專利名稱：新型腈水合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型腈水合酶及編碼其的基因、含有該基因的質(zhì)粒、經(jīng)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株、及用所述細胞株生產(chǎn)腈水合酶的方法、以及利用培養(yǎng)所述細胞株得到的培養(yǎng)液、細胞、細胞處理物從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的方法。另外，本發(fā)明還涉及一種改變具有腈水合酶活性的酶的性質(zhì)的方法。此外，本發(fā)明還涉及一種改變了性質(zhì)的酶及編碼其的基因、含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株、用所述細胞株生產(chǎn)腈水合酶的方法，以及利用培養(yǎng)所述細胞株得到的培養(yǎng)液、細胞、細胞處理物從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的方法。本發(fā)明可有效用于利用生物催化劑的物質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域中。
背景技術(shù)：
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了作為具有腈水合活性的酶的腈水合酶，該酶能夠通過水合作用將各種化合物的腈基轉(zhuǎn)換成酰胺基，并且公開了多種生產(chǎn)該酶的微生物株。為了在工業(yè)上利用腈水合酶從腈化合物制造酰胺化合物，降低該酶的制造成本在酰胺化合物的制造成本中所占的比例尤顯重要。具體而言，必須提高每單位重量酶制備物中該酶的含量。因此為了利用所述酶的基因通過基因工程學(xué)方法大量表達所述酶，嘗試對所述酶的基因進行克隆的方法。作為具有腈水合酶活性的微生 物，有紫紅紅球菌J-1株(根據(jù)布達佩斯條約，保藏在茨城縣筑波市東1-1-1號中央第6獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號為FERMBP-1478)、嗜熱假諾卡氏菌(本菌株保藏在理化學(xué)研究所微生物系統(tǒng)保存處(埼玉縣和光市廣澤2-1)，保藏編號為JCM3095，任何人都可經(jīng)申請獲得；另外，根據(jù)布達佩斯條約，保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號為FERM BP-73790 )(參照專利文獻I及3)。另外，從上述菌株中分離出了腈水合酶，已經(jīng)確認了該酶一般以稱為α亞單位及β亞單位的2種多肽為構(gòu)成要素。并且，從上述菌株中分離出了腈水合酶基因，確定了其氨基酸序列和堿基序列。進而，制備了可使上述腈水合酶在轉(zhuǎn)化子內(nèi)表達的質(zhì)粒及經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株(例如，TGl/pNHJ10H及MT-10822:根據(jù)布達佩斯條約，前者保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號為FERM BP-2777 ;后者于1996年2月7日保藏在茨城縣筑波市東1-1-1號中央第6獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號為FERM BP-5785)。除此之外，能夠經(jīng)上述細胞株生產(chǎn)腈水合酶、以及通過使所述細胞株或者由其制得的腈水合酶與腈化合物接觸以制備對應(yīng)的酰胺化合物(參照專利文獻2、4，非專利文獻I)。另外，也進行了分析腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)的嘗試，分析結(jié)果以PDB編號1AHJ、2AHJ、1IRE被公開。已知所述酶的基本結(jié)構(gòu)單位為α亞單位及β亞單位結(jié)合而成的2聚體，該2聚體進一步結(jié)合形成4聚體、8聚體、12聚體(根據(jù)來源的生物種而不同)而發(fā)揮活性。另外，形成活性中心的區(qū)域、結(jié)構(gòu)也已明確，活性中心并非表露于與反應(yīng)溶劑直接接觸的酶外側(cè)的位置，而是包埋于酶的內(nèi)部。也清楚發(fā)揮活性所必須的金屬原子(鈷原子或者鐵原子:根據(jù)來源的生物種而不同)在活性中心的配位形態(tài)，并已知作為伴隨金屬原子配位發(fā)生的現(xiàn)象，形成活性中心區(qū)域的氨基酸序列中半胱氨酸殘基在翻譯后發(fā)生氧化。具體而言，α亞單位的氨基酸序列中序列X1CXLC1SC2X2X3X4X5(其中，C表示半胱氨酸，X表示絲氨酸或蘇氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亞磺酸(cysteine sulfinicacid、3_sulfinoalanine), S 表不絲氨酸，C2 表不半胱次橫酸(cysteine sulfenicacid、S-hydroxy-cysteine), X1^ X2> X3> X4> X5表示任意氨基酸)表示的區(qū)域為構(gòu)成金屬原子在活性中心進行配位的區(qū)域(參照非專利文獻2 4)。但是，還沒有任何發(fā)明公開關(guān)于在不影響腈水合酶自身活性的情況下，改變其活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性等性質(zhì)的具體方法。特別是著眼于腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)、通過改變結(jié)構(gòu)而改變上述性質(zhì)的方法還未作任何嘗試。另外，專利文獻5中公開了使編碼腈水合酶的基因在宿主細胞中表達而生產(chǎn)具有酶活性的腈水合酶時，存在一種參與激活所述酶的蛋白質(zhì)。專利文獻1:特開平2-470號公報專利文獻2:特開平4-211379號公報專利文獻3:特開平8-56684號公報專利文獻4:特開平9-275978號公報專利文獻5:特開 平11-253168號公報非專利文獻1:Kobayashi M, Nishiyama M, Nagasawa T, Horinouchi S, BeppuΤ，Yamada H.Cloning, nucleotide sequence and expression inEscherichia coli oftwo cobalt-containing nitrile hydratase genes fromRhodococcus rhodochrousJl.Biochim Biophys Acta.1991 Dec 2 ；1129 (I):23-33.
非專利文獻2:Huang W, Jia J，Cummings J，Nelson M，Schneider G，LindqvistY.Crystal structure of nitrile hydratase reveals a novel iron centrein a novelfold.Structure.1997May 15 ；5 (5):691-9.
非專利文獻3:Nagashima SiNakasako MiDohmae N, Tsujimura M, Takio K, OdakaM，Yohda M，Kamiya N，Endo 1.Novel non-heme ironcenter of nitrile hydratase witha claw setting of oxygen atoms.Nat StructBiol.1998 May ；5 (5):347-51.
非專利文獻4:Miyanaga，A.，F(xiàn)ushinobu，S.，Ito，K.，and Wakagi, T.Crystalstructure of cobalt-containing nitrile hydratase.Biochem.Biochem Biophys ResCommun.2001 Novl6 ；288(5):1169-74.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有新型置換突變位點但功能無實質(zhì)變化的腈水合酶的氣基酸序列和該基因的減基序列，還提供一種含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株、及用所述細胞株生產(chǎn)所述酶的方法，以及利用培養(yǎng)所述細胞株得到的培養(yǎng)液、細胞、細胞處理物從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的方法。
本發(fā)明的其它目的在于提供一種在不損害腈水合酶自身活性的情況下，改變其活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性等性質(zhì)中的一種或一種以上的具體方法。具體而言，提供一種通過在腈水合酶基因中引入導(dǎo)致腈水合酶立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的突變而改變上述性質(zhì)的方法，進而，提供一種經(jīng)修飾方法得到的腈水合酶、編碼所述腈水合酶的基因、含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述基因或所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株、用所述細胞株生產(chǎn)所述腈水合酶的方法、以及利用培養(yǎng)所述細胞株得到的培養(yǎng)液、細胞、細胞處理物從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的方法。本發(fā)明人等基于上述情況，在特開平9-275978號公報(專利文獻4)中公開的腈水合酶基因中引入了未在該文獻中公開的新型置換突變位點，并確定了導(dǎo)入所述突變后所述基因的堿基序列。進而制備出了含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株。另夕卜，通過反復(fù)深入地研究了利用所述細胞株生產(chǎn)所述酶、或利用培養(yǎng)所述細胞株得到的培養(yǎng)液、細胞、細胞處理物從腈化合物制備出對應(yīng)的酰胺化合物，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的腈水合酶的α亞單位的特征為，其氨基酸序列具有下述突變，S卩，在序列號I表示的α亞單位的氨基酸序列中第36、71、148、及204位氨基酸中的任何一個或一個以上氨基酸被置換為其它氨基酸。本發(fā)明的腈水合酶的β亞單位的特征為，其氨基酸序列具有下述突變，即，在序列表的序列號2表示的β亞單位的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、及217位氨基酸中的任何一個或一個以上氨基酸被置換為其它氨基酸。本發(fā)明的腈水合酶的特征為，具有α亞單位和β亞單位，上述亞單位中至少一方存在上述突變。編碼本發(fā)明腈水合酶的α亞單位的基因的特征為，其負責(zé)編碼存在于上述α亞單位中的突變的氨基酸序列；編碼本發(fā)明腈水合酶的β亞單位的基因的特征為，其負責(zé)編碼存在于上述β亞單位中的突變的氨基酸序列。

編碼本發(fā)明腈水合酶的基因的特征為，包含編碼α亞單位的基因和編碼β亞單位的基因，上述亞單位中至少一方存在上述突變。本發(fā)明的質(zhì)粒的特征為，具有上述的任一種基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子的特征為，通過利用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞而得到。本發(fā)明中腈水合酶的制備方法特征為，其包含從上述轉(zhuǎn)化子、上述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液、或者上述轉(zhuǎn)化子或上述培養(yǎng)液的處理物中回收腈水合酶的步驟。本發(fā)明的酰胺化合物的制備方法的特征為包含下述步驟:在水性介質(zhì)中使腈化合物與上述腈水合酶接觸，從而將所述腈化合物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的酰胺化合物的步驟。另外，本發(fā)明人等鑒于上述情況，以專利文獻2、專利文獻4中公開的腈水合酶基因為例，基于新觀點規(guī)定了作為突變對象的區(qū)域，并實施對腈水合酶進行修飾的方法，即對形成該區(qū)域的氨基酸殘基所對應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸進行置換、插入、或缺失等改變而修飾腈水合酶。具體而言，參照非專利文獻2、3、4、及以TOB號:1AHJ、2AHJ、1IRE中公開的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)，經(jīng)深入分析研究，確定了符合要求的修飾對象區(qū)域。更具體而言，通過解析立體結(jié)構(gòu)，確定了形成孔穴的區(qū)域、以及形成界面的區(qū)域，所述孔穴是底物從酶外部進入活性中心時、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時通過的孔穴，所述界面為參與2聚體形成的α亞單位和β亞單位之間結(jié)合的界面及參與2聚體之間相互結(jié)合的界面。