專利名稱：一種通用的植物表達(dá)載體構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建通用植物表達(dá)載體的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在植物基因工程研究中，構(gòu)建植物表達(dá)載體是很重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。載體是攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的媒介，沒有載體，目的基因無法進(jìn)入受體，即使進(jìn)入受體細(xì)胞也無法表達(dá)。細(xì)菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體連接啟動基因及多聚核糖體的基因序列就組成了表達(dá)型載體。表達(dá)載體的構(gòu)建是一項(xiàng)非常重要但又比較繁瑣的工作，因此，研究表達(dá)載體的構(gòu)建方法便具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，適合于不同研究目的各種載體系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，其中在轉(zhuǎn)基因植物中最常用的是質(zhì)粒載體。在為某種特定的植物構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，為了使外源基因高效、安全表達(dá)，或由于特定的要求，需要構(gòu)建新載體或改造已有載體，而選擇一種 合適的載體構(gòu)建方法，從而達(dá)到方便、快捷的目的就顯得十分重要。傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法，主要是在體外經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒載體DNA，然后在DNA連接酶的作用下同目的基因結(jié)合成環(huán)，最終得到轉(zhuǎn)化載體。在此過程中，一般的步驟是，先在具有多克隆位點(diǎn)的初步載體上尋找合適的酶切位點(diǎn)，得到入門載體。為了與合適的啟動子、選擇性標(biāo)記基因等序列元件連接，中間還需要轉(zhuǎn)換多個(gè)載體和一系列的酶切、連接、轉(zhuǎn)化、回收等工作，因此，傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法在構(gòu)建多片段拼接的復(fù)雜載體時(shí)，其路線設(shè)計(jì)和實(shí)際操作往往比較麻煩，通常需要構(gòu)建多個(gè)中間載體，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。但是，在沒有更便捷的方法之前或者構(gòu)建的載體比較簡單時(shí)，采用傳統(tǒng)的構(gòu)建方法還是一種比較安全、穩(wěn)妥的選擇，而且能夠獲得預(yù)期的結(jié)果。Gateway技術(shù)是Invitrogen公司開發(fā)的一項(xiàng)基因克隆和表達(dá)的新技術(shù),它利用位點(diǎn)特異重組構(gòu)建入門載體(entry clone)后，不再需要使用限制性內(nèi)切酶和連接酶，而且一旦擁有了一個(gè)入門載體，就可以利用它將目的基因多次轉(zhuǎn)移到各種不同的表達(dá)載體(目的載體,destinationvector)上。此外，由于在重組時(shí)DNA片段的閱讀框和方向保持不變，因而不會影響不同基因的測序結(jié)果，因而每當(dāng)使用一種新的表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，可以節(jié)省大量時(shí)間。Gateway技術(shù)是一種通用性的克隆方法，利用該技術(shù)可以快速、高效地將目的基因同時(shí)構(gòu)建到多種與Gateway技術(shù)兼容的載體系統(tǒng)中，用于基因的蛋白質(zhì)表達(dá)和功能分析。Gateway的優(yōu)勢有以下幾個(gè)方面(1)簡單快速的反應(yīng)在室溫60min后即可轉(zhuǎn)化E. coli ； (2)克隆效率高> 90%甚至>99%的克隆是目標(biāo)克??；(3)快速直接克隆PCR產(chǎn)品；(4)特異性反應(yīng)保持閱讀框架和基因的位置不變。目前，Gateway技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在許多領(lǐng)域中，如構(gòu)建RNAi載體時(shí)優(yōu)先考慮使用此技術(shù)。含三段T-DNA載體是獲得無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株關(guān)鍵?？股睾Y選標(biāo)記基因是目前轉(zhuǎn)基因植物安全性的隱患之一，很多植物轉(zhuǎn)基因材料因此而不能獲準(zhǔn)商品化生產(chǎn)?，F(xiàn)在有幾種無篩選標(biāo)記的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，包括共轉(zhuǎn)化法(cotransformation)、定位重組體系(site-specif icrecombination)、多兀自動轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)(mult-auto-transformationvector)、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(transposition system)和同源重組體系(homologousrecombination)等，但只有共轉(zhuǎn)化法的應(yīng)用最為成功。