專利名稱：一種同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法
一種同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及以取自活體內(nèi)蒙古白絨山羊耳部皮膚組織塊為材料，同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
內(nèi)蒙古白絨山羊是經(jīng)過長期自然選育形成的優(yōu)良地方性絨肉兼用型品種，所產(chǎn)羊絨具有徑細(xì)絨長、綜合品質(zhì)優(yōu)良的特點。然而，由于近年來草場退化，種群數(shù)量增加，舍飼比例加大，導(dǎo)致內(nèi)蒙古白絨山羊的產(chǎn)絨量降低。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入促進(jìn)毛囊發(fā)育和絨毛生長的功能基因，培育高產(chǎn)絨量新品系是解決這一問題的有效手段。
在高產(chǎn)絨量轉(zhuǎn)基因絨山羊新品系的研究中，構(gòu)建功能基因的皮膚特異性表達(dá)載體是關(guān)鍵步驟之一，而實現(xiàn)功能基因在皮膚特異性表達(dá)的關(guān)鍵在于構(gòu)建載體時在功能基因上游引入皮膚特異性表達(dá)的啟動子元件，以驅(qū)動功能基因的表達(dá)。在實際操作中，選擇的皮膚特異性 啟動子的功能首先需得到驗證，具體包括兩個方面一方面是這個啟動子在皮膚細(xì)胞中的有效性，即是否工作及工作效率如何；另一方面是啟動子的特異性，即應(yīng)該是只在皮膚細(xì)胞中表達(dá)，在其它細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)微弱。要實現(xiàn)啟動子功能的驗證，唯一簡單的辦法是將含有皮膚特異性啟動子的載體同時轉(zhuǎn)染皮膚細(xì)胞和其它非細(xì)胞，進(jìn)而檢測其有效性和特異性。鑒于此，通過試驗研究獲得內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞株及表皮細(xì)胞株， 這顯得尤為重要。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要手段，細(xì)胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境，包括溫度、濕度、氣體及培養(yǎng)液。用于維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)液。目前商品化的細(xì)胞培養(yǎng)液較多，有MEM系列，DMEM，RPMI-1640系列，199系列等。迄今，在眾多培養(yǎng)液中，哪種培養(yǎng)液可以用于絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞及表皮細(xì)胞的培養(yǎng)尚未見報道。另外，通過一次原代培養(yǎng)同時獲得絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞株和表皮細(xì)胞株的方法亦在現(xiàn)有技術(shù)中未見報道。發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于通過研究同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，從而獲得內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞株和表皮細(xì)胞株，為開展內(nèi)蒙古白絨山羊分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)研究及轉(zhuǎn)基因研究提供了試驗材料。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的
—種同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，皮膚成纖維細(xì)胞株和表皮細(xì)胞株的構(gòu)建包括以下步驟
(I)采樣從雄性成年內(nèi)蒙古白絨山羊個體的耳尖部取皮膚組織，用含雙抗的生理鹽水沖洗，然后去除附著在皮膚上的脂肪和結(jié)締組織基膜層，露出真皮層后，置于70-75% (v/v)酒精中浸泡約45-60s后，再用含雙抗的PBS洗滌，置于含雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中， 剪碎；
(2)內(nèi)蒙古白絨山羊耳部皮膚組織原代培養(yǎng)將皮膚組織塊均勻接種在培養(yǎng)瓶的瓶壁，加入含胎牛血清、表皮細(xì)胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液，擰緊瓶蓋，以組織塊在上、培養(yǎng)液在下的方式放入培養(yǎng)箱，靜置3 4h后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液浸沒組織塊，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，每2-4d更換一次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)Il-17d后，得到皮膚成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞的混合原代細(xì)胞培養(yǎng)物；
