專利名稱：一種從堆肥中快速、高效篩選拮抗細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和生物防治領(lǐng)域，具體涉及一種從堆肥中快速、高效篩選拮抗細(xì)菌的方法。
背景技術(shù)：
土傳病害是一種危害極其嚴(yán)重的植物病害。大量施用化肥，土壤連作，管理不當(dāng)?shù)榷既菀自斐赏羵鞑『Φ谋l(fā)。病原菌通過侵入植物根部或莖部，引起植物死亡，造成重大的經(jīng)濟損失，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，每年因遭受植物病害引起的減產(chǎn)損失為總產(chǎn)量的109Γ15%。因而對土傳病害防治的研究一直是一個熱點和難點課題。傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥防治雖然能使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的集約化種植中出現(xiàn)的大規(guī)模發(fā)病的問題在短時間內(nèi)得到解決。但從長遠(yuǎn)來看，化學(xué)農(nóng)藥的長期使用會帶來諸多負(fù)面的影響。如藥劑殘留造成水源土壤的污染，危害人畜健康，長期使用農(nóng)藥病原菌容易產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防效下降甚至失敗。大量研究結(jié)果表明生物防治具有對環(huán)境和人畜安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，是一種經(jīng)濟有效的防治植物病害的方法，具有廣闊的前景。因而尋求新的、高效的可替代化學(xué)試劑的生物生防資源，對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展具有重要的意義。堆肥(compost)是指在自然或人工強化接種微生物的情況下通過高溫發(fā)酵使有機物礦質(zhì)化、腐殖化和無害化變成腐熟肥料的過程。在堆肥過程中會產(chǎn)生各種營養(yǎng)類型的微生物群落，已有的研究表明這些豐富的微生物資源庫，也是一個潛在的生防菌庫。從堆肥中成功分離出諸如芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、克雷伯菌、木霉菌等拮抗菌用于土傳病害防治的報道屢見不鮮。但從堆肥中篩選拮抗細(xì)菌普遍采用的方法，與從土壤中篩選拮抗細(xì)菌普遍使用的方法類似。大體上都是先將堆肥制成堆肥懸浮液，而后將懸浮液等梯度稀釋后，用涂布棒均勻涂布到適合細(xì)菌生長的酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB)或大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)上，待涂布后的培養(yǎng)基長出菌落后，將菌落劃線純化，挑選形態(tài)不一樣的單菌落在適合真菌生長的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上采用對峙培養(yǎng)或點接法一一進行拮抗實驗。由于堆肥或土壤中含有的細(xì)菌數(shù)量繁多，涂布純化后長出的單菌落也成百上千，沒有針對性的一一挑選進行拮抗實驗，造成了很多繁瑣和重復(fù)的工作，且需要消耗大量的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿。工作量大、效率低是上述方法的最大缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對用傳統(tǒng)的稀釋平板涂布法從堆肥中篩選拮抗細(xì)菌工作量大、效率低這一問題，通過建立一種高效、快速的從堆肥中 篩選拮抗細(xì)菌的方法，以達(dá)到減少篩選工作量、縮短篩選時間，加快拮抗菌的開發(fā)和應(yīng)用，促進我國生物防治和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展目的。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種從堆肥中快速、高效篩選拮抗細(xì)菌的方法，其特征在于按照以下幾個步驟進行
(I)拮抗菌的初篩將堆肥懸浮液涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上后再直接涂布致病菌孢子懸浮液，使細(xì)菌與致病菌直接對峙，優(yōu)選制備重量百分比為10%堆肥原液后，依次制備稀釋度為10—1，IO-2, IO-3, IO-4, IO-5, IO-6的堆肥懸浮液，堆肥懸浮液涂布的量為100μ I，致病菌孢子懸浮液涂布的量為200 μ 1，濃度為IXlO6CFU/ ml。(2)目標(biāo)細(xì)菌的純化待平板上形成抑菌圈后，從抑菌圈內(nèi)將混合的目標(biāo)細(xì)菌進行劃線，純化，優(yōu)選純化直至每個培養(yǎng)皿中細(xì)菌菌落的形狀、大小和顏色相同。(3)拮抗細(xì)菌的復(fù)篩采用平板對峙法將純化的目標(biāo)細(xì)菌的菌液分別點接到含有病原菌的平板上，通過觀察抑菌圈的有無，篩選出拮抗菌。本發(fā)明所述的篩選出拮抗細(xì)菌的方法，具體可按照下述步驟進行
一、拮抗細(xì)菌的初篩
