專利名稱：Hbb基因的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及HBB基因的用途。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染性疾病，結(jié)核分枝桿菌不僅可引起肺結(jié)核(85%)，而且可引起肺外多種器官的結(jié)核病。盡管目前已有有效的抗結(jié)核藥物，但結(jié)核病仍然是當前感染性疾病的頭號殺手，全球每年約200萬人死于結(jié)核?。蝗蚣s三分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌，在這些被稱為結(jié)核菌潛伏感染(LTBI)的人群中，有約10%最終將進展為活動性結(jié)核病。由于目前缺乏有效的結(jié)核病疫苗，結(jié)核病的預(yù)防控制主要依賴于早期發(fā)現(xiàn)、治療、隔離活動性結(jié)核病人。然而，現(xiàn)今診斷活動性結(jié)核病的檢測技術(shù)存在嚴重不足，不能滿足臨床和結(jié)核病預(yù)防控制的要求:1)痰結(jié)核分枝桿菌微生物檢查特異性高，是當前診斷活動性肺結(jié)核的金標準，但存在敏感性低(不足40%)，耗時長(結(jié)核菌培養(yǎng)耗時I 一 2個月)，實驗室生物安全要求高的缺點。2)結(jié)核分枝桿菌基因檢測，雖然實現(xiàn)了快速診斷的目的(I天)，但直接從痰標本進行的基因檢測在敏感性方面沒有顯著提高，且存在假陰性，假陽性的問題。3)免疫學(xué)檢測中抗體檢測被世界衛(wèi)生組織認定不適合結(jié)核病的診斷；細胞免疫學(xué)檢測包括結(jié)核菌素皮試(TST)和結(jié)核菌干擾素釋放試驗(IGRA)，不能有效判別活動性結(jié)核患者和結(jié)核菌潛伏感染者，雖然后者在活動性結(jié)核患者檢測的敏感性顯著高于其他檢測。!11313也叫0)1131:-(]士6七3-81013；[11,0血紅蛋白與α血紅蛋白組成血紅素，是高等生物體內(nèi)負責運載氧的一種蛋白質(zhì)。在慢性丙肝患者中，HBB基因的突變會導(dǎo)致金屬離子的積累已經(jīng)肝臟纖維化。同時，β —血紅蛋白生成障礙性貧血是全球范圍常見的單基因遺傳病之一，又稱β —地中海貧血，它是由β —血紅蛋白基因突變導(dǎo)致，β —血紅蛋白肽鏈合成減少或缺乏所產(chǎn)生的貧 血。β 一血紅蛋白生成障礙性貧血患者較一般人群更易出現(xiàn)深部靜脈栓塞、肺動脈高壓、腦缺血等栓塞事件。目前尚沒有關(guān)于HBB基因作為結(jié)核診斷標志物的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供HBB基因的用途，HBB基因可作為判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的分子標志物。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):本發(fā)明提供了一種HBB基因的用途，用于制備判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的
女口
廣叩ο所述判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品優(yōu)選包括:用實時定量PCR或基因芯片檢測判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品。所述用實時定量PCR判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品至少優(yōu)選包括一對特異擴增HBB基因的引物。
所述特異擴增HBB基因的引物，優(yōu)選為:HBB-F: 5，-TGGCTAATGCCCTGGCCCACA-3，，HBB-R:5，-TGGACATGCTGCAGTTAGC-3，；所述用基因芯片檢測判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品優(yōu)選包括:與HBB基因的核酸序列雜交的探針。利用本發(fā)明的試劑盒，可以檢測病人HBB基因的表達情況，從而診斷病人是否患有活動性結(jié)核病。在本發(fā)明中，術(shù)語“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點，在合適條件下誘發(fā)合成與核酸鏈互補的引物擴增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液中并在合適的溫度下進行擴增反應(yīng)。優(yōu)選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設(shè)計用途，但一般在15 25個核苷酸之間。在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。經(jīng)實驗證明，本發(fā)明HBB基因在結(jié)核病人血液中的表達明顯高于健康人群以及潛伏感染人群，因此HBB基因可作為診斷結(jié)核的特異標志基因，使結(jié)核診斷更加準確、快速。


:下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明實施例1的HBB基因在人外周血單個核細胞(PBMC)中差異表達的定量RT-PCR結(jié)果圖。圖2是本發(fā)明實施例2的HBB基因在PBMC中差異表達的芯片結(jié)果圖。
具體實施方式