(3)皮膚成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞的分離與純化將步驟(2)所得混合原代細(xì)胞培養(yǎng)物用PBS清洗，再用l-2mL含O. 25% (w/v)胰蛋白酶和O. 02%EDTA (w/v)的D-Hanks液消化，至大部分細(xì)胞回縮及有少量細(xì)胞漂起后，立即終止消化，用移液槍吹打使細(xì)胞懸浮， 吸取細(xì)胞懸液離心棄上清后，接種入新的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，通過2 3次選擇傳代，得純化的皮膚成纖維細(xì)胞株；吸取所述細(xì)胞懸液后的培養(yǎng)瓶用PBS洗滌，加入含胎牛血清、表皮細(xì)胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待表皮細(xì)胞長滿瓶底時，消化傳代，通過2 3次選擇傳代，得純化的表皮細(xì)胞株。
本發(fā)明的目的還可以這樣實現(xiàn)
所述的雙抗是終濃度為100IU/mL的青霉素和100IU/mL的鏈霉素。
所述的PBS由8g/L氯化鈉、O. 2g/L氯化鉀、I. 44g/L磷酸氫二鈉和O. 24g/L磷酸二氫鉀組成，pH=7. 4。
步驟(2)和(3)中所述含胎牛血清、表皮細(xì)胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液是含10% (v/v)胎牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素及15ng/mL表皮細(xì)胞生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液。
步驟(2)和(3)中所述培養(yǎng)箱為37°C、含5%C02，的飽和濕度空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法具有以下優(yōu)點和顯著進(jìn)步
(I)本發(fā)明通過研究同時獲得了內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，進(jìn)而獲得了內(nèi)蒙古白絨山羊的皮膚成纖維細(xì)胞株和表皮細(xì)胞株，為開展內(nèi)蒙古白絨山羊轉(zhuǎn)基因研究及分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)研究提供了試驗材料。
(2)本發(fā)明在進(jìn)行組織塊貼壁法原代培養(yǎng)時，根據(jù)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對TE液 (含0. 25%胰蛋白酶和0. 02%EDTA的D-Hanks液)消化敏感性的不同及二者貼壁強(qiáng)度的差異， 將二者分離、純化。具體而言，通過控制合適的消化時間使成纖維細(xì)胞脫壁，而上皮細(xì)胞因脫壁較慢仍貼在培養(yǎng)瓶壁上，分瓶培養(yǎng)后，只需經(jīng)過幾次傳代就可以得到純化的皮膚成纖維細(xì)胞(參見圖2 )、表皮細(xì)胞(參見圖3)，通過一次原代培養(yǎng)同時獲得了高活力的內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞兩種細(xì)胞株。


圖I為本發(fā)明內(nèi)蒙古白絨山羊耳尖皮膚組織經(jīng)培養(yǎng)前消毒處理及剔毛處理后，采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)8天培養(yǎng)組織塊周圍有成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞長出，環(huán)繞于組織塊周圍；A為皮膚成纖維細(xì)胞，B為表皮細(xì)胞，C為皮膚組織塊。
圖2為本發(fā)明原代培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞經(jīng)過3次傳代以后得到的較純的皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞呈梭型。
圖3為本發(fā)明原代培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞經(jīng)過3次傳代以后得到的較純的表皮細(xì)胞，細(xì)胞呈圓形。
圖4為本發(fā)明獲得的皮膚成纖維細(xì)胞的染色體數(shù)量分析圖，染色體數(shù)量為2n=60。
圖5為本發(fā)明獲得的表皮細(xì)胞的染色體數(shù)量分析圖，染色體數(shù)量為2n=60。
