從嗜熱細(xì)菌中分離的編碼dna聚合酶的dna的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及從嗜熱細(xì)菌中分離的編碼DNA聚合酶的DNA及其編碼的DNA聚合酶，更具體的涉及從Thermococcus?gammatolerans分離得到的編碼DNA聚合酶的DNA及其編碼的DNA聚合酶。本發(fā)明采用從嗜熱細(xì)菌中分離出的編碼DNA聚合酶的DNA，其具有如下序列之一：（i）具有序列表中SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列；（ii）在（i）限定的核苷酸序列中缺失、插入、替換一個(gè)或多個(gè)核苷酸；其編碼出的蛋白質(zhì)即DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中具有較高的保真能力、較高的擴(kuò)增效率以及耐高溫性能。
【專利說明】從嗜熱細(xì)菌中分離的編碼DNA聚合酶的DNA
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及從嗜熱細(xì)菌中分離的編碼DNA聚合酶的DNA及其編碼的DNA聚合酶,更具體的涉及從Thermococcus gammatoIerans分離得到的編碼DNA聚合酶的DNA及其編碼的DNA聚合酶。
【背景技術(shù)】[0002]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR,是一種在體外模擬體內(nèi)核酸復(fù)制的分子生物學(xué)技術(shù)。其利用微量模板，在DNA聚合酶的作用下，沿引物的5’-3’方向不斷添加與模板互補(bǔ)的核苷酸，重復(fù)該循環(huán)過程，實(shí)現(xiàn)在廣3小時(shí)內(nèi)將待擴(kuò)增目的基因放大幾百萬倍的目的。該方法廣泛應(yīng)用于核酸檢測、基因克隆、疾病診斷、分子標(biāo)記育種等各個(gè)領(lǐng)域。影響PCR反應(yīng)結(jié)果的主要因素，除模板和引物外，所使用的DNA聚合酶和反應(yīng)體系直接決定了 PCR是否成功以及結(jié)果的可靠性，DNA聚合酶本身的耐熱性、擴(kuò)增效率、保真性、抗抑制劑等性能是評判其優(yōu)劣的主要指標(biāo)。在耐熱DNA聚合酶出現(xiàn)以前，PCR主要通過大腸桿菌DNA聚合酶或噬菌體DNA聚合酶來實(shí)現(xiàn)，由于PCR反應(yīng)需要高溫變性、低溫退火的過程，其操作繁瑣、結(jié)果不穩(wěn)定，直到從耐熱微生物Thermus aquaticus YTl中分離得到能耐受高溫變性的TaqDNA聚合酶(美國專利號:4，889，818)，才使得該技術(shù)成為分子生物學(xué)的一種常用手段。但Taq DNA聚合酶由于缺少3' _5’校正活性，其擴(kuò)增過程中極易發(fā)生突變，且擴(kuò)增特異性較差，嚴(yán)重影響下游實(shí)驗(yàn)。后來從Pyrococcus furiosus中分離出更耐熱且具有校正活性的Pfu DNA聚合酶，其擴(kuò)增突變率大大降低且特異性得到很大提高，擴(kuò)增保真度是其他有校正活性DNA聚合酶的2-6倍；然而該酶效率低、擴(kuò)增產(chǎn)物少、延伸時(shí)間長(lkb/2min)，限制了其在很多實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用(美國專利號:5，545，552)。目前另一種DNA聚合酶KOD,來自鹿兒島縣小寶島的含硫氣孔中的超嗜熱原始菌ThermococcuskodakaraensisKODl,其具有極強(qiáng)的3’ -5’外切酶活性、更快的延伸速度(lkb/30s),但由于其過強(qiáng)的外切活性，容易導(dǎo)致模板和引物的降解，產(chǎn)生非特異擴(kuò)增且不適宜擴(kuò)增長片段，通過突變減弱其外切活性又導(dǎo)致保真度極大的降低(美國專利號:6，033，859)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從嗜熱細(xì)菌中分離出的編碼DNA聚合酶的DNA，其編碼出的蛋白質(zhì)即DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中具有較高的保真能力、較高的擴(kuò)增效率以及耐高溫性能。
[0004]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0005]從嗜熱細(xì)菌中分離出的編碼DNA聚合酶的DNA，其具有如下序列之一:
[0006](i)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列；
[0007](ii)在(i)限定的核苷酸序列中缺失、插入、替換一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
[0008]本發(fā)明還提供一種DNA聚合酶，其具有如下氨基酸序列:
[0009](i)具有序列表中SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列；[0010](ii)在(i)限定的氨基酸序列中缺失、插入、替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
