一種重組制癌肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組制癌肽的制備方法，根據(jù)腫瘤抑素的N-端74～98氨基酸功能肽(25個(gè)氨基酸)和185-191氨基酸功能肽(7個(gè)氨基酸)兩個(gè)功能區(qū)與人IgG3上游鉸鏈區(qū)的序列，進(jìn)行序列設(shè)計(jì)；根據(jù)所設(shè)計(jì)的序列，設(shè)計(jì)并合成引物F1、F2、R1，以F2為模板，R1為引物進(jìn)行延伸反應(yīng)；以延伸反應(yīng)產(chǎn)物為模板，F(xiàn)1、R1為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到大小為129bp的制癌肽基因OP。構(gòu)建制癌肽重組表達(dá)質(zhì)粒pET-SUMO-OP，將重組質(zhì)粒pET-SUMO-OP進(jìn)行原核表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定；純化重組融合蛋白，得到重組制癌肽，該肽具有靶向腫瘤干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞治療人惡性腫瘤作用。
【專利說明】—種重組制癌肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種重組制癌肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]最近有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞除了高致瘤性之外，具有很強(qiáng)的遷移能力，并涉及腫瘤轉(zhuǎn)移的形成。最初的微小轉(zhuǎn)移灶發(fā)生在血管周圍的微環(huán)境中，隨后，其生長(zhǎng)直至出現(xiàn)明顯的臨床癥狀需要多種復(fù)雜的腫瘤-間質(zhì)相互作用。整合蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的細(xì)胞表面受體，在包括信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞存活、增殖、遷移、血管形成和基因表達(dá)等很多生物行為中起重要作用。最近的研究表明，αν整合蛋白在CSCs中過表達(dá)。此外，與定型的起始前列腺癌祖細(xì)胞亞型相比，av整合蛋白在前列腺癌CSCs群中表達(dá)增高。給予人的a v-siRNA能夠顯著的抑制骨組織中前列腺癌移植瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡?？寡苌蓜鏙F-10-81，一種喜樹堿偶聯(lián)物，可以減少α V β 3和α V β 5在前列腺癌PC3細(xì)胞系中的表達(dá)，同時(shí)可以阻礙體內(nèi)腫瘤細(xì)胞在血管的粘附和血管生成?？傊种痞力驼系鞍椎墓δ苁且环N有希望的靶向CSCs治療惡性腫瘤的策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一種重組制癌肽的制備方法，旨在提供具有靶向腫瘤干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞治療人惡性腫瘤作用的制癌肽。
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種重組制癌肽的制備方法，該制備方法包括以下步驟:
[0005]步驟一，根據(jù)腫瘤抑素兩個(gè)功能區(qū)和IgG3上游鉸鏈區(qū)的序列，進(jìn)行序列設(shè)計(jì)；
[0006]步驟二，根據(jù)所設(shè)計(jì)的序列，設(shè)計(jì)并合成引物Fp F2, R1,以F2為模板，R1為引物進(jìn)行延伸反應(yīng)；
[0007]步驟三，以延伸反應(yīng)產(chǎn)物為模板，F(xiàn)。R1為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并進(jìn)行產(chǎn)物鑒定；
[0008]步驟四，回收PCR產(chǎn)物，構(gòu)建重組pET-SUMO-OP表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)重組pET_SUM0_0P表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列分析；
[0009]步驟五，將重組pET-SUMO-OP質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定；
[0010]步驟六，純化重組融合蛋白，并分析制癌肽空間構(gòu)象。