圖6為本發(fā)明獲得的皮膚成纖維細(xì)胞的生長曲線圖。
圖7為皮膚特異性表達(dá)載體pDsR-K14p轉(zhuǎn)染本發(fā)明獲得的皮膚成纖維細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞48小時紅色熒光表達(dá)情況照片；A、B為胎兒成纖維細(xì)胞，C、D為皮膚成纖維細(xì)胞;A、C為光鏡照片，B、D為熒光照片；皮膚成纖維細(xì)胞中紅色熒光蛋白的表達(dá)量較胎兒成纖維細(xì)胞為多。
圖8 為表達(dá)載體 K 14p-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsRK14p 轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞48h的VEGF表達(dá)實時定量PCR分析圖，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中VEGF表達(dá)量與對照組差別不大。
圖9 為表達(dá)載體 K 14p-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsR_K14p 轉(zhuǎn)染絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞48h的VEGF表達(dá)實時定量PCR分析圖，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中VEGF表達(dá)量與對照組差別較大。
圖10 為表達(dá)載體 K 14p-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsR_K14p 轉(zhuǎn)染絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞或胎兒成纖維細(xì)胞48h，轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對照組細(xì)胞中VEGF的表達(dá)量比較圖；K14p-VEGF-K14PoIyA-Loxp - pCDsR-Loxp轉(zhuǎn)染絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞中VEGF表達(dá)量較高，表明K14啟動子特異性地在皮膚細(xì)胞中高表達(dá)。
具體實施方式
通過下面的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步解釋和說明，但這并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下實施例中采用試劑的配制方法如下
PBS :在800ml蒸餾水中溶解氯化鈉(NaCl) 8. Og，氯化鉀(KCl)O. 2g，磷酸氫二鈉 (Na2HPO4) I. 44g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) O. 24g，用鹽酸調(diào)pH值至7. 4，加水定溶至1L。滅菌后室溫保存?zhèn)溆谩?br> 培養(yǎng)液含10%FBS(胎牛血清)、青霉素100IU/mL、鏈霉素100IU/mL及15ng/mLEGF (表皮生長因子)的DMEM/F12培養(yǎng)液。
D-Hanks液在800mL蒸餾水中溶解氯化鉀(KCl)O. 4g,磷酸二氫鉀(KH2PO4) O. 06g，氯化鈉(NaCl) 8. Og,碳酸氫鈉(NaHCO3) O. 35g，磷酸氫二鈉 (Na2HPO4 · 12H20)0. 132g，D-葡萄糖I. Og，酚紅(O. 1%) lmL，上述試劑依次加入，溶解后定容至1L。10磅，IOmin高壓滅菌,室溫儲存。
冷凍液由占總?cè)芤后w積20%的胎牛血清(FBS)和10% 二甲基亞礬(DMSO)及70% 的DMEM/F12液和雙抗(終濃度為100IU/mL的青霉素和100IU/mL的鏈霉素)組成。
實施例I :內(nèi)蒙古白絨山羊的皮膚組織采樣
從雄性成年內(nèi)蒙古白絨山羊個體的耳尖部取皮膚組織。采集耳尖皮膚時，耳尖剃毛，碘酒消毒，70%酒精脫碘，無菌手術(shù)剪剪取整個耳尖(約2 3cm2)置37°C，含青霉素 (100IU/mL)、鏈霉素(100IU/mL)生理鹽水中，l_2h內(nèi)帶回實驗室。羊耳傷口部分用消炎粉止血。帶回實驗室的耳尖組織再用生理鹽水沖洗3遍，于超凈工作臺中，無菌手術(shù)剪剪去耳尖皮膚，用含有青霉素(100IU/mL)、鏈霉素(100IU/mL)的PBS洗滌皮膚組織3次，清除血跡及其它雜質(zhì)。用眼科剪仔細(xì)去除附著在耳朵皮膚上的脂肪和結(jié)締組織基膜層，露出真皮層后，置于70%酒精中浸泡約45-60s后，再用含有青霉素(100IU/mL)、鏈霉素(100IU/mL)的 PBS洗滌3次，置含有青霉素(100IU/mL)、鏈霉素(100IU/mL)的DMEM/F12液中，使用眼科剪將耳朵皮膚剪切成Imm3大小的組織塊。