對氨基酸序列進行置換、插入、缺失等修飾的方法沒有特別的限制，可以舉出例如采用基因重組手段引入突變的方法。進一步確定了經(jīng)所述修飾后該基因的堿基序列，制備了含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述基因或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株，用所述細胞株生產(chǎn)所述酶或利用培養(yǎng)所述細胞株得到的培養(yǎng)液、細胞、細胞處理物從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物，從而觀察了修飾方法對腈水合酶的性質(zhì)造成了何種改變。經(jīng)過反復(fù)深入研究構(gòu)成作為修飾對象的腈水合酶的氨基酸序列中各位點的改變及由此得到的各種修飾酶，從而完成了本發(fā)明。S卩，除了上述特征，本發(fā)明還涉及下述[I] [22]中所述內(nèi)容。[I], 一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法通過以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對特定的氨基酸殘基中I個或I個以上的位點進行置換、插入或缺失處理從而改變該酶的活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中的任何I種或I種以上的性質(zhì)，這些步驟為:(a)將修飾前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列與序列表中序列號98記載的氨基酸序列及序列表中序列號99記載的氨基酸序列進行對比；(b)根據(jù)對比的結(jié)果確定與下述區(qū)域?qū)?yīng)的氨基酸殘基，所述區(qū)域為，序列表中序列號98記載的氨基酸序列中從第36位的蘇氨酸到第48位的天冬酰胺的區(qū)域、序列表中序列號99記載的氨基酸序列中從第31位的賴氨酸到第51位的苯丙氨酸的區(qū)域、以及從第112位的賴氨酸到第127位的亮氨酸的區(qū)域；(c)對確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上位點進行置換、插入或缺失處理。[2], 一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法通過以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對特定的氨基酸殘基中的I個或I個以上的位點進行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、 底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任何I種或I種以上性質(zhì)，這些步驟為:(d)將修飾前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列與序列表中序列號98記載的氨基酸序列及序列表中序列號99記載的氨基酸序列進行對比；(e)根據(jù)對比的結(jié)果確定與序列表中序列號98記載的氨基酸序列中第36、48、71、148、188、204位對應(yīng)的氨基酸殘基、與序列表中序列號99記載的氨基酸序列中第10、32、33、37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127、146、150、160、168、171、176、186、217、218 位
對應(yīng)的氣基酸殘基；(f)對確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上位點進行置換、插入或缺失處理。[3], 一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法通過以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對特定的氨基酸殘基中的I個或I個以上的位點進行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任何I種或I種以上性質(zhì)，(g)基于F1DB (Protein Data Bank)號:1IRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和與氨基酸序列進行對比的結(jié)果推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(h)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定與PDB號:1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)的A鏈(Chain IIRE:A)中從N末端算起的第2個螺旋對應(yīng)的區(qū)域的氨基酸殘基；以及與B鏈(Chain IIRE:B)中從N末端算起的第I個螺旋、第2個螺旋、及夾在其間的環(huán)狀部分、和從C末端算起的第3個螺旋對應(yīng)的區(qū)域的氨基酸殘基；(i)對確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上位點進行置換、插入或缺失處理。[4], 一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上的位點進行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任何I種或I種以上性質(zhì)，(j)基于PDB號:1IRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和與氨基酸序列進行對比的結(jié)果推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(k)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定與PDB號:1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)的A鏈中從N末端算起作為第89位氨基酸殘基的谷氨酰胺、作為第165位氨基酸殘基的谷氨酸、以及從B鏈N末端算起作為第37位氨基酸殘基的苯丙氨酸、作為第48位氨基酸的亮氨酸對應(yīng)的4個氣基酸殘基；(I)確定下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基的側(cè)鏈前端重原子位于立體結(jié)構(gòu)中半徑為5A的范圍內(nèi)，該立體結(jié)構(gòu)分別以上述確定的4個氨基酸殘基的側(cè)鏈前端重原子為其中心點；(m)對上述I中確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上位點進行置換、插入或缺失處理。[5], 一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上的位點進行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物 特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任I種或I種以上的性質(zhì)，(η)基于PDB號:IIRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列進行對比，根據(jù)對比結(jié)果來推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(ο)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定形成下述孔穴的區(qū)域，所述孔穴是底物從酶外部進入活性中心時、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時通過的孔穴；(P)在構(gòu)成確定的區(qū)域的氨基酸殘基中確定如下的氨基酸殘基，這些氨基酸殘基的改變使孔穴尺寸發(fā)生變化，進而可控制底物/產(chǎn)物通過的難易程度；(q)對上述P中確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上位點進行置換、插入或缺失處理。[6], 一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上的位點進行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任I種或I種以上性質(zhì)，(r)基于PDB號:IIRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列進行對比，根據(jù)對比結(jié)果來推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(s)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定以下共計4個氨基酸殘基,該氨基酸殘基為與F1DB號:1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中從A鏈的N末端算起第89位氨基酸的谷氨酰胺(A89Q)、第165位氨基酸的谷氨酸(A165E)對應(yīng)的氨基酸殘基，以及與從B鏈的N末端算起第37位氨基酸的苯丙氨酸(B37F)、作為第48位氨基酸的亮氨酸(B48L)對應(yīng)的氨基酸殘基;(t)規(guī)定對應(yīng)于A165E的氨基酸殘基和對應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為dl，對應(yīng)于A89Q的氨基酸殘基和對應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d2，對應(yīng)于B37F的氨基酸殘基和對應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d3，確定使dl d3中的I項或I項以上發(fā)生變化的氨基酸殘基；(U)對確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上位點進行置換、插入或缺失處理。[7],在[6]記載的修飾方法中，⑴的步驟如下述(t’ )所述，(t’)規(guī)定對應(yīng)于Α165Ε的氨基酸殘基和對應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為dl，對應(yīng)于A89Q的氨基酸殘基和對應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d2，對應(yīng)于B37F的氨基酸殘基和對應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d3，對應(yīng)于A165E的氨基酸殘基和對應(yīng)于B37F的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d4，對應(yīng)于A89Q的氨基酸殘基與對應(yīng)于B37F的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d5，確定使dl d5中的I項或I項以上發(fā)生變化的氨基酸殘基。[8],如[I] [7]中任一項所述的修飾方法，其特征為，修飾前的具有腈水合酶活性的酶含有下述[A]和[B]所述的2種多肽:[A]由與序列表的序列號98記載的氨基酸序列有40%或40%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽；[B]由與序列表的序列號99記載的氨基酸序列有25%或25%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽。[9],如[8]所述的修飾方法，其特征為，[A]所述的多肽為下述[C]所述的多肽，[B]所述的多肽為下述[D] 所述的多肽，[C]由下述任一種氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為序列表的序列號98記載的氨基酸序列；對序列表的序列號98記載的氨基酸序列中的至少I個位點進行置換、插入、或缺失處理而得到的氨基酸序列；將序列表的序列號98記載的氨基酸序列中的第6、
19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中的至少 I 個氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。[D]由下述任一種氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為序列表中序列號99記載的氨基酸序列；對序列表的序列號99記載的氨基酸序列中的至少I個位點進行置換、插入、或缺失處理而得到的氨基酸序列；將序列表的序列號99記載的氨基酸序列中的第
