含鼠lgG2b抗體Fc標簽的酵母表達載體及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含鼠lgG2b抗體Fc標簽的酵母表達載體，包括鼠lgG2b抗體Fc段基因與畢赤酵母表達載體pPICZαA，鼠lgG2b抗體Fc段基因連接在畢赤酵母表達載體pPICZαA的NotⅠ酶切位點和XbaⅠ酶切位點之間，其中，鼠lgG2b抗體Fc段基因的序列為SEQ?ID?NO.1。上述表達載體表達得到的帶有鼠Fc標簽的融合蛋白易于純化對小鼠無免疫原性或免疫原性很低、適用于小分子蛋白或多肽的表達等優(yōu)點。此外，本發(fā)明還提供一種含鼠lgG2b抗體Fc標簽的酵母表達載體的構(gòu)建方法。
【專利說明】含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]不管是制備單克隆抗體還是制備多克隆抗體，抗原的設(shè)計與制備都是非常重要的問題。設(shè)計或者制備得到不好的抗原有可能完全不能免疫出抗體來或者免疫出的抗體特異性和親和力很差。常用的抗原形式包括:純化的天然蛋白、純化的重組蛋白、人工合成的多肽、小分子物質(zhì)、組織或細胞成分。
[0003]天然蛋白結(jié)構(gòu)完整，因此是很好的抗原，但是天然蛋白很難達到較高的純度，而且對于含量很低的蛋白，很難分離到足夠的蛋白。而為了制備特異針對某一抗原表位(抗原決定簇)的抗體，可以人工表位肽用于免疫，但是多肽分子一般8~20個氨基酸，分子量太小，很難引起機體的免疫反應(yīng)，所以合成的多肽后需要與一個大的載體蛋白連接以增加其免疫原性。但是這種方法的成本較高且制備出的抗體親和力較低。小分子物質(zhì)，主要是小分子藥物，分子量一般不超過lOOODa，小分子藥物屬于半抗原，也需要連接載體才能夠進行免疫動物。有時候也可用從組織直接分離的細胞或體外培養(yǎng)的細胞進行免疫，完整的細胞具有更強的顆粒性和外源性，但是這種方法復(fù)雜，成本更高。
[0004]相對于上述幾種常用的抗原形式，重組蛋白以其來源容易、制備簡單、純度較高，成為研究的熱點。而且隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，重組蛋白的表達載體和純化方式變得豐富多樣。但是重組蛋白的表達載體通常需要帶一段標簽，如631\1^(3、1^?、？1&8等，用于后續(xù)表達的蛋白的鑒定和純化，但是在免疫中動物體通常會產(chǎn)生這些標簽的抗體，尤其對于大分子量的標簽，而且重組蛋白表達載體還普遍存在表達水平低的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]基于此，有必要提供一種表達水平較高的含鼠lgG2b抗體的Fe標簽的酵母表達載體。
[0006]一種含鼠lgG2b抗體Fe標簽的表達載體，包括鼠lgG2b抗體Fe段基因與畢赤酵母表達載體pPICZ α Α，所述鼠lgG2b抗體Fe段基因連接在所述畢赤酵母表達載體pPICZ a A的Not I酶切位點和Xba I酶切位點之間，其中，鼠lgG2b抗體Fe段基因的序列為SEQ IDN0.1。
[0007]由于畢赤酵母蛋白表達水平高，規(guī)模大小容易控制，成本低廉，操作簡單，且本身分泌的蛋白水平低，有利于下游產(chǎn)品的分離純化，因此可以作為外源基因的表達載體。而lgG2b是鼠體內(nèi)含量較高的抗體亞型。因此，上述含鼠lgG2b抗體的Fe標簽的表達載體具有較高的表達水平。
[0008] 且上述含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體能表達帶有鼠Fe標簽的融合蛋白，表達得到的帶有鼠Fe標簽的融合蛋白可直接用蛋白A或蛋白G進行純化，純化方法簡單且獲得的帶有鼠Fe標簽的融合蛋白純度高；而且?guī)в惺驠e標簽的融合蛋白可以直接免疫小鼠用于鼠單克隆抗體或多克隆抗體的制備，不用切除標簽序列，因為Fe片段來自小鼠，對小鼠無免疫原性或免疫原性很低，不會產(chǎn)生與Fe標簽的相應(yīng)的抗體；同時還可以用抗小鼠IgG抗體的二抗對帶有鼠Fe標簽的融合蛋白進行檢測，檢測過程簡單、結(jié)果可信度高。此外，帶有鼠Fe標簽的融合蛋白因Fe的二硫鍵作用形成二聚體，從而得到具有相對較大分子量的蛋白，提高了其穩(wěn)定性和免疫原性，因此上述含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體特別適用于小分子蛋白或多肽的表達，克服小分子蛋白或多肽因分子量小而存在免疫原性低的問題。
[0009]一種含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0010]提取小鼠脾臟的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈；
