專利名稱：用于鼻咽癌易感基因snp位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒。
背景技術(shù)：
鼻咽癌是鼻咽上皮來源的惡性腫瘤，多發(fā)于鼻咽頂部和咽隱窩，是一種多因素影響的復(fù)雜性疾病，其發(fā)生及發(fā)展與遺傳因素、環(huán)境因素及EBV病毒感染密切相關(guān)。中國(guó)是世界鼻咽癌高發(fā)區(qū)，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2008年，中國(guó)新發(fā)病例占全球39. 2%(33101人)，因鼻咽癌死亡病例占全球40. 5% (20899人)；并且，鼻咽癌好發(fā)于壯年，嚴(yán)重影響人民健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。近幾年，巴德年院士提出的現(xiàn)代“3P”醫(yī)學(xué)理念正不斷得到推廣。“3P”醫(yī)學(xué)模式，即預(yù)測(cè)(Prediction)、預(yù)防(Prevention)和個(gè)體化診療(Personalization),強(qiáng)調(diào)利用個(gè)體基因組等信息，進(jìn)行疾病的預(yù)測(cè)和防治，對(duì)于疾病的態(tài)度由“重治”轉(zhuǎn)變?yōu)椤爸胤馈?。同樣，鼻咽癌的防治關(guān)鍵將是進(jìn)行患病高危人群的篩查，提高早診率。臨床研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌早期治療效果遠(yuǎn)高于晚期。臨床分期是影響治療效果的重要因素，早期無局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌的5年生存率(75. 7%)遠(yuǎn)高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌(58. 2%)和晚期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移鼻咽癌(34. 9%)。然而，目前仍然缺乏有效的用于高危人群篩查、早期診斷方法策略，加上鼻咽癌的早期癥狀無特異性和原發(fā)部位較隱蔽，不易被發(fā)現(xiàn)，80%鼻咽癌患者就診時(shí)已處于中晚期，治療效果不理想，導(dǎo)致臨床上鼻咽癌的5年生存率一直徘徊于60%左右。進(jìn)行鼻咽癌高發(fā)區(qū)人群篩選，能夠篩選患病高危人群，提高鼻咽癌早診率，是提高治療效果的關(guān)鍵。因而，開發(fā)鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、用于鼻咽癌高危人群篩查 的新型手段具有重要的意義。目前臨床上提高鼻咽癌早期診斷率主要是通過提高個(gè)人健康意識(shí)，結(jié)合鼻咽腔檢查，并利用EB病毒抗體檢測(cè)技術(shù)以評(píng)估EB病毒感染情況(詳見專利CN92114135 “一種檢測(cè)EB病毒抗體的顯色試劑及其制造方法”;CN200710027841 “檢測(cè)多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒及其制備方法” ；CN201010255146 “EB病毒IgA抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金法)及制備方法”;CN200710029366.1 “檢測(cè)EB病毒gp78抗體的CBA試劑盒及其制備方法”等)。但是，這種策略難以應(yīng)用于大規(guī)模人群的高危人群篩查，難以應(yīng)用于鼻咽癌的早期預(yù)防、預(yù)警，也未能夠有效地提高早診率。因此，根據(jù)個(gè)體攜帶鼻咽癌易感基因情況，進(jìn)行鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，對(duì)于確定鼻咽癌高危人群，提高鼻咽癌早診率，顯得非常重要。在其它相關(guān)的惡性腫瘤研究當(dāng)中，研究者能夠利用個(gè)體攜帶易感基因的情況，對(duì)其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。例如，分別攜帶BRCAl和BRCA2基因突變的女性，罹患乳腺癌的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分別是正常群體的5 - 45倍和9 一 21倍；并且，Antoniou等人通過7個(gè)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)位點(diǎn)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在BRCA2突變攜帶者中，5%高危組到80歲時(shí)發(fā)生乳腺癌的可能性為80 96%，而低危組僅為42 50%，指出這些患病風(fēng)險(xiǎn)差異可以用于指導(dǎo)臨床方案。然而，目前缺乏有效的鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)產(chǎn)品。雖然已有個(gè)別申請(qǐng)專利根據(jù)鼻咽癌相關(guān)基因PLUNC的C-2128T位點(diǎn)、C-1888T位點(diǎn)或由此兩位點(diǎn)組成的單倍型來判定個(gè)體對(duì)鼻咽癌是否易感的方法(詳見專利CN200510008650. 1“一種檢測(cè)與鼻咽癌相關(guān)的易感基因PLUNC基因型的方法及PLUNC易感基因”)，然而，該方法僅針對(duì)極少數(shù)的指標(biāo)檢測(cè)，準(zhǔn)確率較低；并且，該方法可靠性有待于大規(guī)模人群樣本進(jìn)行驗(yàn)證。另外，有大量研究證實(shí)惡性腫瘤家族史及一些環(huán)境暴露因素(如食用腌制食品的歷史、既往吸煙飲酒史、攝取新鮮水果蔬菜及其他食品量、食用中草藥的歷史等)與鼻咽癌的發(fā)生有關(guān)系，綜合考慮遺傳因素和環(huán)境因素對(duì)鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)是必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒可用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)鼻咽癌易感基因的SNP位點(diǎn)，可以為個(gè)體罹患鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)程度、鼻咽癌高發(fā)區(qū)人群普查，篩查鼻 咽癌發(fā)病高危人群以及進(jìn)行相應(yīng)預(yù)防措施提供參考。本發(fā)明所述的一種用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括檢測(cè)鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位點(diǎn)rs2860580的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物；檢測(cè)鼻咽癌易感基因TNFRSF19區(qū)域的SNP位點(diǎn)rsl572072和rs9510787的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物；檢測(cè)鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點(diǎn)rs28421666、rs2860580和rs2894207的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物；檢測(cè)鼻咽癌易感基因MDSl-EVII的SNP位點(diǎn)rs6774494的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物。