專利名稱：一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于篩選草菇雜交菌株領(lǐng)域，特別涉及一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法。
背景技術(shù)：
草燕(Volvariella volvacea)栽培起源于中國，迄今已有300多年的栽培歷史，在我國南方地區(qū)廣泛栽培。草菇味道鮮美，不僅具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，而且還具有重要的醫(yī)療保健作用，深受廣大消費(fèi)者喜愛。草菇作為一種高溫栽培食用菌，同其它食用菌相比，其顯著的特點(diǎn)是生長速度極快，從播種到收獲一般只需要2周的時(shí)間，其年產(chǎn)量在我國食用菌產(chǎn)業(yè)中一直位居前十位。在經(jīng)典遺傳學(xué)研究中，草菇是食用菌中唯一的被認(rèn)定為屬于初級同宗結(jié)合繁殖模式的擔(dān)子菌，但是目前對草菇的遺傳學(xué)研究特別是繁殖模式的研究仍舊存在著很多爭議，這些基礎(chǔ)理論研究的不足制約了草菇雜交育種工作的開展，為草菇新品種的選育帶來了很多困難，從而極大地限制了草菇栽培業(yè)的發(fā)展。草菇菌絲不具有鎖狀聯(lián)合，缺乏篩選雜交菌株的方法，因此迫切需要開發(fā)有效的草菇雜交菌株篩選方法，以利于草菇新品種的選育。近年來對草菇交配型基因的研究以及對草菇基因組進(jìn)行測序，已經(jīng)獲得多個(gè) 草菇菌株的交配型A位點(diǎn)的基因序列，使利用交配型基因的分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法，該方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)和出菇試驗(yàn)等方法相比，具有操作簡便，檢測時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，可以利用交配型基因的分子標(biāo)記篩選雜交菌株，有利于草菇雜交育種工作的開展，從而加快草菇新品種的研發(fā)工作，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種分子標(biāo)記快速篩選草燕雜交菌株的方法，包括(I)比較草菇單孢分離菌株交配型A位點(diǎn)的基因序列，分析序列的保守性，針對草菇不同的單孢分離株分別設(shè)計(jì)特異性引物并合成；(2)將上述草菇單孢菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基，32 34°C培養(yǎng)；挑取草菇菌絲，利用試劑盒檢測菌株交配型基因類型；(3)把上述已確定交配型基因類型的草菇單孢菌株分別接種PDA平板培養(yǎng)基上，32 34°C下培養(yǎng)5 7d，在菌絲生長的部位打孔，把不同的單孢菌株兩兩接種在PDA平板培養(yǎng)基上，相距I厘米，32 34°C培養(yǎng)，兩個(gè)菌落相交時(shí)，分別從兩個(gè)菌落的外側(cè)挑取菌塊轉(zhuǎn)移到PDA試管培養(yǎng)基上，32 34°C培養(yǎng)，3次繼代培養(yǎng)；(4)采用步驟(I)中的交配型基因的特異性引物對草菇雜交獲得的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，草菇雜交菌株能擴(kuò)增出針對兩個(gè)母本的交配型基因的兩條條帶，單孢菌株只能擴(kuò)增出一條條帶，即可篩選出草菇雜交菌株。
所述步驟(I)中的草菇單核菌株Al交配型A位點(diǎn)的基因序列如SEQ ID No.1所示；草菇單核菌株A2交配型A位點(diǎn)的基因序列如SEQ ID No. 2所示。所述Al 對應(yīng)的特異性引物為 AlF AGGGCATTCCAACCTATTCGCTTTC ；AlR AATGTGAACAGTTTGAGCGGAGT。所述A2 對應(yīng)的特異性引物為 A2F CACTATCTCCTTGCGTTTGTTATG ；A2R :ATAACCAAACGCCAGAAACACTA。所述步驟(2)和(3)中的PDA平板培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g切片煮汁濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，用水補(bǔ)足體積到lOOOmL。所述步驟(2)中的試劑盒為Phire Plant Direct PCR Kit試劑盒。所述步驟(3)中的PDA試管培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g切片煮汁濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，用水補(bǔ)足體積到lOOOmL。所述步驟(4)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為擴(kuò)增體系(20yL):2XPCRbuffer 10 μ L, Phire Hot Start II DNAPolymeraseO. 4 μ L，10 μ mol/L草菇菌株檢測專用引物對各I μ L，菌絲體稀釋液0. 5 μ L,ddH207.1 μ L ；PCR 反應(yīng)條件98°C 2min ；98°C 5s, 67°C 5s, 72°C 20s, 40 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0本發(fā)明通過比較草菇單孢分離菌株交配型A位點(diǎn)的基因序列，分析序列的保守性，設(shè)計(jì)特異性引物，分別對草菇單孢分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果把單孢菌株進(jìn)行分類，把具有不同 交配型基因的單核菌株兩兩配對，利用交配型基因?yàn)榉肿訕?biāo)記的快速篩選雜交菌株，雜交菌株同時(shí)擴(kuò)增出兩條條帶，分別對應(yīng)于兩個(gè)母本的交配型基因，而單孢分離菌株只能擴(kuò)增出一條條帶，建立以交配型基因?yàn)榉肿訕?biāo)記的快速篩選雜交菌株的分子生物學(xué)方法。