(I)配制固體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L)。(2)稱取10 g堆肥，加入含有90 ml無菌水的500 ml的三角瓶中，充分振蕩后將三角瓶置于37°C的搖床中200 r/min，搖瓶30 min。(3)吸取5 ml上述步驟制備的堆肥懸浮液加到含有45ml無菌水的150ml的三角瓶中，制成1(Γ2的堆肥懸浮液，混合均勻。再如此依次配制10Λ 1(Γ4，1(Γ5，1(Γ6的系列堆肥稀釋液。(4)用移液槍分別吸取上述系列堆肥稀釋液100 μ I，滴在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，然后用涂布棒將其均勻涂布。(5)待涂布了堆肥懸浮液的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的平板在操凈臺內(nèi)自然風(fēng)干后，在平板上滴取200 μ I用滅菌的生理鹽水重懸的，濃度為IX IO6CFU/ ml的病原菌孢子懸浮液，并用涂布棒均勻涂布。(6)將上述涂布好堆肥懸浮液和病原菌孢子懸浮液的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的平板用封口膜封好后，置于30 1的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7-10天。二、目標(biāo)細(xì)菌的純化
待上述馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板在培養(yǎng)箱內(nèi)生長7-10天后，平板上會長滿大量病原菌的菌絲，有目標(biāo)細(xì)菌的平板，在真菌周圍會出現(xiàn)抑菌帶或抑菌圈，圈內(nèi)不長真菌或菌絲長的較周圍菌絲薄，且圈內(nèi)能明顯看到細(xì)菌。這些抑菌圈內(nèi)的細(xì)菌即為目標(biāo)細(xì)菌。但此時的目標(biāo)細(xì)菌為混合細(xì)菌，用接種環(huán)挑取不同抑菌圈內(nèi)的細(xì)菌在固體酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線。于30 °C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一天，待酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基上長出單菌落后，觀察每個平板中菌落的形態(tài)，如果發(fā)現(xiàn)同一培養(yǎng)皿中出現(xiàn)形狀、大小和顏色不同的細(xì)菌菌落，則用接種環(huán)挑取劃線，進一步進行純化。直至每個培養(yǎng)皿中細(xì)菌形狀、大小和顏色均相同。三、拮抗細(xì)菌的復(fù)篩
用牙簽挑取已經(jīng)純化好的在固體酵母膏蛋白胨培養(yǎng)的細(xì)菌單菌落，接種于含有50 ml酵母膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基的150 ml三角瓶中，30 0C >200 r/min搖至對數(shù)期。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板的中央，轉(zhuǎn)接用打孔器(直徑5cm)在致病菌菌落邊緣區(qū)域打孔制成的菌塞，在距中央致病菌約2. 5 cm處的四周(四點等距)，分別點接對數(shù)期菌液O. 5 μ I。接種好后，用封口膜封好，于30 V的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天左右。通過觀察抑菌圈的有無，進一步判斷所篩選的細(xì)菌是否為拮抗菌。四、菌種的保存
將通過復(fù)篩確定的對植物病原菌具有拮抗作用的細(xì)菌，在液體酵母膏蛋白胨培養(yǎng)上30 °C >200 r/min搖至對數(shù)期后吸取800 μ I加入裝有200 μ I滅過菌的甘油管中。封口膜封好后置于-70°C保存。本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明在傳統(tǒng)的海量式的用稀釋平板涂布法即先涂布，然后挑取單菌落，對單菌落采用一一平板對峙篩選拮抗菌的基礎(chǔ)中。對篩選方法進行了改進，采用先將細(xì)菌與致病菌直接對峙，即將堆肥懸浮液涂布后直接再涂布致病菌孢子懸浮液，待形成抑菌圈后，從抑菌圈內(nèi)將混合的目標(biāo)細(xì)菌進行劃線，再挑取單個目標(biāo)菌落進行平板對峙的方法，篩選拮抗細(xì)菌。本發(fā)明使用的材料與傳統(tǒng)方法相似，具有成本低廉的特點。與傳統(tǒng)的篩選方法相比，該發(fā)明縮小了篩選對象的范圍，大大減少了工作量，縮短了拮抗菌的篩選時間，提高了篩選效率。本發(fā)明加快了生防菌的開發(fā)和利用，促進了我國生物防治和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，具有重要的實際應(yīng)用價值。


圖1醋糟懸浮液和黃瓜尖孢鐮刀菌病原菌共同涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后，平板上抑菌圈的出現(xiàn)。圖2目標(biāo)細(xì)菌純化后在酵母膏蛋白胨培養(yǎng)上形成的菌落。圖3從醋糟堆肥中篩選到的拮抗菌對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型病原菌的拮抗效果。
具體實施例方式以下以醋糟堆肥為例，說明快速、高效篩選植物病原菌尖孢鐮刀菌黃瓜?；娃卓咕姆椒?，但不受實施例限制。 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實施例并參照數(shù)據(jù)進一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。實施例1、醋糟堆肥中拮抗細(xì)菌的初篩
(I)配制固體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L)。(2)稱取10 g醋糟堆肥，加入裝有90 ml無菌水的500 ml的三角瓶中，充分振蕩后將三角瓶置于37°C的搖床中200 r/min，搖瓶30 min。(3)用移液槍吸取5ml上述步驟制備的醋糟懸浮液加到含有45ml無菌水的150ml的三角瓶中，制成10_2的堆肥懸浮液，混合均勻。再如此依次配制10_3，10Λ 10_5，10_6的系列堆肥稀釋液。(4)用移液槍分別吸取上述系列堆肥稀釋液100 μ I，滴在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，然后用涂布棒均勻?qū)⑵渫坎肌?5)待涂布了堆肥懸浮液的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的平板在操凈臺內(nèi)自然風(fēng)干后，在平板上滴取200 μ I用滅菌的生理鹽水重懸的，濃度為IX IO6CFU/ ml的尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡逆咦討腋∫?，并用涂布棒均勻涂布
