專利名稱：一種水產(chǎn)遲鈍愛德華氏菌快速藥敏檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)致病微生物體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水產(chǎn)動(dòng)物病原細(xì)菌遲鈍愛德華氏菌的快速藥敏檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害問題也日益突出，其中細(xì)菌性疾病已在世界范圍內(nèi)對(duì)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失。遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)是一種水產(chǎn)動(dòng)物重要的致病菌，可以感染包括淡水與海水養(yǎng)殖的多種魚類，并能在短期內(nèi)引起大量死亡。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，抗生素的使用仍是解決水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病的重要手段，它能在短期起到良好的治療效果，但由于抗生素在養(yǎng)殖動(dòng)物疾病防治上的廣泛和長期使用，水產(chǎn)耐藥微生物種類及數(shù)量得到不斷攀升。近年來，抗藥性遲鈍愛德華氏菌菌株也陸續(xù)地被分離到，在這種情況下如果無選擇地盲目使用抗生素，不但得不到理想的治療效果，反應(yīng)會(huì)使得菌株的耐藥性進(jìn)一步加劇，從而給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)甚至人類生命健康安全帶來更為嚴(yán)重的危害。因此，為了有針對(duì)性地使用抗生素藥物以達(dá)到理想的治療效果，對(duì)病原微生物開展抗生素敏感試驗(yàn)，以獲知菌株的耐藥特性，對(duì)于指導(dǎo)臨床科學(xué)、合理、準(zhǔn)確用藥，避免疾病的暴發(fā)流行及微生物耐藥性加劇起著關(guān)鍵性的作用。目前，藥敏檢測(cè)方法主要采用K-B紙片法與肉湯稀釋法，其中K-B紙片法一般須在專業(yè)的微生物實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，需要具備專業(yè)知識(shí)的人員來操作完成，存在操作繁瑣、工作量大、周期長等問題，而且無法獲得藥物的最小抑菌濃度(MIC)值。肉湯稀釋法雖然可以測(cè)定藥物的MIC值，但實(shí)驗(yàn)周期長，有時(shí)需要專業(yè)的儀器設(shè)備輔助，且對(duì)結(jié)果判讀不夠直觀。因此，以上兩種方法都不適合在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的遲鈍愛德華氏菌快速藥敏檢測(cè)試劑盒，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒，由檢測(cè)板、菌體采集工具、增菌液、藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基、顯色指示劑、比濁管和比色卡組成；其中檢測(cè)板包含有用于藥敏檢測(cè)的、包被了含有不同濃度藥物和顯色指示劑的檢測(cè)孔，所述顯色指示劑為阿爾瑪藍(lán)。所述的菌體采集工具為無菌接種環(huán)或無菌吸管；所述的增菌液的，其組份及濃度如下牛肉浸粉6 g/L、可溶性淀粉1. 5 g/L、酪蛋白水解物 17. 5g/L、NaCl 10g/L、CaCl2 2. 8mg/L、MgCl2 4mg/L、魚肉蛋白胨 10g/L。所述的藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基的組成如下牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 10g、2.8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、蒸懼水 I L。所述的包被了含有藥物的檢測(cè)孔，是將藥物與海藻糖水溶液混合，加入到檢測(cè)孔中進(jìn)行陰干制成。本發(fā)明檢測(cè)板還包含有用做質(zhì)量控制的檢測(cè)孔和/或生長對(duì)照的檢測(cè)孔。