[0011]以所述cDNA第一條鏈為模板、序列為SEQ ID N0.2的DNA鏈作為上游引物及序列為SEQ ID N0.3的DNA鏈作為下游引物進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，其中，上游引物的序列中含有Not I酶切位點，下游引物的序列中含有終止密碼子與Xba I酶切位點；
[0012]分別用Not I酶與Xba I酶對畢赤酵母表達載體pPICZ a A與PCR產(chǎn)物進行雙酶切反應(yīng)，回收并純化得到含鼠lgG2b抗體Fe段基因的酶切產(chǎn)物及畢赤酵母表達載體pPICZ α A的酶切產(chǎn)物；
[0013]采用DNA連接酶對回收并純化的兩種酶切產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，用Zeocin的LB平板篩選，挑選單菌落后提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定后得到所述含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體，其中，鼠lgG2b抗體Fe段基因連接在所述畢赤酵母表達載體P PICZ a A的Not I酶切位點和Xba I酶切位點之間，鼠lgG2b抗體Fe段基因的序列為SEQ ID N0.1。
[0014]上述構(gòu)建方法首先從小鼠脾細胞中克隆鼠lgG2b抗體Fe段基因，然后將克隆得到的鼠lgG2b抗體Fe段基因插入畢赤酵母表達載體pPICZ a A的Not I酶切位點和Xba I酶切位點之間，得到含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體。該表達載體可表達帶有鼠Fe標簽的融合蛋白，此融合蛋白可直接免疫小鼠，不需要切除標簽序列。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為一實施方式的含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體的構(gòu)建方法的流程圖。
[0016]圖2為PCR擴增小鼠lgG2b Fe片段基因的電泳鑒定圖；
[0017]圖3為構(gòu)建的酵母表達載體pPICZ a A-mFc進行雙酶切的電泳鑒定圖。
【具體實施方式】
[0018]下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體及其構(gòu)建方法作進一步詳細的說明。
[0019]—實施方式的含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體,包括鼠lgG2b抗體Fe段基因與畢赤酵母表達載體PPICZ α Α,鼠lgG2b抗體Fe段基因連接在畢赤酵母表達載體pPICZ a A的Not I酶切位點和Xba I酶切位點之間，其中，鼠lgG2b抗體Fe段基因的序列為 SEQ ID N0.1。[0020]如圖1所示，本實施方式的含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0021]步驟SI 10，提取小鼠脾臟的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。
[0022]步驟S120，以cDNA第一條鏈為模板、序列為SEQ ID N0.2的DNA鏈作為上游引物及序列為SEQ ID N0.3的DNA鏈作為下游引物進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，其中，上游引物的序列中含有Not I酶切位點，下游引物的序列中含有終止密碼子與Xba I酶切位點。
[0023]步驟S130，分別用Not I酶與Xba I酶對畢赤酵母表達載體pPICZ a A與PCR產(chǎn)物進行雙酶切反應(yīng)，回收并純化得到含鼠lgG2b抗體Fe段基因的酶切產(chǎn)物及畢赤酵母表達載體pPICZ a A的酶切產(chǎn)物。
[0024]步驟S140，采用DNA連接酶(如T4DNA連接酶等)對回收并純化的兩種酶切產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，用Zeocin的LB平板篩選，挑選單菌落后提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定后得到含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體，其中，鼠lgG2b抗體Fe段基因連接在畢赤酵母表達載體pPICZ a A的Not I酶切位點和Xba I酶切位點之間，鼠lgG2b抗體Fe段基因的序列為SEQ ID N0.1。