(6)將上述涂布好了醋糟堆肥懸浮液和尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡咦討乙旱鸟R鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板用封口膜封好后，置于30 1的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天。實施例2、目標(biāo)細(xì)菌的純化
將實施例1中所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板在培養(yǎng)箱內(nèi)生長7天后，平板上長滿了大量的尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡木z，且在10_5和10_6的平板上能看到明顯的抑菌圈(見圖1)。用接種環(huán)挑取不同抑菌圈內(nèi)的細(xì)菌在固體酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基(酵母提取物5 g/1、蛋白胨10 g/l、氯化鈉10 g/l)上劃線。于30 °C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一天，待酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基上長出單菌落后，觀察每個平板中菌落的形態(tài)，并對不純的菌種進行劃線純化。直至每個培養(yǎng)皿中細(xì)菌菌落形狀、大小和顏色均相同(見圖2)。最后一共挑取了 34株純化好的細(xì)菌單菌落。實施例3、拮抗細(xì)菌的復(fù)篩
用牙簽挑取實施例2所篩出的34株在固體酵母膏蛋白胨培養(yǎng)的目標(biāo)細(xì)菌，接種于含有50 ml酵母膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基(酵母提取物5 g/Ι、蛋白胨10 g/Ι、氯化鈉10 g/Ι)的150 ml的三角瓶中，30 0C >200 r/min搖至對數(shù)期。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板的中央，轉(zhuǎn)接用打孔器(直徑5 cm)打好的尖孢鐮刀菌黃瓜?；途N，在距中央致病菌約2. 5cm處的四周(四點等距)，分別點接上述對數(shù)期的菌液O. 5 μ 。于30 1的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天左右。通過觀察抑菌圈的有無，一共篩選到8株拮抗菌，部分拮抗細(xì)菌對黃瓜尖孢鐮刀菌病原菌的拮抗效果圖如圖3所示。實施例4、菌種的保存和鑒定
將通過復(fù)篩確定的對植物病原菌具有拮抗作用的細(xì)菌，在液體酵母膏蛋白胨培養(yǎng)(酵母提取物5 g/l、蛋白胨10 g/l、氯化鈉10 g/1) 30 °C>200 r/min搖至對數(shù)期后用移液器槍吸取800 μ l菌夜加入裝有200 μ I滅過菌的甘油管中。封口膜封好后置于_70°C保存。通過16S rDNA分子鑒定分析發(fā)現(xiàn)，這8株拮抗菌分別從屬于多粘類芽孢桿菌、芽孢桿囷、克雷伯囷。
權(quán)利要求
1.一種從堆肥中快速、高效篩選拮抗細(xì)菌的方法，其特征在于按照以下幾個步驟進行 (1)拮抗菌的初篩將堆肥懸浮液涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上后再直接涂布致病菌孢子懸浮液，使細(xì)菌與致病菌直接對峙； (2)目標(biāo)細(xì)菌的純化待平板上形成抑菌圈后，從抑菌圈內(nèi)將混合的目標(biāo)細(xì)菌進行劃線，純化； (3)拮抗細(xì)菌的復(fù)篩采用平板對峙法將純化的目標(biāo)細(xì)菌的菌液分別點接到含有病原菌的平板上，通過觀察抑菌圈的有無，篩選出拮抗菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于制備重量百分比為10%堆肥原液后，依次制備稀釋度為ιοΛιοΛιοΛιοΛιοΛιο—6的堆肥懸浮液，堆肥懸浮液涂布的量為ΙΟΟμ 1，致病菌孢子懸浮液涂布的量為200 μ 1，濃度為IXlO6CFU/ ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)純化直至每個培養(yǎng)皿中細(xì)菌菌落的形狀、大小和顏色相同。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從堆肥中快速、高效篩選拮抗細(xì)菌的方法。先將堆肥懸浮液涂布于平板后，再直接在平板上涂布致病菌菌液，使目標(biāo)細(xì)菌與致病菌直接對峙，待形成抑菌圈后，從抑菌圈內(nèi)將混合的目標(biāo)細(xì)菌進行劃線純化，純化后再挑取單個目標(biāo)細(xì)菌進行平板對峙，從而篩選出拮抗細(xì)菌的方法。本發(fā)明成本低廉，極大減少了工作量，縮短了篩選拮抗菌的時間，提高了篩選效率。本發(fā)明加快了生防菌的開發(fā)和利用，促進了我國生物防治和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，具有重要的實際應(yīng)用價值。
文檔編號C12R1/22GK103013884SQ20121057133
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者李萍萍, 林英, 司春燦, 杜道林, 趙青松, 朱詠莉 申請人:江蘇大學(xué)