專利名稱：共表達(dá)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶制備門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)生產(chǎn)門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的技術(shù)領(lǐng)域，涉及通過(guò)基因工程共表達(dá)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶，繼而微生物酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的方法。
背景技術(shù)：
門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸，化學(xué)名稱為(S)-2，5-二氨基戊酸-(S)-2-氨基丁二酸鹽，是L-天門(mén)冬氨酸與L-鳥(niǎo)氨酸經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)而形成的鹽，分子式為C9H19N306。門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸在體內(nèi)形成門(mén)冬氨酸和鳥(niǎo)氨酸，直接參與尿素循環(huán)。鳥(niǎo)氨酸是尿素循環(huán)中的起始底物，是鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和氨基甲酰磷酸合成酶的活化劑，與血液循環(huán)中氨等有毒代謝物結(jié)合，促進(jìn)尿素合成，加速體內(nèi)有毒物質(zhì)特別是氨的代謝；天門(mén)冬氨酸則參與干細(xì)胞中谷氨酰胺和核酸的合成，既可促進(jìn)肝臟內(nèi)谷氨酰胺的合成，又間接參與三磷酸循環(huán)和核酸的合成，并提供能量代謝的中間產(chǎn)物，促進(jìn)肝細(xì)胞自身的修護(hù)和再生，回復(fù)肝臟功能，增強(qiáng)肝臟解毒功能，從而能迅速降低體內(nèi)異常升高的血氨濃度。門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸有顆粒劑和注射劑兩種劑型，最先于20世紀(jì)70年代在德國(guó)用于臨床，1991年收載德國(guó)藥典，并被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療肝性腦病。目前門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的制備方法主要可以歸納為兩大類第一類，是以L-精氨酸為初始原料，采用化學(xué)或生物催化方法制備L-鳥(niǎo)氨酸中間體，繼而加入L-天門(mén)冬氨酸，制備門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸。德國(guó)專利(DE4020980)采用精氨酸酶催化精氨酸生成鳥(niǎo)氨酸，再與L-天門(mén)冬氨酸反應(yīng)而得。但其所采用的精氨酸酶價(jià)格昂貴，工藝成本高，不具備工業(yè)化價(jià)值。中國(guó)專利(CN101843587A)以精氨酸為原料，加入氫氧化鋇使精氨酸水解為鳥(niǎo)氨酸，再加入天門(mén)冬氨酸，攪拌反應(yīng)后，加入鋇離子沉淀劑以去除鋇離子，再用有機(jī)溶劑進(jìn)行重結(jié)晶。該方法引入鋇離子和有機(jī)溶劑，污染環(huán)境且成本較高。第二類，是以L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽或硫酸鹽為初始原料，采用樹(shù)脂柱或化學(xué)方法獲得游離L-鳥(niǎo)氨酸，繼而與L-天門(mén)冬氨酸成鹽。英國(guó)專利(GB965637)方法一是將L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽溶解于水，通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂獲得游離L-鳥(niǎo)氨酸，再與L-天門(mén)冬氨酸在水溶液中，通過(guò)加入甲醇析出結(jié)晶，但此方法采用了離子交換樹(shù)脂，操作復(fù)雜；方法二是梯度結(jié)晶，采用消旋的游離DL-鳥(niǎo)氨酸與L-天門(mén)冬氨酸先在水溶液中溶解，再加入甲醇析出D-鳥(niǎo)氨酸門(mén)冬氨酸鹽，過(guò)濾后的母液繼續(xù)加入甲醇，析出L-門(mén)冬氨酸-L-鳥(niǎo)氨酸鹽，此方法梯度結(jié)晶不容易控制，得到的產(chǎn)品純度較差，且成鹽拆分收率低。英國(guó)專利(GB1067742)采用強(qiáng)酸性離子交換樹(shù)脂來(lái)使L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽游離，再與L-天門(mén)冬氨酸成鹽，經(jīng)過(guò)結(jié)晶處理，最后得收率52%的L-鳥(niǎo)氨酸-L-天門(mén)冬氨酸鹽一水合物。該方法采用樹(shù)脂脫鹽，且收率較低，不環(huán)保。歐洲專利(EP477991)將L-鳥(niǎo) 氨酸鹽酸鹽水溶液通過(guò)Diaion SKIB樹(shù)脂吸附，氨水解吸附，脫氨后與L-天門(mén)冬氨酸成鹽，加入甲醇回流處理，獲得結(jié)晶，該方法同樣具有污染環(huán)境、成本高等缺點(diǎn)。