20、21、108、200、212位氨基酸中的至少I個氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。[10].如[8]所述的修飾方法，其特征為，[A]所述的多肽為下述[E]所述的多肽，[B]所述的多肽為下述[F]所述的多肽。[E]由與下述氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為序列表的序列號104記載的堿基序列中從第704位到第1315位堿基形成的ORF (Open ReadingFrame，開放讀碼框)所編碼的氨基酸序列。[F]由與下述氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為序列表的序列號104記載的堿基序列中從第I位到第680位堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列。
[11].—種修飾前具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上位點進行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax> Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中的任何I種或I種以上性質(zhì)，其特征為，所述修飾前具有腈水合酶活性的酶中作為構(gòu)成要素含有的2種多肽中，一種為[10]中的[E]記載的多肽，另一種為[10]中的[F]記載的多肽，(d’)將修飾前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列與序列表的序列號99記載的氨基酸序列進行對比，(e’)根據(jù)對比的結(jié)果確定與序列表的序列號99記載的氨基酸序列中第48、51位對應(yīng)的氣基酸殘基，(f’ )對確定的氨基酸殘基中的I個或I個以上位點進行置換、插入或缺失處理。[12].如[8]所述的修飾方法，其特征為，[A]所述的多肽為下述[G]所述的多肽，[G]含有氨基酸序列為X1CXLC1SC2X2X3X4X5的區(qū)域的多肽(其中，C表示半胱氨酸，X表示絲氨酸或蘇氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亞磺酸(cysteine sulfinicacid、3_sulfinoalanine), S 表不絲氨酸，C2 表不半胱次橫酸(cysteine sulfenic acid、S-hydroxy-cysteine), X1^ X2> X3> X4> X5 表示任意氨基酸)。[13].如[12]所述的修飾方法，其特征為，所述序列中X1表示纈氨酸，X4表示色氨
酸，X5表示脯氨酸。[14].如[13]所述的修飾方法，其特征為，所述序列中X2表示酪氨酸，X3表示脯氨酸。[15].如[12] [14]中任一項所述的修飾方法，其特征為，通過X1CXLC1SC2X2X3X4X5序列表示的區(qū)域與金屬原子結(jié)合。[16].如[15]所述的修飾方法，其特征為，所述金屬原子為鈷原子。[17].—種修飾酶，其特征為，所述酶是利用[I] [16]中任一項所述的修飾方法而得到的。[18].—種基因，其特征為，所述基因是編碼[17]所述修飾酶的基因。[19].一種質(zhì)粒，其特征為，所述質(zhì)粒含有[18]所述的基因。[20].—種轉(zhuǎn)化子，其特征為，所述轉(zhuǎn)化子是利用[18]所述基因或[19]所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化微生物而得到的。[21].—種制備修飾酶的方法，其特征為，所述方法包含從培養(yǎng)[20]所述的轉(zhuǎn)化子而得到的培養(yǎng)液、細胞、或其處理物中回收修飾酶的步驟。[22].—種制備酰胺化合物的方法，其特征為，所述方法包含以下步驟:在溶劑中，使培養(yǎng)[20]所述的轉(zhuǎn)化子而得到的培養(yǎng)液、細胞、或其處理物、或者經(jīng)[21]所述的制備方法得到的修飾酶與腈化合物接觸，從而將該腈化合物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的酰胺化合物。本發(fā)明提供一種 腈水合酶的氨基酸序列及所述基因的堿基序列，所述腈水合酶來源于嗜熱假諾卡氏菌，具有新型突變位點，但其本質(zhì)功能未發(fā)生變化。本發(fā)明進一步提供一種含有所述基因的質(zhì)粒、含有所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子、用所述轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)所述酶的方法、以及利用所述轉(zhuǎn)化子從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的方法。本發(fā)明還提供一種酶的修飾方法，其采用以改變具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)為特征的方法來修飾在修飾前具有腈水合酶活性的酶。作為采用上述方法的修飾方法可獲得的效果的特征可以舉出，能夠改變活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性等性質(zhì)中的I種或I種以上性質(zhì)。另外本發(fā)明提供一種具有新型突變位點的腈水合酶、及編碼構(gòu)成所述酶的多肽鏈的基因。還可以提供一種含有所述基因的質(zhì)粒、含有所述基因或所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子、利用所述轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)所述酶的方法，以及利用所述轉(zhuǎn)化子從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的方法。


圖1表示從MT10822提取的質(zhì)粒pPT_DBl的限制性核酸內(nèi)切酶的酶切圖。(參考例1、實施例1、83)圖2表示用于表達具有活性的來源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶而構(gòu)建的質(zhì)粒PJlH-DBl的限制性核酸內(nèi)切酶的酶切圖。(實施例84)圖1及圖2中使用的省略符號的含義如下:bla表示編碼β -內(nèi)酰胺酶的0RF。Col El-ori表示Col El系統(tǒng)的復(fù)制起始位點。IacZ表示來源于pUC 18的乳糖操縱子中的啟動子和操縱基因區(qū)域。NHa表示編碼來源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶的a亞單位的ORF。NHβ表示編碼來源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶的β亞單位的0RF。Ρ16表示編 碼下述蛋白質(zhì)的0RF，所述蛋白質(zhì)的特征為，其參與來源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶的激活。nhhA表示編碼來源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶的a亞單位的0RF。nhhB表示編碼來源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶的β亞單位的0RF。
具體實施例方式
下面更詳細地說明本發(fā)明。本發(fā)明的腈水合酶是在具有腈水合酶活性的酶中引入突變而得到的，例如，在來源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶中引入突變而得到。具體而言，其基本上可通過序列表的序列號I及2表示的氨基酸序列中至少I個或I個以上特定位點的氨基酸經(jīng)其它氨基酸置換而構(gòu)成。即，本發(fā)明包含以下腈水合酶:以序列表的序列號I中的205個氨基酸的序列所表示的α亞單位內(nèi)至少I個或I個以上氨基酸被其它氨基酸置換而得到的序列為構(gòu)成要素的腈水合酶、以序列表的序列號2中的233個氨基酸的序列所表示的β亞單位中至少I個或I個以上氨基酸被其它氨基酸置換而得到的序列為構(gòu)成要素的腈水合酶、以及同時以上述兩種序列為構(gòu)成要素的腈水合酶。本發(fā)明中在來源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶中引入突變而得到的腈水合酶中所使用的具體氨基酸序列中包括以下序列:(a-Ο)序列號I表示的α亞單位的氨基酸序列，(a-Ι)具有突變的氨基酸序列，即，序列號I表示的α亞單位的氨基酸序列中第36、71、148、204位氨基酸中的任一個或一個以上氨基酸被置換為其它氨基酸。(a-2)具有突變的氨基酸序列，即，序列表中序列號I表示的α亞單位的氨基酸序列中第 6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203 位氨基酸中的任一個或一個以上氨基酸被置換為其它氨基酸。(b-Ο)序列表中序列號2表示的β亞單位的氨基酸序列，(b-Ι)具有突變的氨基酸序列，即，序列表的序列號2表示的β亞單位的氨基酸序列中第 10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、217 位氨基酸中的任一個或一
個以上氨基酸被置換為其它氨基酸。(b-2)具有突變的氨基酸序列，即，序列表的序列號2表示的β亞單位的氨基酸序列中第20、21、108、200、212位氨基酸中任一個或一個以上氨基酸被置換為其它氨基酸。上述各突變至少能夠維持突變前的腈水合酶的活性。本發(fā)明在來源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶中引入突變而得到的腈水合酶由以下構(gòu)成要素形成，所述構(gòu)成要素具有選自上述(a-Ο) (b_2)的氨基酸序列。(A-1)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-Ι)所述突變的氨基酸序列。(A-2)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a_l)和(a_2)所述突變的氨基酸序列。(B-1)腈水合酶的β亞單位具有包含上述(b-Ι)所述突變的氨基酸序列。(B-2)腈水合酶的β亞單位具有包含上述(b-Ι)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。(A-3)腈水 合酶的α亞單位具有包含上述(a_l)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有上述(b-Ο)所述氨基酸序列。(A-4)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a_l)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-Ι)所述突變的氨基酸序列。(A-5)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a_l)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-2)所述突變的氨基酸序列。(A-6)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a_l)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-Ι)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。(A-7)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a_l)和(a_2)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有上述(b-Ο)所述氨基酸序列。(A-8)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a_l)和(a_2)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-Ι)所述突變的氨基酸序列。(A-9)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a_l)和(a_2)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-2)所述突變的氨基酸序列。(A-10)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a_l)和(a_2)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-Ι)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。(B-3)腈水合酶的α亞單位具有上述(a_0)所述氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-Ι)的突變的氨基酸序列。(B-4)腈水合酶的α亞單位具有上述(a_0)所述氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-Ι)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。(B-5)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a_2)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-Ι)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。另外，對于上述確定的突變位點以外的氨基酸，只要在不損害經(jīng)上述特定位點突變而得到的目標(biāo)腈水合酶活性的范圍內(nèi)，也可以進行氨基酸的置換、插入、缺失處理。本發(fā)明在來源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶中引入突變而得到的腈水合酶基因包括編碼腈水合酶的α亞單位的基因和編碼腈水合酶的β亞單位的基因。作為本發(fā)明所述基因的一族，可以舉出在來源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶基因中實施引入突變處理而得到的基因，其中包括編碼α亞單位的氨基酸序列的基因、編碼β亞單位的基因、以及同時含有編碼α亞單位的基因和編碼β亞單位的基因的腈水合酶基因。具體可以舉出以下基因。(G-1)具有下述堿基序列的基因，所述堿基序列編碼具有上述(a-Ι)所述突變的氨基酸序列。(G-2)具有下述堿基序列的基因，所述堿基序列編碼具有上述(a-Ι)和(a_2)所述突變的氨基酸序列。(G-3)具有下述堿基序列的基因，所述堿基序列編碼具有上述(b-Ι)所述突變的
