液中，25°C侵染24小時(shí)，得到藻體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)物。(5)離心收集步驟(4)中的藻體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)物，涂布于固體的篩選培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)7天，有藻落長(zhǎng)出，得到轉(zhuǎn)idi小球藻。同時(shí)，以未與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的小球藻原生質(zhì)體做陰性對(duì)照，將其涂布于篩選培養(yǎng)基。與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的藻體涂布于篩選培養(yǎng)基后有藻落(即轉(zhuǎn)idi小球藻)長(zhǎng)出(圖2A),而未與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的藻體涂布于篩選培養(yǎng)基后沒(méi)有藻落長(zhǎng)出(圖2B)。采用同樣的方法將空載體pCAMBIA2301轉(zhuǎn)入小球藻中，得到轉(zhuǎn)空載體小球藻。二、轉(zhuǎn)idi小球藻鑒定及表型分析1、二次篩選和表型鑒定將獲得的轉(zhuǎn)idi小球藻培養(yǎng)后在篩選培養(yǎng)基中劃線，同時(shí)以野生型小球藻和轉(zhuǎn)空載體小球藻做陰性對(duì)照。結(jié)果如圖3所示，Il至17為轉(zhuǎn)idi小球藻藻株，WT為野生型小球藻藻株；可以看出，轉(zhuǎn)idi小球藻能夠在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而野生型小球藻不能生長(zhǎng)。
轉(zhuǎn)空載體小球藻與野生型小球藻的結(jié)果無(wú)顯著差異。2、轉(zhuǎn)idi小球藻分子鑒定PCR驗(yàn)證外源基因在轉(zhuǎn)idi小球藻基因組中的整合情況，具體如下提取轉(zhuǎn)idi小球藻和野生型小球藻的基因，以基因組為模板，分別用引物id1-F/id1-R 和 NPTI1-F/NPTI1-R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。id1-F :5’-GGAATTCATGCAAACGGAACACGTC-3’ ；id1-R :5’-AACTGCAGTTATTTAAGCTGGGTAAATGC-3’。NPTI1-F : 5’-TCACTGAAGCGGGAAGGGACT-3’ ；NPT' I1-R :5’-GCGGCGATACCGTAAAGCAC-3’。PCR反應(yīng)條件為941預(yù)變性51^11，941變性458，581退火lmin，72°C延伸lmin30s，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)后，72°C延伸15min。取5uL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4 (idi基因片段PCR鑒定)和圖5 (NPTII基因片段PCR鑒定)所示，其中，Il至17為轉(zhuǎn)idi小球藻藻株，WT為野生型小球藻藻株；可以看出，轉(zhuǎn)idi小球藻的基因組能夠擴(kuò)增出約549bpidi基因片段，而野生型小球藻的基因組中不能擴(kuò)增出idi基因片段；轉(zhuǎn)idi小球藻的基因組能夠擴(kuò)增出798bpNPTII基因片段，而野生型小球藻的基因組中不能擴(kuò)增出798bpNPTII基因片段。結(jié)果表明，外源 基因已經(jīng)插入小球藻基因組中，進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)idi小球藻構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)空載體小球藻基因組中不能擴(kuò)增出idi基因片段，但能夠擴(kuò)增出798bpNPTII基因片段。3、轉(zhuǎn)idi小球藻生物量的測(cè)定將轉(zhuǎn)idi小球藻、轉(zhuǎn)空載體小球藻和野生型小球藻以5%的量接種于含有IOOmL FC培養(yǎng)基的250mL三角燒瓶中，28°C、180r/min搖床培養(yǎng)5天，得到藻液。將藻液8000r/min離心IOmin收集藻體，除去上清液，藻體冷凍干燥后，稱量干重。結(jié)果如圖6所示，小球藻轉(zhuǎn)化子I1、12、13、14和15的生物量與野生型無(wú)明顯差異，但16和17的生物量和野生型相比有所降低。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)idi基因的轉(zhuǎn)化對(duì)大部分小球藻的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。轉(zhuǎn)空載體小球藻與野生型小球藻的結(jié)果無(wú)顯著差異。三、轉(zhuǎn)idi小球藻產(chǎn)生葉黃素含量的測(cè)定研磨轉(zhuǎn)idi小球藻、轉(zhuǎn)空載體小球藻和野生型小球藻為粉狀，準(zhǔn)確稱取O. 05g轉(zhuǎn)idi小球藻粉、轉(zhuǎn)空載體小球藻粉和野生型小球藻藻粉，加入2. 5mL無(wú)水乙醇超聲破碎30min (超聲功率70%，溫度35°C)，后加1. 5mL 20%K0H (質(zhì)量百分含量)超聲皂化(超聲功率70%,溫度35°C )IOmin ;得到溶液A ;用二氯甲燒、蒸懼水各20mL萃取,5000r/min離心5min,棄去上層水相，收集二氯甲烷相，40°C低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，提取物用色譜純甲醇定容至5mL ；稀釋5倍，過(guò)O. 22um濾膜后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。HPLC檢測(cè)的色譜條件為流動(dòng)相為甲醇和水(體積比為95:5)，流速為O. 8mL/min，進(jìn)樣量10uL，檢測(cè)波長(zhǎng)為444nm。轉(zhuǎn)idi小球藻為轉(zhuǎn)idi 小球藻 I1、12、13、14、15、16、17。