共轉(zhuǎn)化法就是利用基因槍介導(dǎo)將分別攜帶目的基因和標(biāo)記基因的二個(gè)質(zhì)粒載體混合轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，之后即可在Tl或T2的分離后代中獲得無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株，不足的是轉(zhuǎn)化頻率比較低。利用分別含有不同雙兀表達(dá)載體的農(nóng)桿菌混合侵染植物細(xì)胞，同時(shí)含有二個(gè)不同雙兀表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞或含有二段T-DNA雙元表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞。由于目標(biāo)基因和選擇標(biāo)記基因位于不同載體或不同T-DNA上，后代中能夠獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株，獲得頻率同樣比較低。傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法在構(gòu)建多片段拼接的復(fù)雜載體時(shí)，往往操作步驟繁瑣，通常要構(gòu)建多個(gè)中間載體，陸云華等構(gòu)建質(zhì)體定點(diǎn)表達(dá)載體PRSMGA時(shí)，采用了一種通用高效的復(fù)雜載體構(gòu)建新方法，它屬于多片段拼接的水稻單交換表達(dá)載體，是一種簡便、通用、高效的復(fù)雜載體構(gòu)建方法。此法在引物設(shè)計(jì)時(shí)，在目的片段5’端加上隨機(jī)設(shè)計(jì)的接頭，利用PCR克隆目的片段，再用T4DNA聚合酶3’ -5’外切酶活性處理PCR克隆目的片段，產(chǎn)生多個(gè)首尾相匹配的粘性末端，進(jìn)行多片段定向連接、轉(zhuǎn)化、重組子鑒定。七個(gè)片段拼接的表達(dá)載體pRSMGA的構(gòu)建，只需做兩次連接轉(zhuǎn)化就可以完成，且其重組轉(zhuǎn)化效率高。陸云華等已經(jīng)用這 種方法構(gòu)建了幾十個(gè)載體，證明這是一種簡便、通用、高效的復(fù)雜構(gòu)建載體的方法。以上是構(gòu)建植物表達(dá)載體的幾種方法，其中傳統(tǒng)構(gòu)建法通用，不受限制，但構(gòu)建效率不穩(wěn)定，在酶切、連接過程中需要選擇合適的位點(diǎn)，一旦沒有合適的位點(diǎn)，一個(gè)簡單的構(gòu)建也會非常耗時(shí)耗力。Gateway技術(shù)也較為通用，通過兩次反應(yīng)就可完成載體構(gòu)建，其效率極高，但它往往需要與其他手段結(jié)合獲得入門克隆，且其成本高昂。三段T-DNA法需要農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法以去除選擇標(biāo)記，能獲得安全的轉(zhuǎn)基因植株，但其一般需要田間篩選分離，只適用于轉(zhuǎn)基因研究的目的載體，需要得到種子進(jìn)行下一代植株分離，才能得到無標(biāo)記植株。復(fù)雜載體構(gòu)建法適于大片段載體構(gòu)建，步驟相對較少，且其效率很高，而對于一些簡單載體構(gòu)建則無優(yōu)勢可言，同時(shí)它需要與PCR結(jié)合，也限制了其應(yīng)用范圍。結(jié)合以上載體構(gòu)建方法的優(yōu)點(diǎn)和不足，急需一種通用高效，應(yīng)用范圍較廣的載體構(gòu)建方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種構(gòu)建通用植物表達(dá)載體的方法。技術(shù)問題本發(fā)明的目的是針對植物表達(dá)載體傳統(tǒng)構(gòu)建方法中，構(gòu)建效率不穩(wěn)定，在酶切、連接過程中需要選擇合適的位點(diǎn)，一旦沒有合適的位點(diǎn)，一個(gè)簡單的構(gòu)建也會非常耗時(shí)耗力的不足，提供一種構(gòu)建通用植物表達(dá)載體的方法，以克服在植物表達(dá)載體構(gòu)建過程，因?yàn)闆]有合適的酶切位點(diǎn)而導(dǎo)致效率大幅下降的缺陷。該方法的應(yīng)用，將會大大提高一些簡單載體的構(gòu)建效率，提高植物表達(dá)載體的構(gòu)建成功率，從而大大拓寬該方法的應(yīng)用范圍。技術(shù)方案本發(fā)明所提供的一種構(gòu)建通用植物表達(dá)載體的方法是通過以下方法構(gòu)建而成I)目的基因序列選取了 fla基因作為目的基因。2) fla基因作為目的基因構(gòu)建在植物表達(dá)的Ti-質(zhì)粒雙元載體pCMBIA1300上(I)用于構(gòu)建雙元轉(zhuǎn)化一表達(dá)載體的質(zhì)粒的是由T-DNA改造而來，其中除T-DNA25bp重復(fù)序列(LB和RB)，真核生物表達(dá)的花椰菜花葉病毒的啟動子35S(p35S)和終止子夕卜，還有在原核生物(細(xì)菌)中作為選擇標(biāo)記使用的nptl和在真核生物(植物)中作為選擇標(biāo)記使用的hptll。