氨基酸序列。(G-4)具有下述堿基序列的基因，所述堿基序列編碼具有上述(b-Ι)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。(G-5)具有下述堿基序列的基因，所述堿基序列編碼上述(A-ι) (B-4)所述的任
一腈水合酶。編碼作為上述 突變基礎(chǔ)的序列號I所述的α亞單位的氨基酸序列的堿基序列優(yōu)選為序列號3所述的堿基序列。編碼作為上述突變基礎(chǔ)的序列號2所述的β亞單位的氨基酸序列的堿基序列優(yōu)選為序列號4所述的堿基序列。例如，以序列號3為基礎(chǔ)時，上述(a-Ι)所述突變可通過將序列號3的堿基序列中的下述任何I個或I個以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到:第106到第108位、從第211到第213位、從第442到第444位、及從第610到第612位。另外，以序列號3為基礎(chǔ)時，上述(a-2)所述突變可通過將序列號3的堿基序列中的下述任何I個或I個以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到:第16到第18位、從第55到第57位、從第112到第114位、從第229到第231位、從第268到第270位、從第304到第306位、從第316到第318位、從第376到第378位、從第388到第390位、從第424到第426位、從第436到第438位、從第559到第561位、從第580到第582位、從第607到第609 位。以序列號4為基礎(chǔ)時，上述(b-Ι)所述突變可通過將序列號4的堿基序列中的下述任何I個或I個以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到:第28到第30位、從第94到第96位、從第109到第111位、從第121到第123位、從第136到第138位、從第142到第144位、從第151到第153位、從第214到第216位、從第352到第354位、從第379到第381位、從第436到第438位、從第478到第480位、從第556到第558位、從第649到第651位。另外，以序列號4為基礎(chǔ)時，上述(b-2)所述突變可通過將序列號4的堿基序列中的下述任何I個或I個以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到:第58到第60位、從第61到第63位、從第322到第324位、從第598到第600位、以及從第634到第636位。上述置換在將腈水合酶的活性保持置換前的狀態(tài)、或者較之有所提高的范圍內(nèi)進行，所述腈水合酶中具有由各基因編碼的α及β亞單位中的至少其一。另外，引入突變的方式?jīng)]有特別的限制。對于本發(fā)明的腈水合酶基因中(a-1)、(a-2)、(b_l)、及(b_2)所述突變位點之外的位點，在能夠作為具有腈水合酶活性的蛋白質(zhì)模型而發(fā)揮功能的范圍內(nèi)，也可具有經(jīng)堿基的置換、插入、或缺失處理產(chǎn)生的附加突變。上述附加突變可以舉出以下例子。即使在以具有某種特定的堿基序列的基因作為模板進行轉(zhuǎn)錄、翻譯時，因其導(dǎo)入的宿主細胞的種類、或培養(yǎng)時使用的培養(yǎng)基的成分或組成、或培養(yǎng)時的溫度、PH等因素的不同，在經(jīng)基因表達后宿主細胞內(nèi)酶的修飾后，在保留所期望的酶活性的情況下，仍可能出現(xiàn)以下的突變體，即在酶的序列表中N-末端附近的I個、2個或2個以上氨基酸發(fā)生缺失、或在N-末端插入I個、2個或2個以上氨基酸而得到的突變體。因此此類突變的腈水合酶也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的腈水合酶生產(chǎn)用質(zhì)粒可以利用上述腈水合酶基因進行制備，可以舉出以下具體例。(P-1)具有下述堿基序列的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼具有上述(a-Ι)所述突變的
氨基酸序列。(P-2)具有下述堿基序列的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼具有上述(a-Ι)和(a_2)所述突變的氨基酸序列。(P-3)具有下述堿基序列的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼具有上述(b-Ι)所述突變的
氨基酸序列。(P-4)具有下述 堿基序列的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼具有上述(b-Ι)和(b_2)所述突變的氨基酸序列。(P-5)具有下述堿基序列的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼上述(A-1) (B-4)中所述的
任一腈水合酶。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子或細胞株是利用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化任意宿主細胞而得到的。本發(fā)明的腈水合酶的生產(chǎn)方法包括培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化子、細胞株以生產(chǎn)腈水合酶的步驟。另外，本發(fā)明的酰胺化合物的制備方法包括下述步驟:使培養(yǎng)用于生產(chǎn)上述腈水合酶的轉(zhuǎn)化子、細胞株而得到的培養(yǎng)液、細胞或細胞處理物在溶媒中與腈化合物接觸而制備對應(yīng)的酰胺化合物。下面對本發(fā)明中具有腈水合酶活性的酶的修飾方法進行詳細說明。本發(fā)明的腈水合酶活性是指將腈化合物水合成為對應(yīng)的酰胺化合物的水合活性。一般而言，具有所述活性的酶的特征為，以稱為α亞單位、β亞單位的2種多肽鏈作為構(gòu)成要素，腈水合酶基因是指以形成上述兩種多肽鏈為特征的兩個氨基酸序列，或構(gòu)成下述兩個ORF (開放讀碼框)的堿基序列，所述ORF的特征為編碼上述兩個氨基酸序列。以來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶(參照序列表的序列號98及99、專利文獻3、非專利文獻4、PDB號:1IRE)為例進行具體說明，由序列表的序列號98記載的氨基酸序列形成的多肽及PDB號:1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中的A鏈為α亞單位；由序列表的序列號99記載的氨基酸序列形成的多肽及PDB號:1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中的B鏈為β亞單位。而由序列表的序列號100記載的堿基序列形成的ORF和由序列表的序列號101記載的喊基序列形成的ORF稱為臆水合酶基因。另外，對于來源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶(參照序列表中序列號104、專利文獻2、非專利文獻I)而言，由序列表的序列號104記載的堿基序列中從第704位到第1315位形成的ORF編碼的氨基酸序列形成的多肽為α亞單位；由序列表的序列號104記載的堿基序列中從第I位到第690位形成的ORF編碼的氨基酸序列形成的多肽為β亞單位。另夕卜，序列表的序列號104記載的喊基序列編碼的兩個ORF稱為臆水合酶基因。本發(fā)明的修飾方法是指，改變修飾前具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)的方法，其目的為在不損害腈水合酶本來的活性的前提下，改變該酶的活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任何一種或一種以上的性質(zhì)，該方法的特征為包括以下步驟:通過解析立體結(jié)構(gòu)，確定形成下述孔穴的區(qū)域和/或形成下述界面的區(qū)域，并對與該區(qū)域中存在的氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸中的任一或一個以上位點進行置換、插入、缺失等修飾；上述孔穴指底物從酶外部進入活性中心時、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時通過的孔穴，上述界面為參與2聚體形成的α亞單位和β亞單位之間的結(jié)合界面、或參與2聚體之間結(jié)合的界面；以來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶(參照序列表的序列號98及99、專利文獻3、非專利文獻4、PDB號:1IRE)為例進行具體說明，與形成底物從酶外部進入活性中心時、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時通過的孔穴的區(qū)域中存在的氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸殘基可以舉出，形成對應(yīng)于PDB號IIRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中的B鏈從N末端算起第I個螺旋、第2個螺旋、以及夾在其間的環(huán)狀部分的區(qū)域的氨基酸殘基；側(cè)鏈前端重原子位于以下述4個氨基酸殘基的側(cè)鏈前端重原子為各自中心點的立體結(jié)構(gòu)中半徑5Λ的區(qū)域以內(nèi)的氨基酸殘基，上述4個氨基酸殘基為，PDB號IIRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中的從A鏈N末端算起第89位氨基酸殘基的谷氨酰胺、第165位氨基酸殘基的谷氨酸、以及從B鏈N末端算起第37位氨基酸殘基的苯丙氨酸、第48位氨基酸的亮氨酸所對應(yīng)的4個氨基酸殘基；序列表的序列號98記載的氨基酸序列中從第36位的蘇氨酸到第48位的天冬酰胺的區(qū)域、序列表的序列號99記載的氨基酸序列中從第31位的賴氨酸到第51位的苯丙氨酸的區(qū)域、以及從第112位的賴氨酸到第127位的亮氨酸的區(qū)域所對應(yīng)的氨基酸殘基；序列表的序列號99記載的氨基酸序 列中第37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127位所對應(yīng)的氨基酸殘基等。另外，作為存在于參與2聚體形成的α亞單位和β亞單位之間的結(jié)合界面、或參與2聚體之間結(jié)合的界面的區(qū)域中的氨基酸殘基所對應(yīng)的氨基酸殘基，可以舉出對應(yīng)于下述區(qū)域的氨基酸殘基，所述區(qū)域為PDB號IIRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中從A鏈N末端算起第2個螺旋、從B鏈N末端算起第2個螺旋、序列表的序列號98記載的氨基酸序列中從第36位的蘇氨酸到第48位的天冬酰胺的區(qū)域、序列表的序列號99記載的從第112位的賴氨酸到第127位的亮氨酸的區(qū)域；以及與序列表的序列號98記載的氨基酸序列中第36、71、148、188、204位、與序列表的序列號99記載的氨基酸序列中第10、32、33、112、118、127、146、150、160、168、171、176、186、217、218 位對應(yīng)的氨基酸殘基等。在構(gòu)成底物從酶外部進入活性中心、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時通過的孔穴的形成區(qū)域的氨基酸殘基中，對通過修飾可改變孔穴的大小從而控制底物/產(chǎn)物通過的難易程度的氨基酸殘基加以確定的方法可以舉出，確定PDB號IIRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中從A鏈N末端算起第89位氨基酸的谷氨酰胺(A89Q)、第165位氨基酸的谷氨酸(Α165Ε)對應(yīng)的氨基酸殘基，以及從B鏈N末端算起第37位氨基酸的苯丙氨酸(B37F)、第48位氨基酸的亮氨酸(B48L)所對應(yīng)的4個氨基酸殘基，規(guī)定A165E和B48L之間的最短重原子間距為dl，A89Q和B48L之間的最短重原子間距為d2，B37F和B48L之間的最短重原子間距為d3，A165E和B37F之間的最短重原子間距為d4，A89Q和B37F之間的最短重原子間距為d5，確定使dl d5中的I項或I項以上發(fā)生變化的氨基酸殘基，或確定使dl d3中的I項或I項以上發(fā)生變化的氨基酸殘基。