專利名稱：重組水痘－帶狀皰疹病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組水痘一帶狀皰疹病毒，特別是利用BAC (大腸桿菌人工染色體)制備的重組水痘一帶狀皰疹病毒，以及包含此種病毒的藥物組合物。此外，本發(fā)明還涉及包含水痘一帶狀皰疹病毒基因組基因和BAC載體序列的載體，以及包含此種載體的細胞。本發(fā)明還涉及制備重組水痘一帶狀皰疹病毒的方法。再有，本發(fā)明涉及包含能與水痘一帶狀皰疹病毒基因組進行同源重組的片段以及BAC載體序列的核酸盒。
背景技術：
水痘一帶狀皰疫病毒(varicella — zoster virus ;VZV)是屬于人皰疫病毒科(Herpesviridae)的病毒，是表現(xiàn)出兩種不同臨床表象疾病(水痘和帶狀皰疹)的病因。這種病毒的初期感染弓I起水痘(水皰瘡)。其后，此種病毒潛伏感染神經(jīng)節(jié)，經(jīng)年累月后由于某種誘因重新活化引發(fā)帶狀皰疹(形成病毒顆粒，通過神經(jīng)傳導，達到表皮細胞，在神經(jīng)分布的區(qū)域形成水痘癥狀)。VZV基因組是雙鏈DNA，包含約125000個堿基。全部的堿基序列已由Davison等人確定，已知該基因組中至少存在著72個基因。VZV疫苗的研發(fā)困難重重。VZV疫苗Oka株是由高橋等人開發(fā)的(特公昭53 —41202號)，是世界上唯一針對水痘一帶狀皰疹病毒的疫苗?，F(xiàn)有的減毒活水痘疫苗是利用以來源于減毒水痘病毒Oka株的病毒作為種子制備的，目前在世界各國廣泛應用(Requirements forVaricella (Live)Adopted 1984 ；Revised 1993:WH0 TechnicalReportSeries, N0.848, pp.22 — 38,1994)。這一 Oka株是由如下方式獲得的，即將從表現(xiàn)典型的水痘癥狀的患兒分離的病毒(Oka原株)，利用人胎兒肺細胞在34°C下傳代12代，再利用豚鼠胚胎細胞傳代11代，然后利用人二倍體細胞傳代數(shù)代來獲得。所述的Oka原株雖然具有強病源性，但Oka疫苗株(Oka株)即使對正常的兒童接種也幾乎沒有發(fā)現(xiàn)副作用。因此，Oka株作為幾乎沒有病源性的疫苗株是有用的。病毒疫苗在進行傳代培養(yǎng)時有可能改變其基因型。另外，由在Oka株自身的制備過程中經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，Oka株自身也可能具備遺傳多樣性。實踐中，為了確保疫苗的安全性和有效性，考慮到在制備疫苗過程中，由于傳代培養(yǎng)所導致的疫苗遺傳改變，制定了種子批次系統(tǒng)作為對認可進行生產(chǎn)的水痘種子病毒的傳代數(shù)的限制，即以確認種子時的傳代數(shù)為O代，并把從O代開始總傳代數(shù)在10代以內(nèi)的病毒用作疫苗。另一方面，通過水痘疫苗的效果追蹤，以及售后調(diào)查(PMS:post — marketingSurveillance)，從流行病學的觀點，有必要對從自然感染的水痘患者分離的水痘病毒的新鮮野生株與來自上述Oka株的疫苗株之間的病毒學差異進行分析，故已進行了應用免疫學和遺傳工程學進行分析的多種嘗試。例如，已有基于下述文獻進行的試驗報道，即水痘病毒株間基因結構、DNA喊基序列之間的差異(Journal of GeneralVirology, 59,660 一 668,1986 ;同前 67，1759 — 1816，1986)，限制酶 Pst I 酶切位點的有無(Japanese Journal ofExperimental Medicine, 59，233 一 237，1989)，根據(jù)應用 PCR(聚合酶鏈式反應)進行的 RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)判定(Journal of Virology,66,1016 一 1020，1992)，以及將上述Pst I 酶切位點的有無與 RFLP 分析相結合(Journalof Clinical Microbiology, 33,658 —660,1995).盡管通過這些試驗提出了為鑒別新鮮的野生型菌株與來自Oka株的疫苗株的條件，但考慮到Oka株自身的遺傳多樣性的問題，仍缺乏可信性，且不具備確定性，故而仍然存在疫苗的品質(zhì)管理問題。再有，已知有利用水痘病毒的基因14區(qū)域鑒定水痘病毒Oka株的方法(US Patent N0.6，093，535)，利用基因62區(qū)域鑒定減毒活水痘疫苗病毒株的方法(W0 00/50603)，這些方法中的任意一種技術均可以用于鑒定水痘病毒Oka株(強毒親株)，由親株衍生的疫苗株(減毒的Oka株)，以及Oka株之外的水痘病毒株之間的差異。但是以用于減毒活水痘疫苗的品質(zhì)管理和品質(zhì)保證的制劑標準尚不完備。目前，用于評定和確認疫苗品質(zhì)的方法，還沒有進行例如，通過對種子病毒和疫苗病毒的基因組DNA以直接的或定·量的遺傳分析進行品質(zhì)管理，因此用作活疫苗的減毒株的品質(zhì)管理和品質(zhì)保證的準確度無法計算，故而含混不清。因此，提高品質(zhì)管理和品質(zhì)保證的準確度對于確保減毒活水痘疫苗的有效性。安全性 均質(zhì)性至關重要。然而，如上所述，由于尚未確立其方法，使其成為亟待解決的課題。此外，為了研制出一種優(yōu)于Oka株的、經(jīng)改變的水痘一帶狀皰疹病毒疫苗，也需要開發(fā)經(jīng)誘變的重組水痘一帶狀皰疹病毒及其制備方法。專利文獻1:特公昭53 — 41202號專利文獻2:米國特許第6，093，535號專利文獻3:國際公開番號WO 00/50603非專利文獻1:Requirements for Varicella Vaccine (Live)Adopted 1984 ；Revised 1993:WH0 Technical Report Series, N0.848, pp.22-38,1994非專利文獻2:Journal of General Virology, 59,660-668,1986非專利文獻3:Journal of General Virology,67,1759-1816,1986非專利文獻4Japanese Journal of Experimental Medicine, 59, 233-237,1989非專利文獻5 Journal of Virology, 66,1016-1020,1992非專利文獻6:Journal of Clinical Microbiology, 33,658-660,199