其中質(zhì)量控制的檢測(cè)孔和生長對(duì)照的檢測(cè)孔，是將超純水與海藻糖水溶液混合后加入到檢測(cè)孔中進(jìn)行陰干制成。上述的一種檢測(cè)板，包含有96個(gè)檢測(cè)孔，呈8行X 12列排列。所述的藥物為氨芐青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、強(qiáng)力霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、恩諾沙星或利福平。利用本藥敏檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法按照以下步驟進(jìn)行I)利用無菌接種環(huán)挑取前期分離純化的遲鈍愛德華氏菌單菌落，置于增菌液管內(nèi)攪動(dòng)混勻，然后將增菌液管置于28 °C培養(yǎng)箱內(nèi)震蕩培養(yǎng)，直至增菌液濁度與O. 5麥度比濁管的濁度相當(dāng)。2)將增菌后的菌液以藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基將其稀釋1500倍，然后分別滴加于藥敏檢測(cè)和生長對(duì)照的檢測(cè)孔內(nèi)，每孔滴加90 μ I菌液；而質(zhì)量控制的檢測(cè)孔內(nèi)加入90 μ I無菌的
藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基。3)在每個(gè)微孔內(nèi)加入10 μ I顯色指示劑，置于28°C培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)8_12h，取出檢測(cè)板觀察微孔內(nèi)的顏色，進(jìn)行藥敏結(jié)果判讀，判讀標(biāo)準(zhǔn)如下A、若質(zhì)控區(qū)顏色呈藍(lán)色，則試驗(yàn)有效，可以繼續(xù)進(jìn)行判讀；若呈粉紅色，則試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行檢測(cè)。B、若生長對(duì)照區(qū)呈粉色，則可以繼續(xù)進(jìn)行MIC判讀；若生長對(duì)照區(qū)呈藍(lán)色則需將檢測(cè)板置于28°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，至顏色變?yōu)榉奂t色后，再進(jìn)行MIC判讀。C、若質(zhì) 控區(qū)呈藍(lán)色，生長對(duì)照區(qū)呈粉紅色，則判讀各列不同藥物對(duì)菌體的MIC，其中每列與比色卡上細(xì)菌增殖陰性對(duì)照區(qū)內(nèi)顏色相同微孔的最低藥物包被濃度即為待測(cè)弧菌的MIC。 本發(fā)明根據(jù)水生動(dòng)物病原菌的生長需求，在MH培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加魚肉蛋白胨、Ca2+和Mg2+，調(diào)整了 NaCl濃度，作為遲鈍愛德華氏菌的增菌液，可有效促進(jìn)水產(chǎn)遲鈍愛德華氏菌的生長，使得待測(cè)菌液在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到要求濃度，以縮短藥敏檢測(cè)的時(shí)間。同時(shí)本發(fā)明利用一種對(duì)細(xì)胞安全、無毒的藍(lán)色染料阿爾瑪藍(lán)作為生長指示劑，基于氧化/還原反應(yīng)原理，當(dāng)細(xì)菌生長增殖時(shí)，由于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)產(chǎn)生的還原力可將阿爾瑪藍(lán)顯色劑還原，從而使其顏色由氧化態(tài)下的藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)下的粉紅色，這一顏色變化可利用肉眼進(jìn)行直接判斷。由于阿爾瑪藍(lán)染料對(duì)細(xì)胞無毒害作用，直接將其加入藥敏檢測(cè)板微孔內(nèi)不會(huì)影響細(xì)菌的生長，從而使得檢測(cè)操作更加簡便、快速，而且可連續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)菌的增殖動(dòng)態(tài)，因此本發(fā)明是一種簡便、快捷、敏感、高效的藥敏檢測(cè)方法。


圖1 :本發(fā)明的一種檢測(cè)板的不同藥物種類及含量的包被示意圖。圖2 :本發(fā)明的比色卡的示意圖。圖3 :不同增菌液配方對(duì)遲鈍愛德華氏菌生長的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明試劑盒所用到的組份如下