因此，由下述步驟構(gòu)成的修飾方法也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，S卩，對于作為對象的腈水合酶(以來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶為代表例)中與上述確定的任何一種或一種以上氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸進行置換、插入、或缺失等修飾的步驟。另外，本發(fā)明也包含下述修飾方法，即，將來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095以外的生物種的腈水合酶(例如，來源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶)與來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)、氨基酸序列進行對比，從而找出與上述氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸殘基，并修飾對應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸。實施上述例舉的修飾方法時，在基于立體結(jié)構(gòu)或氨基酸序列進行的對比中使用的裝置沒有特別的限制，作為氨基酸序列的對比裝置可以舉出日立Soft社制的DNASIS、Free-Soft的CLUSTALW或BLAST等基因序列分析軟件；而作為基于氨基酸序列的對比結(jié)果的立體結(jié)構(gòu)模擬裝置可以舉出Accelrys社制的Modeler或Homology等蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件。舉一例而言，對于來源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶(參照序列表的序列號104、專利文獻2、非專利文獻I)，對比的結(jié)果為，對應(yīng)于序列表的序列號99記載的氨基酸序列中第48位的氨基酸殘基Leu的氨基酸殘基為Trp，該Trp與由序列表的序列號104記載的堿基序列中從第I個到第690個堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列中第48位對應(yīng)；對應(yīng)于序列表的序列號99記載的氨基酸序列中第51位的氨基酸殘基Phe的氨基酸殘基為Ser，該Ser與由序列表的序 列號104記載的堿基序列中從第I個到第690個堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列中第51位對應(yīng)。上述結(jié)果與基于氨基酸序列的對比和基于立體結(jié)構(gòu)的對比結(jié)果相一致。本發(fā)明也包含改變上述兩個氨基酸殘基所對應(yīng)的氨基酸序列的氨基酸中的任一方或雙方的修飾方法。需要說明的是，在實施上述修飾方法時，用于改變氨基酸殘基所對應(yīng)的氨基酸序列中氨基酸的引入突變的方法沒有特別的限制，可以舉出利用基因重組技術(shù)將氨基酸序列中的氨基酸置換為其它氨基酸的突變弓I入法。另外，對于計劃弓I入的突變之外的附加弓I入的突變所弓I起的氨基酸序列或堿基序列的變化而言，在不影響計劃突變引入得到的目標(biāo)腈水合酶的活性的范圍內(nèi)，也可發(fā)生氨基酸或堿基的置換、插入或缺失。上述附加導(dǎo)入的突變可以舉例如下:即使使用特定堿基序列的基因作為模板進行轉(zhuǎn)錄、翻譯時，根據(jù)導(dǎo)入其的宿主細胞的種類、培養(yǎng)時使用的培養(yǎng)基的成分或組成、培養(yǎng)時的溫度、或PH等因素的不同，經(jīng)基因表達后宿主細胞內(nèi)酶的修飾等作用，在保留最初酶活性的情況下，仍可能出現(xiàn)以下突變體，即序列表中N-末端附近的氨基酸中的I個、2個或2個以上發(fā)生缺失、或N-末端中插入I個、2個或2個以上氨基酸。因此產(chǎn)生上述突變的腈水合酶修飾方法也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
作為本發(fā)明修飾方法的對象的修飾前的腈水合酶，可以舉出例如來源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶和來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶。具體可以舉出下述兩種腈水合酶，其中一種為，以下述兩個多肽鏈為構(gòu)成要素的腈水合酶，所述的兩個多肽鏈分別由與下述兩個氨基酸序列相同的氨基酸序列形成，即由序列表的序列號104記載的堿基序列中從第I個到第690個堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列和由序列表的序列號104記載的堿基序列中從第704個到第1315個堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列；另一種腈水合酶以下述兩個多肽鏈為構(gòu)成要素，即，以由序列表的序列號98記載的氨基酸序列形成的多肽鏈和由序列表的序列號99記載的氨基酸序列形成的多肽鏈為構(gòu)成要素。作為本發(fā)明修飾方法的對象的修飾前的腈水合酶，也包括以下述兩種多肽為構(gòu)成要素的腈水合酶，所述兩種多肽的其中一種為，與序列表的序列號98記載的氨基酸序列有40%或40%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，另一種為與序列表的序列號99記載的氨基酸序列有25%或25%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽。作為與序列表的序列號98記載的氨基酸序列有40%或40%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，可以舉出序列表的序列號98記載的氨基酸序列形成的多肽、對序列表的序列號98記載的氨基酸序列中至少一個位點實施置換、插入或缺失的任一種修飾后得到的氨基酸序列形成的多肽、序列表的序列號98記載的氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中至少一個氨基酸被其它氨基酸置換后得到的氨基酸序列形成的多肽、與序列表的序列號104記載的堿基序列中從第704到第1315個堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽等。另外，由與序列表的序列號98記載的氨基酸序列有40%或40%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽可以具有如下特征，即，其序列中含有X1CXLC1SC2X2X3X4X5 (其中，C表示半胱氨酸，X表示絲氨酸或蘇氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亞磺酸(cysteine sulfinicacid、3_sulfinoalanine), S 表不絲氨酸，C2 表不半胱次橫酸(cysteine sulfenicacid、S-hydroxy-cysteine), X1^ X2> X3> X4> X5表示任意氨基酸)結(jié)構(gòu)的區(qū)域。除此之外，其還可以具有下述特征，即，上述區(qū)域中X1為纈氨酸，X4為色氨酸，X5為脯氨酸。另外，其也可以具有下述特征，即，上述區(qū) 域中X2為酪氨酸，X3為脯氨酸。在上述情況下，其特征也可以為通過X1CXLC1SC2X2X3X4X5結(jié)構(gòu)的區(qū)域與金屬原子結(jié)合。另外，其特征還可為所述金屬為鈷。作為由與序列表的序列號99記載的氨基酸序列有25%或25%以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，可以舉出由序列表的序列號99記載的氨基酸序列形成的多肽；由序列表的序列號99記載的氨基酸序列中至少一個位點經(jīng)置換、插入或缺失的任一修飾后得到的氨基酸序列形成的多肽；由序列表的序列號99記載的氨基酸序列中第20、21、108、200、212位氨基酸中至少一個氨基酸被其它氨基酸置換后得到的氨基酸序列形成的多肽；由與序列表的序列號104記載的堿基序列中從第I到第690個堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽等。舉一例而言，來源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶以下述多肽為構(gòu)成要素，所述多肽為由序列表的序列號104記載的堿基序列中從第704到第1315個堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列形成的多肽和由序列表的序列號104記載的堿基序列中從第I到第690個堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列形成的多肽，因此，本發(fā)明中作為修飾方法的對象的修飾前的腈水合酶中包括上述腈水合酶。另外，來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶以由序列表的序列號98記載的氨基酸序列形成的多肽和由序列表的序列號99記載的氨基酸序列形成的多肽為構(gòu)成要素，因此，其也包含在本發(fā)明中作為修飾方法的對象的修改前的腈水合酶的范圍內(nèi)。另外，作為從來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶，可以舉出滿足下述兩種條件中任一方或雙方的腈水合酶。第一種條件為，在來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的構(gòu)成要素中，由序列表的序列號98記載的氨基酸序列形成的多肽被下述兩種多肽之一置換而得到的酶，所述兩種多肽為，由對序列表的序列號98記載的氨基酸序列中至少一個位點實施置換、插入或缺失的任一修飾后得到的氨基酸序列形成的多肽，或者由序列表的序列號98記載的氨基酸序列的第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中至少一個氨基酸被置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列形成的多肽；第二種條件為，在來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的構(gòu)成要素中，由序列表的序列號99記載的氨基酸序列形成的多肽被下述兩種多肽之一置換而得到的酶，所述兩種多肽為，由對序列表的序列號99記載的氨基酸序列中至少一個位點實施置換、插入或缺失的任一修飾后得到的氨基酸序列形成的多肽，或者由序列表的序列號99記載的氨基酸序列的第20、21、108、200、212位氨基酸中至少一個氨基酸被置換為其它氨基酸后的氨基酸序列形成的多肽。作為本發(fā)明修飾方法的對象的修改前的腈水合酶也包括由來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶。本發(fā)明中修飾酶是指，以具有腈水合酶活性的酶為對象進行修飾后得到的腈水合酶。例如可以舉出具有如下特征的修飾酶，即，該修飾酶是采用上述修飾方法改變修飾前的腈水合酶的特性而得到的。與修飾前的腈水合酶相比較，作為特性的改變可以舉出底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、底物(可以舉 出例如以該酶作為催化劑時，能夠轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的酰胺化合物的任意腈化合物)穩(wěn)定性、產(chǎn)物(可以舉出例如以該酶作為催化劑時，轉(zhuǎn)化任意腈化合物而得到的對應(yīng)酰胺化合物)穩(wěn)定性等性質(zhì)中的任一種或一種以上性質(zhì)發(fā)生的改變。具體可以舉出以下8種改變等，I)相對而言，空間體積更大的腈化合物容易成為底物。2)相對而言，空間體積更小的腈化合物容易成為底物。3)以任意腈化合物作為底物時，Vmax增大。4)以任意腈化合物作為底物時，Km減小。5)將酶暴露于任意熱量中時，其不可逆失活率降低。6)將酶暴露于任意濃度的底物中時，其不可逆失活率降低。7)因反應(yīng)中存在任意濃度產(chǎn)物所引起的反應(yīng)抑制率降低。8)將酶暴露于任意濃度的產(chǎn)物中時，其不可逆失活率降低。作為本發(fā)明中以修飾前的腈水合酶為對象的修飾方法所產(chǎn)生的特性改變的指標(biāo)，可以以底物特異性的變化作為其代表例之一。當(dāng)經(jīng)本發(fā)明的修飾方法得到的修飾酶為改變了底物特異性的酶時，該修飾酶也包含在本發(fā)明的修飾酶的范圍中。作為得到的修飾酶的底物特異性變化的觀察方法，可以舉出如下方法:以空間體積不同的多種腈化合物作為底物進行反應(yīng)，測定生成的對應(yīng)酰胺化合物的量的差異。