結(jié)果如圖7所示，轉(zhuǎn)idi小球藻I1、12、13和14的葉黃素含量與野生型的差異較大，野生型小球藻、轉(zhuǎn)idi小球藻I1、12、13和14的葉黃素含量分別為O. 64mg/g、0. 75mg/g、0. 71mg/g、0. 73mg/g、0. 84mg/g, 14的葉黃素含量最高,與野生型相比提高了 30. 95%。進(jìn)一步分析每升藻液(野生型和各個(gè)轉(zhuǎn)idi小球藻每升藻液的干粉量不同，具體為如圖6所示生物量；藻液的獲取方式在實(shí)施例2的二的3。)中葉黃素的產(chǎn)量，結(jié)果如圖8所示，轉(zhuǎn)idi小球藻I1、13和14的葉黃素產(chǎn)量相對(duì)于野生型有一定提高，野生型小球藻、轉(zhuǎn)idi 小球藻 I1、13 和 14 的葉黃素產(chǎn)量分別為1. 45mg/L、l. 77mg/L、l. 71mg/L、l. 98mg/L，其中14的葉黃素產(chǎn)量最高，比野生型提高了 36. 77%。轉(zhuǎn)空載 體小球藻與野生型小球藻的結(jié)果無(wú)顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因小球藻的方法，為將IPP異構(gòu)酶編碼基因?qū)肽康男∏蛟逯?，得到轉(zhuǎn)基因小球藻，所述轉(zhuǎn)基因小球藻的葉黃素產(chǎn)量大于所述目的小球藻； 所述IPP異構(gòu)酶的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在在于所述IPP異構(gòu)酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第545-1093位核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在在于所述IPP異構(gòu)酶編碼基因以IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒的形式導(dǎo)入目的小球藻； 所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒包括CAMV35S啟動(dòng)子、IPP異構(gòu)酶編碼基因和CYCl終止子； 所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列具體為序列表中的序列I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在在于 所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒通過(guò)重組載體導(dǎo)入目的小球藻； 所述重組載體為將所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體中得到的載體；所述表達(dá)載體具體為PCAMBIA2301。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在在于 所述重組載體通過(guò)重組農(nóng)桿菌導(dǎo)入目的小球藻；所述重組農(nóng)桿菌為將所述重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中得到的重組菌。
6.由權(quán)利要求1-5所述方法得到的轉(zhuǎn)基因小球藻。
7.—種重組載體，為將IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體中得到的載體；所述表達(dá)載體具體為PCAMBIA2301 ； 所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒包括CAMV35S啟動(dòng)子、IPP異構(gòu)酶編碼基因和CYCl終止子； 所述IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列具體為序列表中的序列I。
8.—種重組菌，為將權(quán)利要求7所述的重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中得到的重組菌。
9.由權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因小球藻、權(quán)利要求7所述的重組載體或權(quán)利要求8所述的重組菌在制備葉黃素中的應(yīng)用。
10.一種生產(chǎn)葉黃素的方法，包括如下步驟 1)無(wú)水乙醇超聲破碎由權(quán)利要求1-5所述方法得到的轉(zhuǎn)基因小球藻或由權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因小球藻，再加入KOH水溶液后超聲皂化，得到溶液A ； 2)將所述溶液A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到葉黃素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高產(chǎn)葉黃素轉(zhuǎn)基因小球藻的制備方法。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因小球藻的方法，為將IPP異構(gòu)酶編碼基因?qū)肽康男∏蛟逯?，得到轉(zhuǎn)基因小球藻，所述轉(zhuǎn)基因小球藻的葉黃素產(chǎn)量大于所述目的小球藻；所述IPP異構(gòu)酶的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將IPP異構(gòu)酶編碼基因表達(dá)盒導(dǎo)入野生型小球藻中，得到轉(zhuǎn)基因小球藻，該轉(zhuǎn)基因小球藻的葉黃素含量和野生型小球藻相比最高提高30.95%；葉黃素產(chǎn)量和野生型相比最高提高36.77%，為高產(chǎn)葉黃素小球藻。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103045626SQ201210563819
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者林祥志, 馬瑞娟, 榮輝, 林汝榕, 程汝濱, 王昭凱, 楊善軍, 馬勇, 陳水波, 柯秀蓉, 李惠麗 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所