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提高水痘帶狀皰疹疫苗的品質(zhì)控制和品質(zhì)保證的精度，以確保、保證減毒活水痘疫苗的有效性，安全性和均質(zhì)性。此外，本發(fā)明的課題還在于為了研制一種優(yōu)于Oka株的，經(jīng)改變的水痘一帶狀皰疹病毒疫苗，建立通過誘變生產(chǎn)重組水痘一帶狀皰疹病毒的方法，并提供此種病毒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了重組水痘一帶狀皰疹病毒，及其生產(chǎn)方法，例如利用BAC (大腸桿菌人工染色體)由單一病毒株生產(chǎn)重組水痘一帶狀皰疹病毒的方法。發(fā)明概述本發(fā)明人通過開發(fā)利用BAC載體序列制造重組水痘一帶狀皰疹病毒的方法，完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了下述內(nèi)容。1.重組水痘一帶狀皰疫病毒。2.1項中所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，包含BAC載體序列。3.如2項中所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，至少部分BAC載體序列插入到水痘一帶狀皰疹病毒基因組的非必需區(qū)域之中。4.如3項中所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的非必需區(qū)域選自下述區(qū)域:基因7的ORF中的區(qū)域，基因8的ORF中的區(qū)域，基因9的ORF中的區(qū)域，基因10的ORF中的區(qū)域，基因11的ORF中的區(qū)域，基因12的ORF中的區(qū)域，基因13的ORF中的區(qū)域，基因14的ORF中的區(qū)域，基因15的ORF中的區(qū)域，基因17的ORF中的區(qū)域，基因18的ORF中的區(qū)域，基因19的ORF中的區(qū)域，基因38的ORF中的區(qū)域，基因39的ORF中的區(qū)域，基因46的ORF中的區(qū)域，基因47的ORF中的區(qū)域，基因48的ORF中的區(qū)域，基因49的ORF中的區(qū)域，基因50的ORF中的區(qū)域，基因56的ORF中的區(qū)域，基因57的ORF中的區(qū)域，基因58的ORF中的區(qū)域，基因59的ORF中的區(qū)域，基因61的ORF中的區(qū)域，基因63的ORF中的區(qū)域，基因64的ORF中的區(qū)域，基因65的ORF中的區(qū)域，基因66的ORF中的區(qū)域，基因67的ORF中的區(qū)域，基因68的ORF中的區(qū)域，基因69的ORF中的區(qū)域，基因70的ORF中的區(qū)域，基因7的ORF的側翼區(qū)域，基因8的ORF的側翼區(qū)域，基因9的ORF的側翼區(qū)域，基因10的ORF的側翼區(qū)域，基因11的ORF的側翼區(qū)域，基因12的ORF的側翼區(qū)域，基因13的ORF的側翼區(qū)域，基因14的ORF的側翼區(qū)域，基因15的ORF的側翼區(qū)域，基因17的ORF的側翼區(qū)域，基因18的ORF的側翼區(qū)域，基因19的ORF的側翼區(qū)域，基因38的ORF的側翼區(qū)域，基因39的ORF的側翼區(qū)域，基因46的ORF的側翼區(qū)域，基因47的ORF的側翼區(qū)域，基因48的ORF的側翼區(qū)域，基因49的ORF的側翼區(qū)域，基因50的ORF的側翼區(qū)域，基因56的ORF的側翼區(qū)域，基因57的ORF的側翼區(qū)域，基因5`8的ORF的側翼區(qū)域，基因59的ORF的側翼區(qū)域，基因61的ORF的側翼區(qū)域，基因63的ORF的側翼區(qū)域，基因64的ORF的側翼區(qū)域，基因65的ORF的側翼區(qū)域，基因66的ORF的側翼區(qū)域，基因67的ORF的側翼區(qū)域，基因68的ORF的側翼區(qū)域，基因69的ORF的側翼區(qū)域和基因70的ORF的側翼區(qū)域。5.如4項中所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的非必需區(qū)域是基因11的ORF的側翼區(qū)域或基因12的ORF的側翼區(qū)域。6.如2項所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，至少部分BAC載體序列插入到水痘一帶狀皰疹病毒基因組的基因62的ORF區(qū)域。7.如2項中的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的BAC載體序列包含重組蛋白依賴的重組序列。8.如2項中所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的BAC載體序列包含選擇
己 O9.如8項中所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的選擇標記是藥物選擇
己 O10.如2項中的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的選擇標記是編碼綠熒光蛋白的基因。11.如2項中的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自野生株。
12.如2項中的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自突變型病毒株。13.如2項中的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自Oka疫苗株。 14.如2項中的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組在基因62和基因6中帶有突變。15.如14項中的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的基因62在SEQ ID N0.5中至少包含下述(a) - (d)中的堿基取代:(a)第2110位的G取代;(b)第3100位的G取代；(c)第3818位的C取代；和(d)第4006位的G取代， 以及前述基因6在SEQ ID N0.8的堿基序列中至少具有第5745位堿基是G的堿基取代。16.如2項中的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的BAC載體序列是具有SEQID N0.:7中所示序列的載體。17.包含I項中所述病毒的藥物組合物。18.如17項所述的藥物組合物，其中，組合物是疫苗的形式。19.載體，其包含除基因62之外的水痘一帶狀皰疹病毒基因組必需基因和BAC載體序列。20.如19項所述的載體，其進一步包含基因62。21.如19項所述的載體，其中，當所述載體插入哺乳動物細胞時，哺乳動物細胞產(chǎn)生水痘一帶狀皰疫病毒。22.如19項所述的載體，其中，來自前述水痘一帶狀皰疹病毒基因組的序列與BAC載體序列相連的部分位于該水痘一帶狀皰疹病毒基因組非-必需區(qū)域內(nèi)。23.