例如，比較以丙烯腈為底物反應(yīng)生成的丙烯酰胺與以甲基丙烯腈為底物反應(yīng)生成的甲基丙烯酰胺的摩爾比的方法。此時，與修飾前的對象相比較，可以認為[生成的甲基丙烯酰胺的摩爾量]+[生成的丙烯酰胺的摩爾量]的值向增大的方向變化的修飾酶表現(xiàn)出使空間體積更大的腈化合物容易成為底物的特性變化；上述值向減小的方向變化的修飾酶表現(xiàn)出使空間體積更小的腈化合物容易成為底物的特性變化。以來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶、以及從來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶為對象的例子中，實施包括下述步驟的修飾方法時，與修飾前的對象比較，得到了以丙烯腈為底物反應(yīng)生成的丙烯酰胺與以甲基丙烯腈為底物反應(yīng)生成的甲基丙烯酰胺的摩爾比發(fā)生變化的修飾酶，該步驟為:通過解析立體結(jié)構(gòu)，確定形成下述孔穴的區(qū)域和/或形成下述界面的區(qū)域，所述孔穴是底物從酶外部進入活性中心時、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時通過的孔穴，所述界面為參與2聚體形成的α亞單位和β亞單位之間的結(jié)合界面、或參與2聚體之間結(jié)合的界面；并對與所述區(qū)域中存在的氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸的任一或一個以上位點進行置換、插入、缺失等修飾的步驟。上述性質(zhì)可稱為底物特異性，即，特性改變的產(chǎn)物，因此得到的修飾酶包含在本發(fā)明的修飾酶范圍內(nèi)。在以來源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶為對象的例子中，序列表的序列號104記載的堿基序列中從第I個到第690個堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列的第48位所對應(yīng)的氨基酸殘基Trp被變更為其它氨基酸殘基，采用上述修飾方法時，與修飾前的對象相比較，顯示出空間體積更大的腈化合物易作為底物的特性變化。因此，獲得的表現(xiàn)出特性改變的蛋白質(zhì)也包含在本發(fā)明的修飾酶范圍內(nèi)。另外，容易推測，通過組合得到的修飾酶的突變位點，可獲得附加的特性改變。因此，上述經(jīng)突變位點組合而得到的修飾酶也包含在本發(fā)明的修飾酶范圍之內(nèi)。本發(fā)明中編碼修飾酶的基因是指，以形成構(gòu)成修飾酶的2種多肽鏈為特征的2個氨基酸序列，或形成以 編碼上述2個氨基酸序列為特征的2個ORF的堿基序列。本發(fā)明中以含有基因為特征的質(zhì)粒是指具有下述特征的質(zhì)粒，S卩，該質(zhì)粒的序列中含有形成下述2個ORF的堿基序列，所述2個ORF的特征為編碼下述2個氨基酸序列，而所述2個氨基酸序列的特征為形成構(gòu)成修飾酶的2種多肽鏈。上述質(zhì)粒除本發(fā)明的基因之外，還可具有能夠通過轉(zhuǎn)化任意宿主細胞得到的轉(zhuǎn)化子或細胞株生產(chǎn)修飾酶的所需的結(jié)構(gòu)，如各基因表達中必需的控制區(qū)域及自我復(fù)制的必需區(qū)域等。此處所謂任意的宿主細胞，例如為下述實施例中舉出的大腸桿菌，但并不限定于此，也可以使用枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌屬菌、酵母菌或鏈霉菌屬等其它微生物。作為表達中必需的控制區(qū)域，可以舉出啟動子序列(含有控制轉(zhuǎn)錄的操縱基因序列)、核糖體結(jié)合序列(SD序列)、轉(zhuǎn)錄終止序列等。具體的啟動子序列，可以舉出來源于大腸桿菌的色氨酸操縱子的Trp啟動子、乳糖操縱子的Lac啟動子、來源于λ噬菌體的PL啟動子和PR啟動子；以及來源于枯草芽胞桿菌的葡糖醒酸合成酶啟動子(gnt)、堿性蛋白酶啟動子(apr)、中性蛋白酶啟動子(npr)和α-淀粉酶啟動子(amy)等。另外也可以利用人為設(shè)計、改良的序列,如tac啟動子或trc啟動子。
作為核糖體結(jié)合序列可以舉出來源于大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的序列或紅球菌屬/假諾卡氏菌屬固有的序列，只要是能在諸如大腸桿菌或枯草芽胞桿菌等所希望的宿主細胞中起作用的序列即可，沒有特別的限制。例如，可以利用由DNA合成制備的下述共有序列，所述共有序列由4個或4個以上連續(xù)堿基組成，并可與16S核糖體RNA的3’-末端區(qū)互補。轉(zhuǎn)錄終止序列不是必須的，然而，可以利用P-因子非依賴性序列，例如，脂蛋白終止子或trp操縱子終止子等。上述控制區(qū)域在質(zhì)粒上的序列順序優(yōu)選為，啟動子序列和核糖體結(jié)合序列位于靠近5’ -末端側(cè)本發(fā)明基因的上游位置，轉(zhuǎn)錄終止序列位于靠近3’ -末端側(cè)本發(fā)明基因的下游的位置。編碼構(gòu)成本發(fā)明基因的各種ORF的堿基序列可以通過上述控制區(qū)域以各自獨立的順反子形式進行表達，也可以通過共同的控制區(qū)域以多順反子形式進行表達。作為滿足上述要求的質(zhì)粒載體實例，可以舉出在大腸桿菌中具有可自我復(fù)制的區(qū)域的pBR322、pUC18、pBluescript、pKK223_3、pSClOl ;在枯草芽胞桿菌中具有可自我復(fù)制的區(qū)域的pUB110、pTZ4、pC194、P 11、Φ1、Φ 105等。另外，作為可在2種或2種以上宿主細胞中進行自我復(fù)制的質(zhì)粒載休實例可以舉出，PHV14、TRp7、YEp7和pBS7。本發(fā)明中表達基因以生產(chǎn)具有所期望的活性的腈水合酶時，有時需要參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)。參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)是具有下述性質(zhì)的蛋白質(zhì)，S卩，所述蛋白質(zhì)表達與否直接影響腈水合酶的激活，可以舉出專利文獻4中記載的參與來源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶激活的蛋白質(zhì)(腈水合酶激活蛋白質(zhì))。具體而言，作為腈水合酶激活蛋白質(zhì)可以舉出由序列號102的氨基酸序列所表示的144個氨基酸的序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。另外，將序列號102的氨基酸序列的一部分氨基酸置換、插入或缺失等得到的突變蛋白質(zhì)只要參與腈水合酶的激活，則也 包含在腈水合酶激活蛋白質(zhì)的范疇內(nèi)。作為上述突變蛋白質(zhì)，可以舉出具有對序列號102的氨基酸序列中一個或一個以上氨基酸進行置換、插入或缺失等處理而得到的突變并保持參與腈水合酶激活的性質(zhì)的蛋白質(zhì)。作為編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因，只要是編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因即可，并無特別的限制。作為上述基因，可以舉出具有編碼上述序列號102的氨基酸序列的堿基序列的基因、及編碼上述突變蛋白質(zhì)的基因。另外，作為編碼上述腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因的優(yōu)選例，可以舉出具有序列號103的堿基序列的基因。編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因中，即使是對序列號103記載的堿基序列中的I個、2個或2個以上堿基進行置換、插入、缺失而得到的序列，只要其能夠作為編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因而發(fā)揮作用，則也包含在編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因的范圍之內(nèi)。在使用編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因時，可以舉出例如將其ORF與本發(fā)明中形成基因的2個ORF共同包含在本發(fā)明的質(zhì)粒中。此時，上述ORF在質(zhì)粒上的順序沒有特別的限制，另外，可以是3個ORF被同一個控制區(qū)域控制；也可以是2個ORF被同一個控制區(qū)域控制、而剩余I個ORF被不同于前2個ORF的控制區(qū)域的控制區(qū)域控制；還可以是3個ORF各自被不同的控制區(qū)域控制。如上所述，將本發(fā)明的基因與本發(fā)明中修飾酶的活性表達所必需的區(qū)域一同插入上述質(zhì)粒載體中，從而構(gòu)建本發(fā)明的質(zhì)粒的方法、或利用所述質(zhì)粒將所希望的宿主細胞轉(zhuǎn)化的方法、以及在上述轉(zhuǎn)化子內(nèi)生產(chǎn)腈水合酶的方法，可以利用例如“《分子克隆第三版》(J.Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) ”等記載的分子生物學(xué)、生物工程學(xué)和基因工程學(xué)領(lǐng)域中公知的普通方法和宿主細胞。本發(fā)明中以通過轉(zhuǎn)化而獲得為特征的轉(zhuǎn)化子中，包含利用本發(fā)明的基因或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞而得到的轉(zhuǎn)化子。作為培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子的例子，可以舉出以下述步驟特征的方法:將其接種到培養(yǎng)基中之后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溫度(一般而言為20°C 50°C )下進行培養(yǎng)。需要說明的是，當(dāng)宿主細胞為微生物時，一般使用LB培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基等作為培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基，但也可以在上述培養(yǎng)基成分中添加金屬離子。作為添加的金屬離子可以舉出Fe離子及Co離子。添加量例如為0.1 μ g/mL或0.1 μ g/mL以上。本發(fā)明中修飾酶的制備方法以下述步驟為特征:從培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子得到的培養(yǎng)液、細胞、或其處理物中回收修飾酶，可以舉出具有如下特征的方法，即，該方法包含從上述轉(zhuǎn)化子、所述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液、或者所述轉(zhuǎn)化子或培養(yǎng)液的處理物中回收活性腈水合酶的步驟。本發(fā)明中以包含將腈化合物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)酰胺化合物的步驟為特征的酰胺化合物制備方法，可以舉出以含有下述轉(zhuǎn)化步驟為特征的方法，所述步驟為使用上述轉(zhuǎn)化子、所述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液、或所述轉(zhuǎn)化子或所述培養(yǎng)液的處理物、或經(jīng)上述制備方法回收的活性腈水合酶作為催化劑，從而將腈化合物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的酰胺化合物的步驟。本發(fā)明中作為利用修飾酶或具有該酶活性的轉(zhuǎn)化子從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的例子，可以舉出包含下述步驟的方法，即，將所希望的腈化合物與所述酶的精制物或酶的粗產(chǎn)物、本發(fā)明中轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液、從培養(yǎng)液得到的轉(zhuǎn)化子、或者轉(zhuǎn)化子的處理物在溶劑中接觸的步驟。此處所謂處理物包括從所述轉(zhuǎn)化子得到的提取物、粉碎物；分離上述提取物或粉碎物中腈水合酶活性成分而得到的酶粗產(chǎn)物；進一步精制而得到的酶精制物等后分離物；以及將所述轉(zhuǎn)化子或所述轉(zhuǎn)化子的提取物、粉碎物或后分離物用適當(dāng)?shù)姆椒ü潭ɑ玫降墓潭ɑ?。接觸溫度沒有特別的限制，優(yōu)選在所述腈水合酶不失活的溫度范圍內(nèi)，更優(yōu)選為凝固點或凝固點以上,60 °C或60 °C以下。作為腈化合物，只要是能夠作為本發(fā)明的改良酶的底物發(fā)揮作用的化合物即可，可以舉出碳原子為2 4的腈化合物，例如，乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈、異丁腈、丁烯腈和α-羥基異丁腈等。所述腈化合物在溶劑中的濃度沒有特別的限定，另外，反應(yīng)溫度也無特別的限定，但優(yōu)選在所述腈水合酶不失活的溫度范圍內(nèi)，更優(yōu)選為凝固點或凝固點以上，50°C或50°C以下。