實施例2 :內(nèi)蒙古白絨山羊耳部皮膚組織原代培養(yǎng)及皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的分離純化
將皮膚組織塊按5_左右間隔，接種在T25培養(yǎng)瓶的瓶壁，盡量使組織塊的切面貼在瓶壁上，這樣組織塊更容易粘附瓶壁。加5mL培養(yǎng)液(含10%FBS、青霉素100IU/mL、鏈霉素 100IU/mL及15ng/mL EGF的DMEM/F12培養(yǎng)液)，擰緊瓶蓋，以組織塊在上，培養(yǎng)液在下的方式放入培養(yǎng)箱，靜置3 4h后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液浸沒組織塊，盡量避免組織塊浮起，在37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3d后，換5mL新鮮培養(yǎng)液。以后每3d換培養(yǎng)液一次，8 IOd可明顯看到組織塊周圍有細(xì)胞長出，首先長出的是梭形的成纖維細(xì)胞， 生長較快，通常位于連片生長的細(xì)胞生長區(qū)外緣；隨后是圓形的表皮細(xì)胞出現(xiàn)，通常位于組織塊周圍(內(nèi)緣)。細(xì)胞向周圍擴(kuò)展(參見圖1)，2周左右由組織塊長出的細(xì)胞匯合，細(xì)胞鋪滿瓶底，取出組織塊后可消化傳代、分離和純化。以后細(xì)胞每長到70% 80%匯合度時傳代一次。
根據(jù)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對TE(含0. 25%胰蛋白酶和0. 02%EDTA的D-Hanks液) 消化敏感性的不同及二者貼壁強(qiáng)度的差異，可以將二者分離。成纖維細(xì)胞對TE敏感，貼壁性相對弱，容易消化下來；表皮細(xì)胞對TE敏感性查，貼壁性相對強(qiáng)，不易脫壁。在混合生長的原代細(xì)胞培養(yǎng)物中，去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)瓶中加入PBS5mL清洗I次后倒出，再加ImLTE消化液，使之覆蓋培養(yǎng)物，室溫消化3 4min，倒置顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞回縮及有少量細(xì)胞漂起后，立即加入5mL培養(yǎng)液終止消化，用移液槍吹打使細(xì)胞懸浮，此時成纖維細(xì)胞絕大部分可懸浮，而表皮細(xì)胞不懸浮。
皮膚成纖維細(xì)胞的分離與純化吸取細(xì)胞懸液裝入到15mL離心管中，離心收集細(xì)胞(1000r/min，5min)。棄上清，加入5mL培養(yǎng)液使細(xì)胞懸浮，計數(shù)，接種入新的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。通過2 3次選擇傳代，可完全純化成纖維細(xì)胞，獲得純凈的皮膚成纖維細(xì)胞株(參見圖2)。
表皮細(xì)胞的分離與純化上述(3)中所用T25培養(yǎng)瓶在消化、吸出懸浮的成纖維細(xì)胞后，吸凈培養(yǎng)液，用PBS洗I次，加入5mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。如還有成纖維細(xì)胞長出，重復(fù)上述(3)中所述消化步驟，去除成纖維細(xì)胞直至消失。待表皮細(xì)胞長滿瓶底時，消化傳代， 通過2 3次選擇傳遞，即可獲得純凈的表皮細(xì)胞株(參見圖3)。
實施例3 :內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的冷凍保存
將長至80% 90%匯合的細(xì)胞，進(jìn)行消化(皮膚成纖維細(xì)胞消化3 4min，表皮細(xì)胞消化5 6min)收集，加入含10%DMS0和20%FBS的DMEM/F12冷凍液，調(diào)整細(xì)胞密度為 2 4X IO6個細(xì)胞/mL分裝于I. 5mL凍存管中，將凍存管裝入凍存盒，一 80°C冰箱凍存12h以上，然后直接投入液氮(_196°C )保存。
實施例4 :內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇
將所述的凍存皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞從液氮中取出，立即放入37°C水浴中融化，吸出細(xì)胞懸液，加入10倍體積的培養(yǎng)液稀釋、洗滌，離心收集細(xì)胞(1000r/min，5min)。 棄上清，加入5mL培養(yǎng)液，37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。
實施例5 :染色體制備及計數(shù)