如22項所述的載體，其中，所述的非必需區(qū)域選自下述區(qū)域:基因7的ORF中的區(qū)域，基因8的ORF中的區(qū)域，基因9的ORF中的區(qū)域，基因10的ORF中的區(qū)域，基因11的ORF中的區(qū)域，基因12的ORF中的區(qū)域，基因13的ORF中的區(qū)域，基因14的ORF中的區(qū)域，基因15的ORF中的區(qū)域，基因17的ORF中的區(qū)域，基因18的ORF中的區(qū)域，基因19的ORF中的區(qū)域，基因38的ORF中的區(qū)域，基因39的ORF中的區(qū)域，基因46的ORF中的區(qū)域，基因47的ORF中的區(qū)域，基因48的ORF中的區(qū)域，基因49的ORF中的區(qū)域，基因50的ORF中的區(qū)域，基因56的ORF中的區(qū)域，基因57的ORF中的區(qū)域，基因58的ORF中的區(qū)域，基因59的ORF中的區(qū)域，基因61的ORF中的區(qū)域，基因63的ORF中的區(qū)域，基因64的ORF中的區(qū)域，基因65的ORF中的區(qū)域，基因66的ORF中的區(qū)域，基因67的ORF中的區(qū)域，基因68的ORF中的區(qū)域，基因69的ORF中的區(qū)域，基因70的ORF中的區(qū)域，基因7的ORF的側翼區(qū)域，基因8的ORF的側翼區(qū)域，基因9的ORF的側翼區(qū)域，基因10的ORF的側翼區(qū)域，基因11的ORF的側翼區(qū)域，基因12的ORF的側翼區(qū)域，基因13的ORF的側翼區(qū)域，基因14的ORF的側翼區(qū)域，基因15的ORF的側翼區(qū)域，基因17的ORF的側翼區(qū)域，基因18的ORF的側翼區(qū)域，基因19的ORF的側翼區(qū)域，基因38的ORF的側翼區(qū)域，基因39的ORF的側翼區(qū)域，基因46的ORF的側翼區(qū)域，基因47的ORF的側翼區(qū)域，基因48的ORF的側翼區(qū)域，基因49的ORF的側翼區(qū)域，基因50的ORF的側翼區(qū)域，基因56的ORF的側翼區(qū)域，基因57的ORF的側翼區(qū)域，基因58的ORF的側翼區(qū)域，基因59的ORF的側翼區(qū)域，基因61的ORF的側翼區(qū)域，基因63的ORF的側翼區(qū)域，基因64的ORF的側翼區(qū)域，基因65的ORF的側翼區(qū)域，基因66的ORF的側翼區(qū)域，基因67的ORF的側翼區(qū)域，基因68的ORF的側翼區(qū)域，基因69的ORF的側翼區(qū)域和基因70的ORF的側翼區(qū)域。24.如23項所述的載體，其中，所述的連接部分是基因11的ORF側翼區(qū)域或基因12的ORF側翼區(qū)域。25.如19項所述的載體，其中，所述的來自水痘一帶狀皰疹病毒基因組的序列與前述BAC載體序列相連的部分位于水痘一帶狀皰疹病毒基因組中基因62的ORF中的區(qū)域內(nèi)。26.如19項所述的載體，其中，所述的BAC載體序列包含重組蛋白依賴的重組序列。27.如19項所述的載體，其中，所述的BAC載體序列包含選擇標記。28.如27項所述的載體,其中,所述的選擇標記是藥物選擇標記。29.如27項所述的載體，其中，所述的選擇標記是編碼綠熒光蛋白的基因。30.如19項所述的 載體，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自野生株。31.如19項所述的載體，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自突變型病毒株。32.如19項所述的載體，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自Oka疫苗株。33.如19項所述的載體，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組帶有在基因62和基因6中的突變。34.如33項中的載體，其中，所述的基因62在SEQ ID N0.5中至少包含下述(a) —(d)中的喊基取代:(a)第2110位的G取代;(b)第3100位的G取代；(c)第3818位的C取代；和(d )第4006位的G取代，此外，基因6在SEQ ID N0.8的堿基序列中至少包含第5745位堿基是G的堿基取代。35.如19項所述的載體，其中，是所述的BAC載體序列包含SEQID N0.:7所示的序列的載體。36.包含19項所述載體的細胞。37.如36項所述的細胞，其中，所述的細胞是細菌細胞。38.如37項所述的細胞，其中，所述的細菌細胞是大腸桿菌細胞。39.如36項所述的細胞，其中所述的細胞是哺乳動物細胞。40.如39項所述的哺乳動物細胞，其中，所述的哺乳動物細胞是來自人的細胞。41.由如39項所述的哺乳動物細胞產(chǎn)生的病毒。
42.包含如41項所述病毒的藥物組合物。43.如42項所述的藥物組合物，其中，所述的組合物是疫苗形式。44.生產(chǎn)重組水痘一帶狀皰疹病毒的方法，它是重組水痘一帶狀皰疹病毒的生產(chǎn)方法，該方法包含以下步驟:將含有除基因62之外的水痘一帶狀皰疹病毒基因組必需基因與BAC載體序列的載體導入哺乳動物宿主細胞的步驟；和培養(yǎng)該哺乳動物宿主細胞，產(chǎn)生重組水痘一帶狀皰疹病毒的步驟。45.如44項所述的方法，其中，所述的載體還包含基因62。46.如44項所述的方法，其中，所述的哺乳動物宿主細胞來源于人。47.如44項所述的方法，其中，所述的BAC載體序列至少包含兩種重組蛋白依賴的重組序列。

48.如47項所述的方法，其中，進一步包含引起上述兩個重組蛋白依賴的重組序列之間重組的步驟。49.如44項所述的方法，其中，來自前述水痘一帶狀皰疹病毒基因組的序列與BAC載體序列相連的部位位于該水痘一帶狀皰疹病毒基因組的非必需區(qū)域內(nèi)。50.如49項所述的方法，其中，所述的非必需區(qū)域選自下述區(qū)域:基因7的ORF中的區(qū)域，基因8的ORF中的區(qū)域，基因9的ORF中的區(qū)域，基因10的ORF中的區(qū)域，基因11的ORF中的區(qū)域，基因12的ORF中的區(qū)域，基因13的ORF中的區(qū)域，基因14的ORF中的區(qū)域，基因15的ORF中的區(qū)域，基因17的ORF中的區(qū)域，基因18的ORF中的區(qū)域，基因19的ORF中的區(qū)域，基因38的ORF中的區(qū)域，基因39的ORF中的區(qū)域，基因46的ORF中的區(qū)域，基因47的ORF中的區(qū)域，基因48的ORF中的區(qū)域，基因49的ORF中的區(qū)域，基因50的ORF中的區(qū)域，基因56的ORF中的區(qū)域，基因57的ORF中的區(qū)域，基因58的ORF中的區(qū)域，基因59的ORF中的區(qū)域，基因61的ORF中的區(qū)域，基因63的ORF中的區(qū)域，基因64的ORF中的區(qū)域，基因65的ORF中的區(qū)域，基因66的ORF中的區(qū)域，基因67的ORF中的區(qū)域，基因68的ORF中的區(qū)域，基因69的ORF中的區(qū)域，基因70的ORF中的區(qū)域，基因7的ORF的側翼區(qū)域，基因8的ORF的側翼區(qū)域，基因9的ORF的側翼區(qū)域，基因10的ORF的側翼區(qū)域，基因11的ORF的側翼區(