專利名稱：基于納米顆粒和滾環(huán)擴(kuò)增的核酸定性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及利用在二氧化硅納米顆粒表面進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增前后顆粒的聚集形態(tài)變化，快速、簡(jiǎn)易地實(shí)現(xiàn)核酸分子定性檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification, RCA)是新近發(fā)展起來的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法。以環(huán)狀DNA為模板，通過一個(gè)短的DNA引物(與部分環(huán)狀模板互補(bǔ))，在特殊的DNA聚合酶(phi 29DNA聚合酶)催化下將dNTPs轉(zhuǎn)變成單鏈DNA。其線性擴(kuò)增倍數(shù)為105，指數(shù)化擴(kuò)增能力大于109，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的信號(hào)放大，靈敏度達(dá)到一個(gè)拷貝的核酸分 子，在核酸檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。比如Juan Hu等人(Juan Hu, Chun-yangZhang ；Sensitive detection of nucleic acids with rolling circleamplification andsurface-enhanced raman scattering spectroscopy ;Anal.Chem. 2010，82，8991-8997)利用RCA實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的核酸檢測(cè)，但是其中利用到了熒光探針來檢測(cè)，成本高，對(duì)儀器設(shè)備的要求較高。納米顆粒是一種人工合成的微小顆粒，它的形態(tài)可能是乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒。1996年，Mirkin等人(Mirkin, C. A. , et al ；)發(fā)現(xiàn)表面修飾有核酸探針的13nm金顆粒溶液中加入與修飾核酸互補(bǔ)配對(duì)的目標(biāo)核酸分子時(shí)，由于金顆粒的聚集溶液的顏色會(huì)由紅變藍(lán)。自此利用納米顆粒來進(jìn)行生物分子檢測(cè)的研究廣泛開展開來。目前通用的方法主要分為兩種，一種是利用在金或銀納米顆粒修飾核酸探針，根據(jù)溶液的顏色變化來檢測(cè)目標(biāo)核酸分子，優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，但是所用的納米顆粒成本較高；另一種是利用在顆粒表面修飾核酸分子，通過不同的核酸擴(kuò)增手段后加入熒光探針來進(jìn)行目標(biāo)分子檢測(cè)，優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)的靈敏度相對(duì)更好，但是熒光探針的成本也較高。且這些檢測(cè)方法都著眼于定量的檢測(cè)，而臨床上很多疾病的檢測(cè)只需要判斷有或無即可，不需要進(jìn)行定量的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述問題，提供一種在二氧化硅納米顆粒表面進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以實(shí)現(xiàn)核酸分子快速、高靈敏度的定性檢測(cè)方法。本發(fā)明所述的基于滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)目標(biāo)核酸的方法，其特征在于利用滾環(huán)擴(kuò)增之前二氧化硅納米顆粒在溶液中呈自由分散狀態(tài)，加入目標(biāo)核酸分子滾環(huán)擴(kuò)增之后溶液中的二氧化硅納米顆粒聚集成肉眼可分辨的白色團(tuán)塊狀物的現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸分子的快速、高靈敏度的定性檢測(cè)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的檢測(cè)方法包括以下步驟I)將待測(cè)目標(biāo)核酸分子的捕獲探針修飾到二氧化硅納米顆粒表面；2)加入引物探針、BSA、DNA連接酶及目標(biāo)核酸分子與捕獲探針雜交；3)加入環(huán)狀DNA、BSA、聚合酶及擴(kuò)增原料進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增；
4)當(dāng)ニ氧化硅納米顆粒的聚集狀態(tài)由自由分散狀態(tài)變?yōu)榘咨珗F(tuán)塊狀物時(shí)，則判定目標(biāo)核酸分子存在。步驟I)中，所述目標(biāo)核酸分子為單鏈DNA或RNA。步驟I)中，所述ニ氧化硅納米顆粒，大小為540nm ;其表面帶有鏈激酶親和素修飾。步驟I)中，所述捕獲探針為一段單鏈DNA片段，其5’端帶有連接分子修飾，其中所述連接分子為生物素，通過與鏈激酶親和素結(jié)合，將捕獲探針修飾到顆粒的表面；所述捕獲探針與目標(biāo)核酸分子的5’末端一段序列互補(bǔ)配對(duì)。步驟2)中，所述引物探針為一段單鏈DNA，其5’端帶有磷酸基團(tuán)修飾。 進(jìn)ー步地，所述的引物探針的5’末端序列與目標(biāo)核酸分子的3’末端的一段堿基互補(bǔ)配對(duì)。進(jìn)ー步地，所述的引物探針的3’末端序列與環(huán)狀DNA的一段堿基互補(bǔ)配對(duì)，作為滾環(huán)擴(kuò)增的引物。步驟2)中，所述的DNA連接酶包括T4DNA連接酶。步驟3)中，所述的環(huán)狀DNA為單鏈環(huán)狀DNA，為滾環(huán)擴(kuò)增的模板。步驟3)中，所述的DNA聚合酶為等溫聚合酶，包括Phi 29DNA聚合酶，RNA聚合酶。步驟3)中，所述的核酸擴(kuò)增原料，當(dāng)檢測(cè)目標(biāo)核酸分子為單鏈DNA時(shí)為四種脫氧核糖核苷酸，當(dāng)檢測(cè)目標(biāo)核酸分子為RNA時(shí)為四種核糖核苷酸。