I)藥敏檢測(cè)板為常規(guī)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，也可是其它類型的細(xì)胞培養(yǎng)板；2)菌體采集工具為無菌接種環(huán)或一次性無菌塑料接種環(huán)3)增菌液的一種配制方法如下牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物17. 5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2>4 mg MgCl2、魚肉蛋白胨 10 g、蒸懼水 I L ；4)0. 5 麥?zhǔn)媳葷峁埽且?O. 5ml 的 O. 048M BaCl2 溶液與 99. 5ml 的 O. 36M H2SO4 溶液(1%濃度，V/V)混合配制裝于密閉的透明小管內(nèi)；也可選用商品化的麥?zhǔn)媳葷峁埽?)比色卡其上劃分有細(xì)菌增殖陽性對(duì)照區(qū)及細(xì)菌增殖陰性對(duì)照區(qū)(圖2)，其中從細(xì)菌增殖陰性對(duì)照區(qū)到細(xì)菌增殖陽性對(duì)照區(qū)的顏色從藍(lán)色(RGB44、19、185)至粉紅色(RGB :255，143，218)漸變；6)選用的藥品粘附保護(hù)劑海藻糖為試劑級(jí)純度大于99%，顯色指示劑采用試劑級(jí)的阿爾瑪藍(lán)染料，該染料是一種對(duì)細(xì)胞安全、無毒的氧化/還原指示染料，當(dāng)細(xì)菌生長增殖時(shí)，由于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)產(chǎn)生的還原力可將阿爾瑪藍(lán)染料發(fā)生還原，從而使其顏色由氧化態(tài)下的藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)下的粉紅色，這一顏色變化可利用肉眼進(jìn)行直接判斷。實(shí)施例1 :水產(chǎn)遲鈍愛德華氏菌藥敏快速檢測(cè)微孔板的制備1、藥物的配置依據(jù)水產(chǎn)常用藥物種類和禁用藥物目錄，確定檢測(cè)藥物的種類為氨芐青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、強(qiáng)力霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、利福平，共11種。根據(jù)不同藥物的特性分別采用不同的溶劑準(zhǔn)確配制成濃度為6. 4mg/ml、
6.4mg/ml、5. 1 2mg/ml、6. 4mg/ml、6. 4mg/ml、5. 12mg/ml、6. 4mg/ml、1. 28mg/ml、5. 12mg/ml、
2.56mg/ml、3. 2mg/ml的抗菌藥物儲(chǔ)液,其中氨節(jié)青霉素、硫酸鏈霉素、阿米卡星、鹽酸土霉素、新霉素、強(qiáng)力霉素、多粘菌素B用超純水配制；氟苯尼考、利福平用甲醇溶解，超純水稀釋配制；恩諾沙星用O.1N的NaOH溶解，超純水稀釋配制；SMZ用O.1NNaOH溶解，超純水稀釋配制，TMP用O.1N的冰醋酸溶解，超純水稀釋配制，以SMZ:TMP=5:1的比例混合配制成復(fù)方新諾明。配制好的藥物儲(chǔ)液經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾后，置于_20°C保存。2、藥敏檢測(cè)微孔板的制備水產(chǎn)遲鈍愛德華氏菌藥敏快速檢測(cè)板為96孔無菌微孔板，共有8行(A-H) 12列(1-12)，根據(jù)用途不同分為三個(gè)區(qū)域藥敏檢測(cè)區(qū)(A1:H11)、生長對(duì)照區(qū)(A12:D12)、質(zhì)控區(qū)(E12:H12)，其中藥敏檢測(cè)區(qū)每一列微孔底部包被有不同種類濃度呈倍比稀釋的抗菌藥物。首先，將包被藥物稀釋成以下不同濃度氨芐青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、土霉素、強(qiáng)力霉素由高至低的稀釋濃度分別為0· 064 μ g/ μ 1、0· 032 μ g/ μ 1、0· 016 μ g/ μ 1、0· 008 μ g/ μ 1、0· 004 μ g/ μ 1、0· 002 μ g/μ 1、0·001 μ g/μ 1、0· 0005 μ g/μ I ；鏈霉素、新霉素、復(fù)方新諾明由高至低的稀釋濃度分別為0. 512μ g/μ1、
