一種牛虻抗血栓酶kfpase的復(fù)性方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及牛虻抗血栓酶kfpase的高效復(fù)性方法,對重組表達(dá)而不具有生物活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行了高效快速的復(fù)性。基本過程為將變性蛋白吸附到離子交換柱上,然后逐漸降低變性劑的濃度,使蛋白在這個過程中逐漸復(fù)性,正確折疊而形成天然活性蛋白。最后通過復(fù)性液將復(fù)性蛋白洗脫下來。本發(fā)明的方法不僅操作簡便,便于大規(guī)模的應(yīng)用,而且可以獲得高純度的蛋白并保持很高的蛋白回收率。
【專利說明】一種牛虻抗血栓酶kfpase的復(fù)性方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及牛蛇抗血栓酶kfpase的復(fù)性方法,屬于生物制藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]血栓栓塞性疾病嚴(yán)重影響人類的健康,是導(dǎo)致死亡率最高的病因之一。在過去的幾十年中,已經(jīng)開發(fā)了針對血液凝固、血小板激活和聚集、血栓溶解的不同步驟而起作用的基礎(chǔ)和臨床藥物,但是很多抗血栓藥物經(jīng)常被包括低血壓、出血等系統(tǒng)性的副作用所限制,因此,需要開發(fā)新型的更具潛力和特異性的抗血栓藥物。[0003]牛虻抗血栓酶kfpase為一種單鏈蛋白,其表觀分子量為27kDa。實驗表明牛虻抗血栓酶kfpase具有明顯的抗靜脈血栓的作用。牛虻抗血栓酶kfpase的相關(guān)內(nèi)容申請者已經(jīng)申請序列專利(專利號:201210057832.8),該專利介紹了該蛋白的序列,結(jié)構(gòu)該工作對有潛力開發(fā)成為新型單組份抗血栓藥物的牛虻抗血栓酶kfpase進(jìn)行了較為系統(tǒng)的理化性質(zhì)研究,為該酶的進(jìn)一步開發(fā)和研究奠定了基礎(chǔ)。
[0004]原核表達(dá)系統(tǒng)作為一種成熟的蛋白表達(dá)系統(tǒng),因其表達(dá)量高,操作簡便和成本較低一直以來都受到工業(yè)化生產(chǎn)的青睞。因此借助大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行基因工程重組表達(dá)具有成本低,大規(guī)模發(fā)酵容易等優(yōu)點,但重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中基本以包涵體形式表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物不具有生物活性,往往需要進(jìn)行繁瑣的蛋白質(zhì)復(fù)性實驗才能獲得部分活性。蛋白質(zhì)在折疊復(fù)性中存在一個難以調(diào)和的矛盾,那就是蛋白質(zhì)的折疊和聚集是個競爭過程。當(dāng)疏水基團(tuán)的結(jié)合發(fā)生在在蛋白質(zhì)內(nèi)時即為折疊,發(fā)生在分子間時就為聚集。后者是個不可逆的過程,往往形成不溶性沉淀。蛋白質(zhì)的折疊是單分子的一級反應(yīng),聚集是雙分子或者多分子反應(yīng),通常為二級乃至更高級的反應(yīng),因此隨著蛋白質(zhì)濃度的提高聚集的傾向?qū)⒋笥谡郫B的傾向?;蚬こ痰漠a(chǎn)業(yè)化首先要求能在高濃度下復(fù)性,蛋白濃度過低無疑會增加后處理的繁瑣,提高成本;其次,要保證高的活性收率,即復(fù)性的產(chǎn)物與天然結(jié)構(gòu)完全相同;再次,需要高的蛋白收率,盡量減少蛋白質(zhì)折疊過程中的聚集沉淀。
[0005]蛋白質(zhì)復(fù)性的經(jīng)典方法一般采用稀釋和透析法,前者將變性蛋白直接加入復(fù)性緩沖液,高蛋白濃度下往往形成大量沉淀,因而復(fù)性時要求很低的蛋白質(zhì)濃度,而后者操作繁瑣,不利于放大。超濾法復(fù)性時可以講變性劑用復(fù)性緩沖液連續(xù)置換,使變性劑濃度緩慢降低,而蛋白濃度不會明顯降低,而且便于自動化操作,但剪切力可能導(dǎo)致復(fù)性好的蛋白重新變性而降低活性收率。其他改進(jìn)的經(jīng)典復(fù)性方法還有脈沖復(fù)性、滴加復(fù)性和膜管流加復(fù)性,它們均不能從根本上解決聚集沉淀的問題。
[0006]近年來,固相復(fù)性和層析復(fù)性的方法被提出且逐漸受到重視,因為它有如下優(yōu)越性:減少蛋白質(zhì)互相聚集的機(jī)會,提高蛋白質(zhì)復(fù)性濃度;便于去除變性劑;打破復(fù)性變性反應(yīng)平衡,使復(fù)性反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行;使復(fù)性和純化同時進(jìn)行;便于自動化、規(guī)?;a(chǎn)。
