專利名稱：一種積累乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種積累乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙酰氨基葡萄糖是生物體內(nèi)的一種單糖，廣泛存在于細菌、酵母、霉菌、植物以及動物體內(nèi)。在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復(fù)和維持軟骨及關(guān)節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛作為藥物和營養(yǎng)膳食添加來治療和修復(fù)關(guān)節(jié)損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領(lǐng)域也具有諸多應(yīng)用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解蝦殼或蟹殼中甲殼素生產(chǎn)，此方法產(chǎn)生的廢液對環(huán)境污染較為嚴重，而且得到的產(chǎn)品易引起過敏反應(yīng)，不適宜海鮮過敏的人群服用。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養(yǎng)化學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被FDA認證為“generally regarded as safe” (GRAS)安全級別。 因此，運用代謝工程手段構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌是生產(chǎn)食品安全級乙酰氨基葡萄糖的有效途徑。然而，枯草芽孢桿菌中氨糖代謝途徑調(diào)控嚴密，并不會形成氨糖的積累。如何改造枯草芽孢桿菌中氨糖代謝途徑是一個值得深入探討的問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是構(gòu)建一種積累乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為
將外源葡萄糖乙?；妇幋a基因，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C)克隆到表達載體pP43NMK (核苷酸序列如SEQ ID NO. 1)，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis 168),通過改造代謝途徑,實現(xiàn)乙酰氨基葡萄糖的積累。
本發(fā)明優(yōu)選是用表達載體pP43NMK表達氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因。
本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建上述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟
I)構(gòu)建重組質(zhì)粒
克隆釀酒酵母的氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(GNA1)，連接到重組表達質(zhì)粒上；
2)構(gòu)建產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌
將上述重組 表達載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，得到產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌。
所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis 168 ;所述重組表達載體為pP43NMK。
本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的方法，將37° C、200rpm下培養(yǎng)12h的重組枯草芽孢桿菌以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于 37。C、200rpm條件下發(fā)酵30h。
重組枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵
種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCllO。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，胰蛋白胨10，酵母粉5，NaC110。
培養(yǎng)條件將37° C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基， 于37。C、200rpm條件下培養(yǎng)30h。
乙酰氨基葡萄糖的測定方法
高效液相色譜(HPLC)檢測法Agilent1200, RID 檢測器，NH2 柱(250X4. 6mm,5μ m),流動相:70%乙腈,流速O. 75mL/min,柱溫30。C,進樣體積為10 μ L。
本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌可實現(xiàn)乙酰氨基葡萄糖在胞外積累，其濃度可達到115mgL，為進一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法簡單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。
具體實施方式
實施例1重組質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)NCBI上公布的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C,購自美國典型微生物保藏中心，編號ATCC 204508)中氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNAl)核苷酸序列如 SEQ IDN0.1，設(shè)計引物GNA1-F5，-GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGCTTACCCG ATGGATTTTATA-3’，GNAl-R :5’ -CCCAAGCTTCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3’。使用上述引物從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C)基因組中擴增氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNAl)。擴增片段經(jīng)KpnI和HIndI 11雙酶切后連接至pP43NMK表達載體(美國弗吉尼亞理工大學(xué)，張曉舟博士惠贈)。酶切驗證并測序，確認重組質(zhì)粒PP43-GNA1構(gòu)建成功。
實施例2重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建
將構(gòu)建好的表達載體PP43-GNA1轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168，購自美國俄亥俄州立大學(xué)Bacillus遺傳保藏中心)。采用GNAl-F及GNAl-R引物挑選轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR，出現(xiàn)480bp條帶，驗證重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建成功。
實施例3發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖
將37° C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37° C、 200rpm條件下培養(yǎng)30h。最終發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量達到115mgL。過量表達氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNA1)，實現(xiàn)了乙酰氨基葡萄糖在重組枯草芽孢桿菌胞外的積累。
對照實施例1整合表達GNAl積累乙酰氨基葡萄糖
根據(jù)NCBI 上公`布 pP43NMK 質(zhì)粒序列(GenBank accessionno. DQ264732)及的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C)中氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNA1),設(shè)計引物 GNA1-2-F :5，-GGGGTACCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTG-3，，GNA1-2-R :5，-CGGGATCCCTA TTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3’。使用上述引物從pP43_GNAl擴增GNAl表達盒，擴增片段經(jīng) KpnI和BamHI雙酶切后連接至pM7Z6M整合載體(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，聞新博士惠贈)。pM7Z6M P43-GNA1經(jīng)線性化后，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisl68)，將GNAl整合至枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisl68)基因組。菌落PCR驗證GNAl基因整合成功。
將37° C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37° C、200rpm條件下培養(yǎng)30h。最終發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量達到25mgL。
對照實施例2誘導(dǎo)表達GNAl
根據(jù)NCBI上公布的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C)中氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(GNA1)，設(shè)計引物 GNA1-3-F :5’ -GGACTAGTATGAGCTTACCCGATGGATTTTAT A-3，，GNA1-3-R :5’ -CGGGATCCCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3，。使用上述弓 I物從釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiaeS288C)基因組中擴增氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNA1)。 擴增片段經(jīng)SpeI和BamHIII雙酶切后連接至pST0P1622表達載體(Technische Universital Braunschweig, Dr. Dieter Jahn惠贈)。將構(gòu)建好的表達載體pSTOP-GNAl轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168)，采用GNA1-3-F及GNA1-3-R引物挑選轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR， 出現(xiàn)480bp條帶，驗證重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建成功。將37° C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，OD600達到O. 4時，添加木糖至終濃度5gL誘導(dǎo)，于37° C、 200rpm條·件下培養(yǎng)30h。最終發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量達到15mgL。
權(quán)利要求
1.一種積累乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌，其特征是含有外源的氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因GNAl。
2.權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征是乙酰化酶編碼基因為釀酒酵母來源，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因克隆于重組表達載體上。
4.權(quán)利要求1所述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟O構(gòu)建重組質(zhì)粒克隆釀酒酵母的氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因GNAl，連接到重組表達質(zhì)粒上；2)構(gòu)建產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌將上述重組表達載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，得到產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于所述枯草芽孢桿菌為Bacillussubtilis168。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述重組表達載體為PP43NMK。
7.應(yīng)用權(quán)利要求1-3任一所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的方法，將 37° C、200rpm下培養(yǎng)12h的重組枯草芽孢桿菌以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37° C、 200rpm條件下發(fā)酵30h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種積累乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明是以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168)作為表達宿主，通過過量表達來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C)的氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNA1)，加強氨糖合成途徑，得到了積累乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌基因工程菌，產(chǎn)量達到115mgL，為進一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/75GK103045527SQ20121057417
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者陳堅, 堵國成, 劉龍, 李江華, 劉延峰 申請人:江南大學(xué)