中國(guó)專利(CNlO 1798275A)將L-鳥(niǎo)氨酸醋酸鹽溶解于水后，加入L-天門(mén)冬氨酸，然后用氨調(diào)PH至6-9，活性炭脫色，極性有機(jī)溶劑重結(jié)晶，該方法引入了大量的有機(jī)溶劑，成本較高。中國(guó)專利(CN101100435A)將L-鳥(niǎo)氨酸硫酸鹽溶解于水中，加入L-天門(mén)冬氨酸，加熱溶解后，用過(guò)量氫氧化鋇中和硫酸，過(guò)濾，用樹(shù)脂螯合殘余的鋇離子，過(guò)濾除去樹(shù)脂，減壓濃縮溶液，活性炭脫色，無(wú)水乙醇結(jié)晶制得，該方法引入了劇毒的鋇離子，且需采用樹(shù)脂去除金屬離子，操作工藝復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。中國(guó)專利(CN102475697A)以L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽為原料，加入氫氧化鈉，然后加入天門(mén)冬氨酸反應(yīng)后，采用納濾技術(shù)一步實(shí)現(xiàn)脫鹽、濃縮，濃縮液加入極性有機(jī)溶劑進(jìn)行重結(jié)晶。酶法生產(chǎn)鳥(niǎo)氨酸是利用動(dòng)植物或微生物體內(nèi)的精氨酸酶作催化劑，水解精氨酸，生成鳥(niǎo)氨酸和尿素，反應(yīng)式見(jiàn)圖1。不過(guò)，精氨酸酶的來(lái)源不易。傳統(tǒng)的酶法采用的精氨酸酶一般提取自動(dòng)物的肝臟，或者來(lái)自某些微生物菌株體內(nèi)，直接以微生物細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化體系來(lái)生產(chǎn)鳥(niǎo)氨酸。這些菌株的生長(zhǎng)周期一般不少于24h，且由于其自身表達(dá)酶活水平有限，在轉(zhuǎn)化體系中添加一定量的酶源細(xì)胞后，勢(shì)必轉(zhuǎn)化后的分離提取工藝相對(duì)繁瑣。生物酶法是目前工業(yè)上合成L-天門(mén)冬氨酸的主要方法。其原理見(jiàn)圖2，是利用天門(mén)冬氨酸酶催化延胡索酸和氨加成反應(yīng)生成L-天門(mén)冬氨酸。該方法具有收率高、光學(xué)純度 高的優(yōu)點(diǎn)。生物酶法又可分為固定化細(xì)胞法(也稱固定化酶法)和游離細(xì)胞法(游離酶法)。與固定化細(xì)胞法生產(chǎn)L-天門(mén)冬氨酸相比，游離細(xì)胞法工藝流程簡(jiǎn)潔、設(shè)備投資少、生產(chǎn)成本低，具有較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。綜上，現(xiàn)有的天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的制備方法存在以下不足化學(xué)合成方法，都經(jīng)過(guò)了一個(gè)鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽、醋酸鹽或硫酸鹽的中間體，增加了反應(yīng)的操作過(guò)程，降低了收率。且由于引入的C1_、CH3C00_或S042_等離子雜質(zhì)，給產(chǎn)物的分離純化帶來(lái)麻煩，增加了成本。而以L-精氨酸為初始原料的方法中，酶法所采用的精氨酸酶價(jià)格昂貴，工藝成本高，不具備工業(yè)化價(jià)值?；瘜W(xué)法引入鋇離子和有機(jī)溶劑，污染環(huán)境且成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種新的天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸制備方法，該方法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、綠色環(huán)保。本發(fā)明提供的共表達(dá)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶制備門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的方法包括首先PCR擴(kuò)增來(lái)源于枯草芽孢桿菌的天門(mén)冬氨酸酶基因，采用基因工程方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-20b (+) -asp ;然后以pET-20b (+) -asp為模板，PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物為5 ’端帶有T7啟動(dòng)子和rbs序列的天門(mén)冬氨酸酶基因，采用基因工程方法，將該基因克隆到pET-24a(+) -arg中，獲得重組質(zhì)粒pET_24a(+)-arg-asp ;將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E. coliBL21 (DE3)，獲得共表達(dá)基因工程菌株BL21 (DE3)-pET24a (+)-arg-asp。