[0007]本發(fā)明提出用陽離子交換層析輔助牛虻抗血栓酶kfpase復(fù)性的方法,所有操作簡單,不會對復(fù)性蛋白造成污染,易于放大,并且離子交換層析介質(zhì)經(jīng)適當(dāng)處理后可重復(fù)利用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)的缺點,為了提高蛋白質(zhì)收率的同時又提高蛋白質(zhì)的活性,而且變性蛋白質(zhì)可在高濃度下復(fù)性,不易產(chǎn)生沉淀的目的,從而提供一種操作簡單、利用陽離子交換層析復(fù)性蛋白質(zhì)的方法。
[0009]本發(fā)明的方法是利用陽離子層析復(fù)性蛋白的,包括如下步驟實現(xiàn)的:
[0010](I)柱平衡:用流動相I平衡常規(guī)離子交換層析介質(zhì);其中流動相I為尿素6-8mol/L,三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) 20-50mmol/L,pH 8.0-9.5, L-半胱氨酸l-3mmol/L, L-月光氛酸 0.2-0.Bmmol /I,;
[0011](2)變性蛋白的吸附:用含l_30mmol/L還原劑的6_8mol/L尿素的變性緩沖液溶解包涵體,吸附到流動相I平衡的離子交換層析柱上;
[0012](3)變心蛋白的柱上復(fù)性:步驟(2)中包涵體蛋白溶解被上述選擇的離子交換介質(zhì)吸附后,用流動相I沖洗0-5個柱體積。在AKTA上,流動相I接在A泵,流動相II接在B泵上,梯度沖洗0-100% B,沖洗20個柱體積,使蛋白質(zhì)在柱上逐漸形成天然結(jié)構(gòu);沖洗流速為0.l-2ml/min ;其中流動相II為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) 20-50mmol/L,pH
8.0-9.5, L-半胱;氛酸 1 -3mmoI /T,, L- Jj光氛酸 0.2-0.Bmmol /I,;
[0013](4)復(fù)性蛋白的洗脫:步驟(3)中蛋白質(zhì)已經(jīng)在柱上進(jìn)行了正確的折疊形成了天然結(jié)構(gòu),用流動相III洗脫0-5個柱體積;其中流動相III為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) 20-50mmol/L, pH 8.0-9.5, L-半胱氨酸 l-3mmol/L, L-胱氨酸 0.2-0.Bmmol /I,,L-精氛酸 0.2-lmol/L。
[0014]整個復(fù)性過程是在AKTA上運行的,所有的流動相使用之前都通過了 0.22 μ m的膜進(jìn)行過濾,步驟(1)中的離子交換層析介質(zhì)是SP Sepharose Fast Flow或者CM SepharoseFast Flow,步驟(3)中的還原劑可以是β巰基乙醇(β-mercaptoethanol)或者二硫蘇糖醇(DTT)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為牛蛇抗血栓酶kfpase的SP Sepharose Fast Flow離子交換層析:圖中箭頭所示為目的蛋白。
[0016]圖2為復(fù)性并純化后的牛虻抗血栓酶kfpase還原SDS-PAGE檢測結(jié)果
[0017]圖3為復(fù)性并純化后的牛虻抗血栓酶kfpase非還原Native-PAGE檢測結(jié)果
[0018]圖4為復(fù)性并純化后的牛虻抗血栓酶kfpase的RP-HPLC檢測結(jié)果
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體的實施例將對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行更具體的解釋,但并不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]實施例1:強(qiáng)陽離子交換層析介質(zhì)SP Sepharose FF在pH8.0的條件下對牛蛇抗血栓酶kfpase進(jìn)行柱上復(fù)性
[0021]牛虻抗血栓酶kfpase基因 工程菌(江蘇柯菲平醫(yī)藥有限公司)發(fā)酵后,取30g菌泥,用裂解液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.0,500mmol/L NaCl,5%甘油,lmmol/L EDTA)重懸,在固液比為1: 30的條件下,混合成均一的懸液,倒入高壓破碎儀(ATS)中進(jìn)行破碎,繼而通過離心分離得到濕的包涵體粗品。