下面通過實施例對本發(fā)明進行更加詳細地說明，但本發(fā)明并不受到下述實施例的任何限定。應(yīng)予說明，各實施例及比較例中的HPLC分析使用日本分光制的FiMpak SIL018-5(250Χ4.6Φ )作為色譜柱，并以含有4體積％乙腈的IOmM磷酸水溶液為流動相。利用210nm處的吸光度檢測丙烯酰胺、丙烯腈、丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯腈、甲基丙烯酸。[參考例I]保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(I)為了將α亞單位中的第6位的Leu置換為Met，使用寶酒造社制的“LA PCR invitro mutagenesis Kit” 引入位點特異性突變。下文中 “LA PCR in vitro mutagenesisKit”簡稱為試劑盒。在以下參考例中基本按照試劑盒的原理和操作方法來進行。在30ml試管中裝入IOml的LB液體培養(yǎng)基，并通過高壓滅菌鍋進行121°C、20分鐘的滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使其最終濃度為100 μ g/ml后，使用鉬金接菌環(huán)將MT-10822接種在培養(yǎng)基上，并在37°C、300rpm下培養(yǎng)約20小時。取出Iml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpmX5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法由該菌體制備質(zhì)粒pPT-DBl。分別以IOng的pPT-DBl為模板進行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)N0.1通過下述步驟完成:在分別含有50pmol序列表的序列號7記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號8中記載有其序列)的總計50 μ I的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)進行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98°C)15秒、退火(55°C)30秒、鏈延長反應(yīng)(72°C ) 120秒。PCR反應(yīng)N0.2通過下述步驟完成:在分別含有50pmol MUT4引物(序列表的序列號9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號10中記載有其序列)的總計50 μ I的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進行與PCR反應(yīng)N0.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)N0.1及N0.2的最終反應(yīng)液各5 μ I進行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％ )以分析DNA擴增產(chǎn)物時，可以確認存在擴增DNA產(chǎn)物。使用Microcon100 (寶酒造社制)從各PCR最終反應(yīng)液中除去過量的引物和dNTP后，加入TE分別配制成50 μ I的溶液。配制總計47.5 μ I的分別含0.5 μ I上述TE溶液的退火溶液(組成遵照試劑盒中記載的條件)，實施10分鐘熱變性處理(98°C )后，經(jīng)60分鐘以恒定的速度冷卻至37°C，接著在37°C下保持15分鐘進行退火處理。將0.5 μ I TaKaRa LA Taq加入至退火處理液中，并在72 °C下加熱處理3分鐘，由此形成了異源雙鏈。使其進行PCR反應(yīng)N0.3，S卩，向其中加入M13引物M4 (序列表的序列號8中記載有其序列)及M13引物RV(序列表的序列號10中記載有其序列)各50pmol，使總量達到50μ I后，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98°C ) 15秒、退火(55°C )30秒、鏈延長反應(yīng)(72°C ) 120秒。取5μ I PCR反應(yīng)N0.3的最終反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.8重量％ )以分析DNA擴增產(chǎn)物時，可以確認存在約2kbp的擴增DNA產(chǎn)物。接著從瓊脂糖凝膠中僅切出約2kbp的DNA片段，將該瓊脂糖片(約0.1g)微細地粉碎并混懸在Iml的TE溶液中，在55°C下保溫I小時使瓊脂糖完全熔化。對所得熔化液進行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以純化所述DNA片段。最后，將該片段溶于10μ1的TE中。用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI及HindIII切割上述純化后的約2kbp的擴增DNA片段，然后對該限制性核酸內(nèi)切酶處理液 進行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以純化所述DNA片段，最終使其溶于10 μ I的TE中。同樣用EcoRI及HindIII切割pPT-DBl后，進行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.7% )，僅將約2.7kbp的DNA片段從瓊脂糖凝膠中切下。將切下的瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細地粉碎并混懸在Iml TE溶液中，將其在55°C下保溫I小時使瓊脂糖完全熔化。對該熔化液進行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化該DNA片段，使該片段最終溶于10 μ I的TE中。用DNAligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的約2kbp及約2.7kbp的DNA片段進行連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB 101感受態(tài)細胞(東洋紡績社制)，得到轉(zhuǎn)化子N0.1。利用下述方法求出用得到的轉(zhuǎn)化子制備酰胺化合物時的轉(zhuǎn)化率和選擇率。在500ml裝有擋板的三角燒瓶中配制含有40 μ g/ml硫酸鐵.七水合物和10 μ g/ml氯化鈷.二水合物的LB液體培養(yǎng)基100ml，并通過高壓滅菌鍋進行121°C、20分鐘的高壓滅菌處理。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使其最終濃度為100 μ g/ml。然后使用鉬金接菌環(huán)將轉(zhuǎn)化子N0.1接種在培養(yǎng)基上，并在37°C、130rpm下培養(yǎng)約20小時。通過離心分離(5000GX15分鐘)從該最終培養(yǎng)液中分離出菌體，接著將上述分離后的菌體重懸在50ml的生理鹽水中，并再次離心分離(5000GX15分鐘)出菌體。將0.1g該菌體混懸在20ml、50mM的磷酸鉀水溶液(PH7.0)中，向其中加入Iml丙烯腈或甲基丙烯腈，并在10°C下邊緩慢地攪拌邊使其反應(yīng)I小時。反應(yīng)結(jié)束后，用HPLC分析反應(yīng)液，結(jié)果確認了在反應(yīng)液中僅存在與反應(yīng)液中添加的腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)相當(dāng)摩爾量的酰胺化合物(丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺)，而不存在腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)及對應(yīng)的有機酸(丙烯酸或甲基丙烯酸)。即，轉(zhuǎn)化率和選擇率都是100 %。然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著使用ABI社制的測序試劑盒和核酸自動測序儀373A的雙脫氧鏈終止法測定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表I所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Met。表1-1-1-1 *、
克隆號突變位點氨基酸序列的改變堿基序列的改變
(α亞單位內(nèi)內(nèi))置換前置換后置換前置換后
權(quán)利要求
1.一種腈水合酶突變體，是具有由序列表I的序列號I的氨基酸序列構(gòu)成的α亞單位及由序列表I的序列號2的氨基酸序列構(gòu)成的β亞單位的腈水合酶的至少一個以上的氨基酸置換為其它氨基酸而得到的腈水合酶突變體，其中 所述腈水合酶具有形成參與2聚體形成的α亞單位和β亞單位之間的結(jié)合界面、或參與2聚體之間結(jié)合的界面的區(qū)域， 所述腈水合酶突變體包含下述突變，所述突變是選自由位于所述腈水合酶中所述結(jié)合界面或形成所述界面的區(qū)域中的、所述序列號I的氨基酸序列的第71、148、188及204位的氨基酸及所述序列 號2的氨基酸序列的第10、146、150、160、168、171、176、186、217及218位氨基酸構(gòu)成的組中的任一氨基酸置換為下述(i) (XV)所示的其它氨基酸而得到的突變， (i)所述序列號I的氨基酸序列的第71位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為His， ( )所述序列號I的氨基酸序列的第148位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Asp， (iii)所述序列號I的氨基酸序列的第188位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Gly, (iv)所述序列號I的氨基酸序列的第204位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Arg、Lys > Trp 或 Thr, (V)所述序列號2的氨基酸序列的第10位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Asp、Glu、Trp> Gly、Tyr 或 Cys, (vi)所述序列號2的氨基酸序列的第146位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Gly， (vii)所述序列號2的氨基酸序列的第150位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Ser或 Asn, (viii)所述序列號2的氨基酸序列的第160位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Leu > Trp > Met 或 Cys, (ix)所述序列號2的氨基酸序列的第168位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Glu， (X)所述序列號2的氨基酸序列的第171位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Ala， (xi)所述序列號2的氨基酸序列的第176位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Ala、Met、Cys 或 Thr, (xii)所述序列號2的氨基酸序列的第186位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Glu、Asp、Lys、Arg、Asn、Ser 或 Gly, (xiii)所述序列號2的氨基酸序列的第217位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Gly、Val、Leu、Met、Cys> Ser> Thr 或 His, (xiv)所述序列號2的氨基酸序列的第218位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Met或 Ser0
2.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體，其特征在于， 當(dāng)包含所述(ii)及(iv)的突變時，包含所述序列號I的氨基酸序列第148位和第204位的氨基酸分別置換為Asp和Arg的所述α亞單位,或者 當(dāng)包含所述(viii)及(xii)的突變時，包含所述序列號2的氨基酸序列第160位和第186位的氨基酸分別置換為Trp和Arg的所述β亞單位。
3.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體，其特征在于，當(dāng)包含所述(i)的突變時，所述序列號I的氨基酸序列第71位氨基酸置換為His的所述α亞單位進一步包含在第19位和第126位氨基酸處分別成為Val和Tyr的置換,或者 當(dāng)包含所述(ii)及(iv)的突變時，所述序列號I的氨基酸序列第148位和第204位氨基酸分別置換為Asp和Arg的所述α亞單位進一步包含在第36位氨基酸處成為Met的置換。