本發(fā)明利用滾環(huán)擴(kuò)增前后顆粒聚集狀態(tài)的改變來判斷目標(biāo)核酸分子的有無，提供了ー種簡(jiǎn)易、快速、高靈敏的核酸分子定性檢測(cè)方法，其有益效果如下a)滾環(huán)擴(kuò)增前后顆粒聚集狀態(tài)的改變通過肉眼即可明顯觀察到，無需專門的檢測(cè)儀器，降低檢測(cè)的成本，適合臨床檢測(cè)的推廣；b)利用了滾環(huán)擴(kuò)增的高效性，能實(shí)現(xiàn)快速、高靈敏度的定性檢測(cè)；c)檢測(cè)的步驟較少，所涉及的實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單；d)檢測(cè)體系所用的物質(zhì)均是商品化的產(chǎn)品，可以很容易在市場(chǎng)上買到或合成，適于大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1為利用滾環(huán)擴(kuò)增前后顆粒聚集狀態(tài)不同實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)的原理圖(其中，I ニ氧化硅顆粒；2.鏈激酶親和素；3.親和素；4.捕獲探針；5.引物探針；6.目標(biāo)核酸分子；7.捕獲探針和引物探針連接產(chǎn)物；8.環(huán)狀DNA;9.滾環(huán)擴(kuò)增后的長(zhǎng)鏈DNA; 10.滾環(huán)擴(kuò)增后形成的顆粒團(tuán)聚物)。圖2為目標(biāo)DNA濃度分別為lfM，IOfM, IOOfM, IOOOfM滾環(huán)擴(kuò)增前顆粒聚集狀態(tài)的實(shí)物圖。圖3為目標(biāo)DNA濃度分別為lfM，IOfM, IOOfM, IOOOfM滾環(huán)擴(kuò)增后顆粒聚集狀態(tài)的實(shí)物圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)ー步闡述在納米顆粒表面進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增對(duì)核酸分子進(jìn)行定性檢測(cè)的方法。1.檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)與合成
權(quán)利要求
1.一種基于滾環(huán)擴(kuò)增的核酸定性檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將待測(cè)目標(biāo)核酸分子的捕獲探針修飾到二氧化硅納米顆粒表面； 2)加入引物探針、BSA、DNA連接酶及目標(biāo)核酸分子與捕獲探針雜交； 3)加入環(huán)狀DNA、BSA、聚合酶及擴(kuò)增原料進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增； 4)當(dāng)二氧化硅納米顆粒的聚集狀態(tài)由自由分散狀態(tài)變?yōu)榘咨珗F(tuán)塊狀物時(shí)，則判定目標(biāo)核酸分子存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述目標(biāo)核酸分子為單鏈DNA或RNA。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述二氧化硅納米顆粒，直徑為540nm,其表面帶有鏈激酶親和素分子修飾。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述捕獲探針為一段單鏈DNA片段，其5’端帶有連接分子修飾。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述捕獲探針的3’末端堿基與目標(biāo)核酸分子的5’末端堿基互補(bǔ)。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述連接分子為生物素，通過與鏈激酶親和素結(jié)合，將捕獲探針修飾到顆粒的表面。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的引物探針為一段單鏈DNA，其5’端帶有磷酸基團(tuán)修飾。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的引物探針5’末端序列與目標(biāo)核酸分子的3’末端的一段堿基互補(bǔ)配對(duì)，其3’末端序列與環(huán)狀DNA的一段堿基互補(bǔ)配對(duì)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的DNA連接酶包括T4DNA連接酶。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述的環(huán)狀DNA為單鏈環(huán)狀DNA，為滾環(huán)擴(kuò)增的模板。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述的聚合酶為等溫聚合酶，包括Phi 29DNA聚合酶，RNA聚合酶。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述的核酸擴(kuò)增原料，當(dāng)檢測(cè)目標(biāo)核酸分子為單鏈DNA時(shí)為四種脫氧核糖核苷酸，當(dāng)檢測(cè)目標(biāo)核酸分子為RNA時(shí)為四種核糖核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于納米顆粒和滾環(huán)擴(kuò)增的核酸定性檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法主要利用滾環(huán)擴(kuò)增之前，二氧化硅納米顆粒在溶液中呈分散狀態(tài)，當(dāng)存在目標(biāo)核酸分子時(shí)，滾環(huán)擴(kuò)增發(fā)生，二氧化硅納米顆粒聚集在一起，在溶液中形成肉眼可見的白色團(tuán)塊狀物質(zhì)，以達(dá)到定性檢測(cè)目標(biāo)核酸分子的目的。該方法通過滾環(huán)擴(kuò)增前后二氧化硅納米顆粒的聚集狀態(tài)即可判斷目標(biāo)核酸分子的有無，既實(shí)現(xiàn)了對(duì)微量核酸分子的大量擴(kuò)增，又實(shí)現(xiàn)了結(jié)果的快速直觀檢測(cè)，無需專門的檢測(cè)儀器，降低檢測(cè)的成本，適合臨床檢測(cè)的推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103014169SQ20121059133
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者桑建明, 王瑋 申請(qǐng)人:北京大學(xué)