專利名稱：一種四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物原生質(zhì)體制備與再生方法，具體地說是一種四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備與再生的方法。
背景技術(shù)：
四環(huán)素(Tetracycline，TC)是一種抑制細菌蛋白質(zhì)合成的廣譜抗生素，因其分子結(jié)構(gòu)含四并苯基本骨架而得名，主要用于各種革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陽性桿菌的感染治療，在醫(yī)藥、畜牧和農(nóng)業(yè)方面均有廣泛的用途。我國從20世紀60年代開始工業(yè)化生產(chǎn)四環(huán)素，至今已有五十多年的歷史。四環(huán)素產(chǎn)生菌為放線菌中的鏈霉菌屬(Str印tomyces)，目前，其優(yōu)良菌種的選育主要采用傳統(tǒng)的育種方法，菌種經(jīng)過長期的人工誘變育種和自然分離，已形成較高的生產(chǎn)能力。但是菌種經(jīng)過多種物理和化學(xué)因子誘發(fā)突變之后，不僅遺傳背景變得相當復(fù)雜，而且對誘變劑的耐受性也大大的增強了，因此，利用傳統(tǒng)的育種方法繼續(xù)提高四環(huán)素的產(chǎn)量已經(jīng)越來越困難，菌種誘變率低、選育效果差是困擾四環(huán)素菌種選育工作的主要問題。原生質(zhì)體融合技術(shù)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種新的遺傳育種手段，該育種技術(shù)的優(yōu)點是去除了細胞壁的障礙，采用物理因子或化學(xué)因子對原生質(zhì)體進行誘變處理，能夠提高原生質(zhì)體的突變頻率，在再生菌落中篩選突變株，可以有效提高優(yōu)良菌種的選育效率，利用原生質(zhì)體技術(shù)來培育工業(yè)新菌株已受到國內(nèi)外微生物育種工作者的普遍重視。在探索四環(huán)素原生質(zhì)體育種技術(shù)的過程中，存在的最大問題是沒有關(guān)于四環(huán)類抗生素原生質(zhì)體制備和再生的方法可以借鑒，原生質(zhì)體制備成功后細胞壁的重建過程非常困難，或者是無法產(chǎn)生原生質(zhì)體的再生菌落，或者是只生長基內(nèi)菌絲和極少量氣生菌絲，不能產(chǎn)生孢子絲，造成菌落不能進行正常的傳代。由此極大地限制了原生質(zhì)技術(shù)在四環(huán)素菌種選育工作中的應(yīng)用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備、再生方法，以解決現(xiàn)有傳統(tǒng)育種技術(shù)中存在的菌種誘變率低及選育效果差的問題。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明所提供的四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備與再生的方法，它包括如下步驟a、制備四環(huán)素斜面培養(yǎng)基稱取小麥麩皮3. 0-3. 5g，硫酸鎂0. 004-0. 006g，磷酸氫二鉀0. 01-0. 12g，磷酸氫二銨0. 013-0. 015g,瓊脂粉1. 3-1. 5g，加蒸餾水至IOOml ；120-124°C條件下濕熱滅菌30分鐘。斜面培養(yǎng)基裝量60ml/茄子瓶。b、制備孢子懸浮液將四環(huán)素產(chǎn)生菌接種于斜面培養(yǎng)基上，于33_36°C條件下培養(yǎng)96小時左右，長出外觀質(zhì)量合格的斜面孢子。在無菌條件下加入無菌蒸餾水或菌絲體培養(yǎng)基制成孢子懸浮液，使孢子液濃度在IXlO8Ail以上。C、制備菌絲體培養(yǎng)基稱取葡萄糖0. 