O.256 μ g/ μ1、O. 128 μ g/ μ1、O. 064 μ g/ μ 1、0. 032 μ g/ μ 1>0. 016 μ g/ μ 1>0. 008 μ g/μ1、0·004 μ g/μ I ；恩諾沙星由高至低的稀釋濃度分別為0. 256 μ g/μ 1,0. 128 Ug/μ 1,0. 064 μ g/μ 1、0. 032 μ g/ μ 1、0. 016 μ g/ μ 1、0. 008 μ g/ μ 1、0. 004 μ g/ μ 1、0. 002 μ g/ μ I ；多粘菌素B由高至低的稀釋濃度分別為0. 128 μ g/μ 1、0. 064 μ g/ μ1、O.032 μ g/ μ 1>0. 016 μ g/ μ 1>0. 008 μ g/ μ 1、0· 004 μ g/ μ 1、0· 002 μ g/ μ1、0· 001 μ g/μ I ；利福平由高至低的稀釋濃度分別為0. 032 μ g/μ 1,0. 016 μ g/μ 1,0. 008 μ g/μ 1、0. 004 μ g/ μ 1、0. 002 μ g/ μ 1、0. 001 μ g/ μ 1、0. 0005 μ g/ μ 1、0. 00025 μ g/ μ I。然后，用超純水配置lmg/ml的海藻糖溶液，用O. 22 μ m濾膜過濾，將配置好的海藻糖溶液分別與以上不同稀釋度的藥物按體積比1:1混合，分別取不同濃度的藥物混合液20μ I對(duì)應(yīng)地加入微孔板檢測(cè)區(qū)內(nèi)(A1:H11)。在生長對(duì)照區(qū)(A12:D12)及質(zhì)控區(qū)(E12:H12)內(nèi)加入以無菌超純水與海藻糖溶液1:1混合液20μ I。將微孔板置于無菌超凈臺(tái)內(nèi)室溫陰干，最終獲得藥敏檢測(cè)微孔板，4°C保存?zhèn)溆?，其具體藥物包被種類及包被量如圖1所示。實(shí)施例2 :快速增菌液的優(yōu)選為實(shí)現(xiàn)遲鈍愛德華氏菌快速生長以縮短藥敏檢測(cè)過程，在Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行改良以制成增菌液，改良配方為ΜΗ0 (牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、蒸懼水 I L)、MHl(牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1.5 g、酪蛋白水解物17.5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2,4mg MgCl2、10%魚湯、蒸餾水I L)和MH2 (牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物17. 5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、魚肉蛋白胨 10 g、蒸懼水 I L)。為測(cè)定不同增菌液配方對(duì)遲鈍愛德華氏菌的增殖效果，分別吸取I ml過夜培養(yǎng)的遲鈍愛德華氏菌菌液轉(zhuǎn)入100 ml MHO,MHl和MH2中，混合均勻后取5 mL菌液加入13支無菌試管中，置于28°C搖床180 rpm振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，于600 nm波長下測(cè)定O. D值，以培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，繪制不同細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長曲線。結(jié)果顯示三種改良配方中，MH2培養(yǎng)基可以縮短遲鈍愛德華氏菌的生長延滯期，使遲鈍愛德華氏菌快速進(jìn)入指數(shù)生長期，具有最好的細(xì)菌增殖效果，因此以下實(shí)施例均選用MH2培養(yǎng)基作為增菌液。
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實(shí)施例3 :應(yīng)用水產(chǎn)遲鈍愛德華氏菌藥敏快速檢測(cè)微孔板進(jìn)行藥敏檢測(cè)對(duì)比I)從固體培養(yǎng)基平板上挑取遲鈍愛德華氏菌JF-1單菌落，將其接種于增菌液中，置于28°C培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速120rpm)至肉眼可見渾濁。其中所述的遲鈍愛德華氏菌增菌液的配方為牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1. 5g、酪蛋白水解物17. 5g、NaCl 10g、魚肉蛋白胨 10g、lmgCa2+、lmgMg2+、蒸懼水 1L。2)將增菌液用檢測(cè)培養(yǎng)液調(diào)整濃度至O. 5麥度，再稀釋1500倍，使菌體濃度達(dá)到IX IO5個(gè)/ml用于藥敏檢測(cè)使用。其中所述的檢測(cè)培養(yǎng)液的配方為牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1. 5g、酪蛋白水解物 17. 5g、NaCl 10g、lmgCa2+、lmgMg2+、蒸懼水 1L。3)以粗頭接種滴管向質(zhì)控區(qū)內(nèi)的每個(gè)微孔里滴加2滴(90μ I)檢測(cè)培養(yǎng)液，將稀釋好的菌液分別滴加于微孔檢測(cè)板的藥敏檢測(cè)區(qū)及生長對(duì)照區(qū)，每孔滴加2滴。