專利名稱：引物及該引物質(zhì)譜檢測pik3ca基因熱點突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及引物及該引物質(zhì)譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法。
背景技術(shù)：
(I)、單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500 1000個堿基對中就有I個，估計其總數(shù)可達(dá)300萬個甚至更多。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單 個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。一般而言，SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異。SNP成為第三代遺傳標(biāo)志，人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。大量存在的SNP位點，使人們有機(jī)會發(fā)現(xiàn)與各種疾病，包括腫瘤相關(guān)的基因組突變；從實驗操作來看，通過SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因突變要比通過家系來得容易；有些SNP并不直接導(dǎo)致疾病基因的表達(dá)，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標(biāo)記。SNP將提供一個強(qiáng)有力的工具，用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計和測試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等。SNP研究是人類基因組計劃走向應(yīng)用的重要步驟。(2)、PIK3CA 基因PIK3CA是PI3K家族的關(guān)鍵成員-1A類磷脂酰肌醇_3激酶的ρ110 α催化亞基。PIK3CA是一個34kb的基因，定位于染色體3q26. 32，含20個外顯子，編碼1068個氨基酸，生成124kDa蛋白質(zhì)，它是逆轉(zhuǎn)錄病毒v-p3k癌基因在細(xì)胞內(nèi)的同系物。PIK3CA的功能是催化4，5-PIP2成為3，4, 5-PIP3。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在多種人類癌癥(結(jié)腸癌，乳癌，腦癌，肝癌，胃癌和肺癌等)中存在PIK3CA的擴(kuò)增、缺失、及體細(xì)胞突變。體細(xì)胞突變的PIK3CA其激酶活性增加并導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化。PIK3CA基因在癌癥中呈現(xiàn)高頻突變?nèi)藗儗IK3CA在多種癌癥中的突變進(jìn)行了檢測，大量的數(shù)據(jù)表明PIK3CA有3個熱點突變區(qū)，即第9外顯子的E542K和E545K，以及第20號外顯子的H1047R。PI3K作為EGFR下游信號分子被激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對EGFR-TKI等藥物的耐藥。所以，檢測PIK3CA基因突變可以預(yù)測腫瘤患者對EGFR-TKI等藥物的耐藥性。(3)、目前的PIK3CA突變的檢測方法目前PIK3CA突變的檢測方法有直接測序法，實時定量PCR法，液態(tài)芯片法等。其中，直接測序法的靈敏度低，要求受檢材料的突變比例大于20%，且檢測成本也較高；實時定量PCR法的靈敏度較直接測序法高，可達(dá)5%左右，但其通量低，且需面對其假陽性高的問題。液態(tài)芯片法的特異性和準(zhǔn)確率高，但是需要針對突變位點設(shè)計探針和相應(yīng)的微球，成本較聞。因此，我們需要找到一種靈敏度高，操作簡便，成本低的方法，以求可以實現(xiàn)對PIK3CA熱點突變快速簡便準(zhǔn)確的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種引物及該引物質(zhì)譜檢測PIK3CA熱點突變的方法；旨在解決現(xiàn)有技術(shù)靈敏度低，通量低，準(zhǔn)確度不高，成本高的問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是引物，包括擴(kuò)增引物和測序引物，所述的擴(kuò)增引物序列如下SEQ ID N0:15’-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’SEQ ID N0:25’-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’
SEQ ID N0:35’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’SEQ ID N0:45’-ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’SEQ ID N0:55’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’SEQ ID NO: 65 ’ -ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3，SEQ ID N0:75，-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’SEQ ID NO:85’ -ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’ ；所述的延伸引物序列如下SEQ ID NO:95’ -TCCAGCCACCATGAT-3’SEQ ID NO: 105’-CCTCTCTCTGAAATCACT-3’SEQ ID NO: 115’-CACGAGATCCTCTCTCT-3’SEQ ID NO: 125’-GAAACAAATGAATGATGCAC-3’。進(jìn)一步的所述的引物是具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 12任一項所示序列的核