qū)域，基因12的ORF的側翼區(qū)域，基因13的ORF的側翼區(qū)域，基因14的ORF的側翼區(qū)域，基因15的ORF的側翼區(qū)域，基因17的ORF的側翼區(qū)域，基因18的ORF的側翼區(qū)域，基因19的ORF的側翼區(qū)域，基因38的ORF的側翼區(qū)域，基因39的ORF的側翼區(qū)域，基因46的ORF的側翼區(qū)域，基因47的ORF的側翼區(qū)域，基因48的ORF的側翼區(qū)域，基因49的ORF的側翼區(qū)域，基因50的ORF的側翼區(qū)域，基因56的ORF的側翼區(qū)域，基因57的ORF的側翼區(qū)域，基因58的ORF的側翼區(qū)域，基因59的ORF的側翼區(qū)域，基因61的ORF的側翼區(qū)域，基因63的ORF的側翼區(qū)域，基因64的ORF的側翼區(qū)域，基因65的ORF的側翼區(qū)域，基因66的ORF的側翼區(qū)域，基因67的ORF的側翼區(qū)域，基因68的ORF的側翼區(qū)域，基因69的ORF的側翼區(qū)域和基因70的ORF的側翼區(qū)域。51.如50項所述的載體，其中，所述的非必需區(qū)域是基因11的ORF側翼區(qū)域或基因12的ORF側翼區(qū)域。52.如44項所述的方法，其中，所述的來自水痘一帶狀皰疹病毒基因組的序列與BAC載體序列相連接的部分位于水痘一帶狀皰疹病毒基因組的基因62的ORF區(qū)域內(nèi)。
53.如44項所述的方法，其中，所述的BAC載體序列包含重組蛋白依賴的重組序列。54.如44項所述的方法，其中，所述的BAC載體序列包含選擇標記。55.如第54項所述的方法,其中，所述的選擇標記是藥物選擇標記。56.如第54項所述的方法，其中，所述的選擇標記是編碼綠熒光蛋白的基因。57.如44項所述的方法，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自野生株。58.如44項所述的方法，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自突變型病毒株。59.如44項所述的方法，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自Oka疫苗株。60.如44項所述的方法，其中，前述水痘一帶狀皰疹病毒基因組具有基因62和基因6中的突變。61.如第60項所述的方法，其中，所述的基因62在SEQ ID N0.5中至少包含下述(a) - (d)中的堿基取代:(a)第2110位的G取代;(b)第3100位的G取代；(C)第3818位的C取代；和(d)第4006位的G取代，此外，基因6包含在SEQ ID N0.8的堿基序列中至少第5745位堿基是G的堿基取代。62.如44項所述的方法，其中，是所述的BAC載體序列包含SEQID N0.:7所示的序列的載體。63.如第44項所述方法所生產(chǎn)的病毒。64.藥物組合物，其包含如第63項所述的病毒。65.如第64項所述的藥物組合物，其中，所述的組合物是疫苗的形式。66.向如第19項所述的載體中導入突變的方法，包括以下步驟:將所述載體導入細菌宿主細胞的步驟；將包含由水痘一帶狀皰疹病毒基因組的一部分組成的片段的質(zhì)粒載體導入該細菌宿主細胞的步驟，其中，所述片段至少具有一個突變；培養(yǎng)所述的細菌宿主細胞的步驟；由經(jīng)培養(yǎng)的細菌宿主細胞分離具有BAC序列的載體的步驟。67.向如第19項所述的載體中導入突變的方法，包括以下步驟:將所述載體導入細菌宿主細胞的步驟；將包含由水痘一帶狀皰疹病毒基因組的一部分組成的第一片段的第一質(zhì)粒載體導入所述細菌宿主細胞的步驟，其中，所述的第一片段至少具有一個變異；

將包含由水痘一帶狀皰疹病毒基因組的一部分組成的第二片段的第二質(zhì)粒載體導入所述細菌宿主細胞中的步驟，其中，所述的第二片段至少具有一個變異，所述的第二片段與第一片段不同；培養(yǎng)所述細菌宿主細胞的步驟；
從所培養(yǎng)的細菌宿主細胞分離具有BAC載體序列的載體的步驟。68.核酸盒，其包含在細菌細胞內(nèi)可以與水痘一帶狀皰疹病毒基因組同源重組的第一片段，BAC載體序列，和在細菌細胞內(nèi)可以與水痘一帶狀皰疹病毒基因組同源重組的第二片段的核酸，其中，所述的BAC序列兩端分別與第一片段和第二片段相連。69.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少為lkb。70.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少為1.5kb。71.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少為2kb。72.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段與水痘一帶狀皰疫病毒基因組序列至少80%同一。73.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段與水痘一帶狀皰疫病毒基因組序列至少85%同一。74.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段與水痘一帶狀皰疫病毒基因組序列至少90%同一。75.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段與水痘一帶狀皰疫病毒基因組序列至少95%·同一。76.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分別獨立地來自選自下述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組的區(qū)域:基因7的ORF中的區(qū)域，基因8的ORF中的區(qū)域，基因9的ORF中的區(qū)域，基因10的ORF中的區(qū)域，基因11的ORF中的區(qū)域，基因12的ORF中的區(qū)域，基因13的ORF中的區(qū)域，基因14的ORF中的區(qū)域，基因15的ORF中的區(qū)域，基因17的ORF中的區(qū)域，基因18的ORF中的區(qū)域，基因19的ORF中的區(qū)域，基因38的ORF中的區(qū)域，基因39的ORF中的區(qū)域，基因46的ORF中的區(qū)域，基因47的ORF中的區(qū)域，基因48的ORF中的區(qū)域，基因49的ORF中的區(qū)域，基因50的ORF中的區(qū)域，基因56的ORF中的區(qū)域，基因57的ORF中的區(qū)域，基因58的ORF中的區(qū)域，基因59的ORF中的區(qū)域，基因61的ORF中的區(qū)域，基因62的ORF中的區(qū)域，基因63的ORF中的區(qū)域，基因64的ORF中的區(qū)域，基因65的ORF中的區(qū)域，基因66的ORF中的區(qū)域，基因67的ORF中的區(qū)域，基因68的ORF中的區(qū)域，基因69的ORF中的區(qū)域，基因70的ORF中的區(qū)域，基因7的ORF的