[0025]構(gòu)建表達載體的目的之一是為了表達蛋白，在本實施方式中，還包括用甲醇誘導(dǎo)得到的含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體表達帶有鼠Fe (mouse Fe,簡稱mFc)標簽的融合蛋白的步驟，具體為:將得到的含鼠lgG2b抗體Fe標簽的表達載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，當然，也可以轉(zhuǎn)化畢赤酵母XS-33等表達宿主菌；然后用甲醇誘導(dǎo)表達帶有鼠Fe標簽的融合蛋白，并采用蛋白A 對得到的帶有鼠Fe標簽的融合蛋白進行純化，當然，也可以采用蛋白G來進行純化。
[0026]作為抗原的蛋白，其純度都是越高越好。上述得到的帶有鼠Fe標簽的融合蛋白采用蛋白A來進行純化后，具有高的純度，實際應(yīng)用價值大。
[0027]由于畢赤酵母蛋白表達水平高，規(guī)模大小容易控制，成本低廉，操作簡單，且本身分泌的蛋白水平低，有利于下游產(chǎn)品的分離純化，因此可以作為外源基因的表達載體。因此，上述含鼠lgG2b抗體的Fe標簽的酵母表達載體具有較高的表達水平，且表達的蛋白具有易于純化的優(yōu)點。
[0028]且上述含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體能表達帶有鼠Fe標簽的融合蛋白，表達得到的帶有鼠Fe標簽的融合蛋白可直接用蛋白A或蛋白G進行純化，純化方法簡單且獲得的帶有鼠Fe標簽的融合蛋白純度高；而且?guī)в惺驠e標簽的融合蛋白可以直接免疫小鼠用于鼠單克隆抗體或多克隆抗體的制備，不用切除標簽序列，因為Fe片段來自小鼠，對小鼠無免疫原性或免疫原性很低，不會產(chǎn)生與Fe標簽的相應(yīng)的抗體；同時還可以用抗小鼠IgG抗體的二抗對帶有鼠Fe標簽的融合蛋白進行檢測，檢測過程簡單、結(jié)果可信度高。此外，帶有鼠Fe標簽的融合蛋白因Fe的二硫鍵作用形成二聚體，從而得到具有相對較大分子量的蛋白，提高了其穩(wěn)定性和免疫原性，因此上述含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體特別適用于小分子蛋白或多肽的表達，克服小分子蛋白或多肽因分子量小而存在免疫原性低的問題。
[0029]且上述構(gòu)建方法首先從小鼠脾細胞中克隆鼠lgG2b抗體Fe段基因，然后將克隆得到的鼠lgG2b抗體Fe段基因插入畢赤酵母表達載體pPICZ a A的Not I酶切位點和Xba I酶切位點之間，得到含鼠lgG2b抗體Fe標簽的表達載體。該表達載體可表達帶有鼠Fe標簽的融合蛋白，此融合蛋白可直接免疫小鼠，不需要切除標簽序列。
[0030]以下為具體實施例部分
[0031](1)提取小鼠脾臟的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈
[0032]小鼠放血后，取新鮮的脾臟，切取50_100mg的組織置于培養(yǎng)皿中的濾網(wǎng)(100目)上，加入ImL的Trizol (—種總RNA抽提試劑)，用注射器的活塞擠壓組織，去除大的組織團塊后，用帶槍頭的移液槍吹打細胞數(shù)次使細胞裂解，將混合液轉(zhuǎn)入一支潔凈的無RNA酶的離心管中。室溫靜置5分鐘使核蛋白復(fù)合物完全裂解。
[0033]向離心管中加入0.2mL氯仿，蓋好離心管蓋；劇烈渦旋振蕩15秒后，室溫靜置2~3分鐘；然后于4°C，12000Xg的條件下離心15分鐘；將離心管傾斜45°，將上層水相溶液轉(zhuǎn)移到另一小離心管中，并加入與上層水相等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，然后于4°C，12000Xg的條件下離心10分鐘；棄上清液后，向離心管中加入ImL乙醇，并短暫渦旋，乙醇的質(zhì)量分數(shù)為80% ;然后于4°C，7500Xg的條件離心5分鐘，棄洗出液；在潔凈環(huán)境中放置5~IO分鐘使RNA沉淀干燥，然后用適量的DEPC水(一種經(jīng)DEPC(diethylpyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的水)溶解RNA沉淀，并于55~60°C下放置10-15分鐘。
[0034]嚴格按invitrogen的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(cat.nos.28025-032)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。
[0035](2) PCR擴增小鼠IgG2b抗體的Fe段基因
[0036]根據(jù)GenBank:V00763.1序列設(shè)計鼠Fe段基因的引物