4.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體，其特征在于， 當(dāng)包含所述(V)的突變時，所述序列號2的氨基酸序列第10位氨基酸置換為Asp的所述α亞單位進一步包含在第118位和第200位氨基酸處分別成為Val和Glu的置換,或者 當(dāng)包含所述(vii)及(xii)的突變時，所述序列號2的氨基酸序列第160位和第186位氨基酸分別置換為Trp和Arg的所述β亞單位進一步包含在第127位氨基酸處成為Ser的置換。
5.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體，其特征在于: 當(dāng)包含所述(V)時，所述突變體具有:包含在所述序列號I的氨基酸序列第6、36及126位氨基酸處分別成為Thr、Met和Tyr的置換的所述α亞單位，及包含在所述序列號2的氨基酸序列第10、118及200位氨基酸處分別成為Asp、Val和Glu的置換的所述β亞單位，或者 當(dāng)包含所述(ii)及(iv)的突變時，所述突變體具有:包含在所述序列號I的氨基酸序列第36、148及204位氨基酸處分別成為Met、Asp和Arg的置換的所述α亞單位，且包含在所述β亞單位的序列號2的氨基酸序列第41、51及108位氨基酸處分別成為lie、Val和Asp的置換的所述β亞單位，或者 當(dāng)包含所述(ii)及(iv)的突變時，所述突變體具有:包含在所述序列號I的氨基酸序列第148及204位氨基酸處分別成為Asp和Arg的置換的所述α亞單位，且包含在所述β亞單位的序列號2的氨基酸序列第108及200位氨基酸處分別成為Asp和Glu的置換的所述β亞單位。
6.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體， 當(dāng)包含所述(viii)及(xii)的突變時，包含在所述ct亞單位的所述序列號I的氨基酸序列第6、19和126位氨基酸處分別成為Ala、Val和Tyr的置換，且包含在所述β亞單位的所述序列號2的氨基酸序列第127、160和186位氨基酸處分別成為Ser、Trp和Arg的置換，或者 當(dāng)包含所述(i)的突變時，包含在所述α亞單位的所述序列號I的氨基酸序列第19、71和126位氨基酸處分別成為Val、His和Tyr的置換，且包含在所述β亞單位的所述序列號2的氨基酸序列第37、108和200位氨基酸處分別成為LeiuAsp和Glu的置換，或者 當(dāng)包含所述(i)的突變時，包含在所述α亞單位的所述序列號I的氨基酸序列第19、71和126位氨基酸處分別成為Val、His和Tyr的置換，且包含在所述β亞單位的所述序列號2的氨基酸序列第37、108和200位氨基酸處分別成為Val、Asp和Glu的置換。
7.一種編碼腈水合酶的基因，具有編碼腈水合酶的α亞單位的氨基酸序列的基因與編碼腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列的基因，其特征在于，編碼如權(quán)利要求1或2所述的腈水合酶突變體。
8.如權(quán)利要求7所述的基因， 其特征在于，編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有包含下述置換的堿基序列: 序列表的序列號3的堿基序列中第211至213位堿基處成為CAT的置換，或 第442至444位成為GAC的置換,或 第562至564位成為GGC的置換，或 第610至612位成為CGC、AAA、TGG或ACC的置換，或 編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有包含下述置換的堿基序列: 序列表的序列號4的堿基序列中第28至第30位堿基處成為GAC、GAA、TGG、GGC、TAC或TGC的置換，或 第436至438位成為GGG的置換，或 第448至450位堿基處成為TCG或AAT的置換，或 第478至480位堿基處成為CTG、TGG、ATG或TGT的置換，或 第502至504位堿基處成為GAG的置換，或 第511至513位堿基處成為GCG的置換，或 第526至528位堿基處成為GCC、ATG、TGC或ACC的置換，或 第556至558位堿基處成為GAG、GAT、AAG、CGG, AAC, TCG或GGG的置換，或 第649至651位堿基處成為GGC、GTC、CTC、ATG、TGT、AGC、ACC或CAC的置換，或 第652至654位堿 基處成為ATG或TCC的置換。
9.如權(quán)利要求7所述的基因，其特征在于， 編碼所述α亞單位的氣基酸序列的基因具有包含下述置換的喊基序列:序列表的序列號3的堿基序列中第442至444位和第610至612位堿基處分別成為GAC和CGC的置換，或者 編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有包含下述置換的堿基序列:序列表的序列號4的堿基序列中第478至480位和第556至558位堿基處分別成為TGG和CGG的置換。
10.如權(quán)利要求7所述的基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求3所述的腈水合酶突變體。
11.如權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于， 具有所述序列號3的喊基序列中第211至213位喊基處置換為CAT的喊基序列的編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有進一步包含第55至57位和第376至378位堿基處成為GTG和TAC的置換的堿基序列，或者 具有所述序列號3的堿基序列中第442至444位堿基和第610至612位堿基處分別置換為GAC和CGC的喊基序列的編碼所述α亞單位的氣基酸序列的基因具有進一步包含第106至108位堿基處分別成為ATG的置換的堿基序列。
12.如權(quán)利要求7所述的基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求4所述的腈水合酶突變體。
13.如權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于， 具有所述序列號4的喊基序列中第28至30位喊基處置換為GAC的喊基序列的編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有進一步包含第352至354位和第598至600位堿基處成為GTC和GAA的置換的堿基序列，或者 具有所述序列號4的堿基序列中第478至480位堿基和第556至558位堿基處分別置換為TGG和CGG的堿基序列的編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有進一步包含第379至381位堿基處分別成為TCG的置換的堿基序列。
14.如權(quán)利要求7所述的基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求5所述的腈水合酶突變體。
15.如權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于， 編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號3的堿基序列中第16至18位、及第106至108位、及第376至378位堿基處分別成為ACG、ATG和TAC的置換的堿基序列，且編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號4的堿基序列中第28至30位、第352至354位、及第598至600位堿基處分別成為GAC、GTC和GAA的置換的堿基序列，或者 編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號3的堿基序列中第106至108位、第442至444位及第610至612位堿基處分別成為ATG、GAC和CGC的置換的堿基序列，且編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號4的堿基序列中第121至123位、第151至153位、及第322至324位堿基處分別成為ATC、GTC和GAT的置換的堿基序列，或者 編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號3的堿基序列中第442至444位及第610至612位堿基處分別成為GAC和CGC的置換的堿基序列，且編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號4的堿基序列中第322至324位、及第598至600位堿基處分別成為GAT和GAA的置換的堿基序列。
16.如權(quán)利要求7所述的基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求6所述的腈水合酶突變體。
17.如權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于， 編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號3的堿基序列中第16至18位、第55至57位、及第376至378位堿基處分別成為GCG、GTG和TAC的置換的堿基序列，且編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號4的堿基序列中第379至381位、第478至480位、及`第556至558位堿基處分別成為TCG、TGG和CGG的置換的喊基序列，或者 編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號3的堿基序列中第55至57位、第211至213位及第376至378位堿基處分別成為GTG、CAT和TAC的置換的堿基序列，且編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號4的堿基序列中第109至111位、第322至324位、及第598至600位堿基處分別成為CTC、GAT和GAC的置換的喊基序列，或者 編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號3的堿基序列中第55至57位、第211至213位及第376至378位堿基處分別成為GTG、CAT和TAC的置換的堿基序列，且編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有包含在所述序列號4的堿基序列中第109至111位、第322至324位、及第598至600位堿基處分別成為GTC、GAT和GAA的置換的堿基序列。
18.一種質(zhì)粒,其特征在于,含有編碼如權(quán)利要求7 17中任一項所述的腈水合酶突變體的基因。
19.如權(quán)利要求18所述的質(zhì)粒，其特征為，該質(zhì)粒具有在宿主細胞內(nèi)表達所述腈水合酶突變體所需的結(jié)構(gòu)。
20.一種轉(zhuǎn)化子，是利用權(quán)利要求19所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞而得到的轉(zhuǎn)化子。
21.—種生產(chǎn)腈水合酶的方法，其特征在于含有下述步驟，即，將權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，基于所述轉(zhuǎn)化子中所述質(zhì)粒具有的腈水合酶基因生產(chǎn)腈水合酶的步驟。
22.如權(quán)利要求21所述的生產(chǎn)方法，其特征為，該方法進一步含有從所述培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化子、培養(yǎng)液、及其處理物中回收腈水合酶的步驟。
23.一種制備酰胺化合物的方法，是通過在水性介質(zhì)中使腈化合物與腈水合酶接觸而得到對應(yīng)的酰胺化合物的制備方法，其特征為，所述腈水合酶為如權(quán)利要求1 6中任一項所述的腈水合酶突變體 。
全文摘要
本發(fā)明的目的為提供一種具有新型突變位點的腈水合酶的氨基酸序列及其基因的堿基序列，另外本發(fā)明的目的還在于提供一種對具有腈水合酶活性的酶進行修飾的方法。作為解決目前問題的方法，提供了在來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095、由2種異源亞單位構(gòu)成的腈水合酶中引入新型突變而得到的突變體的氨基酸序列及其基因的堿基序列。而且，通過確定腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)/氨基酸序列中作為修飾對象的區(qū)域，并對與形成所述區(qū)域的氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸進行置換、插入、缺失等改變從而修飾腈水合酶。通過本發(fā)明，能夠比現(xiàn)有技術(shù)更高效率地將腈化合物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的酰胺化合物。
文檔編號C12N15/09GK103103175SQ20121057427
公開日2013年5月15日 申請日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者八卷俊文, 番場伸一, 的石香, 伊藤潔, 小林英樹, 田中英司, 及川利洋 申請人:三井化學(xué)株式會社