然后，在藥敏檢測(cè)微孔板每個(gè)微孔內(nèi)用細(xì)頭接種滴管滴加I滴( ομ I)顯色指示劑，置于28°C培養(yǎng)箱中靜置避光培養(yǎng)8-12h，取出藥敏檢測(cè)微孔板肉眼觀察記錄各微孔內(nèi)的顏色變化情況。4)同時(shí)，取一塊預(yù)先參照實(shí)施例1同等操作制備的包被不同藥物的96孔無菌酶標(biāo)板，參照藥敏檢測(cè)微孔板平行地滴加待檢菌液。然后置于28°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在藥敏檢測(cè)微孔板進(jìn)行MIC結(jié)果判讀的同時(shí)，將接種有待檢菌的酶標(biāo)板以酶標(biāo)儀在595 nm波長下測(cè)定各微孔的吸光值。
5)與此同時(shí)，采用常規(guī)試管稀釋法進(jìn)行MIC測(cè)定。在試管中接種Iml濃度為IO5個(gè)/mL菌液，分別在每個(gè)試管中加入以上11種8個(gè)濃度梯度的抗菌藥物，終濃度與微孔檢測(cè)法相同，每個(gè)藥物濃度處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于28°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，肉眼觀察至試管出現(xiàn)明顯濁度，且濁度不再變化，記錄結(jié)果，以肉眼觀察未出現(xiàn)渾濁的試管對(duì)應(yīng)的最小藥物濃度為MIC。6)結(jié)果判讀(I)根據(jù)藥敏檢測(cè)微孔板內(nèi)的顏色變化情況對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行判讀，判讀標(biāo)準(zhǔn)如下a.若質(zhì)控區(qū)顏色呈藍(lán)色，則試驗(yàn)有效，可以繼續(xù)進(jìn)行判讀；若呈粉紅色，則試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行檢測(cè)。b.若生長對(duì)照區(qū)呈粉色，則可以繼續(xù)進(jìn)行MIC判讀；若生長對(duì)照區(qū)呈藍(lán)色則需將檢測(cè)板置于28°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，至顏色變?yōu)榉奂t色后，再進(jìn)行MIC判讀。c.若質(zhì)控區(qū)呈藍(lán)色，生長對(duì)照區(qū)呈粉紅色，則判讀各列不同藥物對(duì)菌體的MIC，其中每列與比色卡上細(xì)菌增殖陰性對(duì)照區(qū)內(nèi)顏色相同微孔的最低藥物包被濃度即為待測(cè)弧菌的MIC。最終藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示，利用顯色指示劑的微孔檢測(cè)板結(jié)果表明不同藥物不同濃度對(duì)遲鈍愛德華氏菌生長的抑制作用不同，以每列藥物包被孔內(nèi)顏色與比色卡上細(xì)菌增殖陰性對(duì)照區(qū)顏色相同測(cè)試孔的最低藥物濃度即為MIC，結(jié)果顯示，氨芐青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素 、強(qiáng)力霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、利福平對(duì)遲鈍愛德華氏菌的 MIC 分別為 O. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、1.6 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、6. 4 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 05 μ g/ml。(2)同時(shí)，根據(jù)酶標(biāo)板內(nèi)各微孔的吸光值對(duì)微孔內(nèi)的細(xì)菌存活率進(jìn)行計(jì)算，具體計(jì)算方法為細(xì)菌存活率=(藥物組O. D-空白對(duì)照組O. D) / (藥物陰性對(duì)照組O. D-空白對(duì)照組O. D) X 100%,將細(xì)菌存活率彡20%微孔內(nèi)的最低藥物濃度判定為MIC值，結(jié)果顯示，氨芐青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、強(qiáng)力霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、利福平對(duì)遲鈍愛德華氏菌的MIC分別為O. 4μ g/ml、0. 8μ g/ml、3. 2μ g/ml>0. 4 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、1. 6 μ g/ml、0. 4 μ g/ml>0. 8 μ g/ml>6. 4 μ g/ml、3.2 μ g/ml、