[0011]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種包含前述編碼DNA聚合酶的DNA的表達(dá)載體。
[0012]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種制備前述DNA聚合酶的方法，包括用包含前述編碼DNA聚合酶的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得DNA聚合酶。具體步驟如下:
[0013](I)擴(kuò)增如SEQ ID N0.1所述的基因片段，構(gòu)建至含啟動(dòng)子的表達(dá)載體；
[0014](2)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主菌，得到能生產(chǎn)適用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶的重組細(xì)胞；
[0015](3)擴(kuò)大培養(yǎng)該重組細(xì)胞，誘導(dǎo)后用于制備該DNA聚合酶；
[0016](4)利用凝膠介質(zhì)，例如鎳和肝素層析柱依次純化該DNA聚合酶。
[0017]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種前述的DNA聚合酶在核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種PCR擴(kuò)增試劑盒，其包含有前述的DNA聚合酶。
[0019]另外，本發(fā)明還提供一種含有前述的DNA聚合酶的PCR反應(yīng)體系，具體包括有:
[0020](I)反應(yīng)的緩沖環(huán)境，包含 Tris-HCl，pH7.4-8.8;
[0021](2)反應(yīng)體系中的K+離子濃度:l_30mMKCl ；
[0022](3)反應(yīng)體系中的 NH4+ 離子濃度:0.5-14mM (NH4) 2S04 ；
[0023](4)反應(yīng)體系中的Mg2+離子濃度:1.5-8.5mM MgCl2。
[0024]本發(fā)明人經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)，從某些細(xì)菌中尤其是本發(fā)明所述嗜熱細(xì)菌中分離得到的能夠編碼DNA聚合酶的cDNA，核苷酸序列如序列表SEQ IDN0.1所示，其編碼獲得的DNA聚合酶，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，其在PCR反應(yīng)中具有較高的保真能力、較高的擴(kuò)增效率以及耐高溫性能。
[0025]本發(fā)明所述嗜熱細(xì)菌是指Thermococcus gammato Ierans,該細(xì)菌購自日本微生物菌種保藏中心(保藏編號:JCM: 11827)，其原始來源是從墨西哥瓜伊馬斯(27° 01' N, 111° 24' W)超高溫?zé)焽柚蟹蛛x得到的古細(xì)菌，其最適生長溫度為88°C，最適pH為6.0。菌株的分離地具有高于地表數(shù)百倍的放射性，因此菌株能耐受高達(dá)30kG Y的Y 射線(Edmond Jolivet 等，IJSEM，2003，53 (3):847_851)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1示DNA聚合酶Tga純化產(chǎn)物SDS-PAGE檢測結(jié)果。泳道I為處理后上清；泳道2為鎳柱流穿產(chǎn)物；泳道3為肝素柱以含200mM NaCl洗脫產(chǎn)物；泳道4為肝素柱以含400mMNaCl洗脫產(chǎn)物。
[0027]圖2不DNA聚合酶Tga擴(kuò)增高GC復(fù)雜模板的應(yīng)用。擴(kuò)增Thermus thermophilusHB8GC含量為72.3%的1.5kb片段和GC含量71%的2kb片段。泳道I和7為Tga擴(kuò)增1.5kb結(jié)果，2和8為Taq擴(kuò)增1.5kb結(jié)果，3和9為Pfu擴(kuò)增1.5kb結(jié)果；4和10為Tga擴(kuò)增2kb結(jié)果，5和11為Taq擴(kuò)增2kb結(jié)果，6和12為Pfu擴(kuò)增2kb結(jié)果。
[0028]圖3示DNA聚合酶Tga保真性。以藍(lán)白斑方式測試不同DNA聚合酶保真性。
[0029]圖4示DNA聚合酶Tga在快速PCR擴(kuò)增中的應(yīng)用。測試不同DNA聚合酶的延伸速度，以程序 98°C 2min, (98°C 10s, 68°C 5s、30s、lmin) 30Cycles 擴(kuò)增 ADNA5kb 片段。泳道
1、5、9為Taq DNA聚合酶不同延伸時(shí)間擴(kuò)增，2、6、10為Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增，3、7、11為KODDNA聚合酶擴(kuò)增，4、8、12為Tga DNA聚合酶擴(kuò)增。
【具體實(shí)施方式】