側翼區(qū)域，基因8的ORF的側翼區(qū)域，基因9的ORF的側翼區(qū)域，基因10的ORF的側翼區(qū)域，基因11的ORF的側翼區(qū)域，基因12的ORF的側翼區(qū)域，基因13的ORF的側翼區(qū)域，基因14的ORF的側翼區(qū)域，基因15的ORF的側翼區(qū)域，基因17的ORF的側翼區(qū)域，基因18的ORF的側翼區(qū)域，基因19的ORF的側翼區(qū)域，基因38的ORF的側翼區(qū)域，基因39的ORF的側翼區(qū)域，基因46的ORF的側翼區(qū)域，基因47的ORF的側翼區(qū)域，基因48的ORF的側翼區(qū)域，基因49的ORF的側翼區(qū)域，基因50的ORF的側翼區(qū)域，基因56的ORF的側翼區(qū)域，基因57的ORF的側翼區(qū)域，基因58的ORF的側翼區(qū)域，基因59的ORF的側翼區(qū)域，基因61的ORF的側翼區(qū)域，基因62的ORF的側翼區(qū)域，基因63的ORF的側翼區(qū)域，基因64的ORF的側翼區(qū)域，基因65的ORF的側翼區(qū)域，基因66的ORF的側翼區(qū)域，基因67的ORF的側翼區(qū)域，基因68的ORF的側翼區(qū)域，基因69的ORF的側翼區(qū)域，基因70的ORF的側翼區(qū)域。77.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分別獨立地與選自下述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組的區(qū)域至少80%同一，所述的區(qū)域為:
基因7的ORF中的區(qū)域，基因8的ORF中的區(qū)域，基因9的ORF中的區(qū)域，基因10的ORF中的區(qū)域，基因11的ORF中的區(qū)域，基因12的ORF中的區(qū)域，基因13的ORF中的區(qū)域，基因14的ORF中的區(qū)域，基因15的ORF中的區(qū)域，基因17的ORF中的區(qū)域，基因18的ORF中的區(qū)域，基因19的ORF中的區(qū)域，基因38的ORF中的區(qū)域，基因39的ORF中的區(qū)域，基因46的ORF中的區(qū)域，基因47的ORF中的區(qū)域，基因48的ORF中的區(qū)域，基因49的ORF中的區(qū)域，基因50的ORF中的區(qū)域，基因56的ORF中的區(qū)域，基因57的ORF中的區(qū)域，基因58的ORF中的區(qū)域，基因59的ORF中的區(qū)域，基因61的ORF中的區(qū)域，基因62的ORF中的區(qū)域，基因63的ORF中的區(qū)域，基因64的ORF中的區(qū)域，基因65的ORF中的區(qū)域，基因66的ORF中的區(qū)域，基因67的ORF中的區(qū)域，基因68的ORF中的區(qū)域，基因69的ORF中的區(qū)域，基因70的ORF中的區(qū)域，基因7的ORF的側翼區(qū)域，基因8的ORF的側翼區(qū)域，基因9的ORF的側翼區(qū)域，基因10的ORF的側翼區(qū)域，基因11的ORF的側翼區(qū)域，基因12的ORF的側翼區(qū)域，基因13的ORF的側翼區(qū)域，基因14的ORF的側翼區(qū)域，基因15的ORF的側翼區(qū)域，基因17的ORF的側翼區(qū)域，基因18的ORF的側翼區(qū)域，基因19的ORF的側翼區(qū)域，基因38的ORF的側翼區(qū)域，基因39的ORF的側翼區(qū)域，基因46的ORF的側翼區(qū)域，基因47的ORF的側翼區(qū)域，基因48的ORF的側翼區(qū)域，基因49的ORF的側翼區(qū)域，基因50的ORF的側翼區(qū)域，基因56的ORF的側翼區(qū)域，基因57的ORF的側翼區(qū)域，基因58的ORF的側翼區(qū)域，基因59的ORF的側翼區(qū)域，基因61的ORF的側翼區(qū)域，基因62的ORF的側翼區(qū)域，基因63的ORF的側翼區(qū)域，基因64的ORF的側翼區(qū)域，基因65的ORF的側翼區(qū)域，基因66的ORF的側翼區(qū)域，基因67的ORF的側翼區(qū)域，基因68的ORF的側翼區(qū)域，基因69的ORF的側翼區(qū)域和基因70的ORF的側翼區(qū)域。78.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分別獨立地與選自下述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組的區(qū)域至少85%同一，所述的區(qū)域為:基因7的ORF中的區(qū)域，基因8的ORF中的區(qū)域，基因9的ORF中的區(qū)域，基因10的ORF中的區(qū)域，基因11的ORF中的區(qū)域，基因12的ORF中的區(qū)域，基因13的ORF中的區(qū)域，基因14的ORF中的區(qū)域，基因15的ORF中的區(qū)域，基因17的ORF中的區(qū)域，基因18的ORF中的區(qū)域，基因19的ORF中的區(qū)域，基因38的`ORF中的區(qū)域，基因39的ORF中的區(qū)域，基因46的ORF中的區(qū)域，基因47的ORF中的區(qū)域，基因48的ORF中的區(qū)域，基因49的ORF中的區(qū)域，基因50的ORF中的區(qū)域，基因56的ORF中的區(qū)域，基因57的ORF中的區(qū)域，基因58的ORF中的區(qū)域，基因59的ORF中的區(qū)域，基因61的ORF中的區(qū)域，基因62的ORF中的區(qū)域，基因63的ORF中的區(qū)域，基因64的ORF中的區(qū)域，基因65的ORF中的區(qū)域，基因66的ORF中的區(qū)域，基因67的ORF中的區(qū)域，基因68的ORF中的區(qū)域，基因69的ORF中的區(qū)域，基因70的ORF中的區(qū)域，基因7的ORF的側翼區(qū)域，基因8的ORF的側翼區(qū)域，基因9的ORF的側翼區(qū)域，基因10的ORF的側翼區(qū)域，基因11的ORF的側翼區(qū)域，基因12的ORF的側翼區(qū)域，基因13的ORF的側翼區(qū)域，基因14的ORF的側翼區(qū)域，基因15的ORF的側翼區(qū)域，基因17的ORF的側翼區(qū)域，基因18的ORF的側翼區(qū)域，基因19的ORF的側翼區(qū)域，基因38的ORF的側翼區(qū)域，基因39的ORF的側翼區(qū)域，基因46的ORF的側翼區(qū)域，基因47的ORF的側翼區(qū)域，基因48的ORF的側翼區(qū)域，基因49的ORF的側翼區(qū)域，基因50的ORF的側翼區(qū)域，基因56的ORF的側翼區(qū)域，基因57的ORF的側翼區(qū)域，基因58的ORF的側翼區(qū)域，基因59的ORF的側翼區(qū)域，基因61的ORF的側翼區(qū)域，基因62的ORF的側翼區(qū)域，基因63的ORF的側翼區(qū)域，基因64的ORF的側翼區(qū)域，基因65的ORF的側翼區(qū)域，基因66的ORF的側翼區(qū)域，基因67的ORF的側翼區(qū)域，基因68的ORF的側翼區(qū)域，基因69的ORF的側翼區(qū)域和基因70的ORF的側翼區(qū)域。