0.05 μ g/ml,結(jié)果與顯色法完全吻合。(3)通過觀察試管稀釋法測(cè)定MIC的結(jié)果顯示，各試管的濁度需要在28°C培養(yǎng)24h后才能趨于穩(wěn)定，肉眼無法觀察到明顯渾濁試管中不同藥物的最低濃度為MIC，結(jié)果顯示，氨芐青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、強(qiáng)力霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、利福平分別為 O. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、
1.6 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、6. 4 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 05 μ g/ml,結(jié)果與顯色法及分光光度法完全吻合。綜上所述，利用分光光度比濁法計(jì)算細(xì)菌存活率，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌存活率< 20%的測(cè)試孔所對(duì)應(yīng)的最小抑菌藥物濃度與阿爾瑪藍(lán)顯色法的結(jié)果一致。同時(shí)，試管稀釋法測(cè)定出的MIC也與以上兩種方法結(jié)果一致。因此，本發(fā)明利用阿爾瑪藍(lán)作為顏色指示劑結(jié)合制備的藥敏檢測(cè)微孔板可以準(zhǔn)確有效地應(yīng)用于水產(chǎn)遲鈍愛德華氏菌的藥敏檢測(cè)。本發(fā)明操作簡便，觀察方法直觀，結(jié)果穩(wěn)定易讀，檢測(cè)時(shí)間短，可以作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中遲鈍愛德 華氏菌敏感藥物的快速檢測(cè)，能夠大大縮短藥物篩選的時(shí)間，有助于養(yǎng)殖過程中愛德華氏菌病的預(yù)防和治療，降低疾病暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，為漁業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來潛在效益，具有廣闊的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種水產(chǎn)遲鈍愛德華氏菌快速藥敏檢測(cè)試劑盒，由檢測(cè)板、菌體采集工具、增菌液、藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基、比濁管和比色卡組成；其中檢測(cè)板包含有用于藥敏檢測(cè)的、包被了含有藥物和顯色指示劑的檢測(cè)孔，所述顯色指示劑為阿爾瑪藍(lán)。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的菌體采集工具為無菌接種環(huán)或無菌吸管。
3.一種用于權(quán)利要求1所述的試劑盒的增菌液，其組份及濃度如下牛肉浸粉6 g/L、可溶性淀粉1. 5 g/L、酪蛋白水解物 17. 5g/L、NaCl 15g/L、CaCl22. 8 mg/L、MgCl2 4 mg/L、魚肉蛋白胨10g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基的組成如下牛肉浸粉 6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 15g、2. 8 mg CaCl2,4 mg MgCl2'蒸餾水I L。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的包被了含有藥物的顯色指示劑的檢測(cè)孔，是將溶解有藥物的海藻糖水溶液與顯色指示劑阿爾瑪藍(lán)混合，加入到檢測(cè)孔中進(jìn)行陰干制成。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測(cè)板還包含有用做質(zhì)量控制的檢測(cè)孔和/或生長對(duì)照的檢測(cè)孔。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述的質(zhì)量控制的檢測(cè)孔和生長對(duì)照的檢測(cè)孔，是將海藻糖水溶液和顯色指示劑阿爾瑪藍(lán)混合，加入到檢測(cè)孔中進(jìn)行陰干制成。
