專利名稱：一種以蘄蛇為原料提?、蛐湍z原蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以蘄蛇為原料提取II型膠原蛋白的方法。
背景技術(shù)：
II型膠原(collagen type II, C II )是軟骨基質(zhì)的主要有機成分,是關(guān)節(jié)軟骨中主要細胞外間質(zhì)之一。近年來研究表明，類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與C II自身免疫反應(yīng)有關(guān)[Deyl Z, Miksik I, Eckhardt A.Preparative procedures and purity assessment ofcollagen proteins [J].Chromatography B, 2003, 79(12): 245-275.Smolen JS, HayerS, Schett G, et al.Tmmunosenescence autoimmunity and Rheumatoid Arthritis[J].Autoimmunity and rheumatoid arthritis, 2004, 31 (1): 23-25.],用 C II 免疫某些動物可誘導(dǎo)出實驗性關(guān)節(jié)炎[Sweeney SE, Firestein GS.Rheumatoid arthritis:regulation of synovial inflammation [J].1ntern J Biochemical Cell Bio, 2004,36(3): 372-378.]，口服C II誘導(dǎo)免疫耐受對類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)有顯著的療效[盧延旭，陳敏珠.可溶性雞II型膠原對關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫治療作用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9 (2): 180-183.]。因此，C II的提取純化與鑒定的研究具有較大的價值，獲得純化的C II是進行相關(guān)研究的關(guān)鍵。雖然C II在人體含量較多，但臨床取材可獲得的數(shù)量有限；C II與蛋白多糖形成緊密的結(jié)合，難以用單純的化學(xué)方法提取。目前所報道的方法，操作復(fù)雜，條件不一，結(jié)果存在差別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種以蘄蛇為原料提取II型膠原蛋白的方法。本發(fā)明采用的技術(shù) 方案是:一種以蘄蛇為原料提取II型膠原蛋白的方法，所述方法包括:(I)蘄蛇粉末用鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液混懸，4 6°C攪拌24 30h，離心，去上清，沉淀用4(T60 mM Tris-HCl溶液洗滌除去鹽酸胍；所述鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液中鹽酸胍濃度為4 5M，Tris-HCl濃度為40 60 mM ；(2)步驟(I)所得沉淀用0.5^1 M乙酸水溶液重懸，以6(Γ80%甲酸水溶液調(diào)節(jié)pH值為2 3，加入足量胃蛋白酶，4 6°C攪拌48飛0h，離心，棄去沉淀；(3)步驟(2)得到上清液滴加5 6M NaCl溶液至NaCl濃度為0.8 0.9 M，4 6°C靜置12 24h，離心，去除上清液；(4)步驟(3)得到沉淀用足量0.05、.2 M乙酸溶解，轉(zhuǎn)入截留分子量50000道爾頓的透析袋中、用2(T30 mM Na2HPO4充分透析，所得沉淀再用足量0.05、.2M乙酸溶解，轉(zhuǎn)入截留分子量10000道爾頓的透析袋中、用0.05、.2M乙酸溶液充分透析，所得液體真空干燥，得到所述II型膠原蛋白的粉末。蘄蛇為蜂科動物五步蛇Agkistrodon acutus (Giienther)的干燥體。性味甘、咸，溫；有毒。歸經(jīng)歸肝經(jīng)。功能主治祛風，通絡(luò)，止痙。用于風濕頑痹，麻木拘攣，中風口眼歪斜，半身不遂，抽搐痙攣，破傷風，麻風疥癬。臨床發(fā)現(xiàn)，蘄蛇是臨床治療風濕痹證的要藥，對RA有明顯的治療作用[國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部[M],北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:349.]，實驗研究表明蘄蛇及II型膠原蛋白對RA都具有一定的治療作用[Kyung-Su Park, Min-Jung Park, M1-La Cho, et al.Type IIcollagen oral tolerance; mechanism and role in collagen-1nduced arthritis andrheumatoid arthritis [J].Modern Rheumatology, 2009，6 (19): 581-589.]。