:下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明進行進一步描述:實施例1本實施例將人群分為三組:結(jié)核病患者、潛伏感染人群和健康人群(各20例)，通過檢測每例外周血單個核細胞(PBMC)中HBB基因mRNA變化，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)核病患者中呈明顯的上調(diào)表達趨勢。本實施例用定量RT-PCR方法檢測每例HBB基因的表達變化。具體步驟如下:步驟一:外周血單個核細胞(PBMC)懸液的制備在離心管中加入淋巴細胞分離液(Fresenius Kabi NOrge As:LYS3773) 5ml ;取上述確診的結(jié)核病患者，潛伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝靜脈血各2ml分別與等量IM的磷酸緩沖液(PBS)充分混勻得到混合液，用移液器將混合液沿管壁緩慢疊加于淋巴細胞分離液液面上，保持清 晰的界面，2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；用吸管吸取中間云霧層置入另一離心管后接著加入5倍體積的IM PBS, 1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘洗滌細胞，棄上清，相同條件重復(fù)洗滌細胞一次，接著加入含小牛血清體積百分比為10%的的RPMI1640 (Thermoscientific:SH30807.01b) 1ml，重懸細胞，得到三組人群的各20例PBMC懸液；每例取20 μ I的PBMC懸液于血球計數(shù)板上，計數(shù)細胞濃度。步驟二:RNA抽提采用Qiagene公司的RNeasy Mini Kit (貨號74106)對上述得到的三組人群的各20例PBMC懸液進行RNA抽提。具體操作是:取上述含I X IO6個細胞的PBMC懸液于去DNA酶和RNA酶的離心管中，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清；在細胞沉淀中加入350 μ IBuffer RLT,充分混勻裂解；加入250 μ I無水乙醇，混勻，把液體轉(zhuǎn)移到RNeasy柱子中，8，OOOg離心30秒，棄廢液；加入350 μ I Buffer Rffl以8，OOOg離心30秒，棄廢液；加入80 μ I DNase 溶液(10 μ I DNase+70 μ I Buffer RDD),柱上消化 15min，8，OOOg 離心 30 秒，棄廢液；加入 350 μ I Buffer RWl, 8，OOOg 離心 30 秒，棄廢液；加入 500 μ I Buffer RPE,8，OOOg離心30秒，棄廢液；空甩，8，OOOg離心I分鐘；把柱子轉(zhuǎn)移到一個去DNA酶和RNA酶的1.5ml離心管，加入40 μ I無RNase的ddH20,10，OOOg離心I分鐘，收集三組人群的各20例的RNA于-80 ° C保存、待用。步驟三:反轉(zhuǎn)錄采用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR047)，取步驟二得到的RNA0.5μ g進行反轉(zhuǎn)錄，該試劑盒較傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒增加了去除基因組DNA的步驟，可在最大程度上保證RNA的純度和擴增的特異性。分步如下:(I)基因組DNA的去除反應(yīng)表I
權(quán)利要求
1.一種HBB基因的用途，其特征在于，用于制備判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品O
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBB基因的用途，其特征在于，所述判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品包括:用實時定量PCR或基因芯片檢測判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品O
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的HBB基因的用途，其特征在于，所述用實時定量PCR判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增HBB基因的引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的HBB基因的用途，其特征在于， 所述特異擴增HBB基因的引物，為:HBB-F:5’ -TGGCTAATGCCCTGGCCCACA-3’，HBB-R:5’ -TGGACATGCTGCAGTTAGC-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的HBB基因的用途，其特征在于，所述用基因芯片檢測判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn) 品包括:與HBB基因的核酸序列雜交的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種HBB基因的用途，用于制備判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品。所述判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品優(yōu)選包括用實時定量PCR或基因芯片檢測判別結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核的產(chǎn)品。經(jīng)實驗證明，本發(fā)明HBB基因在結(jié)核病人血液中的表達明顯高于健康人群以及潛伏感染人群，因此HBB基因可作為診斷結(jié)核的特異標志基因，使結(jié)核診斷更加準確、快速。
文檔編號C12N15/11GK103074424SQ20121058947
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者陳心春, 周伯平, 張明霞, 楊倩婷, 蔡毅, 張影 申請人:深圳市第三人民醫(yī)院