[0011]進(jìn)一步，在步驟一中，根據(jù)腫瘤抑素兩個(gè)功能區(qū)和IgG3上游鉸鏈區(qū)的序列，設(shè)計(jì)序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種重組制癌肽的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟: 步驟一，根據(jù)腫瘤抑素兩個(gè)功能區(qū)和IgG3上游鉸鏈區(qū)的序列，進(jìn)行序列設(shè)計(jì)； 步驟二，根據(jù)所設(shè)計(jì)的序列，設(shè)計(jì)并合成引物Fp F2, R1,以F2為模板，R1為引物進(jìn)行延伸反應(yīng)； 步驟三，以延伸反應(yīng)產(chǎn)物為模板，F(xiàn)1, R1為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并進(jìn)行產(chǎn)物鑒定； 步驟四，回收PCR產(chǎn)物，構(gòu)建重組pET-SUMO-OP表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)重組pET-SUM0_0P表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列分析； 步驟五，將重組pET-SUMO-OP質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定； 步驟六，純化重組融合蛋白，并分析制癌肽空間構(gòu)象。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟一中，根據(jù)腫瘤抑素兩個(gè)功能區(qū)和IgG3上游鉸鏈區(qū)的序列，設(shè)計(jì)序列。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟二中，根據(jù)所設(shè)計(jì)的序列，設(shè)計(jì)并合成的三條引物。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟二中，以F2為模板，R1為引物進(jìn)行延伸反應(yīng)的具體 過程為: 在無菌 PCR 管中加入以下試劑:5 μ L F2(10ymol/L),5yL R1 (10 μ mol/L)、16 μ LdNTP(10mmol/L)、10μ L 10 X 連接緩沖液、63 μ L H2O0 94°C孵育 30s，55°C溫浴 lOmin，離心5s，加入 IyL Taq 酶，72°C 孵育 5min。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟三中，以延伸產(chǎn)物為模板，F(xiàn)1,R1為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)的具體過程為: 在無菌PCR管中加入以下試劑:IyL延伸反應(yīng)液、2 yL F1 (10 μ mol/L)、2 μ LR1 (10 μ mol/L) U μ L dNTP (10mmol/L)、5μ L 10XPCR緩沖液、Taq酶0.2 μ L，最后加雙蒸水補(bǔ)足體積至 50 μ L。PCR 循環(huán)參數(shù)如下-MV 30s, 550C 30s, 72°C 30s, 35cycles, 72°C延伸IOrnin0 用無水乙醇沉淀DNA，12000rpmX IOmin離心，棄除上清液，再用70%乙醇洗滌2次，棄除殘余乙醇，TE緩沖液溶解。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟三中，產(chǎn)物鑒定的實(shí)現(xiàn)方法為: 稱取0.75g瓊脂糖，加入50mL I X TAE緩沖液； 微波爐加熱使瓊脂糖溶解，溶液冷卻至60°C，加入溴化乙錠至終濃度為0.5 μ g/mL ； 裝好電泳槽模具，將膠倒入其內(nèi)，迅速在模具一側(cè)安插梳子，等凝膠冷卻凝固； 小心取出梳子，將凝膠放置于電泳槽中； 加入電泳緩沖液至電泳槽中，讓液面離于膠面Imm ； 取IyL DNA樣品與適量Loading Buffer混勻后加入點(diǎn)樣孔中，接通電泳槽和電泳儀的電源，電壓調(diào)至94V ； 待指示劑遷移至2/3凝膠處，中止電泳； 將膠轉(zhuǎn)移至紫外線透射儀下觀察有條帶后，再放置在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。剩下DNA樣品送往上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，回收PCR產(chǎn)物的具體過程為: 灌制I %的普通瓊脂糖凝膠，在加樣孔下方2cm處切一個(gè)約1X0.Scm2的小孔，用相應(yīng)濃度的低熔點(diǎn)凝膠填充，16°C凝固； 在加樣孔中加入100 μ L PCR產(chǎn)物后電泳，待樣品進(jìn)入低熔點(diǎn)凝膠中，在310nm的紫外燈下切取目的條帶，放入到1.5mL Ep管中稱重，按試劑盒說明回收目的DNA; 加 30 μ L Elution Buffer 入回收柱中 37°C靜置 2min, 1000Orpm 離心 lmin, Ep 管中液體即為回收的DNA溶液。