本發(fā)明選擇蘄蛇為原料，用鹽酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化鈉鹽析和透析處理等步驟，制備出高純度(純度96.93%)的II型膠原蛋白，采用SDS-PAGE、紫外全波長掃描、HPLC和質(zhì)譜對其進行了純度分析和鑒定。所述蘄蛇粉末粒徑不大于2_。步驟(2 )中胃蛋白酶加入量為300 800 U/g蘄蛇粉末。步驟(I)中所述蘄蛇粉末與鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液用量之比為IOOg:1000 5000mL。步驟(2)中步驟(I)所得沉淀與乙酸水溶液用量之比為100g:100(T3000mL。具體的，所述方法如下:(I)蘄蛇粉碎至粒徑為2mm，粉末用鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液混懸，4°C攪拌24h，4°C、14000Xg離心lh，去上清，沉淀用50 mM Tris-HCl溶液洗滌除去鹽酸胍；所述鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液中鹽酸胍濃度為4M，Tris-HCl濃度為50 mM, pH7.5 ；(2)步驟(I)所得沉淀用0.5 M乙酸水溶液重懸，以70%甲酸水溶液調(diào)節(jié)pH值為2.8，加入胃蛋白酶，4°〇攪拌4811，41:、1400(^8離心111，棄去沉淀；所述胃蛋白酶加入量為300^800 U/g蘄蛇粉末；

(3)步驟(2)得到上清液滴加5M NaCl溶液至NaCl濃度為0.8 0.9 M，46°C靜置12h，4°C、14000Xg離心lh，去除上清液；(4)步驟(3)得到沉淀用0.1 M乙酸溶解，轉(zhuǎn)入截留分子量50000道爾頓的透析袋中、用20 mM Na2HPO4于4°C下充分透析，所得沉淀再用0.1M乙酸溶解，轉(zhuǎn)入截留分子量10000道爾頓的透析袋中、用0.1M乙酸溶液于4°C下充分透析，所得液體真空干燥，得到所述II型膠原蛋白的粉末。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明方法操作簡單，制得II型膠原蛋白純度高。


圖1為本發(fā)明方法流程圖；圖2為靳蛇II型父原蛋白成品照片；圖3為II型膠原蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖；圖4為蘄蛇II型膠原蛋白HPLC分析圖；圖5為蘄蛇與牛II型膠原蛋白質(zhì)紫外全波長掃波圖譜；圖6為蘄蛇與牛II型膠原蛋白質(zhì)譜圖；上圖為蘄蛇II型膠原蛋白，下圖為牛II型膠原蛋白。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:實施例1:方法如下:1、將蘄蛇(購自黃山市蛇類科學(xué)研究所)粉碎成粒徑2 mm的粉末；2、將150克蘄蛇粉末置于2000 mL的4 M鹽酸胍-50 mM的Tris-HCl混合溶液(pH7.5)中混懸，溫度控制在4°C，攪拌24 h ；4°C, 14000Xg離心I h，去上清液，沉淀用50mM的Tris-HCl溶液洗去鹽酸胍，4°C，14000 X g離心I h，去上清液；3、上步得到的沉淀用20倍沉淀體積的0.5 M乙酸重懸，并用70%的甲酸調(diào)節(jié)pH至
2.8，向混懸液中加入5g胃蛋白酶(購自無錫中天食品添加劑有限公司，單位酶活15000U/g)，4°C輕輕攪拌48 h ； 4、離心去除沉淀:4°C，14000Xg，離心I h，棄去沉淀(如果離心后由于粘稠度過高，分離不完全，可以用適量0.5 M乙酸稀釋后重新離心)；5、沉淀C II:向上一步得到的上清液中緩慢滴加5 M的NaCl，致使其終濃度為0.89M，然后4°C靜置12 h，以充分沉淀C II ;然后4°C，14000Xg，離心I h，去除上清，得到沉淀的 C II ;6、將上一步得到的沉淀用100 mL的0.1 M乙酸4°C攪拌12 h，使其充分溶解；然后轉(zhuǎn)入透析袋中(MWC0=50，000)，20 mM Na2HPO4溶液(pH 9.4) 4°C反復(fù)透析多次，透析袋中II型膠原蛋白形成沉淀。7、將上步獲得的II型膠原蛋白沉淀用100 mL 0.1 M乙酸溶解，然后轉(zhuǎn)入透析袋中(MWCO=IO, 000)，用0.1 M乙酸，4°C充分透析以除去鹽離子；8、冷凍干燥:將透析后的液體低溫冷凍真空干燥，得到蘄蛇II型膠原蛋白凍干粉(圖 2)。所得蘄蛇II型膠原蛋白與牛II型膠原蛋白作對照進行SDS-PAGE電泳觀察分子量與純度，結(jié)果見圖3。顯示本發(fā)明所提取蘄蛇II型膠原蛋白純度較高(經(jīng)HPLC方法測得純度96.93%)，分子量大約為130KD。所得蘄蛇II型膠原蛋白采用HPLC方法經(jīng)峰歸一化法檢測純度，按以下色譜條件進行:BioS 印-SEC-S2000 (7.8 mmX300 mm, 5 μ m)色譜柱，流動相為 0.15 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖液化訴4.7)，流速1.0 ml/min，UV檢測波長210 nm，柱溫為室溫。結(jié)果見圖4，經(jīng)本方法檢測蘄蛇II型膠原蛋白純度較高(為96.93%)。所得蘄蛇II型膠原蛋白與牛II型膠原蛋白作對照進行全波長掃描，結(jié)果見圖5。顯示蘄蛇II型膠原蛋白與牛II型膠原蛋白紫外吸收圖譜相近，最大吸收波長均為223 nm。所得蘄蛇II型膠原蛋白與牛II型膠原蛋白作對照進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析，結(jié)果見圖