在細(xì)胞傳代時，將一皿細(xì)胞以I. 60 X IO4個細(xì)胞/mL的濃度接種于T25培養(yǎng)瓶中， 12h后換液。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，換成含有終濃度為O. 05 μ g/mL秋水仙胺的培養(yǎng)液，培養(yǎng)5h。 吸除培養(yǎng)液，加入O. 05%胰酶消化細(xì)胞。收集細(xì)胞懸液，經(jīng)1600r/min離心5min，棄上清。 加O. 075mol/L的氯化鉀低滲液于室溫下低滲40min,以1600r/min離心5min,棄上清。第一次固定，加入甲醇與冰乙酸的體積比為3 I的混合液5mL(現(xiàn)用現(xiàn)配)固定30min。以 1600r/min離心5min,棄上清。再經(jīng)第二、三次固定,方法同第一次。棄上清，留O. 5 I. OmL 制成細(xì)胞懸液，用100 μ I的移液器吸取細(xì)胞懸液，滴在冰冷潔凈的載玻片上。滴與滴之間勿重疊，置于空氣中至少干燥24h。再經(jīng)Giemsa染色20min，流水沖洗，自然干燥后鏡檢。挑選形態(tài)清晰、分散度良好、收縮適中的染色體中期分裂相，在油鏡下進(jìn)行拍照(圖4，圖5)， 并統(tǒng)計染色體數(shù)目。染色體數(shù)目2n=60。
實施例6 :細(xì)胞生長曲線測定
細(xì)胞生長曲線是測定細(xì)胞增殖數(shù)量和規(guī)律的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。對于通過原代培養(yǎng)獲得的細(xì)胞株，細(xì)胞生長曲線是所培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。實驗采用臺盼藍(lán)染色一血球計數(shù)板法計數(shù)。指數(shù)生長期的內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞以5 X IO3/孔的數(shù)量接種至24孔板(dayO)中(按照每日計數(shù)3孔的數(shù)目接種) 培養(yǎng)，自接種后第Id (dayl)開始每日用胰酶消化3孔細(xì)胞計數(shù)，直至第9d。臺盼藍(lán)染色后，顯微鏡下無色細(xì)胞為活細(xì)胞，藍(lán)色細(xì)胞為死細(xì)胞。只對活細(xì)胞計數(shù)。以細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)作圖，即得生長曲線(圖6)。
實施例7 :脂質(zhì)體介導(dǎo)皮膚特異性表達(dá)載體pDsR-K14p轉(zhuǎn)染絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞
角蛋白(Keratin)是外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，存在于脊椎動物皮膚、毛發(fā)和指甲等部位，調(diào)控皮膚角蛋白基因表達(dá)的啟動子是皮膚特異性的。KeratinH主要表達(dá)于表皮基底層細(xì)胞，對維持細(xì)胞形態(tài)及防止細(xì)胞溶解起著重要的作用。K14基因的啟動子具有較強(qiáng)的皮膚特異性，在皮膚細(xì)胞中工作效率較高。為了構(gòu)建用于轉(zhuǎn)基因克隆絨山羊的皮膚特異性表達(dá)載體，我們克隆了人K14啟動子。為了檢測克隆的K14啟動子是否工作，我們利用K14 啟動子構(gòu)建了皮膚特異性表達(dá)載體pDsR-K14p，轉(zhuǎn)染絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞。pDsR-K14p載體中，K14啟動子驅(qū)動紅色熒光蛋白基因表達(dá)，如果K14啟動子工作，則會在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)紅色熒光蛋白；如果K14啟動子具有較強(qiáng)的皮膚特異性，紅色熒光蛋白在皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量應(yīng)該多于胎兒成纖維細(xì)胞，紅色熒光蛋白在熒光顯微鏡下可以觀察到。
首先利用限制性內(nèi)切酶BglII (載體中單一酶切位點)在37°C酶切pDsR-K14p載體使其線性化。酶切質(zhì)粒經(jīng)過凝膠電泳檢測確認(rèn)酶切完全后，乙醇沉淀、重新以RNasefree dH20回溶、經(jīng)紫外分光光度計檢測線性化質(zhì)粒DNA濃度后，調(diào)整DNA濃度( O. 5 μ g/μ I)備用。
然后參照Lipo2000操作說明和要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染前一日，胰蛋白酶消化絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。離心去上清，以無抗生素DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照2 3 X IO5細(xì)胞/孔密度接種六孔培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染當(dāng)日，用移液器量取10. 