專利名稱：同時(shí)檢測(cè)櫻桃是否感染蘋果褪綠葉斑病毒和李屬壞死環(huán)斑病毒的方法及專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測(cè)櫻桃是否感染蘋果褪綠葉斑病毒和李屬壞死環(huán)斑病毒的方法及專用引物。
背景技術(shù)：
櫻桃是經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的果品之一，但是容易受病毒的為害。至今已發(fā)現(xiàn)68種侵染樓桃的病毒，其中蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)和李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)危害較為嚴(yán)重。近年來，由于不斷從國(guó)外大量引進(jìn)櫻桃種子和苗木新品系以及國(guó)內(nèi)不同地區(qū)苗木和種子的頻繁調(diào)運(yùn)，加快了病毒的傳播。李春敏等(1997)利用PAS-ELISA檢測(cè)出昌黎地區(qū)甜櫻桃ACLSV的感染率為47. 1%。牛建新等(2003)用RT-PCR檢測(cè)出了庫爾勒香梨上的ACLSV。李青等(1996)利用ELISA法對(duì)北京地區(qū)的桃、櫻桃攜帶PNRSV的情況進(jìn)行了檢測(cè)；阮小鳳等(1998，2004)對(duì)陜西省甜櫻桃、桃上的病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行了 ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在這兩種果樹上，PNRSV、PDV,ACLSV的發(fā)生率較高，之后用改良RT-PCR對(duì)櫻桃PDV和PNRSV進(jìn)行了檢測(cè)。侯義龍等(2005，2006)應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)桃和櫻桃及起組培苗上的PNRSV，調(diào)查大連市甜櫻桃品種‘紅燈’的田間植株時(shí)發(fā)現(xiàn)被檢植株P(guān)NRSV的感染率達(dá)100%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助檢測(cè)櫻桃是否感染蘋果褪綠葉斑病毒和/或李屬壞死環(huán)斑病毒的方法及專用引物。本發(fā)明所提供的用于 檢測(cè)植物病毒的引物，為引物對(duì)甲和引物對(duì)乙；所述引物對(duì)甲為檢測(cè)蘋果褪綠葉斑病毒的引物對(duì)，一條引物序列如SEQ ID No.1所示，另一條引物序列如SEQ ID No. 2所示；所述引物對(duì)乙為檢測(cè)李屬壞死環(huán)斑病毒的引物對(duì)，一條引物序列如SEQ ID No. 3所示，另一條引物序列如SEQ IDNo. 4所示。所述植物病毒可為所述蘋果褪綠葉斑病毒和/或李屬壞死環(huán)斑病毒。本發(fā)明所提供的輔助檢測(cè)櫻桃是否感染蘋果褪綠葉斑病毒和/或李屬壞死環(huán)斑病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)櫻桃的葉片的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小分別為632bp和455bp的兩個(gè)條帶，則待測(cè)櫻桃候選為同時(shí)感染蘋果褪綠葉斑病毒和李屬壞死環(huán)斑病毒；若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅為大小為632bp的條帶，則待測(cè)櫻桃候選為感染蘋果褪綠葉斑病毒；若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅為大小為455bp的條帶，則待測(cè)櫻桃候選為感染李屬壞死環(huán)斑病毒；若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中無大小分別為632bp和455bp的兩個(gè)條帶，則待測(cè)櫻桃候選為沒有感染蘋果褪綠葉斑病毒和李屬壞死環(huán)斑病毒。上述方法中，所述用引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法為先用引物對(duì)甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，10個(gè)循環(huán)后，再加入引物對(duì)乙繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直至擴(kuò)增結(jié)束。上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中每條引物的濃度為O. 5μΜ ;所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為57°C。含有上述引物的用于檢測(cè)蘋果褪綠葉斑病毒和/或李屬壞死環(huán)斑病毒植物病毒的試劑或試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述引物或上述試劑或上述試劑盒在檢測(cè)蘋果褪綠葉斑病毒和/或李屬壞死環(huán)斑病毒植物病毒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明中所建立的多重RT-PCR可以同時(shí)檢測(cè)出生產(chǎn)中櫻桃ACLSV和PNRSV病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，比單一 RT-PCR節(jié)省時(shí)間；操作上也更為簡(jiǎn)單；此外，也減少了試驗(yàn)中所消耗的藥品，更為經(jīng)濟(jì)。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄體系中的帶病植株的總RNA量為10_4yg時(shí)，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，仍可以同時(shí)檢測(cè)到兩種病毒。