苷酸序列。本發(fā)明的另一目的是利用該引物質(zhì)譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法，包括如下步驟⑴、確定PIK3CA熱點突變在基因序列中的位置；⑵、根據(jù)突變位點及其兩端的序列設(shè)計用于擴(kuò)增反應(yīng)的引物對和用于延伸反應(yīng)的引物；⑶、使用擴(kuò)增引物對進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以獲得包含突變位點及其兩端序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)、使用SAP酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物，去除殘留在反應(yīng)體系中多余的脫氧核苷酸；(5)、使用延伸引物進(jìn)行延伸反應(yīng)；(6)、然后使用樹脂純化延伸產(chǎn)物；(7)、將延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到芯片上；(8)、將芯片放置于質(zhì)譜儀中，運(yùn)行程序進(jìn)行檢測；⑶、讀取并分析檢測數(shù)據(jù)，確認(rèn)樣本PIK3CA基因目的位點的基因型。進(jìn)一步的所述步驟⑴熱點突變定位于PIK3CA基因的第542位、545位、1047位密碼子中的一種或幾種；所述步驟⑵擴(kuò)增反應(yīng)所使用的擴(kuò)增引物包括SEQID NO:1至SEQ IDN0:8所示序列中的一對組合或多對組合；所述步驟⑵延伸引物包括SEQ ID N0:9至SEQ IDNO: 12所示序列中的一條或多條。
進(jìn)一步的所述第542位密碼子熱點突變發(fā)生在此密碼子的第一位堿基上，為錯義突變，擴(kuò)增引物為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，延伸引物為SEQ ID N0:9。進(jìn)一步的所述第545位密碼子熱點突變發(fā)生在此密碼子的第一位堿基上，為錯義突變，擴(kuò)增引物為SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4，延伸引物為SEQ ID NO: 10。進(jìn)一步的所述第1047位密碼子熱點突變發(fā)生在此密碼子的第一位堿基和第二位堿基上，均為錯義突變，擴(kuò)增引物分別為SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6的組合以及SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8的組合，延伸引物分別為SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12。本發(fā)明的有益技術(shù)效果是與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于(I)、檢測靈敏度高，質(zhì)譜儀將不同質(zhì)量的產(chǎn)物加以區(qū)分，可以檢測出PIK3CA突變比率低于1%的樣本。
(2)、通量高，使用384孔板進(jìn)行實驗，可一次性對190例樣本同時進(jìn)行檢測。( 3 )、準(zhǔn)確率高，不出現(xiàn)假陽性的檢測結(jié)果。(4)、檢測成本低。


圖1、使用延伸引物SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10對測試樣本PIK3CA基因545位密碼子的第一位堿基以及1047位密碼子的第一位堿基進(jìn)行檢測的結(jié)果；圖2、使用延伸引物SEQ ID N0:11和SEQ ID NO: 12對測試樣本PIK3CA基因542位密碼子的第二位堿基以及1047位密碼子的第二位堿基進(jìn)行檢測的結(jié)果。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。下面結(jié)合具體樣本對本發(fā)明進(jìn)行具體說明(I)、確定PIK3CA熱點突變在基因序列中的位置；人們對PIK3CA在多種癌癥中的突變進(jìn)行了檢測，大量的數(shù)據(jù)表明PIK3CA有3個熱點突變區(qū)，分別是第9號外顯子的542位密碼子和545位密碼子以及第20號外顯子的1047位密碼子；這3個熱點突變位置共包括4個堿基的錯義突變(其中1047位密碼子的第一和第二位堿基均為突變位點；542、545位密碼子則均為第一位堿基發(fā)生突變)，每一個突變對應(yīng)一個SNP號(rs號)；具體如下542位密碼子第一位堿基對應(yīng)rs號為rsl21913273 ；545位密碼子第一位堿基對應(yīng)rs號為rsl04886003 ；1047位密碼子第一位堿基對應(yīng)rs號為rsl21913281 ；1047位密碼子第二位堿基對應(yīng)rs號為rsl21913279。為了避免延伸反應(yīng)中延伸引物之間形成二聚體，將這個4個突變檢測分為兩組rsl04886003 和 rsl21913281 一組；rsl21913273 和 rsl21913279 一組，在擴(kuò)增反應(yīng)和延伸反應(yīng)中，始終分為這兩組進(jìn)行。
(2)、根據(jù)步驟(I)中的SNP位點設(shè)計擴(kuò)增引物，遵循引物間不形成二聚體，引物自身不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以及引物與模板間不發(fā)生錯配的原則；rsl21913273 使用擴(kuò)增引物 SEQ ID N0:5 和 SEQ ID NO:6;rsl04886003 使用擴(kuò)增引物 SEQ ID N0:3 和 SEQ IDN0:4;rsl21913281 使用擴(kuò)增引物 SEQ ID N0:1 和 SEQ ID NO:2;rsl21913279 使用擴(kuò)增引物 SEQ ID N0:7 和 SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4混合為一管擴(kuò)增引物工作液，工作液濃度為I μ M ;SEQ ID Ν0:5至SEQ ID NO:8混合為一管擴(kuò)增引物工作液，工作液濃度為I μ M ;
(3)、根據(jù)步驟(I)中的SNP位點設(shè)計延伸引物，遵循每條延伸引物的分子量相互間的差別要大于30Da，各延伸引物與各延伸產(chǎn)物之間的分子量差異不小于9Da，延伸引物與延伸產(chǎn)物的分子量要在4500-8500Da之間的原則。rsl21913273 使用延伸引物 SEQ ID NO: 11;rsl04886003 使用延伸引物 SEQ ID NO: 10;rsl21913281 使用延伸引物 SEQ ID NO:9;rsl21913279 使用延伸引物 SEQ ID NO: 12;(4)、使用擴(kuò)增引物對進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以獲得包含突變位點及其兩端序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；擴(kuò)增體系為
試劑終濃度加樣體積(μι)ilFLC 級純水__/__1.3
PCR反應(yīng)緩沖液
2mi MgCL-0.5
(含 20nM MgCLO25mM MgCl22mM().4---
25mM dNTP 混合液 500___CL I I uM引物混介液O. μ\1__0.5