2 μ I (O. 39 μ g/μ I)線性化質(zhì)粒pDsR_K14p至2個I. 5mL規(guī)格Eppendorf管中，用無血清DMEM/ F12調(diào)整至終體積為250 μ I ;另外2個I. 5mL規(guī)格Eppendorf管中分別加入Lipo20008y 1， 以無血清DMEM/F12調(diào)整至終體積為250 μ 1，室溫放置lOmin，將質(zhì)粒和脂質(zhì)體對應(yīng)輕輕混勻，室溫下靜置20min，吸棄細(xì)胞原上清液后將同種載體的混合物分別加入絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的六孔培養(yǎng)板中、前后搖動培養(yǎng)板混勻，在37°C、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，6h后續(xù)加500 μ I DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)至48h。熒光顯微鏡觀察，拍照。
檢測結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)可以看到紅色熒光蛋白的表達(dá)，皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)多于胎兒成纖維細(xì)胞，表明K14啟動子工作并具有組織特異性，在皮膚細(xì)胞中驅(qū)動紅色熒光蛋白基因高表達(dá)(圖7)。
實施例8 :皮膚特異性表達(dá)載體 K14p-VEGF-K14PolyA_Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsRK14p轉(zhuǎn)染絨山羊皮膚成·纖維細(xì)胞后VEGF表達(dá)情況的實時定量熒光PCR (real-time PCR)檢測
我們首先利用克隆的人K14啟動子構(gòu)建了皮膚特異性表達(dá)載體 K14P-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp，該載體中由K14啟動子驅(qū)動VEGF基因的表達(dá)。 然后采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法利用K14p-VEGF-K HPolyA-Loxp - pCDsR-Loxp和pDsR_K14p轉(zhuǎn)染絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞。載體線性化、轉(zhuǎn)染及細(xì)胞培養(yǎng)與實施例7中一致。 轉(zhuǎn)染后48小時收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。根據(jù)GenBank中山羊β -actin 以及我們克隆測序的絨山羊VEGF164cDNA序列，采用Primer5. O軟件分別設(shè)計了一對用于 SYBR Green I real-time PCR 的引物。上游引物 5 , -TGCGGGGGCTGCTGTAAT-3 ,，下游引物 5 ' -GCCCACAGGGATTTTCTT-3 '，預(yù)期擴(kuò)增片段186bp ;以β -actin為內(nèi)參基因，。上游引物 5 z -TGGCACCACACCTTCTACAACGAGC-3 ,，下游引物 5 , -CGTCCCCAGAGTCCATGACAATG-3 ^，預(yù)期擴(kuò)增片段218bp。
結(jié)果表明，表達(dá)載體K14p-VEGF-K14PolyA_Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsR_K14p 轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞48小時，與未轉(zhuǎn)染的對照組相比，VEGF表達(dá)量差別不大(圖8)。表達(dá)載體 K 14p-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsR_K14p 轉(zhuǎn)染皮膚成纖維細(xì)胞 48 小時， 與未轉(zhuǎn)染的對照組相比，VEGF表達(dá)量差別較大(圖9)。綜合K14p-VEGF-K HPolyA-Loxp -P⑶sR-Loxp和pDsR-K14p轉(zhuǎn)染皮膚成纖維細(xì)胞或胎兒成纖維細(xì)胞48h，比較轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照組細(xì)胞中VEGF表達(dá)量，轉(zhuǎn)染K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp的皮膚成纖維細(xì)胞中VEGF表達(dá)量較高(圖10)，表明K14啟動子在皮膚細(xì)胞中特異性地高表達(dá)。
根據(jù)以上實施例的描述可以看出，本發(fā)明利用一次耳尖皮膚組織塊的原代培養(yǎng)， 可同時構(gòu)建獲得內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞株和表皮細(xì)胞株。采用本發(fā)明獲得的皮膚成纖維細(xì)胞可以檢測外源皮膚特異性啟動子的工作效率和特異性，以及用于絨山羊轉(zhuǎn)基因的研究，也可以用于其他相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究。8