[0022]將上述得到的粗包涵體用緩沖液A(20mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 500mmol/LNaCl)和緩沖液 B(20mmol/L Tris-HCl, pH8.0,500mmol/L NaCl,2mol/L Urea)依次洗滌,得到高純度包涵體。
[0023]取5g高純度包涵體,以固液比1: 40的比例用溶解液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.0,5mmol/L DTT,6mol/L Urea)溶解,室溫溫和攪拌1_2小時,離心得上清液200ml,并用Lowry法測定蛋白濃度。
[0024]將SPSepharose FF層析柱用流動相 I (6mol/L Urea, 20mmol/L Tris_HCl,pH8.0,2mm ο I /T, L-Cysteine, 0.4mmol/L L-Cystine)平衡,將溶解的變性牛抗血栓酶 tablysin在AKTA prime plus上泵入層析柱,上樣結(jié)束后,用流動相沖洗5個柱體積。然后流動相T-流動相 TT (20mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 2mmol/LL-Cysteine, 0.4mmol/L L-Cystine)梯度洗脫 200ml。最后用流動相 TTT (SOOmmol /T,T -Arginine, 20mmo1 /T, Tris-HCl,pH8.0, 2mmol/L L-Cysteine,0.4mmol/LL-Cystine)洗脫。蛋白復(fù)性率達(dá) 75%。
[0025] 實施例2:強(qiáng)陽離子交換層析介質(zhì)SP Sepharose FF在pH8.5的條件下對牛蛇抗血栓酶kfpase進(jìn)行柱上復(fù)性
[0026]牛虻抗血栓酶kfpase基因工程菌(江蘇柯菲平醫(yī)藥有限公司)發(fā)酵后,取30g菌泥,用裂解液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.5,500mmol/L NaCl,5%甘油,lmmol/L EDTA)重懸,在固液比為1: 30的條件下,混合成均一的懸液,倒入高壓破碎儀(ATS)中進(jìn)行破碎,繼而通過離心分離得到濕的包涵體粗品。
[0027]將上述得到的粗包涵體用緩沖液A(20mmol/L Tris-HCl, pH8.5, 500mmol/LNaCl)和緩沖液 B(20mmol/L Tris-HCl, pH8.5,500mmol/L NaCl,2mol/L Urea)依次洗滌,得到高純度包涵體。
[0028]取5g高純度包涵體,以固液比1: 40的比例用溶解液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.5,10mmol/L DTT,6mol/L Urea)溶解,室溫溫和攪拌1_2小時,離心得上清液200ml,并用Lowry法測定蛋白濃度。將SP Sepharose FF層析柱用流動相I (6mol/L Urea, 20mmol/L Tris-HCl,pH8.5,2mmol/L L-Cysteine,0.4mmol/L L-Cystine)平衡,將溶解的變性牛抗血栓酶tablysin在AKTAprime plus上泵入層析柱,上樣結(jié)束后,用流動相沖洗5個柱體積。然后流動相 1-流動相 II (20mmol/L Tris-HCl,pH8.5,2mmol/L L-Cysteine,0.4mmo1 /L L-Cystine)梯度洗脫 200ml。最后用流動相 III (500mmol/L L-Arginine, 20mmol/LTris-HCl,pH8.5,2mmol/L L-Cysteine, 0.4mmol/L L-Cystine)洗脫。蛋白復(fù)性率達(dá) 80%。
[0029]實施例3:強(qiáng)陽離子交換層析介質(zhì)SP Sepharose FF在pH9.0的條件下對牛蛇抗血栓酶kfpase進(jìn)行柱上復(fù)性
[0030]牛虻抗血栓酶kfpase基因工程菌(江蘇柯菲平醫(yī)藥有限公司)發(fā)酵后,取30g菌泥,用裂解液(20mmol/L Tris-HCl,pH9.0,500mmol/L NaCl,5%甘油,lmmol/L EDTA)重懸,在固液比為1: 30的條件下,混合成均一的懸液,倒入高壓破碎儀(ATS)中進(jìn)行破碎,繼而通過離心分離得到濕的包涵體粗品。
[0031]將上述得到的粗包涵體用緩沖液A(20mmol/L Tris-HCl, pH9.0, 500mmol/LNaCl)和緩沖液 B(20mmol/L Tris-HCl, pH9.0,500mmol/L NaCl,2mol/L Urea)依次洗滌,得到高純度包涵體。
[0032]取5g高純度包涵體,以固液比1: 40的比例用溶解液(20mmol/L Tris-HCl,pH9.0, 30mmol/L DTT, 6mol/L Urea)溶解,室溫溫和攪拌1_2小時,離心得上清液200ml,并用Lowry法測定蛋白濃度。