以該重組菌為酶源，在同一個(gè)反應(yīng)體系中，分別催化底物L(fēng)-精氨酸和延胡索酸銨，其中底物L(fēng)-精氨酸的用量為O.1至lmol/L，延胡索酸銨的用量為O.1至lmol/L，菌體的添加量為4_6g/L，在30至45°C下，pH8至10,以lmmol/L無(wú)水硫酸鎂為輔助因子,經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化反應(yīng)4至12h,生成L-鳥(niǎo)氨酸和L-天門(mén)冬氨酸；收集轉(zhuǎn)化液后，通過(guò)I萬(wàn)截留分子量中空纖維素柱去除大分子量雜質(zhì)及活性炭脫色，最后減壓濃縮，加入3倍體積無(wú)水乙醇，冰水浴攪拌冷卻析出，收集沉淀得天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸。酶促反應(yīng)液中，底物L(fēng)-精氨酸的用量?jī)?yōu)選為lmol/L，底物延胡索酸銨的用量?jī)?yōu)選為lmol/L，菌體細(xì)胞的添加量?jī)?yōu)選為5g/L，優(yōu)選轉(zhuǎn)化溫度為37°C，優(yōu)選轉(zhuǎn)化pH9，優(yōu)選轉(zhuǎn)化時(shí)間12h。所述的共表達(dá)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶的基因工程重組菌為大腸桿菌BL21 (DE3) -pET24a (+) -arg-asp,表達(dá)載體為 pET24a (+) -arg-asp 重組表達(dá)載體,重組菌體細(xì)胞能同時(shí)表達(dá)有高活性的精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶。其中，菌體細(xì)胞的精氨酸酶活力可達(dá)560U/g，天門(mén)冬氨酸酶活力可達(dá)490U/g。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明利用自行構(gòu)建的高效共表達(dá)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶的大腸桿菌基因工程菌株BL21 (DE3) -pET24a (+) -arg-asp的發(fā)酵菌體為酶源，在同一個(gè)反應(yīng)體系中，雙酶分別催化底物L(fēng)-精氨酸和延胡索酸銨，生成L-鳥(niǎo)氨酸和天門(mén)冬氨酸。產(chǎn)物經(jīng)過(guò)中空纖維素柱過(guò)濾和活性炭脫色、減壓濃縮，最后加入無(wú)水乙醇結(jié)晶析出天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸。該方法具 有生產(chǎn)成本低、條件溫和、周期短、產(chǎn)物分離提取方便、工藝步驟簡(jiǎn)單、操作安全等優(yōu)點(diǎn)，為天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸提供了新的綠色環(huán)保制備方法，具有很好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。


圖1是精氨酸酶催化L-精氨酸生成L-鳥(niǎo)氨酸的反應(yīng)示意圖；圖2是天門(mén)冬氨酸酶催化延胡索酸銨生成L-天門(mén)冬氨酸的反應(yīng)示意圖；圖3是以本發(fā)明構(gòu)建的基因重組菌菌體為酶源考察底物L(fēng)-精氨酸和延胡索酸銨的轉(zhuǎn)化率；A :反應(yīng)溫度與底物轉(zhuǎn)化率的關(guān)系；B :pH與底物轉(zhuǎn)化率的關(guān)系；C :反應(yīng)時(shí)間與底物轉(zhuǎn)化率的關(guān)系；D :菌體添加量與底物轉(zhuǎn)化率的關(guān)系；E :底物濃度與轉(zhuǎn)化率的關(guān)系。圖4是天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的薄層層析圖譜。其中，第I道L_鳥(niǎo)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品；第2道=L-天門(mén)冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品；第3道天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品；第4道樣品。
具體實(shí)施例方式一、L-精氨酸酶活力的測(cè)定采用化學(xué)顯色法測(cè)定L-精氨酸酶活力，原理是在一定條件下，L-精氨酸酶催化L-精氨酸，生成L-鳥(niǎo)氨酸，利用鳥(niǎo)氨酸能與茚三酮反應(yīng)生成一種紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm處有最高吸收峰。在一定范圍內(nèi)，紅色的深淺與L-鳥(niǎo)氨酸含量成正比，與同樣處理的L-鳥(niǎo)氨酸標(biāo)準(zhǔn)液比色，求得酶活力。具體操作過(guò)程如下( I)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用50mL混酸溶液(6M磷酸醋酸=1 :3)溶解1. 25g茚三酮配制O. 25g/L的顯色溶液，分別配制0、0. 04,0. 08,0. 12,0. 16,0. 2mM的L-鳥(niǎo)氨酸500 μ L，加入2mL茚三酮顯色溶液，沸水浴Ih后510nm測(cè)定吸光度，以L-鳥(niǎo)氨酸濃度為橫坐標(biāo)，510nm吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)精氨酸酶活力的測(cè)定催化體系25mMGlycine-NaOH pH9. 5, ImM MnCl2,0_20mM 的 L-精氨酸,一系列梯度濃度的實(shí)施例2得到的濕菌體，37°C催化反應(yīng)lh。