79.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分別獨立地與選自下述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組的區(qū)域至少90%同一，所述的區(qū)域為:基因7的ORF中的區(qū)域，基因8的ORF中的區(qū)域，基因9的ORF中的區(qū)域，基因10的ORF中的區(qū)域，基因11的ORF中的區(qū)域，基因12的ORF中的區(qū)域，基因13的ORF中的區(qū)域，基因14的ORF中的區(qū)域，基因15的ORF中的區(qū)域，基因17的ORF中的區(qū)域，基因18的ORF中的區(qū)域，基因19的ORF中的區(qū)域，基因38的ORF中的區(qū)域，基因39的ORF中的區(qū)域，基因46的ORF中的區(qū)域，基因47的ORF中的區(qū)域，基因48的ORF中的區(qū)域，基因49的ORF中的區(qū)域，基因50的ORF中的區(qū)域，基因56的ORF中的區(qū)域，基因57的ORF中的區(qū)域，基因58的ORF中的區(qū)域，基因59的ORF中的區(qū)域，基因61的ORF中的區(qū)域，基因62的ORF中的區(qū)域，基因63的ORF中的區(qū)域，基因64的ORF中的區(qū)域，基因65的ORF中的區(qū)域，基因66的ORF中的區(qū)域，基因67的ORF中的區(qū)域，基因68的ORF中的區(qū)域，基因69的ORF中的區(qū)域，基因70的ORF中的區(qū)域，基因7的ORF的側翼區(qū)域，基因8的ORF的側翼區(qū)域，基因9的ORF的側翼區(qū)域，基因10的ORF的側翼區(qū)域，基因11的ORF的側翼區(qū)域，基因12的ORF的側翼區(qū)域，基因13的ORF的側翼區(qū)域，基因14的ORF的側翼區(qū)域，基因15的ORF的側翼區(qū)域，基因17的ORF的側翼區(qū)域，基因18的ORF的側翼區(qū)域，基因19的ORF的側翼區(qū)域，基因38的ORF的側翼區(qū)域，基因39的ORF的側翼區(qū)域，基因46的ORF的側翼區(qū)域，基因47的ORF的側翼區(qū)域，基因48的ORF的側翼區(qū)域，基因49的ORF的側翼區(qū)域，基因50的ORF的側翼區(qū)域，基因56的ORF的側翼區(qū)域，基因57的ORF的側翼區(qū)域，基因58的ORF的側翼區(qū)域，基因59的ORF的側翼區(qū)域，基因61的ORF的側翼區(qū)域，基因62的ORF的側翼區(qū)域，基因63的ORF的側翼區(qū)域，基因64的ORF的側翼區(qū)域，基因65的ORF的側翼區(qū)域，基因66的ORF的側翼區(qū)域，基因67的ORF的側翼區(qū)域，基因68的ORF的側翼區(qū)域，基因69的ORF的側翼區(qū)域和基因70的ORF的側翼區(qū)域。80.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分別獨立地與選自下述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組的區(qū)域至少95%同一，所述的區(qū)域為:基因7的ORF中的區(qū)域，基因8的ORF中的區(qū)域，基因9的ORF中的區(qū)域，基因10的ORF中的區(qū)域，基因11的ORF中的區(qū)域，基因12的ORF中的區(qū)域，基因13的ORF中的區(qū)域，基因14的ORF中的區(qū)域，基因15的ORF中的區(qū)域，基因17的ORF中的區(qū)域，基因18的ORF中的區(qū)域，基因19的ORF中的區(qū)域，基因38的ORF中的區(qū)域，基因39的ORF中的區(qū)域，基因46的ORF中的區(qū)域，基因47的ORF中的區(qū)域，基因48的ORF中的區(qū)域，基因49的ORF中的區(qū)域，基因50的ORF中的區(qū)域，基因56的ORF中的區(qū)域，基因57的ORF中的區(qū)域，基因58的ORF中的區(qū)域，基因59的ORF中的區(qū)域，基因61的ORF中的區(qū)域，基因62的ORF中的區(qū)域，基因63的ORF中的區(qū)域，基因64的ORF中的區(qū)域，基因65的ORF中的區(qū)域，基因66的ORF中的區(qū)域，基因67的ORF中的區(qū)域，基因68的ORF中的區(qū)域，基因69的ORF中的區(qū)域，基因70的ORF 中的區(qū)域，基因7的ORF的側翼區(qū)域，基因8的ORF的側翼區(qū)域，基因9的ORF的側翼區(qū)域，基因10的ORF的側翼區(qū)域，基因11的ORF的側翼區(qū)域，基因12的ORF的側翼區(qū)域，基因13的ORF的側翼區(qū)域，基因14的ORF的側翼區(qū)域，基因15的ORF的側翼區(qū)域，基因17的ORF的側翼區(qū)域，基因18的ORF的側翼區(qū)域，基因19的ORF的側翼區(qū)域，基因38的ORF的側翼區(qū)域，基因39的ORF的側翼區(qū)域，基因46的ORF的側翼區(qū)域，基因47的ORF的側翼區(qū)域，基因48的ORF的側翼區(qū)域，基因49的ORF的側翼區(qū)域，基因50的ORF的側翼區(qū)域，基因56的ORF的側翼區(qū)域，基因57的ORF的側翼區(qū)域，基因58的ORF的側翼區(qū)域，基因59的ORF的側翼區(qū)域，基因61的ORF的側翼區(qū)域，基因62的ORF的側翼區(qū)域，基因63的ORF的側翼區(qū)域，基因64的ORF的側翼區(qū)域，基因65的ORF的側翼區(qū)域，基因66的ORF的側翼區(qū)域，基因67的ORF的側翼區(qū)域，基因68的ORF的側翼區(qū)域，基因69的ORF的側翼區(qū)域和基因70的ORF的側翼區(qū)域。81.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段來自不同的區(qū)域。82.如第72項所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分別獨立地來自于基因11的ORF的側翼序列和基因12的ORF的側翼序列。83.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的BAC載體序列包含重組蛋白依賴的重組序列。84.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的BAC載體序列包含選擇標記。85.如第84項所述的核酸盒，其中，所述的選擇標記是藥物選擇標記。