8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟五中，將重組pET-SUMO-OP質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定的具體過程為: 1.用重組pET-SUMO-OP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，Kan篩選陽性克隆，挑取單個(gè)BL21 (DE3)陽性菌落，于20mL含50 μ g/mL Kan的LB培養(yǎng)基，37°C，180rpm過夜培養(yǎng)； 2.取200μ L過夜菌液轉(zhuǎn)移至20mL含Kan的LB培養(yǎng)基，37°C，200rpm,培養(yǎng)2h左右至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 3.加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為lmmol/L，28°C分別誘導(dǎo)2h、4h、6h、8h，各取1.5mL菌液，1000Orpm離心lmin,收集沉淀菌體； 4.各管加入50 μ L 2 X SDS-PAGE Loading Buffer 溶解沉淀； 5.然后100°C水浴中加熱5min，1000Orpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至另一Ep管中； 6.SDS-PAGE凝膠電泳: (1)準(zhǔn)備玻璃板，依次用水、10%SDS、H20、乙醇和水沖洗，干燥；
(2)配制5mL 由 1.6mL H 2OU.7mL 30 % 聚丙烯酰胺、pH8.81.5mmol/L Tris、0.05mL10% SDS、0.05mL 10%過硫酸胺溶液、0.002mL TEMED構(gòu)成12%分離膠溶液； (3)小心將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，輕輕在頂層加入水封閉； (4)凝膠聚合后，用去離子水洗凝膠上部數(shù)次，用吸水紙吸干凝膠頂端殘層液體； (5)配制5%成層膠3mL，注入分離膠上端，插入梳子小心避免氣泡，其中，5%成層膠由ddH20 2.lmL、30%聚丙烯酰胺 0.5mL、l.0mmoI/L ρΗ6.8 的 Tris0.38mLU0% SDS 0.03mL、10%過硫酸胺0.003mL構(gòu)成； (6)成層膠聚合后，用去離子水沖洗梳孔，將凝膠放入電泳槽上，上下槽均加入電泳緩沖液，上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔； (7).每個(gè)小孔中加入10μ L樣品上清液后，電壓60ν，電泳至濃縮和分離膠界面，120ν電泳至凝膠底端； (8).染色與脫色: 1)0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250溶解于IOOmL由甲醇:水:冰乙酸=45: 45: 10構(gòu)成的溶液中，過濾備用； 2)染色液浸泡凝膠，脫色搖床緩慢旋轉(zhuǎn)IOmin； 3)將凝膠用無染料的甲醇/冰乙酸溶液脫色，脫色搖床緩慢旋轉(zhuǎn)2h，中間換液3-4次； 4)將脫色后的凝膠于凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析。
9.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，純化重組融合蛋白的具體過程為: 將重組菌株菌液IOOmL誘導(dǎo)4h后,8000rpmX IOmin離心收集菌體,懸浮于ImL預(yù)冷的PBS溶液中，冰上超聲破碎細(xì)胞10 X 30s，離心取上清液，其中，PBS溶液由150mmol/L NaCl,16mmol/L Na2HPO4、4mmoI/L ρΗ7.4 的 NaH2PO4 構(gòu)成； 鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，柱床體積為5mL，用PBS平衡2_5個(gè)床體積，流速為2mL/min ；將IOOmL細(xì)胞破碎液的上清液0.45 μ m濾膜過濾，上樣，流速為lmL/min，用PBS再洗2-5個(gè)床體積,流速為2mL/min ； 用400mM咪唑的緩沖液3進(jìn)行洗脫，流速為2mL/min，收集過柱液，即為純化的目的蛋白溶液； 制癌肽氨基酸序列在蛋白質(zhì)序列分析網(wǎng)站通過GARNIER方法分別預(yù)測(cè)其α螺旋含量(Hh)、β折疊(Ee), β轉(zhuǎn)角(Tt)、無規(guī)則卷曲(Ce)的百分含量，結(jié)果如下:
10.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，該制備方法所獲得的重組制癌肽具有靶向腫瘤干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞治療人惡性腫瘤作用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103882026SQ201210591150
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月22日
【發(fā)明者】曹建國(guó), 全梅芳, 任凱群 申請(qǐng)人:湖南師范大學(xué)