圖1為CTAB法提取櫻桃葉片RNA電泳。1-4 ‘紅燈’、考特、Chelan、F8。圖2為ACLSV、PNRSV病毒引物AF1/AR1和PF/PR ‘紅燈’葉片的PCR預(yù)擴(kuò)增。A ACLSV ；B PNRSV ；M D2000DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)量。圖3為ACLSV、PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在不同退火溫度下PCR擴(kuò)增‘紅燈’櫻桃葉片電泳。A =ACLSV ；B =PNRSV0 M:2000bp DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量;1-6分別為45°C、48°C、51°C、55°C、57°C和 60°C ;A:引物 AF2/AR2 ;B:引物 PF/PR。圖4為ACLSV和PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在復(fù)合侵染的‘紅燈’葉片的多重PCR預(yù)擴(kuò)增電泳。M:D2000DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量；1 :只加入AF2/AR2 ；2 :只加入PF/PR ；3 :同時(shí)加入 AF2/AR2 和 PF/PR。圖5為ACLSV和PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在復(fù)合侵染的‘紅燈’葉片的多重 PCR 擴(kuò)增電泳。M:D2000DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)量；1 =ACLSV ;2，3 ACLSV+PNRSV ；4 =PNRSV ；5 :健康葉片；6 :空白對(duì)照。圖6為ACLSV和PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在復(fù)合侵染‘紅燈’葉片的多重RT-PCR靈敏度檢測(cè)。M :D2000DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量；1-7 :以RNA總量分別為10'10'10'10'10_5、10_6、10_7μ g反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)；8 :健康葉片；9 :空白對(duì)照。圖7為引進(jìn)的無毒苗ACLSV和PNRSV病毒mRT-PCR檢測(cè)電泳圖。M D2000marker ；1-8 Chelan λ Cristalina、Skeana、Sonata、Black republican、Sonet、Selah Λ BlackYork + :陽性對(duì)照。 圖8為147份櫻桃資源ACLSV和PNRSV病毒mRT-PCR檢測(cè)電泳圖。1-147品種(種)名見表3-1 ；M D2000marker ； + :陽性對(duì)照；—:健康植物。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本申請(qǐng)說明書中ACLSV均指蘋果褪綠葉斑病毒，PNRSV均指李屬壞死環(huán)斑病毒。材料采自北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所櫻桃資源圃的147份待檢測(cè)櫻桃資源葉片，具有ACLSV和PNRSV病毒感病特征的櫻桃‘紅燈’葉片作為陽性對(duì)照。感病的‘紅燈’葉片癥狀為葉片細(xì)長(zhǎng)，葉面不平展；主葉脈皺縮；葉片褪綠，甚至葉片全為黃色，部分有穿孔。檢測(cè)方法( I)櫻桃葉片總RNA的提取CTAB 裂解液10mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)25mM EDTA (ρΗ8· O), 2. OmM NaCl，O. 5g/L 亞精胺(spermide),1-巰基乙醇(用前加)；I)、葉片材料lg，加入少許PVP-40，液氮研磨充分后，迅速加入預(yù)熱好CTAB裂解液，渦旋振蕩30-60s，65°C水浴lOmin，期間振蕩搖勻1_2次；2)、迅速置冰上，冰浴3min，加入等體積積氯仿/異戊醇(體積比24:1)，振蕩搖勻，冰浴 lOmin,4°C 13000rpm 離心 IOmin ； 3)、重復(fù)步驟2 —次；4)、取上清液，加入I / 4體積的IOMLiCl混勻，(TC沉淀4h ；5)、4°C 13000rpm離心20min,棄上清，加入O. 5ml0. 5M SDS溶解沉淀，加入等體積氯仿/異戍醇(體積比24:1)抽提一次,冰浴5min ；6)、4°C 13000rpm離心lOmin，取上清，加入2. 5倍體積無水乙醇，_80°C沉淀30min ；7)、4°C 13000r pm 離心 20min,棄上清；8)、用75%的乙醇沉淀洗漆，4°C 5000rpm離心3min ;重復(fù)一次；9)、瞬時(shí)離心30s，吸出殘余的酒精，常溫涼干沉淀3min ;用適量無RNase水溶解沉淀，-80°C保存。(2)引物的設(shè)計(jì)