[0030]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0031]實(shí)施例1.Thermococcus gammatolerans DNA聚合酶基因的克隆與表達(dá)
[0032]菌種購買于日本微生物菌種保藏中心(保藏編號JCM11827)，將購買的菌種以 12000rpm 離心 5min,棄上清；細(xì)胞沉淀參照 Wizard* Genomic DNAPurificationkit (Promega公司)提取基因組DNA,簡要步驟如下:細(xì)胞沉淀以600 μ L NucleiLysis Solution重懸，80°C水浴5min裂解細(xì)胞；冷卻至室溫后，加入200μ L ProteinPreciptitation Solution,震蕩混勻，冰浴5min ;12000rpm離心5min ;吸取上清至另一個(gè)干凈的離心管，加入600 μ L異丙醇，混勻后冰浴IOmin ;12000rpm離心5min ;核酸沉淀以700 μ L70%乙醇洗漆兩次，12000rpm離心5min后,棄上清,室溫干燥核酸沉淀IOmin至無酒精味，加入50 μ L TE溶解。
[0033]根據(jù)Thermococcus gammato lerans DNA聚合酶基因序列，設(shè)計(jì)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物:TgaF:gtaGGATCCatgattctggataccgattacataaccgaaaacg, TgaR: gtaGTCGACtcatttcttgcctttcactttcagccacgcgcc0 下劃線部分 GGATCC 代表 BamHI酶切位點(diǎn)，GTCGAC代表Sal I酶切位點(diǎn)。按以下體系配制PCR反應(yīng)液，50 μ L體系中包含:基因組 DNA50ng，引物 TgaF400nM, TgaR400nM, dNTPs200 μ Μ, 5 x PrimeSTAR*' Buffer(Mg2+Plus) 10 μ L, PrinieSTAR11: HS0.5 μ L (寶生物公司)。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?98°C 2min，(94°C IOs ；55°C 20s ；68°C 2.5min)30cycles，68°C延伸 5min。PCR產(chǎn)物電泳并回收約 2.5kb條帶，以BamH I和Sal I酶切，連接至同樣酶切的含T7啟動(dòng)子載體中，轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。
[0034]通過菌液PCR和酶切鑒定，得到的陽性質(zhì)粒測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌Rosetta (DE3)細(xì)胞中。挑取單菌落培養(yǎng)至OD6tltl=0.4，加入0.1mM IPTG誘導(dǎo)4h，收集菌體超聲波破碎，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。
[0035]實(shí)施例2.DNA聚合酶Tga的純化
[0036] 將能正確表達(dá)DNA聚合酶Tga的菌種按1:100接種至500mL含200mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，加入終濃度30mg/L的卡那霉素和34mg/L氯霉素，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl=0.4，加入終濃度為0.1mM的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，于30°C誘導(dǎo)4h ;收集誘導(dǎo)后菌液，12000rpm 離心 2min,棄上清，細(xì)胞用 20mL buffer A (20mM Tris-HCl (pH7.8), 0.1MKCl, 50mM NaCl)加30mM咪唑重懸，于_80°C冰箱中凍存12h ;37°C溶解細(xì)胞，超聲波破碎后于70°C水浴鍋處理30min，12000rpm離心10min ;上清過鎳親和介質(zhì)(IDA，國家生化工程技術(shù)研究中心)，以含400mM咪唑的buffer A洗脫；洗脫液過肝素親和介質(zhì)(國家生化工程技術(shù)研究中心)，以含200mM、400mM、600mM、lM NaCl的bufferA洗脫；收集各蛋白峰經(jīng)SDS-PAGE檢測，含200mM NaCl的bufferA能洗脫部分目的蛋白，含400mM的buffer A大量洗脫目的蛋白，純度達(dá)到95%以上。將得到的產(chǎn)物透析至Storage buffer:20mM TrisHCl (ρΗ7.4)，0.1mM EDTA, 0.l%Tween20, 0.5%Nonidet P40, 0.1M KCl, 50% 甘油。[0037]實(shí)施例3.DNA聚合酶Tga反應(yīng)體系測試