[0033]將SPSepharose FF層析柱用流動相 I (6mol/L Urea, 20mmol/L Tris_HCl,pH9.0,2mm ο I /T, L-Cysteine, 0.4mmol/L L-Cystine)平衡,將溶解的變性??寡?tablysin在AKTA prime plus上泵入層析柱,上樣結(jié)束后,用流動相沖洗5個柱體積。然后流動相T-流動相 TT (20mmol/L Tris-HCl,pH9.0, 2mmol/LL-Cysteine, 0.4mmo1 /T, L-Cystine)梯度洗脫 200ml。最后用流動相 TTT (SOOmmol /T,T -Arginine, 20mmo1 /T, Tris-HCl,pH9.0, 2mmol/L L-Cysteine,0.4mmol/LL-Cystine)洗脫。蛋白復(fù)性率達(dá) 78%。
[0034]實施例4:弱陽離子交換層析介質(zhì)CM Sepharose FF在pH8.0的條件下對牛蛇抗血栓酶kfpase進(jìn)行柱上復(fù)性
[0035]牛虻抗血栓酶kfpase基因工程菌(江蘇柯菲平醫(yī)藥有限公司)發(fā)酵后,取30g菌泥,用裂解液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.0,500mmol/L NaCl,5%甘油,lmmol/L EDTA)重懸,在固液比為1: 30的條件下,混合成均一的懸液,倒入高壓破碎儀(ATS)中進(jìn)行破碎,繼而通過離心分離得到濕的包涵體粗品。
[0036]將上述得到的粗包涵體用緩沖液A(20mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 500mmol/LNaCl)和緩沖液 B(20mmol/L Tris-HCl, pH8.0,500mmol/L NaCl,2mol/L Urea)依次洗滌,得到高純度包涵體。
[0037]取5g高純度包涵體,以固液比1: 40的比例用溶解液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.0,5mmol/L DTT,6mol/L Urea)溶解,室溫溫和攪拌1_2小時,離心得上清液200ml,并用Lowry法測定蛋白濃度。
[0038]將CMSepharose FF層析柱用流動相 I (6mol/L Urea, 20mmol/L Tris_HCl,pH8.0,2mm ο I /T, L-Cysteine, 0.4mmol/L L-Cystine)平衡,將溶解的變性牛抗血栓酶 tablysin在AKTA prime plus上泵入層析柱,上樣結(jié)束后,用流動相沖洗5個柱體積。然后流動相T-流動相 TT (20mmol/L Tris-HCl,pH8.0, 2mmol/LL-Cysteine, 0.4mmol/L L-Cystine)梯度洗脫 200ml。最后用流動相 TTT (SOOmmol /T,T -Arginine, 20mmo1 /T, Tris-HCl,pH8.0, 2mmol/L L-Cysteine,0.4mmol/LL-Cystine)洗脫。蛋白復(fù)性率達(dá) 72%。
[0039]實施例5:強(qiáng)陽離子交換層析介質(zhì)CM Sepharose FF在pH8.5的條件下對牛蛇抗血栓酶kfpase進(jìn)行柱上復(fù)性
[0040]牛虻抗血栓酶kfpase基因工程菌(江蘇柯菲平醫(yī)藥有限公司)發(fā)酵后,取30g菌泥,用裂解液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.5,500mmol/L NaCl,5%甘油,lmmol/L EDTA)重懸,在固液比為1: 30的條件下,混合成均一的懸液,倒入高壓破碎儀(ATS)中進(jìn)行破碎,繼而通過離心分離得到濕的包涵體粗品。 [0041]將上述得到的粗包涵體用緩沖液A(20mmol/L Tris-HCl, pH8.5, 500mmol/LNaCl)和緩沖液 B(20mmol/L Tris-HCl, pH8.5,500mmol/L NaCl,2mol/L Urea)依次洗滌,得到高純度包涵體。
[0042]取5g高純度包涵體,以固液比1: 40的比例用溶解液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.5,10mmol/L DTT,6mol/L Urea)溶解,室溫溫和攪拌1_2小時,離心得上清液200ml,并用Lowry法測定蛋白濃度。