Γ 引物名稱i 列5· -3'·度Usp)大小(bp)
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)植物病毒的引物，為引物對(duì)甲和引物對(duì)乙； 所述引物對(duì)甲為檢測(cè)蘋果褪綠葉斑病毒的引物對(duì)，一條引物序列如SEQ ID No.1所示，另一條引物序列如SEQ ID No. 2所示； 所述引物對(duì)乙為檢測(cè)李屬壞死環(huán)斑病毒的引物對(duì)，一條引物序列如SEQ ID No. 3所示，另一條引物序列如SEQ ID No. 4所示。
2.一種輔助檢測(cè)櫻桃是否感染蘋果褪綠葉斑病毒和/或李屬壞死環(huán)斑病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)櫻桃的葉片的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用權(quán)利要求1中所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小分別為632bp和455bp的兩個(gè)條帶，則待測(cè)櫻桃候選為同時(shí)感染蘋果褪綠葉斑病毒和李屬壞死環(huán)斑病毒；若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅為大小為632bp的條帶，則待測(cè)櫻桃候選為感染蘋果褪綠葉斑病毒；若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅為大小為455bp的條帶，則待測(cè)櫻桃候選為感染李屬壞死環(huán)斑病毒；若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中無大小分別為632bp和455bp的兩個(gè)條帶，則待測(cè)櫻桃候選為沒有感染蘋果褪綠葉斑病毒和李屬壞死環(huán)斑病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述用權(quán)利要求1中所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法為先用所述引物對(duì)甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，10個(gè)循環(huán)后，再加入所述引物對(duì)乙繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直至擴(kuò)增結(jié)束。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中每條引物的濃度為0. 5 μ M ;所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為57°C。
5.含有權(quán)利要求1所述引物的用于檢測(cè)蘋果褪綠葉斑病毒和/或李屬壞死環(huán)斑病毒植物病毒的試劑或試劑盒。
6.權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求5所述的試劑或試劑盒在檢測(cè)蘋果褪綠葉斑病毒和/或李屬壞死環(huán)斑病毒植物病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測(cè)櫻桃是否感染蘋果褪綠葉斑病毒和李屬壞死環(huán)斑病毒的方法及專用引物。該用于檢測(cè)植物病毒的引物，為引物對(duì)甲和引物對(duì)乙；所述引物對(duì)甲為檢測(cè)蘋果褪綠葉斑病毒的引物對(duì)，一條引物序列如SEQ ID No.1所示，另一條引物序列如SEQ ID No.2所示；所述引物對(duì)乙為檢測(cè)李屬壞死環(huán)斑病毒的引物對(duì)，一條引物序列如SEQ ID No.3所示，另一條引物序列如SEQ ID No.4所示。本發(fā)明中所建立的多重RT-PCR可以同時(shí)檢測(cè)出生產(chǎn)中櫻桃ACLSV和PNRSV病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，比單一RT-PCR節(jié)省時(shí)間；操作上也更為簡(jiǎn)單；此外，也減少了試驗(yàn)中所消耗的藥品，更為經(jīng)濟(jì)。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄體系中的帶病植株的總RNA量為10-4μg時(shí)，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，仍可以同時(shí)檢測(cè)到兩種病毒。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK103031387SQ20121058559
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者李天忠, 馬國(guó)玲, 張開春 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)