86.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的選擇標記是編碼綠熒光蛋白的基因。87.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自野生株。88.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自突變型病毒株。89.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自Oka疫苗株。90.如第68項所述的核酸盒，其中，所述的BAC載體序列包含SEQ ID N0.:7所示的序列。91.如第68項所述的核酸盒，其具有SEQ ID N0.:2所示的核酸序列。本發(fā)明提供重組水痘一帶狀皰疹病毒及其生產(chǎn)方法。例如，本發(fā)明提供利用BAC(大腸桿菌人工染色體)由單個的病毒株生產(chǎn)重組水痘一帶狀皰疹病毒的方法，以及由該方法生產(chǎn)的重組水痘一帶狀皰疹病毒。此外，本發(fā)明還提供包含所述重組水痘一帶狀皰疹病毒的藥物組合物。本發(fā)明還提供包含水痘一帶狀皰疹病毒基因組基因和BAC載體序列的載體，包含所述載體的細胞，以及包含能與水痘一帶狀皰疹病毒基因組同源重組的片段以及BAC載體序列的核酸盒。


圖1是顯示水痘一帶狀皰疹病毒Oka株基因組和重組水痘一帶狀皰疹病毒的結構的模式圖。圖2是水痘一帶狀皰疫病毒Oka株(未株)基因組與重組水痘一帶狀皰疫病毒(rV02)的體外增殖比較圖。優(yōu)選實施方案的描述
以下，對本發(fā)明進行說明。在整個說明書中，只要沒有特別說明，單數(shù)表達形式應當理解為也包含其復數(shù)形式的概念范疇。只要沒有特別說明，本說明書中所使用的術語應理解為本領域通常所指的含義。因而在沒有其它定義的情況下，本說明書中所使用的全部專業(yè)術語和科技用語，應理解為本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員通常所理解的含義。當發(fā)生矛盾時，首先依照本說明書(包括定義)。以下對本發(fā)明進行說明。在本說明書中，只要沒有特別說明，單數(shù)表達形式應當理解為包含其復數(shù)形式的概念范疇。因此，單數(shù)形式的冠詞(例如英語中的“a”，“an”，“the”)在沒有特別說明的情況下也包含其復數(shù)形式的概念范疇。在沒有特別說明的情況下，本說明書中所使用的術語應理解為本領域通常所指的含義。因而在沒有其它定義的情況下，本說明書中所使用的全部專業(yè)術語和科技用語，應理解為與本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。發(fā)生矛盾時，優(yōu)先依照本說明書中(包括定義)。術語的定義以下列舉的是本說明書中特別使用的術語的定義。在本說明書中使用時，水痘一帶狀皰疹病毒的“必需基因”是指水痘一帶狀皰疹病毒增殖所必需的基因。水痘一帶狀皰疹病毒的“非必需基因”指對于非水痘一帶狀皰疹病毒增殖所必需的基因，即使缺失了這些“非必需基因”，水痘一帶狀皰疹病毒仍然可以增殖的基因。作為水痘一帶狀皰疹病毒的非必需基因，例如包括但不限于:基因7，基因8，基因9，基因10，基因11，基因12，基因13，基因14，基因15，基因17，基因18，基因19，基因38，基因39，基因46，基因47，基因48，基因49，基因50，基因56，基因57，基因58，基因59，基因61，基因63，基因64，基因65，基因66，基因67，基因68，基因69和基因70。當病毒基因組中的基因為必需基因時，由于該基因被破壞，病毒將不能增殖。因此，當病毒基因組中的任意基因被破壞后，通過檢測病毒的增殖情況即可判斷被破壞的基因是必需基因還是非必需基因。

本說明書中所述的水痘一帶狀皰疹病毒的“野生株”指未經(jīng)人工修飾，從自然界中分尚的水痘一帶狀皰疫病毒株。作為野生株例如，包括但不限于Davison, A.J.and Scott,J.E.(J.Gen.Virol.67 (Pt 9)，1759 — 1816 (1986)鑒定的 Dumas 株。Dumas 株的核酸序列如SEQ IDN0.:5所示。該Dumas株的ORF的編號及其位置如下:
權利要求
1.重組、減毒水痘一帶狀皰疹病毒，其包含BAC載體序列，其中，至少部分前述BAC載體序列插入到水痘一帶狀皰疹病毒基因組的非必需區(qū)域之中，并且其中，前述非必需區(qū)域選自基因11的ORF的側翼區(qū)域或基因12的ORF的側翼區(qū)域。
2.如權利要求1所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的非必需區(qū)域是基因11的ORF和基因12的ORF之間的區(qū)域。
3.如權利要求1所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒,其中,所述的BAC載體序列包含重組蛋白依賴的重組序列。
4.如權利要求1所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的BAC載體序列包含選擇標記。
5.如權利要求4所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的選擇標記是藥物選擇標記。
6.如權利要求1所述 的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的選擇標記是編碼綠熒光蛋白的基因。
7.如權利要求1所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自野生株。
8.如權利要求1所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒,其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自突變型病毒株。
9.如權利要求1所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自Oka疫苗株。
10.如權利要求1所述的重組水痘一帶狀皰疹病毒,其中,所述的BAC載體序列包含SEQID N0.:7所示的序列。
11.包含權利要求1所述病毒的藥物組合物。
12.如權利要求11所述的藥物組合物，其中，所述的組合物是疫苗的形式。
13.載體，其包含水痘一帶狀皰疹病毒必需基因和BAC載體序列，其中，一部分BAC載體序列位于該水痘一帶狀皰疹病毒基因組的非必需區(qū)域內(nèi)，所述的非必需區(qū)域選自基因11的ORF的側翼區(qū)域或基因12的ORF的側翼區(qū)域。
14.如權利要求13所述的載體，其進一步包含基因62。
15.如權利要求13所述的載體，其中，當所述載體插入哺乳動物細胞時，哺乳動物細胞產(chǎn)生水痘一帶狀皰疫病毒。
16.如權利要求13所述的載體，其中，所述的非必需區(qū)域是基因11的ORF與基因12的ORF之間的區(qū)域。
17.如權利要求13所述的載體，其中，所述的BAC載體序列包含重組蛋白依賴的重組序列。
18.如權利要求13所述的載體，其中，所述的BAC載體序列包含選擇標記。
19.如權利要求18所述的載體，其中，所述的選擇標記是藥物選擇標記。