[0043]將CMSepharose FF層析柱用流動相 I (6mol/L Urea, 20mmol/L Tris_HCl,pH8.5,2mm ol /T, L-Cysteine, 0.4mmol/L L-Cystine)平衡,將溶解的變性??寡?tablysin在AKTA prime plus上泵入層析柱,上樣結(jié)束后,用流動相沖洗5個柱體積。然后流動相T-流動相 TT (20mmol/L Tris-HCl,pH8.5, 2mmol/LL-Cysteine, 0.4mmo1 /T, L-Cystine)梯度洗脫 200ml。最后用流動相 TTT (SOOmmol /T,T -Arginine, 20mmo1 /T, Tris-HCl,pH8.5, 2mmol/L L-Cysteine,0.4mmol/LL-Cystine)洗脫。蛋白復(fù)性率達(dá) 75%。
[0044]實施例6:強(qiáng)陽離子交換層析介質(zhì)CM Sepharose FF在pH9.0的條件下對牛蛇抗血栓酶kfpase進(jìn)行柱上復(fù)性
[0045]牛虻抗血栓酶kfpase基因工程菌(江蘇柯菲平醫(yī)藥有限公司)發(fā)酵后,取30g菌泥,用裂解液(20mmol/L Tris-HCl,pH9.0,500mmol/L NaCl,5%甘油,lmmol/L EDTA)重懸,在固液比為1: 30的條件下,混合成均一的懸液,倒入高壓破碎儀(ATS)中進(jìn)行破碎,繼而通過離心分離得到濕的包涵體粗品。
[0046]將上述得到的粗包涵體用緩沖液A(20mmol/L Tris-HCl, pH9.0, 500mmol/LNaCl)和緩沖液 B(20mmol/L Tris-HCl, pH9.0,500mmol/L NaCl,2mol/L Urea)依次洗滌,得到高純度包涵體。
[0047]取5g高純度包涵體,以固液比1: 40的比例用溶解液(20mmol/L Tris-HCl,pH9.0, 30mmol/L DTT, 6mol/L Urea)溶解,室溫溫和攪拌1_2小時,離心得上清液200ml,并用Lowry法測定蛋白濃度。
[0048]將CMSepharose FF層析柱用流動相 I (6mol/L Urea, 20mmol/L Tris_HCl,pH9.0,2mmol /T, L-Cysteine, 0.4mmol/L L-Cystine)平衡,將溶解的變性??寡?tablysin在AKTA prime plus上泵入層析柱,上樣結(jié)束后,用流動相沖洗5個柱體積。然后流動相T-流動相 TT (20mmol/L Tris-HCl,pH9.0, 2mmol/LL-Cysteine, 0.4mmo1 /T, L-Cystine)梯度洗脫 200ml。最后用流動相 TTT (SOOmmol /T,T -Arginine, 20mmo1 /T, Tris-HCl,pH9.0, 2mmol/L L-Cysteine,0. 4mmol/LL-Cystine)洗脫。蛋白復(fù)性率達(dá) 70%。
【權(quán)利要求】
1.一種牛虻抗血栓酶kfpase的復(fù)性方法,其包括如下步驟: (1)柱平衡:用流動相I平衡常規(guī)離子交換層析介質(zhì),其中流動相I為尿素6-8mol/L,三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) 20-50mmol/L,pH 8.0-9.5, L-半胱氨酸l-3mmol/L,L-胱氨酸 0.2-0.6mmol/L ; (2)變性蛋白的吸附:用含5-30mmol/L還原劑的6-8mol/L尿素的變性緩沖液溶解包涵體,吸附到流動相I平衡的離子交換層析柱上; (3)變性蛋白的柱上復(fù)性:將步驟(2)中被吸附的蛋白用流動相I沖洗0-5個柱體積,流動相II沖洗20個柱體積,沖洗流速為0.l-2ml/min,使蛋白質(zhì)在柱上逐漸形成天然結(jié)構(gòu),其中流動相II為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) 20-50mmol/L,pH 8.0-9.0, L-半胱氛酸 1 -3mmoI /T,, L- Jj光氛酸 0.2-0.Bmmol /L,; (4)復(fù)性蛋白洗脫:將步驟(3)中蛋白質(zhì)用流動相III洗脫0-5個柱體積;其中流動相III為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) 20-50mmol/L,pH 8.0-9.5, L-半胱氨酸l-3mmol/L, L- Jj光氛酸 0.2-0.Bmmol /T,, L-精氛酸 0.2-lmol/L。
2.如權(quán)利要求1所述復(fù)性方法,其中步驟(1)所述的離子交換層析介質(zhì)為SPSepharoseFast Flow 或者 CM Sepharose Fast Flow。
3.如權(quán)利要求1所述復(fù)性方法,其中步驟(2)所述的還原劑為β巰基乙醇或二硫蘇糖醇。
【文檔編號】C12N9/68GK103898082SQ201210567665
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月25日
【發(fā)明者】秦引林, 吳旭亞, 韓承業(yè) 申請人:江蘇柯菲平醫(yī)藥有限公司