6。肽段質(zhì)譜圖顯示蘄蛇II型膠原蛋白與牛II型膠原蛋白相比具有相似肽段，具有II型膠原蛋白結(jié)構(gòu)特征。
權(quán)利要求
1.一種以蘄蛇為原料提取II型膠原蛋白的方法，所述方法包括: (1)蘄蛇粉末用鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液混懸，4 6°C攪拌24 30h，離心，去上清，沉淀用40-60 mM Tris-HCl溶液洗滌除去鹽酸胍；所述鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液中鹽酸胍濃度為4 5M，Tris-HCl濃度為40 60 mM ； (2)步驟(I)所得沉淀用0.5^1 M乙酸水溶液重懸，以60-80%甲酸水溶液調(diào)節(jié)pH值為2 3，加入足量胃蛋白酶，4 6°C攪拌48-60h，離心，棄去沉淀； (3)步驟(2)得到上清液滴加5 6MNaCl溶液至NaCl濃度為0.8 0.9 M，4 6°C靜置12 24h，離心，去除上清液； (4)步驟(3)得到沉淀用足量0.05、.2 M乙酸溶解，轉(zhuǎn)入截留分子量50000道爾頓的透析袋中、用20-30 mM Na2HPO4充分透析，所得沉淀再用足量0.05-0.2M乙酸溶解，轉(zhuǎn)入截留分子量10000道爾頓的透析袋中、用0.05-0.2M乙酸溶液充分透析，所得液體真空干燥，得到所述II型膠原蛋白的粉末。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述蘄蛇粉末粒徑不大于2mm。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中胃蛋白酶加入量為300-800U/g蘄蛇粉末。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述蘄蛇粉末與鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液用量之比為1OOg:1000-5000mL。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中步驟(I)所得沉淀與乙酸水溶液用量之比為 100g:1000-3000mL。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下: Cl)蘄蛇粉碎至粒徑為2mm，粉末用鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液混懸，4°C攪拌24h，4°C、14000Xg離心lh，去上清，沉淀用50 mM Tris-HCl溶液洗滌除去鹽酸胍；所述鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液中鹽酸胍濃度為4M，Tris-HCl濃度為50 mM, pH7.5 ； (2)步驟(I)所得沉淀用0.5 M乙酸水溶液重懸，以70%甲酸水溶液調(diào)節(jié)pH值為2.8，加入胃蛋白酶，4°C攪拌48h，4°C、14000Xg離心lh，棄去沉淀；所述胃蛋白酶加入量為300^800 U/g蘄蛇粉末； (3)步驟(2)得到上清液滴加5MNaCl溶液至NaCl濃度為0.8 0.9 M，46°C靜置12h，4°C、14000 Xg離心lh，去除上清液； (4)步驟(3)得到沉淀用0.1 M乙酸溶解，轉(zhuǎn)入截留分子量50000道爾頓的透析袋中、用20 mM Na2HPO4于4°C下充分透析，所得沉淀再用0.1M乙酸溶解，轉(zhuǎn)入截留分子量10000道爾頓的透析袋中、用0.1M乙酸溶液于4°C下充分透析，所得液體真空干燥，得到所述II型膠原蛋白的粉末。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以蘄蛇為原料提?、蛐湍z原蛋白的方法。所述方法包括將蘄蛇粉末用鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液除去蛋白多糖；除去多糖后收集沉淀，用乙酸溶液溶解沉淀；溶液采用胃蛋白酶酶解釋放Ⅱ型膠原蛋白；酶解液離心后取上清進行鹽析充分沉淀Ⅱ型膠原蛋白；離心收集沉淀Ⅱ型膠原蛋白離心并用乙酸再次溶解，溶解液透析除胃蛋白酶和其他雜蛋白；透析袋中Ⅱ型膠原蛋白再次使用乙酸溶解并透析除去鹽離子；將透析后的袋內(nèi)液體低溫冷凍真空干燥，得到蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明方法操作簡單，制得Ⅱ型膠原蛋白純度高。
文檔編號C12P21/06GK103088096SQ20121059158
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者丁興紅, 谷恒存, 丁志山, 蔣福升, 范永升 申請人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)