根據(jù)本發(fā)明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位點(diǎn)rs2860580的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID N0:3。根據(jù)本發(fā)明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因TNFRSF19區(qū)域的SNP位點(diǎn)rsl572072的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID N0:6。根據(jù)本發(fā)明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點(diǎn)rs28421666的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO:9。根據(jù)本發(fā)明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點(diǎn)rs2860580的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQID NO: 10和SEQ ID NO: 11，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO: 12。根據(jù)本發(fā)明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點(diǎn)rs2894207的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQID NO: 13和SEQ ID NO: 14，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO: 15。根據(jù)本發(fā)明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位點(diǎn)rs6774494的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO: 18。根據(jù)本發(fā)明所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因TNFRSF19的SNP位點(diǎn)rs9510787的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO:21。本發(fā)明所述的試劑盒以是以本發(fā)明人的基于大規(guī)模樣本量的鼻咽癌人群和正常人對(duì)照人群及全基因組水平鼻咽癌易感基因篩查結(jié)果的前期研究為基礎(chǔ)，結(jié)合其它已知的鼻咽癌相關(guān)易感基因，選擇7個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)進(jìn)行制備的。采取受檢者外周血、唾液或漱口水來源的基因組DNA，在本發(fā)明所述的試劑盒上進(jìn)行基因分型檢測(cè)，再利用多重PCR擴(kuò)增及桑格(Sanger)測(cè)序方法，檢測(cè)這7個(gè)單核苷酸位點(diǎn)，綜合分析環(huán)境因素(腌制食品食用史、既往吸煙史、新鮮水果蔬菜食用量)、腫瘤家族史及鼻咽癌易感基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)信息，利用遺傳風(fēng)險(xiǎn)計(jì)分模型，推測(cè)受檢者罹患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)程度，克服了現(xiàn)有的僅僅通過檢測(cè)EB病毒感染情況、或者依靠極少數(shù)的易感基因指標(biāo)的等結(jié)果來進(jìn)行鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)判斷的不足。本發(fā)明所述的試劑盒能夠在受檢者任何一個(gè)年齡階段進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合受檢者環(huán)境暴露因素，提示受檢者不同時(shí)期罹患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)程度，能夠進(jìn)行大規(guī)模人群普查、篩選鼻咽癌發(fā)病高危人群，實(shí)現(xiàn)鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、預(yù)警，提高早診率。
具體實(shí)施例方式1、本發(fā)明所述的試劑盒所檢測(cè)的受檢者基因組SNP位點(diǎn)(7個(gè))通過本發(fā)明人大規(guī)模樣本量的鼻咽癌全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到與鼻咽癌發(fā)病顯著相關(guān)的SNP，另外結(jié)合HapMap，dbSNP等數(shù)據(jù)庫挑選出SNP位點(diǎn)，并進(jìn)行位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)成功率評(píng)分，確定要進(jìn)行研究的7個(gè)SNP位點(diǎn)。其中，rsl412829位于基因⑶KN2A-⑶KN2B區(qū)域，rsl572072 和 rs9510787 位于基因 TNFRSF19 區(qū)域，rs2860580、rs2894207 和 r s28421666位于基因HLA區(qū)域，rs6774494位于基因MDSl-EVII區(qū)域。表1、與鼻咽癌發(fā)病顯著相關(guān)的7個(gè)SNP位點(diǎn)
位點(diǎn)名稱序列rs!412829TTAG 丁AGTACTACACATATCATGCTTTGGCfAAACTCTACCCATGA GATTCATATTCAAGCIA/G |TGAGGA ATGGCAAAAG AAAATAC AG AAATAGTGATAGTAACCATAGCAATGGTAATAAGArs!572072GGTGAGGTmGGGAAAGCTTCCAGATCAGTCTTTTTTTTTCGGTT GTTAAGCATCCTTCT[T/G]TCCTACTTCTCTCCATATATATACAAAT ACATAATAAATATTCCTATAGAGTTTTTAATGrs28421666ACTACAAAGACTAATATTACAATTCTGTAAATGTATCTATACTGTG
ATATTTATATTTAT[A/G]AAAACAGGAAGGATCTTAATGACACTCA GAAGACTAGAATTAGATGATAGAAGAACGACTrs2860580TGATGGTTTTATAAGGGGCTTTTCCCTGCTTCATTGTGCATTTCTC TCTCCTGTCACCAC|A/G|TGAAGAAGCfACGGGTTTGCTTCCACTT CTGCCATGACTGTAAGTTTCCTGGGGCAGCCTCrs2894207TACTTCACACCACAi ATAAAAATTACCTCAGTGTATCAAAGACCT AAATGTGAGACTTAAj TC |ATTAGAGAACTCTTAG AAGAAAACAT AAGCATAAATCTTCATGACTTTGGATTAGGTAAArs6774494CAAACAGATCTATCTTACTTACATTTACCAAATCAATTTAATTTTT ACAGGCCATGGCTTI AG IGTGACATATTGACTGTTrTCCTTAATGG C ATCTACCGTATTTAATGCAAGG ATGTC ATCTrs9510787AGCTGGGCTGACCTGCAACTCTTAGGAATTGTATGTGGCTTCATA GTCTTAGAAGACAGC|A/G]AGCAGTTGTTTGCACCAATAAGTAAT AAATCACATTATTAAAAG 丁丁 TATTATTTTCCAAA