8-1. 2g,蛋白胨0. 3-0. 5g,酵母膏0. 3-0. 5g,磷酸二氫鉀o. 1-0. 2g，硫酸鎂0. 03-0. 05g,磷酸氫二鉀0. 3-0. 4g，甘氨酸0. 2_lg，加水至100ml ;120-124°C濕熱滅菌30分鐘。d、制備再生培養(yǎng)基稱取面粉2-4g，蛋白胨0.3-0. 5g，磷酸二氫鉀0.05-0. 10g，碳酸鈣0. 1-0. 4g，蔗糖o-llg,瓊脂1. 0-2. 5g，加水至100ml ；120-124°C °C濕熱滅菌30分鐘后制成平板培養(yǎng)基。e、培養(yǎng)菌絲體將四環(huán)素孢子懸浮液接種于c步所述菌絲體培養(yǎng)基中，27°C _33°C條件下，震蕩培養(yǎng)22-32小時，離心棄去上清液，得到菌絲體；f、酶解細胞壁將e步驟所得菌絲體中加入穩(wěn)定液，離心洗滌2-4次，加入溶菌酶溶液，使酶的作用濃度為2mg/ml-6mg/ml，30°C _37°C酶解1-3小時，得到酶解液；g、分離原生質(zhì)體酶解液經(jīng)離心先去除沉淀(離心時的優(yōu)選條件為500轉(zhuǎn)/分，2-4分鐘)。然后再將上清液離心(上清液離心的優(yōu)選條件為轉(zhuǎn)速3500-8000轉(zhuǎn)/分，時間10-15分鐘)，獲得原生質(zhì)體；·h、原生質(zhì)體再生將g步驟所得的原生質(zhì)體用穩(wěn)定液離心洗滌2-4次，加入一定量的穩(wěn)定液制成原生質(zhì)體懸浮液，血球計數(shù)板計數(shù)后，用穩(wěn)定液對原生質(zhì)體懸浮液進行梯度稀釋，采用夾層法培養(yǎng)于再生培養(yǎng)基上，33°C _36°C條件下培養(yǎng)5-7天后形成再生菌落。本發(fā)明所述四環(huán)素產(chǎn)生菌可選用菌種編號CPCC220020的菌種。本發(fā)明所述的穩(wěn)定液選擇高濃度蔗糖滲透液，其中蔗糖濃度以10-11%為宜。本發(fā)明b步驟所述的制備四環(huán)素孢子懸浮液的方法為將四環(huán)素產(chǎn)生菌接種于斜面培養(yǎng)基上，于33-36°C條件下培養(yǎng)96小時左右，長出外觀質(zhì)量合格的斜面孢子。在無菌條件下加入無菌蒸餾水或菌絲體培養(yǎng)基制成孢子懸浮液，孢子液濃度IXlOVml以上。為了更有利于原生質(zhì)體的形成，本發(fā)明將四環(huán)素孢子懸浮液接種于c步所述菌絲體培養(yǎng)基時，接種量不低于IO6個/ml。由于原生質(zhì)體對溶液和培養(yǎng)基的滲透壓很敏感，必須在高滲透壓或等滲透壓的環(huán)境下才能維持其生存。因此，本發(fā)明方法所述原生質(zhì)體再生工序中藥選用穩(wěn)定劑。其中以質(zhì)量比濃度為10-11%的蔗糖溶液為優(yōu)選穩(wěn)定劑，其作為原生質(zhì)體保護劑，可營造一個高滲的環(huán)境，然后加入溶菌酶溶液進行酶解，起到保護原生質(zhì)體免于膨脹破裂的作用。為了能夠提高菌種突變率，選育出更好的高產(chǎn)菌種，本發(fā)明對所制備原生質(zhì)體進行誘變處理。其優(yōu)選的處理方法包括有所述獲得的原生體，經(jīng)物理誘變劑紫外線進行誘變處理(紫外線照射時間30秒至120秒；照射距離33-66cm)；所述獲得的原生體,經(jīng)化學(xué)誘變劑乙烯亞胺(EI)在1000ug/ml條件下處理50-100分鐘。本發(fā)明提供了一種四環(huán)素菌種選育的新方法，解決了四環(huán)素原生質(zhì)體菌落無法再生和產(chǎn)孢子能力低、不能傳代的問題。該育種方法去除了菌體細胞壁的障礙，提高了菌種突變率，再生菌落能產(chǎn)生豐厚的孢子絲，適宜于接斜面?zhèn)鞔?，值得在四環(huán)素類抗生素菌種選育工作中進行推廣和應(yīng)用。本發(fā)明方法制備的原生質(zhì)體釋放量高達IO4個/ml，其再生率可達3%以上。