5 /μ| PCR _ I1:/反應(yīng) ().2 5ng/ μ L DNA IOng/反說 2 總體積[μι]__/__B. ()()()反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.引物，包括擴(kuò)增引物和延伸引物，其特征在于所述的擴(kuò)增引物序列如下SEQ ID NO:15’ -ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’SEQ ID NO:25’ -ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’SEQ ID NO:35’ -ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’SEQ ID NO:45’ -ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’SEQ ID NO:55’ -ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’SEQ ID NO:65’ -ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’S EQ I D NO:75’ -ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’SEQ ID NO:85’ -ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’ ；所述的延伸引物序列如下SEQ ID NO:95’ -TCCAGCCACCATGAT-3’SEQ ID NO:105’ -CCTCTCTCTGAAATCACT-3’SEQ ID NO:115’ -CACGAGATCCTCTCTCT-3’SEQ ID NO:125’ -GAAACAAATGAATGATGCAC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于所述的引物是具有SEQID NO:1至SEQ ID NO: 12任一項所示序列的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述該引物質(zhì)譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法，其特征在于 包括如下步驟⑴、確定PIK3CA熱點突變在基因序列中的位置；⑵、根據(jù)突變位點及其兩端的序列設(shè)計用于擴(kuò)增反應(yīng)的引物對和用于延伸反應(yīng)的引物；⑶、使用擴(kuò)增引物對進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以獲得包含突變位點及其兩端序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；⑷、使用SAP酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物，去除殘留在反應(yīng)體系中多余的脫氧核苷酸；(5)、使用延伸引物進(jìn)行延伸反應(yīng)；(6)、然后使用樹脂純化延伸產(chǎn)物；⑴、將延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到芯片上；(8)、將芯片放置于質(zhì)譜儀中，運(yùn)行程序進(jìn)行檢測；⑶、讀取并分析檢測數(shù)據(jù)，確認(rèn)樣本PIK3CA基因目的位點的基因型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述該引物質(zhì)譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法，其特征在于所述步驟⑴熱點突變定位于PIK3CA基因的第542位、545位、1047位密碼子中的一種或幾種； 所述步驟⑵擴(kuò)增反應(yīng)所使用的擴(kuò)增引物包括SEQ IDNO:l至SEQ ID NO:8所示序列中的一對組合或多對組合；所述步驟⑵延伸引物包括SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:12所示序列中的一條或多條。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述該引物質(zhì)譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法，其特征在于所述第542位密碼子熱點突變發(fā)生在此密碼子的第一位堿基上，為錯義突變，擴(kuò)增引物為SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2，延伸引物為 SEQ ID NO:9。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述該引物質(zhì)譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法，其特征在于所述第545位密碼子熱點突變發(fā)生在此密碼子的第一位堿基上，為錯義突變，擴(kuò)增引物為SEQID N0:3 和 SEQ ID NO:4，延伸引物為 SEQ ID NO: 10。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述該引物質(zhì)譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法，其特征在于所述第1047位密碼子熱點突變發(fā)生在此密碼子的第一位堿基和第二位堿基上，均為錯義突變，擴(kuò)增引物分別為SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的組合以及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 的組合，延伸引物分別為SEQ ID ΝΟ:11和SEQ ID NO:12。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種引物及該引物質(zhì)譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法，包括如下步驟⑴定位PIK3CA基因的熱點突變位點；⑵根據(jù)這些突變位點兩端的DNA序列設(shè)計出用于擴(kuò)增反應(yīng)的引物和用于延伸反應(yīng)的引物；⑶擴(kuò)增反應(yīng)；⑷SAP酶(堿性磷酸酶)處理；⑸延伸反應(yīng)；⑹使用樹脂純化延伸反應(yīng)的產(chǎn)物；⑺將樹脂純化過的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到芯片上；⑻將芯片置于質(zhì)譜儀中，運(yùn)行檢測程序；⑼讀取并分析檢測數(shù)據(jù)，確定PIK3CA基因目的位點的基因型。相對于傳統(tǒng)的檢測方法，本發(fā)明具有靈敏度高，準(zhǔn)確率高，通量高，成本低的特點。
文檔編號C12N15/11GK103013993SQ20121057458
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者郝瑋, 陳然, 張聰, 李金歡, 李小青, 周蕊, 梁超, 韓韜, 黃士昂, 涂贊兵, 陳忠, 方國偉 申請人:武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司