有益效果本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)和出菇試驗(yàn)等方法相比，具有操作簡便，檢測時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，可以利用交配型基因的分子標(biāo)記篩選雜交菌株，有利于草菇雜交育種工作的開展，從而加快草菇新品種的研發(fā)工作，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明草菇菌株特異條帶擴(kuò)增圖；其中，M為Marker；1為草菇單孢菌株I ;2為草菇單孢菌株I和2的雜交菌株；3為草菇單孢菌株2。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1(I)引物合成針對草菇單核菌株Al交配型A位點(diǎn)的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物為AlF AGGGCATTCCAACCTATTCGCTTTC ；
AIRAATGTGAACAGTTTGAGCGGAGT。(2)草燕菌絲培養(yǎng)草菇單孢菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基，32°C培養(yǎng)；PDA平板培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g切片煮汁濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，用水補(bǔ)足體積到lOOOmL。(3)確定單核菌株的交配型基因類型挑取草燕菌絲,利用Phire Plant Direct PCR Kit (FINNZYMES)試劑盒直接檢測菌株交配型基因類型。(4)草菇雜交試驗(yàn)把已確定交配型基因類型的草菇單孢菌株分別接種PDA平板培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)5d，用打孔器在菌絲生長的部位打孔，把不同的單孢菌株兩兩接種在PDA平板培養(yǎng)基上，兩個(gè)菌塊相距I厘米，32°C培養(yǎng)，兩個(gè)菌落相交時(shí)，分別從兩個(gè)菌落的外側(cè)挑取菌塊轉(zhuǎn)移到PDA試管培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)，3次繼代培養(yǎng)；PDA試管培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g切片煮汁濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，用水補(bǔ)足體積到lOOOmL。(5)草燕雜交菌株篩選挑取繼代培養(yǎng)的菌絲，利用Phire Plant Direct PCR Kit (FINNZYMES)試劑盒直接檢測菌絲交配型基因類型，同時(shí)具有母本兩種交配型基因的菌株為雜交菌株。(6) PCR 擴(kuò)增采用交配型基因的特異性引物對草菇雜交獲得的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為擴(kuò)增體系( 20yL) :2XPCR buffer 10 μ L, Phire Hot Start II DNAPolymeraseO. 4 μ L，10 μ mol/L草菇菌株檢測專用引物對各I μ L，菌絲體稀釋液0. 5 μ L,ddH207.1 μ L ；PCR 反應(yīng)條件98°C 2min ；98°C 5s, 67°C 5s, 72°C 20s, 40 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0草菇雜交菌株能擴(kuò)增出針對兩個(gè)母本的交配型基因的兩條條帶，單孢菌株只能擴(kuò)增出一條條帶，如圖1所示。實(shí)施例2(I)引物合成針對草菇單核菌株A2交配型A位點(diǎn)的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物為A2F :CACTATCTCCTTGCGTTTGTTATG ；A2R ATAACCAAACGCCAGAAACACTA。(2)草燕菌絲培養(yǎng)草菇單孢菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基，32°C培養(yǎng)；PDA平板培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g切片煮汁濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，用水補(bǔ)足體積到1000mL。(3)確定單核菌株的交配型基因類型挑取草燕菌絲,利用Phire Plant Direct PCR Kit (FINNZYMES)試劑盒直接檢測菌株交配型基因類型。(4)草菇雜交試驗(yàn)把已確定交配型基因類型的草菇單孢菌株分別接種PDA平板培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)5d，用打孔器在菌絲生長的部位打孔，把不同的單孢菌株兩兩接種在PDA平板培養(yǎng)基上，兩個(gè)菌塊相距I厘米，32°C培養(yǎng)，兩個(gè)菌落相交時(shí)，分別從兩個(gè)菌落的外側(cè)挑取菌塊轉(zhuǎn)移到PDA試管培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)，3次繼代培養(yǎng)；PDA試管培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g切片煮汁濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，用水補(bǔ)足體積到lOOOmL。(5)草燕雜交菌株篩選挑取繼代培養(yǎng)的菌絲，利用Phire Plant Direct PCR Kit (FINNZYMES)試劑盒直接檢測菌絲交配型基因類型，同時(shí)具有母本兩種交配型基因的菌株為雜交菌株。(6) PCR 擴(kuò)增 采用交配型基因的特異性引物對草菇雜交獲得的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為擴(kuò)增體系(20yL) :2XPCR buffer 10 μ L, Phire Hot Start II DNAPolymeraseO. 4 μ L，10 μ mol/L草菇菌株檢測專用引物對各I μ L，菌絲體稀釋液0. 5 μ L,ddH207.1 μ L ；PCR 反應(yīng)條件98°C 2min ；98°C 5s, 67°C 5s, 72°C 20s, 40 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0草菇雜交菌株能擴(kuò)增出針對兩個(gè)母本的交配型基因的兩條條帶，單孢菌株只能擴(kuò)增出一條條帶。