權(quán)利要求
1.一種同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于皮膚成纖維細(xì)胞株和表皮細(xì)胞株的構(gòu)建包括以下步驟 (1)采樣從雄性成年內(nèi)蒙古白絨山羊個體的耳尖部取皮膚組織，用含雙抗的生理鹽水沖洗，然后去除附著在皮膚上的脂肪和結(jié)締組織基膜層，露出真皮層后，置于70-75%酒精中浸泡約45-60s后，再用含雙抗的PBS洗滌，置于含雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中，剪碎； (2)內(nèi)蒙古白絨山羊耳部皮膚組織原代培養(yǎng)將皮膚組織塊均勻接種在培養(yǎng)瓶的瓶壁，加入含胎牛血清、表皮細(xì)胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液，擰緊瓶蓋，以組織塊在上、培養(yǎng)液在下的方式放入培養(yǎng)箱，靜置3 4h后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液浸沒組織塊，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，每2-4d更換一次新鮮培養(yǎng)液,培養(yǎng)ll-17d后,得到皮膚成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞的混合原代細(xì)胞培養(yǎng)物； (3)皮膚成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞的分離與純化將步驟(2)所得混合原代細(xì)胞培養(yǎng)物用PBS清洗，再用l-2mL含O. 25%胰蛋白酶和O. 02%EDTA的D-Hanks液消化，至大部分細(xì)胞回縮及有少量細(xì)胞漂起后，立即終止消化，用移液槍吹打使細(xì)胞懸浮，吸取細(xì)胞懸液離心棄上清后，接種入新的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，通過2 3次選擇傳代，得純化的皮膚成纖維細(xì)胞株；吸取所述細(xì)胞懸液后的培養(yǎng)瓶用PBS洗滌，加入含胎牛血清、表皮細(xì)胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待表皮細(xì)胞長滿瓶底時，消化傳代，通過2 3次選擇傳代，得純化的表皮細(xì)胞株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述的雙抗是終濃度為100IU/mL的青霉素和100IU/mL的鏈霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述的PBS由8g/L氯化鈉、O. 2g/L氯化鉀、I. 44g/L磷酸氫二鈉和O. 24g/L磷酸二氫鉀組成，pH=7. 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)和(3)中所述含胎牛血清、表皮細(xì)胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液是含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素及15ng/mL表皮細(xì)胞生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)和(3)中所述培養(yǎng)箱為37°C、含5%C02，的飽和濕度空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時分離內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，皮膚成纖維細(xì)胞株和表皮細(xì)胞株的構(gòu)建包括以下步驟(1)采樣；(2)內(nèi)蒙古白絨山羊耳尖皮膚組織原代培養(yǎng)；(3)皮膚成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞的分離與純化。本發(fā)明經(jīng)過一次原代培養(yǎng)同時獲得了高活力的內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞株和表皮細(xì)胞株,為深入開展內(nèi)蒙古白絨山羊轉(zhuǎn)基因研究、分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)研究提供了試驗材料與技術(shù)支持。
文檔編號C12N5/071GK102978154SQ201210564250
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月23日
發(fā)明者王志鋼, 劉東軍, 旭日干 申請人:內(nèi)蒙古大學(xué)