酶活力定義在上述反應(yīng)條件下，于37°C，lmin催化形成Ιμπιο L-鳥(niǎo)氨酸所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。二、L-天門(mén)冬氨酸酶活力的測(cè)定于20mM PBS pH8. 5，ImM MgCl2, 20mM的延胡索酸銨，加入一系列梯度濃度的實(shí)施例2得到的濕菌體，37°C催化反應(yīng)30min。然后立即置于沸水中煮沸5min以終止反應(yīng)?？瞻讟悠凡捎妙A(yù)先煮沸過(guò)的大腸桿菌細(xì)胞代替酶源細(xì)胞進(jìn)行同樣操作。離心，取0.2mL上清液，加入20mL蒸餾水，5mL濃硫酸，混勻后加熱至沸騰，然后用O.1M的KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至30s不褪色為終點(diǎn)?？瞻缀蜆悠返味ㄖ抵顬檠雍魉岬南牧俊８鶕?jù)不同濃度延胡索酸標(biāo)準(zhǔn)液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出延胡索酸的轉(zhuǎn)化量。酶活力定義在上述反應(yīng)條件下，于37°C，Imin催化消耗I μ mo I延胡索酸所需要 的酶量為一個(gè)酶活力單位。三、天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的薄層層析法檢測(cè)薄層層析條件分別為，展開(kāi)劑是正丙醇氨水=2 :1，顯色液是4g/L的茚三酮乙醇溶液，顯色溫度105°C，顯色時(shí)間5min。實(shí)施例1共表達(dá)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的大鼠的精氨酸酶基因序列，設(shè)計(jì)上游引物argl 5’-GGAATTCCATAT GAG CTC CAAGCC AMGCC-3’和下游引物arg2 :5’_CCC GAATTC TTATTTCGGTGG TTT A-3’。提取大鼠肝臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以大鼠肝臟cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到精氨酸酶基因。采用基因工程方法，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-24a(+)-arg。將重組表達(dá)載體pET-24a(+)-arg轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 (DE3)，獲得基因工程菌株Argl。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的枯草芽孢桿菌的天門(mén)冬氨酸酶基因序列，設(shè)計(jì)上游引物 aspl :5’ -GGG AAT TCC ATA TGT TAA ACG GCC AAA AAG-3’ 和下游引物 asp2 :5’ -CCGCTCGAG TTA TTT TTC TAA TAG TTC-3，。提取枯草芽孢桿菌的基因組，PCR擴(kuò)增得到天門(mén)冬氨酸酶基因。采用基因工程方法，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-20b(+)-asp。將重組表達(dá)載體pET-20b (+) -asp 轉(zhuǎn)化至 Ε· coIi BL21 (DE3)，獲得基因工程菌株 Aspl。為了同時(shí)實(shí)現(xiàn)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶在重組大腸桿菌中的高水平表達(dá)，首先以 pET-20b(+)-asp 為模板，設(shè)計(jì)上游引物為 T7f :5’ -AAG GAAGAG CTC TAATAC GACTCACTATAG-3’ 和下游引物 asp2 :5’ -CCG CTC GAG TTATTT TTC TAATAG TTC-3’。PCR 擴(kuò)增獲得產(chǎn)物為5’端帶有T7啟動(dòng)子和rbs序列的天門(mén)冬氨酸酶基因。然后采用基因工程方法，將該基因克隆到pET-24a (+) -arg中，獲得重組質(zhì)粒pET_24a (+) -arg-asp。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至 E. co I i BL21 (DE3)，獲得共表達(dá)基因工程菌株 BL21 (DE3) -pET24a (+) -arg-asp。將陽(yáng)性重組菌株接種于4mL含有卡那霉素100 μ g/mL的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，隨后以1%轉(zhuǎn)接量接入IOOmL含有卡那霉素100 μ g/mL的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)3h，然后，加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)液，特異性誘導(dǎo)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶的表達(dá)。所得培養(yǎng)液于4°C下6，OOOrpm離心lOmin，收集菌體，獲得共表達(dá)L-精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶的基因工程重組菌，用50mM的磷酸緩沖液(pH8. O)懸浮洗滌后再離心，收集菌體作為酶源細(xì)胞。