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳述，但并不以此對本發(fā)明進行任何限制。下述實施例中的溶菌酶來源于AMRESC0公司，用穩(wěn)定液配制而成，酶溶解之后采用過濾方式除菌(0. 22um的水系針頭過濾器)，溶菌酶配制濃度是10%。下述實施例中的穩(wěn)定液為10. 3%的蔗糖溶液。實施例1a、菌絲體的培養(yǎng)將四環(huán)素產(chǎn)生菌(Streptomyces aureofaciens)斜面孢子制成孢子懸浮液,接種于菌絲體培養(yǎng)基中，接種量不低于IO6個/ml，30°C條件下震蕩培養(yǎng)26小時，獲得菌絲體培養(yǎng)液，顯微鏡鏡檢菌絲呈網(wǎng)狀，離心(3500轉(zhuǎn)/分，10分鐘)棄去上清液，獲得菌絲體。其中四環(huán)素斜面孢子的菌種來源于中國微生物菌種總目錄，菌株保藏編號CPCC220020。菌絲體培養(yǎng)基由蒸餾水配制而成，以IOOml菌絲體培養(yǎng)基總體積計，其含有以下組分葡萄糖lg，蛋白胨0. 4g，酵母膏0. 4g，磷酸氫二鉀0. 4g，磷酸二氫鉀0. 2g，硫酸鎂
0.058，甘氨酸化。滅菌條件121°C，30分鐘。b、原生質(zhì)體的制備將a步驟所得菌絲體用10. 3%蔗糖穩(wěn)定液離心(3500轉(zhuǎn)/分，10分鐘)洗滌3次，加入溶菌酶溶液，使反應(yīng)容器(試管)中溶菌酶的作用濃度為4mg/ml，置于35°C恒溫水浴箱中進行酶解，每10分鐘震蕩一次，酶解2小時，鏡檢原生質(zhì)體釋放量達IO6個/ml以上，將反應(yīng)容器(試管)從水浴箱中取出，終止酶解。酶解液經(jīng)離心(轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分，時間3分鐘)去除沉淀，上清液再進行離心(轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)/分，時間15分鐘)獲得原生質(zhì)體。C、將原生質(zhì)體用穩(wěn)定液離心洗滌3次(穩(wěn)定液加至離心管IOml處，3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘)，加入5ml穩(wěn)定液制成原生質(zhì)體懸浮液。d、原生質(zhì)體懸浮液用穩(wěn)定液進行稀釋，經(jīng)夾層法培養(yǎng)于再生培養(yǎng)基上，34_35°C培養(yǎng)5-6天，形成再生菌落，再生菌落直徑2-5mm，饅頭形或草帽型，外觀鼠灰色，孢子豐厚，孢子絲初旋至松敞螺旋形，孢子卵圓形，表面光滑，適于傳代。其中再生培養(yǎng)基由體積比為1:1的蒸餾水和飲用水配制而成，以IOOml再生培養(yǎng)基總體積計，其中含有以下組分面粉2g，蛋白胨0. 05g，磷酸二氫鉀0. 08g，碳酸鈣0. lg，蔗糖2g，瓊脂2.2g。滅菌條件121°C，30分鐘。實施例2a、菌絲體的培養(yǎng)將四環(huán)素產(chǎn)生菌(Streptomyces aureofaciens)斜面孢子制成孢子懸浮液,接種于菌絲體培養(yǎng)基中，接種量不低于IO6個/ml，30°C條件下震蕩培養(yǎng)26小時，獲得菌絲體培養(yǎng)液，顯微鏡鏡檢菌絲呈網(wǎng)狀，離心(3500轉(zhuǎn)/分，10分鐘)棄去上清液，獲得菌絲體。
其中四環(huán)素斜面孢子的菌種來源于中國微生物菌種總目錄，菌株保藏編號CPCC220020。菌絲體培養(yǎng)基由蒸餾水配制而成，以IOOml菌絲體培養(yǎng)基總體積計，其含有以下組分葡萄糖lg，蛋白胨0. 4g，酵母膏0. 4g，磷酸氫二鉀0. 4g，磷酸二氫鉀0. 2g，硫酸鎂