[0037]h游引物:5’-ATTTGCGGCCGCGAGCCCAGCGGGCCCATTTC-3，(序列表中 SEQ ID N0.2,GCGGCCGCG為Not I酶切位點)
[0038]下游引物:5’-CCGTCTAGATTATCATTTACCCGGAGACCGGGAG-3> (序列表中 SEQ IDN0.3，TCTAGA為Not I酶切位點，TTATCA為終止密碼子)
[0039]以上述cDNA第一條鏈為模板，以及兩條引物進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物。如圖2所示，PCR擴增小鼠lgG2b Fe片段基因，在700bp左右具有明顯條帶，與目的片段大小(717bp)—致，表明成功擴增出了小鼠lgG2b Fe片段基因。
[0040]分別用Not I酶與Xba I酶對畢赤酵母表達載體pPICZ a A與PCR產(chǎn)物進行雙酶切反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的產(chǎn)物；然后采用T4DNA連接酶對回收并純化的酶切產(chǎn)物進行連接，得到含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體。
[0041]將得到的含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，經(jīng)Not I和Xba I酶切鑒定和測序驗證后確認獲得了正確的含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體。如圖3所示，構(gòu)建的酵母表達載體pPICZ a A-mFc進行雙酶切(Not I和Xba I )鑒定，在4000bp和700bp左右具有明顯條帶與pPICZ a A和mFc的大小一致，表明mFc成功構(gòu)建到pPICZ a A載體上。
[0042]將得到的含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，并用甲醇誘導(dǎo)表達帶有鼠Fe標簽的融合蛋白。采用蛋白A純化帶有鼠Fe標簽的融合蛋白。
[0043]以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本 發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。
【權(quán)利要求】
1.一種含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體,其特征在于,包括鼠lgG2b抗體Fe段基因與畢赤酵母表達載體pPICZ a A，所述鼠lgG2b抗體Fe段基因連接在所述畢赤酵母表達載體pPICZ a A的Not I酶切位點和Xba I酶切位點之間，其中，鼠lgG2b抗體Fe段基因的序列為 SEQ ID N0.1。
2.一種含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: 提取小鼠脾臟的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈； 以所述cDNA第一條鏈為模板、序列為SEQ ID N0.2的DNA鏈作為上游引物及序列為SEQ ID N0.3的DNA鏈作為下游引物進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，其中，上游引物的序列中含有Not I酶切位點，下游引物的序列中含有終止密碼子與Xba I酶切位點； 分別用Not I酶與Xba I酶對畢赤酵母表達載體pPICZ a A與PCR產(chǎn)物進行雙酶切反應(yīng)，回收并純化得到含鼠lgG2b抗體Fe段基因的酶切產(chǎn)物及畢赤酵母表達載體pPICZ a A的酶切產(chǎn)物； 采用DNA連接酶對回收并純化的兩種酶切產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，用Zeocin的LB平 板篩選，挑選單菌落后提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定后得到所述含鼠lgG2b抗體Fe標簽的酵母表達載體，其中，鼠lgG2b抗體Fe段基因連接在所述畢赤酵母表達載體pPICZ a A的Not I酶切位點和Xba I酶切位點之間，鼠lgG2b抗體Fe段基因的序列為SEQ ID N0.1。
【文檔編號】C12N15/13GK103898152SQ201210575163
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月26日
【發(fā)明者】萬曉春, 王彩霞 申請人:深圳先進技術(shù)研究院