實(shí)施例2共表達(dá)基因工程重組菌的發(fā)酵將實(shí)施例1中的共表達(dá)基因工程菌株BL21 (DE3)_pET24a(+)-arg-asp接種于4mL含100 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)作為一級(jí)種子液；隨后以1%轉(zhuǎn)接量接入IOOmL含100μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C，200rpm培養(yǎng)8-12h作為二級(jí)種子液；二級(jí)種子液以1%接種量轉(zhuǎn)接于100L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基為新鮮的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37°C，初始轉(zhuǎn)速300rpm，初始pH7. 2。定時(shí)取樣，菌液0D600nm達(dá)到1. 0-1. 2時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)液誘導(dǎo)。下罐發(fā)酵液4°C下3，OOOrpm離心15min收集菌體細(xì)胞，得到共表達(dá)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶的基因工程重組菌的發(fā)酵菌體細(xì)胞。按方法一測(cè)定，精氨酸酶活力可達(dá)560U/g ;按方法二測(cè)定,天門(mén)冬氨酸酶活力可達(dá)490U/g。實(shí)施例3共催化體系中溫度的考察以上述實(shí)施例2制備的發(fā)酵菌體細(xì)胞作為酶原，分別在每升的轉(zhuǎn)化體系中，加入菌體5g/L,底物L(fēng)-精氨酸100mmol/L,延胡索酸銨100mmol/L,無(wú)水硫酸鎂lmmol/L,轉(zhuǎn)化pH值9，轉(zhuǎn)化時(shí)間lh。考察轉(zhuǎn)化溫度30-45°C時(shí)兩個(gè)催化反應(yīng)各自底物L(fēng)-精氨酸和延胡索酸的轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3A。實(shí)施例4共催化體系中pH的考察 以上述實(shí)施例2制備的發(fā)酵菌體細(xì)胞作為酶原，分別在每升的轉(zhuǎn)化體系中，加入菌體5g/L，底物L(fēng)-精氨酸lOOmmol/L，延胡索酸銨lOOmmol/L，無(wú)水硫酸鎂ImM，轉(zhuǎn)化溫度為37°C，轉(zhuǎn)化時(shí)間lh。考察轉(zhuǎn)化pH值8-10時(shí)兩個(gè)催化反應(yīng)各自底物L(fēng)-精氨酸和延胡索酸的轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3B。實(shí)施例5共催化體系中反應(yīng)時(shí)間的考察以上述實(shí)施例2制備的發(fā)酵菌體細(xì)胞作為酶原，分別在每升的轉(zhuǎn)化體系中，加入菌體5g/L，底物L(fēng)-精氨酸lmol/L，延胡索酸銨lmol/L，無(wú)水硫酸鎂lmmol/L，轉(zhuǎn)化溫度為37°C，轉(zhuǎn)化pH值為9?？疾燹D(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)兩個(gè)催化反應(yīng)各自底物L(fēng)-精氨酸和延胡索酸的轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3C。實(shí)施例6共催化體系中菌體量的考察以上述實(shí)施例2制備的發(fā)酵菌體細(xì)胞作為酶原，分別在每升的轉(zhuǎn)化體系中，加入底物L(fēng)-精氨酸lmol/L，延胡索酸銨lmol/L，無(wú)水硫酸鎂lmmol/L，轉(zhuǎn)化溫度為37°C，轉(zhuǎn)化pH值為9，轉(zhuǎn)化時(shí)間12h?？疾炀w添加量對(duì)兩個(gè)催化反應(yīng)各自底物L(fēng)-精氨酸和延胡索酸的轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3D。從結(jié)果可見(jiàn)，以ImM無(wú)水硫酸鎂為輔助因子，在30-45°C，pH值為8_10，菌體量為4_6g/L，反應(yīng)4-12h，共表達(dá)系統(tǒng)的精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶可以分別催化各自底物，生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸和L-天門(mén)冬氨酸。同時(shí)，通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合考慮實(shí)際操作以及成本，優(yōu)選的轉(zhuǎn)化條件為L(zhǎng)-精氨酸1M，延胡索酸銨1M，無(wú)水硫酸鎂ImM，菌體量5g/L，反應(yīng)溫度37°C，pH值9，反應(yīng)時(shí)間12h。在該優(yōu)選條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，L-精氨酸和延胡索酸的轉(zhuǎn)化率分別為99% 和 98. 