0.058，甘氨酸化。滅菌條件121°C，30分鐘。b、原生質(zhì)體的制備將a步驟所得菌絲體用10. 3%蔗糖穩(wěn)定液離心(3500轉(zhuǎn)/分，10分鐘)洗滌3次，加入溶菌酶溶液，使反應(yīng)容器(試管)中溶菌酶的作用濃度為4mg/ml，置于35°C恒溫水浴箱中進行酶解，每10分鐘震蕩一次，酶解2小時，鏡檢原生質(zhì)體釋放量達IO6個/ml以上，將反應(yīng)容器(試管)從水浴箱中取出，終止酶解。酶解液經(jīng)離心(轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分，時間3分鐘)去除沉淀，上清液再進行離心(轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)/分，時間15分鐘)獲得原生質(zhì)體。C、將原生質(zhì)體用穩(wěn)定液離心洗滌3次(穩(wěn)定液加至離心管IOml處，3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘),加入5ml穩(wěn)定液制成原生質(zhì)體懸浮液，采用紫外線照射30秒鐘(30瓦紫外燈，照射距離42cm)進行誘變處理，促進其發(fā)生突變。d、處理后的原生質(zhì)體懸浮液用穩(wěn)定液進行稀釋，經(jīng)夾層法培養(yǎng)于再生培養(yǎng)基上，34-35°C培養(yǎng)5-6天，形成再生菌落，再生菌落直徑2-5_，饅頭形或草帽型，外觀鼠灰色，孢子豐厚，孢子絲初旋至松敞螺旋形，孢子卵圓形，表面光滑，適于傳代。其中再生培養(yǎng)基由體積比為 1:1的蒸餾水和飲用水配制而成，以IOOml再生培養(yǎng)基總體積計，其中含有以下組分面粉2g，蛋白胨0. 05g，磷酸二氫鉀0. 08g，碳酸鈣0. lg，蔗糖2g，瓊脂2.2g。滅菌條件121°C，30分鐘。實施例3a、菌絲體的培養(yǎng)將四環(huán)素產(chǎn)生菌(Streptomyces aureofaciens)斜面孢子制成孢子懸浮液,接種于菌絲體培養(yǎng)基中，接種量不低于IO6個/ml，30°C條件下震蕩培養(yǎng)26小時，獲得菌絲體培養(yǎng)液，顯微鏡鏡檢菌絲呈網(wǎng)狀，離心(3500轉(zhuǎn)/分，10分鐘)棄去上清液，獲得菌絲體。其中四環(huán)素斜面孢子的菌種來源于中國微生物菌種總目錄，菌株保藏編號CPCC220020。菌絲體培養(yǎng)基由蒸餾水配制而成，以IOOml菌絲體培養(yǎng)基總體積計，其含有以下組分葡萄糖lg，蛋白胨0. 4g，酵母膏0. 4g，磷酸氫二鉀0. 4g，磷酸二氫鉀0. 2g，硫酸鎂
0.058，甘氨酸化。滅菌條件121°C，30分鐘。b、原生質(zhì)體的制備將a步驟所得菌絲體用10. 3%蔗糖穩(wěn)定液離心(3500轉(zhuǎn)/分，10分鐘)洗滌3次，加入溶菌酶溶液，使反應(yīng)容器(試管)中溶菌酶的作用濃度為4mg/ml，置于35°C恒溫水浴箱中進行酶解，每10分鐘震蕩一次，酶解2小時，鏡檢原生質(zhì)體釋放量達IO6個/ml以上，將反應(yīng)容器(試管)從水浴箱中取出，終止酶解。酶解液經(jīng)離心(轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分，時間3分鐘)去除沉淀，上清液再進行離心(轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)/分，時間15分鐘)獲得原生質(zhì)體。C、將原生質(zhì)體用穩(wěn)定液離心洗滌3次(穩(wěn)定液加至離心管IOml處，3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘)，加入5ml穩(wěn)定液制成原生質(zhì)體懸浮液，經(jīng)化學(xué)誘變劑乙烯亞胺(EI)在IOOOug/ml條件下，進行50-100分鐘誘變處理，促進其發(fā)生突變。