20.如權利要求18所述的載體，其中，所述的選擇標記是編碼綠熒光蛋白的基因。
21.如權利要求13所述的載體，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自野生株。
22.如權利要求13所述的載體，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自突變型病毒株。
23.如權利要求13所述的載體，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自Oka疫苗株。
24.如權利要求13所述的載體，其中，所述的BAC載體序列包含SEQID N0.:7所示的序列。
25.包含權利要求13所述載體的細胞。
26.如權利要求25所述的細胞，其中，所述的細胞是細菌細胞。
27.如權利要求26所述的細菌細胞，其中，所述的細菌是大腸桿菌。
28.如權利要求25所述的細胞，其中，所述的細胞是哺乳動物細胞。
29.如權利要求28所述的哺乳動物細胞，其中，所述的哺乳動物細胞來源于人。
30.如權利要求28所述的哺乳動物細胞產(chǎn)生的病毒。
31.包含如權利要求30所述的病毒的藥物組合物。
32.如權利要求31所述的藥物組合物，其中所述的組合物是疫苗的形式。
33.生產(chǎn)重組、減毒水痘一帶狀皰疹減毒病毒的方法，該方法包含以下步驟: 將含有水痘一帶狀皰疹病毒基因組必需基因與BAC載體序列的載體導入到哺乳動物宿主細胞中的步驟；和 培養(yǎng)所述的哺乳動物宿主細胞，生產(chǎn)重組水痘一帶狀皰疹病毒的步驟，其中，所述BAC載體序列位于該水痘一 帶狀皰疹病毒基因組的非必需區(qū)域內(nèi)，所述的非必需區(qū)域選自基因11的ORF的側翼區(qū)域，或基因12的ORF的側翼區(qū)域。
34.如權利要求33所述的方法，其中所述的哺乳動物宿主細胞來源于人。
35.如權利要求33所述的方法，其中，所述的BAC載體序列至少包含兩種重組蛋白依賴的重組序列。
36.如權利要求35所述的方法，其進一步包含在上述兩種重組蛋白依賴的重組序列之間的重組步驟。
37.如權利要求33所述的載體，其中，所述的非必需區(qū)域是基因11的ORF和基因12的ORF之間的區(qū)域。
38.如權利要求33所述的方法，其中，所述的BAC載體序列包含重組蛋白依賴的重組序列。
39.如權利要求33所述的方法，其中，所述的BAC載體序列包含選擇標記。
40.如權利要求39所述的方法，其中，所述的選擇標記是藥物選擇標記。
41.如權利要求39所述的方法，其中，所述的選擇標記是編碼綠熒光蛋白的基因。
42.如權利要求33所述的方法，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自野生株。
43.如權利要求33所述的方法，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自突變型病毒株。
44.如權利要求33所述的方法，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自Oka疫苗株。
45.如權利要求33所述的方法，其中，所述的BAC載體序列包含SEQID N0.:7所示的序列。
46.如權利要求33所述的方法制備的病毒。
47.包含權利要求46所述病毒的藥物組合物。
48.如權利要求47所述的藥物組合物，其中，所述的組合物是疫苗的形式。
49.將突變導入如權利要求13所述的載體中的方法，該方法包括以下步驟: 將所述載體導入到細菌宿主細胞中的步驟； 將包含由水痘一帶狀皰疹病毒基因組的一部分組成的片段的質(zhì)粒載體導入該細菌宿主細胞的步驟，其中，所述片段至少具有一個突變； 培養(yǎng)所述的細菌宿主細胞的步驟； 由經(jīng)培養(yǎng)的細菌宿主細胞分離具有BAC載體序列的載體的步驟。
50.向如權利要求13所述的載體中導入突變的方法，該方法包括以下步驟，將所述載體導入細菌宿主細胞的步驟； 將包含由水痘一帶狀皰疫病毒基因組的一部分組成的第一片段的第一質(zhì)粒載體導入所述細菌宿主細胞的步驟，其中，所述的第一片段至少具有一個變異； 將包含由水痘一帶狀皰疹病毒基因組的一部分組成的第二片段的第二質(zhì)粒載體導入所述細菌宿主細胞的步驟，其中，所述的第二片段至少具有一個變異，并且所述的第二片段與第一片段不同； 培養(yǎng)所述細菌宿主細胞的步驟； 從所培養(yǎng)的細菌宿主細胞分 離具有BAC載體序列的載體的步驟。
51.核酸盒，其包含能夠在細菌細胞內(nèi)與水痘一帶狀皰疹病毒基因組基因組同源重組的第一片段，BAC載體序列，能夠在細菌細胞內(nèi)與水痘一帶狀皰疹病毒基因組基因組同源重組的第二片段，其中，所述的BAC序列兩端與第一片段和第二片段相連，所述的第一片段和第二片段分別獨立地選自基因11的ORF的側翼區(qū)域，或基因12的ORF的側翼區(qū)域。
52.如權利要求51所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少為lkb。
53.如權利要求51所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段來自不同的區(qū)域。
54.如權利要求51所述的核酸盒，其中，所述的BAC載體包含重組蛋白依賴的重組序列。
55.如權利要求51所述的核酸盒，其中，所述的BAC載體序列包含選擇標記。
56.如權利要求55所述的核酸盒，其中，所述的選擇標記是藥物選擇標記。
57.如權利要求51所述的核酸盒，其中，所述的選擇標記是編碼綠熒光蛋白的基因。
58.如權利要求51所述的核酸盒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自野生株。
59.如權利要求51所述的核酸盒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自突變型病毒株。
60.如權利要求51所述的核酸盒，其中，所述的水痘一帶狀皰疹病毒基因組來自Oka疫苗株。
61.如權利要求51所述的核酸盒，其中，所述的BAC載體序列包含SEQID N0.:7所示的序列。
62.如權利要求51所述的核酸盒，其具有SEQID N0.:2所示的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供重組水痘－帶狀皰疹病毒及其制備方法，和包含重組水痘－帶狀皰疹病毒的藥物組合物；還提供包含所述水痘－帶狀皰疹病毒基因組基因和BAC載體序列的載體、包含這種載體的細胞以及能與水痘－帶狀皰疹病毒進行同源重組的片段、包含所述的BAC載體序列的核酸盒。為此，本發(fā)明通過開發(fā)利用BAC載體序列制備重組水痘－帶狀皰疹病毒的方法，解決了上述課題。
文檔編號C12N7/04GK103074305SQ20121058160
公開日2013年5月1日 申請日期2005年3月3日 優(yōu)先權日2004年3月5日
發(fā)明者長池和宏, 森康子, 五味康行, 高橋理明, 山西弘一 申請人:財團法人阪大微生物病研究會