用于選擇的抗生素均為Km和HYG。作為目的基因使用的fla基因插入在pCMBIA1300質(zhì)粒的p35S和T-DNA 25bp重復(fù)序列RB之間的多克隆酶切位點(diǎn)上，我們所采用的轉(zhuǎn)基因載體PCAMBIA1300，其上含有一個(gè)35S啟動子和終止子。質(zhì)粒pCAMBIA1300經(jīng)過XhoI酶切后自連得到7. 9kb的重組質(zhì)粒片段。設(shè)計(jì)引物添加酶切位點(diǎn)BamHI和SalI擴(kuò)增35S啟動子和終止子，擴(kuò)增得到的DNA片段連入pMD18-T載體。最后得到一個(gè)含有BamHI和SalI酶切位點(diǎn)的35S啟動子和終止子克隆pMD18-T :35S。(2)將fla基因用XhoI酶切，將pMD18-T :35S用XhoI單酶切并用去磷酸化酶CIAP處理后回收3. 6kb大片段。將此大片段和酶切回收的fla基因一起進(jìn)行連接。最后酶切驗(yàn)證并測序得到pMD18-T 35S fla重組片段。 (3)將pMD18-T 35S fla重組片段用SalI酶切位點(diǎn)切下2kb左右35S fla基因片段，同時(shí)用SalI單酶切pCAMBIA1300載體，二者混合連接即可得到pCAMBIA1300 fla重組植物表達(dá)載體。


圖lpCMBIA1300: :fla基因重組載體構(gòu)建圖XhoI酶切pCAMBIA1300后自連；擴(kuò)增35S啟動子和終止子并連入pMD18-T載體；構(gòu)建pMD18_T 35S fla重組片段；SalI酶切連入 PCAMBIA1300。
具體實(shí)施例方式I.在植物中表達(dá)fla基因的雙元轉(zhuǎn)化-表達(dá)載體pCMF(pCMBIA1300: :fla)的構(gòu)建用于構(gòu)建雙元轉(zhuǎn)化-表達(dá)載體的質(zhì)粒的是由T-DNA改造而來，其中除T_DNA25bp重復(fù)序列(LB和RB)，真核生物表達(dá)的花椰菜花葉病毒的啟動子35S(p35S)和終止子外，還有在原核生物(細(xì)菌)中作為選擇標(biāo)記使用的nptl和在真核生物(植物)中作為選擇標(biāo)記使用的hptll。用于選擇的抗生素均為Km和HYG ;作為目的基因使用的基因插入在PCMBIA1300質(zhì)粒的多酶切克隆位點(diǎn)上，所用內(nèi)切酶為BamHI，即獲得基因重組載體。雙元載體 pCMBIA1300 為公知公用載體(Roberts, C.，Rajagopal, S.，Smith, L. Μ.，et al. 1994，Plant Mol. Biol. 25(6)，989-994)。雙元轉(zhuǎn)化-表達(dá)載體pCMBIA1300: :fla轉(zhuǎn)化植物及fla基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)構(gòu)建的雙元轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒pCMBIA1300: :fla，可以直接轉(zhuǎn)化于含vir區(qū)輔助質(zhì)粒、不帶卡那霉素抗性的pTiBo542衍生質(zhì)粒的感受態(tài)根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105 中。EHA105 是 EHAlOl (C58/pTiBo542)的 Km 敏感衍生株。重組根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法用胚轉(zhuǎn)化法?；蜣D(zhuǎn)化參照Hiei等的方法并加以修改。取開花后12 15d的稻穗脫粒，表面滅菌后接種在NB培養(yǎng)基上，26°C下暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織。約5 7d后取愈傷組織在相同條件下繼代培養(yǎng)，用于共培養(yǎng)。農(nóng)桿菌于含50mg/L卡那霉素(Km)的YM平板上劃線，28°C下暗培養(yǎng)3d，用金屬匙收集農(nóng)桿菌菌體，懸浮于共培養(yǎng)CM液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌體濃度至0D_為O. 3 O. 5，加入乙酰丁香酮(AS，終濃度為100mg/L)，SP為共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化水稻用的農(nóng)桿菌懸浮液。將繼代培養(yǎng)4天后的愈傷組織浸于此菌液中，20min后取出并用無菌濾紙吸去多余菌液，隨即轉(zhuǎn)入鋪有無菌濾紙的固體培養(yǎng)基上，于26°C下暗培養(yǎng)2 3天。共培養(yǎng)后的愈傷組織在含50mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，26°C下暗培養(yǎng)14天，再轉(zhuǎn)到新鮮配制的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選14天。然后選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有50mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)至15h/天光照條件下培養(yǎng)，再生的小苗在1/2MS上生根壯苗兩周左右。選擇高約10cm、根系發(fā)達(dá)的小苗，按編號移栽入土。