8.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的比色卡上劃分有細(xì)菌增殖陽性對(duì)照區(qū)及細(xì)菌增殖陰性對(duì)照區(qū)，其中細(xì)菌增殖陰性對(duì)照區(qū)到細(xì)菌增殖陽性對(duì)照區(qū)的顏色從藍(lán)色(RGB44、19、185)至粉紅色(RGB :255，143,218)漸變。
9.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的藥物為氨芐青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、恩諾沙星或利福平。
10.權(quán)利要求1所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括如下的步驟 1)利用無菌接種環(huán)挑取前期分離純化的遲鈍愛德華氏菌單菌落，置于增菌液管內(nèi)攪動(dòng)混勻，然后將增菌液管置于28 °C培養(yǎng)箱內(nèi)震蕩培養(yǎng)，直至增菌液濁度與O. 5麥度比濁管的濁度相當(dāng)； 2)將增菌后的菌液以藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基將其稀釋1500倍，然后分別滴加于藥敏檢測(cè)和生長對(duì)照的檢測(cè)孔內(nèi)，每孔滴加90 μ I菌液；而質(zhì)量控制的檢測(cè)孔內(nèi)加入90 μ I無菌的藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基； 3)在每個(gè)微孔內(nèi)加入10μ I顯色指示劑，置于28°C培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)8-12h，取出檢測(cè)板觀察微孔內(nèi)的顏色，進(jìn)行藥敏結(jié)果判讀，判讀標(biāo)準(zhǔn)如下 A、若質(zhì)控區(qū)顏色呈藍(lán)色，則試驗(yàn)有效，可以繼續(xù)進(jìn)行判讀；若呈粉紅色，則試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行檢測(cè)； B、若生長對(duì)照區(qū)呈粉色，則可以繼續(xù)進(jìn)行MIC判讀；若生長對(duì)照區(qū)呈藍(lán)色則需將檢測(cè)板置于28°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，至顏色變?yōu)榉奂t色后，再進(jìn)行MIC判讀； C、若質(zhì)控區(qū)呈藍(lán)色，生長對(duì)照區(qū)呈粉紅色，則判讀各列不同藥物對(duì)菌體的MIC，其中每列與比色卡上細(xì)菌增殖陰性對(duì)照區(qū)內(nèi)顏色相同微孔的最低藥物包被濃度即為待測(cè)弧菌的MIC。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的遲鈍愛德華氏菌快速藥敏檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒，包括有檢測(cè)板、菌體采集工具、增菌液、藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基、比濁管及比色卡；其中檢測(cè)板包含有用于藥敏檢測(cè)的、包被了含有藥物和顯色指示劑的檢測(cè)孔，所述顯色指示劑為阿爾瑪藍(lán)。本發(fā)明在MH培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加魚肉蛋白胨、Ca2+和Mg2+，調(diào)整NaCl濃度，作為遲鈍愛德華氏菌的增菌液，可有效促進(jìn)遲鈍愛德華氏菌的生長，使得增菌液在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到要求濃度，以縮短藥敏檢測(cè)的時(shí)間。同時(shí)利用一種對(duì)細(xì)胞安全、無毒的藍(lán)色染料阿爾瑪藍(lán)，對(duì)細(xì)胞無毒害作用，直接將其包被在藥敏檢測(cè)板微孔內(nèi)不會(huì)影響細(xì)菌的生長，從而使得檢測(cè)操作更加簡便、快速，可連續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)菌增殖動(dòng)態(tài)。
文檔編號(hào)C12Q1/20GK103060186SQ20121057121
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者刁菁, 楊秀生, 葉海斌, 薛蓮, 蓋春蕾 申請(qǐng)人:山東省海水養(yǎng)殖研究所