[0038]實(shí)施例2中得到的酶以72°C 30min摻入的核苷酸量確定活性，稀釋為2.5u/ μ L，以熒光探針測試其3’-5’外切酶活性。以pUC19質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增約2.7kb片段確定DNA聚合酶Tga反應(yīng)的最適pH及K+、NH4+、Mg2+離子濃度。配制IOXbuffer B: 500mMTris-HCl (pH7.4~8.8)，15mMMgCl2。反應(yīng)體系為 20 μ L 含:10 X buffer B (pH7.4~8.8)2μ L,dNTPs(2.5mM) 1.6μ L,引物 PAs 及 PAa (10 μ Μ)各 0.5 μ L，Tga0.2 μ L，pUC19 (15ng/μ L)0.5μ L,按 94 °C 2min, (94°C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 2min40s) 25cycles,最后 72。。延伸5min,電泳檢測確定最適pH。同樣流程測試PCR體系終濃度為lmM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM KCl 的擴(kuò)增效果，含 0.5mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM、14mM(NH4)2SO4 的擴(kuò)增效果，含 1.5mM、2.5mM、3.5mM、4.5mM、5.5mM、6.5mM、7.5mM、8.5mMMgCl2 的擴(kuò)增效果。結(jié)果 DNA 聚合酶 Tga 的最適反應(yīng) buffer 為:10 Xbuffer C4:500mM Tris-HCl (pH8.4), 150mMKCl，5mM (NH4)2SO4, 15mM MgCl2。
[0039]實(shí)施例4.DNA聚合酶Tga保真性測試
[0040]以pUC19質(zhì)粒為模板，Taq DNA聚合酶(天根生化科技(北京)有限公司)、Pfu DNA聚合酶(天根生化科技(北京)有限公司)和Tga DNA聚合酶分別擴(kuò)增，得到的片段以相同量加Dpn I消化去除模板，Aat II酶切擴(kuò)增片段，自連后轉(zhuǎn)化DH5 α細(xì)胞，涂布于含100 μ g/11^氨芐青霉素、4(^8/1111^-6&1、24118/1^ IPTG的平板，37°C培養(yǎng)過夜計(jì)數(shù)藍(lán)白斑。按以下公式計(jì)算擴(kuò)增錯(cuò)誤率(Error rate, ER):ER=突變率/ (bpX擴(kuò)增倍數(shù))。計(jì)算結(jié)果，擴(kuò)增錯(cuò)誤率分別為:Taq DNA聚合酶1.40X 1(T5，Pfu DNA聚合酶4.13Χ 1(T6，Tga DNA聚合酶
4.26Χ 10_6，Tga與Pfu保真性能相當(dāng)，高于Taq DNA聚合酶3倍。
[0041 ] 實(shí)施例5.DNA聚合酶Tga擴(kuò)增高GC復(fù)雜模板和快速PCR的應(yīng)用
[0042]擴(kuò)增GC含量大于70%的復(fù)雜模板，結(jié)果Taq無法擴(kuò)增得到任何條帶；Pfu僅擴(kuò)增得到少量產(chǎn)物，且存在非特異擴(kuò)增現(xiàn)象；本發(fā)明的Tga DNA聚合酶能特異地?cái)U(kuò)增兩種模板，在復(fù)雜模板擴(kuò)增中有明顯優(yōu)勢。
[0043]以不同延伸時(shí)間測試Taq、Pfu、KOD-Plus-Neo (TOYOBO)、Tga DNA聚合酶擴(kuò)增ADNA5kb片段,設(shè)置兩步法5s、30s、lmin延伸，結(jié)果Imin延伸Tga DNA聚合酶能擴(kuò)增得到目的條帶，其余酶均無擴(kuò)增，說明本發(fā)明的TgaDNA聚合酶能簡化PCR反應(yīng)程序，縮短實(shí)驗(yàn)周期。
[0044]以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.從嗜熱細(xì)菌中分離出的編碼DNA聚合酶的DNA，其特征在于:其具有如下序列之一: (i)具有序列表中SEQID N0.1所示的核苷酸序列； (ii)在(i)限定的核苷酸序列中缺失、插入、替換一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
2.—種DNA聚合酶，其特征在于:其具有如下氨基酸序列: (i)具有序列表中SEQID N0.2所示的氨基酸序列； (ii)在(i)限定的氨基酸序列中缺失、插入、替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
3.包含權(quán)利要求1所述的DNA的表達(dá)載體。
4.制備權(quán)利要求2所述的DNA聚合酶的方法，其特征在于:包括用權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得DNA聚合酶。
5.權(quán)利要求2所述的DNA聚合酶在核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用。
6.一種PCR擴(kuò)增試劑盒，其特征在于包含有權(quán)利要求2所述的DNA聚合酶。
【文檔編號】C12N9/12GK103898131SQ201210590758
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月31日
【發(fā)明者】龍虎, 李春芳, 狄廷娣, 周裕程, 萬強(qiáng) 申請人:思洛生物技術(shù)股份有限公司