對Tl代植株按株系檢測轉(zhuǎn)化頻率以及植株中fla基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)化株系的檢測方法是用PCR法檢測轉(zhuǎn)化植株葉片中fla基因，fla基因的表達(dá)用定量RT-PCR方法檢測植株葉片中fla基因的RNA的積累。根癌土壤桿菌EHA105為公知公用菌株，基因轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的植株再生方法為轉(zhuǎn)基因植物的常規(guī)方法。(Hiei Y, Ohta S, Komari T, et al. Efficient transformationof rice(Oryza sativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the、boundaries of the T-DNA. Plant J, 1994, 6 :271-282)。2. fla基因轉(zhuǎn)基因水稻的表型特征將I所得到的fla基因轉(zhuǎn)基因水稻的T1代種子分別播種在溫室和病害流行區(qū)隔離田塊中，用人工接種法測定fla基因轉(zhuǎn)基因水稻株系對稻痕病(Magnaporthe grisea)和水稻細(xì)條斑病(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)的抗病型。人工接種法用常規(guī)噴霧(稻瘟病菌)和針刺接種法(細(xì)條斑病)。通過43個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系約4000個(gè)單株的鑒定結(jié)果,對稻瘟病中抗的單株占10 %，對水稻細(xì)條斑病表現(xiàn)中抗的單株約占5 %，與對照相比，防病效果分別達(dá)到60-80%和40 50%。用于轉(zhuǎn)基因的親本水稻品種有優(yōu)質(zhì)粳稻武育粳3號及日本晴(圖I)。進(jìn)行抗病性鑒定的水稻細(xì)條斑病菌和稻瘟病菌均為公知公用。轉(zhuǎn)基因親本水稻品種武育粳3號及日本晴是生產(chǎn)上使用的品種，公知公用。表達(dá)fla基因的轉(zhuǎn)基因植物品系分子生物學(xué)特征從水稻T1代植株中有約80%的單株可以用PCR方法檢測到fla基因的全長插入序列。用定量RT-PCR方法可檢測到fla基因表達(dá)，PCR和RT-PCR方法是分子生物學(xué)常規(guī)研究方法。
權(quán)利要求
1.一種通用的植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟本發(fā)明方法可利用載體的雙多克隆酶切位點(diǎn)構(gòu)建植物表達(dá)載體，從而大大拓寬該方法的應(yīng)用范圍。
a.構(gòu)建含有啟動子終止子的中間載體； b.利用中間載體將目的基因連入高效植物轉(zhuǎn)化載體PCMBIA1300上，獲得植物表達(dá)載體； c.將構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，外植體在植物再生培養(yǎng)基中篩選被轉(zhuǎn)化的再生植株(TciR),檢測轉(zhuǎn)化株系，獲得轉(zhuǎn)基因水稻。
2.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，用帶有目的基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻受體組織是將待轉(zhuǎn)化植物受體組織與有轉(zhuǎn)化能力的根農(nóng)桿菌接觸轉(zhuǎn)化所述組織，所述中間載體是含有啟動子和終止子的PMD-18T載體，所述高效植物轉(zhuǎn)化載體是PCMBIA1300載體。
3.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的水稻是秈稻、粳稻和爪哇稻。
4.按照權(quán)利要求3所述的秈稻、粳稻和爪哇稻，是常規(guī)稻，雜交稻不育系、保持系和恢復(fù)系。
5.按照權(quán)利要求I所述的目的基因是有應(yīng)用價(jià)值的抗逆基因、抗蟲基因、抗病基因、抗除草劑基因、抗衰老基因、品質(zhì)改良基因以及由上述基因組成的融合或多價(jià)基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種構(gòu)建通用植物表達(dá)載體的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包括構(gòu)建含有啟動子終止子的中間載體；利用中間載體將目的基因連入高效植物轉(zhuǎn)化載體pCMBIA1300上，獲得植物表達(dá)載體；將構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，外植體在植物再生培養(yǎng)基中篩選被轉(zhuǎn)化的再生植株(T0代)，檢測轉(zhuǎn)化株系，獲得轉(zhuǎn)基因水稻。本發(fā)明方法可利用載體的雙多克隆酶切位點(diǎn)構(gòu)建植物表達(dá)載體，從而大大拓寬該方法的應(yīng)用范圍。
文檔編號C12N15/82GK102978237SQ201210575410
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者王曉宇, 劉文真, 陳志誼, 羅楚平, 張榮勝, 周華飛 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院