2.設(shè)計(jì)待測(cè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物并合成。表2、待測(cè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物(PCRP )及單堿基延伸引物(UEP )
權(quán)利要求
1.一種用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位點(diǎn)rs2860580的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物；檢測(cè)鼻咽癌易感基因TNFRSF19區(qū)域的SNP位點(diǎn)rsl572072和rs9510787的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物；檢測(cè)鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點(diǎn)rs28421666、rs2860580和 rs2894207的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物；檢測(cè)鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位點(diǎn)rs6774494的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，其特征在于 所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位點(diǎn)rs2860580的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO :3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，其特征在于 所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因TNFRSF19區(qū)域的SNP位點(diǎn)rsl572072的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO :6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，其特征在于 所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點(diǎn)rs28421666的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為 SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO :9。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，其特征在于 所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點(diǎn)rs2860580的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為 SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO :12。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，其特征在于 所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點(diǎn)rs2894207的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為 SEQ ID N0:13和SEQ ID NO : 14，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ ID NO :15。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，其特征在于 所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位點(diǎn)rs6774494的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQ ID N0:16和SEQ ID NO : 17，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQID NO 180
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，其特征在于 所述檢測(cè)鼻咽癌易感基因TNFRSF19的SNP位點(diǎn)rs9510787的兩個(gè)PCR擴(kuò)增引物，其序列分別為SEQ ID NO 19和SEQ ID NO :20，以及單堿基延伸引物，其序列為SEQ IDNO :21。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于鼻咽癌易感基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒包括檢測(cè)鼻咽癌易感基因CDKN2A-CDKN2B的SNP位點(diǎn)rs2860580的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物；檢測(cè)鼻咽癌易感基因TNFRSF19區(qū)域的SNP位點(diǎn)rs1572072和rs9510787的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物；檢測(cè)鼻咽癌易感基因HLA的SNP位點(diǎn)rs28421666、rs2860580和rs2894207的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物；檢測(cè)鼻咽癌易感基因MDS1-EVI1的SNP位點(diǎn)rs6774494的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物。本發(fā)明所述的試劑盒可用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)鼻咽癌易感基因的SNP位點(diǎn)，可以為個(gè)體罹患鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)程度、鼻咽癌高發(fā)區(qū)人群普查，篩查鼻咽癌發(fā)病高危人群以及進(jìn)行相應(yīng)預(yù)防措施提供參考。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103045743SQ20121058427
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者曾益新, 賈衛(wèi)華, 崔倩, 貝錦新, 阮紅蓮 申請(qǐng)人:中山大學(xué)腫瘤防治中心