權(quán)利要求
1.一種分子標(biāo)記快速篩選草燕雜交菌株的方法,包括 (1)比較草菇單孢分離菌株交配型A位點(diǎn)的基因序列，分析序列的保守性，針對草菇不同的單孢分離株分別設(shè)計(jì)特異性引物并合成； (2)將上述草菇單孢菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基，32 34°C培養(yǎng)；挑取草菇菌絲，利用試劑盒檢測菌株交配型基因類型； (3)把上述已確定交配型基因類型的草菇單孢菌株分別接種PDA平板培養(yǎng)基上，32 34°C下培養(yǎng)5 7d，在菌絲生長的部位打孔，把不同的單孢菌株兩兩接種在PDA平板培養(yǎng)基上，相距I厘米，32 34°C培養(yǎng)，兩個(gè)菌落相交時(shí)，分別從兩個(gè)菌落的外側(cè)挑取菌塊轉(zhuǎn)移到PDA試管培養(yǎng)基上，32 34°C培養(yǎng)，3次繼代培養(yǎng)； (4)采用步驟(I)中的交配型基因的特異性引物對草菇雜交獲得的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，草菇雜交菌株能擴(kuò)增出針對兩個(gè)母本的交配型基因的兩條條帶，單孢菌株只能擴(kuò)增出一條條帶，即可篩選出草菇雜交菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草燕雜交菌株的方法，其特征在于所述步驟(I)中的草菇單孢分離菌株交配型為Al或A2，A位點(diǎn)的基因序列分別如SEQ IDNo.1所示或如SEQ ID No. 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草燕雜交菌株的方法,其特征在于所述Al對應(yīng)的特異性引物為AlF AGGGCATTCCAACCTATTCGCTTTC ；AlR AATGTGAACAGTTTGAGCGGAGT
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草燕雜交菌株的方法,其特征在于所述A2對應(yīng)的特異性引物為A2F CACTATCTCCTTGCGTTTGTTATG ；A2R ATAACCAAACGCCAGAAACACTA
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草燕雜交菌株的方法，其特征在于所述步驟(2)和(3)中的PDA平板培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g切片煮汁濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，用水補(bǔ)足體積到lOOOmL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草燕雜交菌株的方法，其特征在于所述步驟(2)中的試劑盒為Phire Plant Direct PCR Kit試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草燕雜交菌株的方法，其特征在于所述步驟(3)中的PDA試管培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200g切片煮汁濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂20g,用水補(bǔ)足體積到lOOOmL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分子標(biāo)記快速篩選草燕雜交菌株的方法，其特征在于所述步驟(4)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為 擴(kuò)增體系2XPCR buffer 10 μ L, Phire Hot Start II DNA PolymeraseO. 4 μ L,10 μ mol/L草菇菌株檢測專用引物對各I μ L，菌絲體稀釋液O. 5 μ L，ddH207.1 μ L ；PCR反應(yīng)條件98°C 2min ；98°C 5s, 67°C 5s, 72°C 20s, 40 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記快速篩選草菇雜交菌株的方法，包括(1)引物合成；(2)草菇菌絲培養(yǎng)；(3)確定單核菌株的交配型基因類型；(4)草菇雜交試驗(yàn)；(5)PCR擴(kuò)增判斷。本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)和出菇試驗(yàn)等方法相比，具有操作簡便，檢測時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，可以利用交配型基因的分子標(biāo)記篩選雜交菌株，有利于草菇雜交育種工作的開展，從而加快草菇新品種的研發(fā)工作，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK103060445SQ201210575580
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者汪虹, 陳明杰, 鮑大鵬, 馮愛萍, 薛承琴 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院