5%ο實(shí)施例7天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸鹽的提取分離轉(zhuǎn)化液反應(yīng)結(jié)束后，于4000rpm離心15min收集上清液；然后采用I萬(wàn)截留分子量的中空纖維素柱去除大分子量雜質(zhì)；收集液按照0. 5% (質(zhì)量體積比)加入活性炭，于60°C脫色30min ;過(guò)濾去除活性炭后，在75°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至飽和溶液，然后加入3倍體積的無(wú)水乙醇，冰水浴中攪拌；采用真空泵抽濾樣品，將析出物真空干燥，得到天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸 ’最后，稱重，采用薄層層析法檢測(cè)產(chǎn)品，結(jié)果見(jiàn)附圖4。
權(quán)利要求
1.一種共表達(dá)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶制備門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的方法，其特征在于該方法包括 首先PCR擴(kuò)增來(lái)源于枯草芽孢桿菌的天門(mén)冬氨酸酶基因，采用基因工程方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-20b (+) -asp ;然后以pET-20b (+) -asp為模板，PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物為5 ’端帶有T7啟動(dòng)子和rbs序列的天門(mén)冬氨酸酶基因，采用基因工程方法，將該基因克隆到pET-24a (+) -arg中，獲得重組質(zhì)粒pET_24a (+)-arg-asp ;將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E. coliBL21 (DE3)，獲得共表達(dá)基因工程菌株BL21 (DE3)-pET24a(+) -arg-asp,該重組菌體細(xì)胞能同時(shí)表達(dá)有高活性的精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶； 以該重組菌為酶源，在同一個(gè)反應(yīng)體系中，分別催化底物L(fēng)-精氨酸和延胡索酸銨，其中底物L(fēng)-精氨酸的用量為O.1至lmol/L，延胡索酸銨的用量為O.1至lmol/L，菌體的添加量為4-6g/L，在30至45°C下，pH8至10，以lmmol/L無(wú)水硫酸鎂為輔助因子，經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化反應(yīng)4至12h，生成L-鳥(niǎo)氨酸和L-天門(mén)冬氨酸，收集轉(zhuǎn)化液后，通過(guò)I萬(wàn)截留分子量中空纖維素柱去除大分子量雜質(zhì)及活性炭脫色，最后減壓濃縮，加入3倍體積無(wú)水乙醇，冰水浴攪拌冷卻析出，收集沉淀得天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于酶促反應(yīng)液中，底物L(fēng)-精氨酸的用量?jī)?yōu)選為lmol/L，底物延胡索酸銨的用量?jī)?yōu)選為lmol/L，菌體細(xì)胞的添加量?jī)?yōu)選為5g/L，優(yōu)選轉(zhuǎn)化溫度為37°C，優(yōu)選轉(zhuǎn)化pH9，優(yōu)選轉(zhuǎn)化時(shí)間12h。
全文摘要
一種共表達(dá)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶制備門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的方法。本發(fā)明采用基因工程方法，構(gòu)建能高效共表達(dá)精氨酸酶和天門(mén)冬氨酸酶的重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET24a(+)-arg-asp，以發(fā)酵菌體細(xì)胞為酶源，在同一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)，雙酶分別催化底物L(fēng)-精氨酸、延胡索酸銨反應(yīng)，生成L-鳥(niǎo)氨酸和L-天門(mén)冬氨酸，轉(zhuǎn)化液收集后通過(guò)1萬(wàn)截留分子量中空纖維素柱去除大分子量雜質(zhì)及活性炭脫色、減壓濃縮，加入無(wú)水乙醇，冰水浴攪拌冷卻析出得天門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸。本發(fā)明提供了一種新的門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸的綠色生產(chǎn)工藝方法，該方法具有條件溫和、周期短、酶促體系中雜質(zhì)少、產(chǎn)物分離提取方便、工藝步驟簡(jiǎn)單、操作安全等優(yōu)點(diǎn)，有很好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103014087SQ201210575299
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者高智慧, 丁國(guó)鈺 申請(qǐng)人:天津啟仁醫(yī)藥科技有限公司