d、處理后的原生質(zhì)體懸浮液用穩(wěn)定液進行稀釋，經(jīng)夾層法培養(yǎng)于再生培養(yǎng)基上，34-35°C培養(yǎng)5-6天，形成再生菌落，再生菌落直徑2-5_，饅頭形或草帽型，外觀鼠灰色，孢子豐厚，孢子絲初旋至松敞螺旋形，孢子卵圓形，表面光滑，適于傳代。其中再生培養(yǎng)基 由體積比為1:1的蒸餾水和飲用水配制而成，以IOOml再生培養(yǎng)基總體積計，其中含有以下組分面粉2g，蛋白胨0. 05g，磷酸二氫鉀0. 08g，碳酸鈣0. lg，蔗糖2g，瓊脂2.2g。滅菌條件121°C，30分鐘。
權(quán)利要求
1.一種四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于它包括如下步驟 a、制備四環(huán)素斜面培養(yǎng)基稱取小麥麩皮3.0-3. 5g，硫酸鎂0. 004-0. 006g，磷酸氫二鉀 0. 01-0. 12g，磷酸氫二銨 0. 013-0. 015g，瓊脂粉1. 3-1. 5g，加蒸餾水至 100ml ；120-124°C條件下濕熱滅菌30分鐘；斜面培養(yǎng)基裝量60ml/茄子瓶； b、制備孢子懸浮液將四環(huán)素產(chǎn)生菌接種于斜面培養(yǎng)基上，于33-36°C條件下培養(yǎng)96小時左右，長出斜面孢子；在無菌條件下加入無菌蒸餾水或菌絲體培養(yǎng)基制成孢子懸浮液，使孢子懸浮液濃度在IXlO8Ail以上； C、制備菌絲體培養(yǎng)基稱取葡萄糖0. 8-1. 2g,蛋白胨0. 3-0. 5g,酵母膏0. 3-0. 5g,磷酸二氫鉀0. 1-0. 2g，硫酸鎂0. 03-0. 05g,磷酸氫二鉀0. 3-0. 4g，甘氨酸0. 2_lg，加水至IOOml ；120-124 °C條件下濕熱滅菌30分鐘； d、制備再生培養(yǎng)基稱取面粉2-4g，蛋白胨0.3-0. 5g，磷酸二氫鉀0. 05-0. 10g，碳酸鈣0.1-0. 4g，蔗糖o-llg，瓊脂1. 5-2. 5g加水至100ml ;120_124°C條件下濕熱滅菌30分鐘后制成平板培養(yǎng)基； e、培養(yǎng)菌絲體 將四環(huán)素孢子懸浮液接種于c步驟所述菌絲體培養(yǎng)基中，在27°C _33°C條件下，震蕩培養(yǎng)22-32小時，離心棄去上清液，得到菌絲體； f、酶解細胞壁 將e步驟所得菌絲體加入穩(wěn)定液，離心洗滌2-4次，加入溶菌酶溶液，使溶菌酶作用濃度為2mg/ml-6mg/ml，30°C _37°C酶解1-3小時，得到酶解液； S、分尚原生質(zhì)體 酶解液經(jīng)離心去除沉淀，然后再將上清液離心，獲得原生質(zhì)體； h、原生質(zhì)體再生 將g步驟所得的原生質(zhì)體用穩(wěn)定液離心洗滌2-4次后，加入穩(wěn)定液制成原生質(zhì)體懸浮液，原生質(zhì)體懸浮液用穩(wěn)定液稀釋，采用夾層法培養(yǎng)于再生培養(yǎng)基上，于33°C _36°C條件下培養(yǎng)5-7天，形成再生菌落。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于所述穩(wěn)定液是質(zhì)量比濃度為10-11%的蔗糖溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備與再生的方法，其特征在于所述獲得的原生體，經(jīng)過紫外線照射30秒至2分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備與再生的方法，其特征在于所述獲得的原生體，經(jīng)過乙烯亞胺在1000ug/ml條件下,處理50-100分鐘。
全文摘要
本發(fā)明的目的就是提供一種四環(huán)素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備、再生方法。它包括如下步驟a、制備四環(huán)素斜面培養(yǎng)基；b、制備孢子懸浮液；c、制備菌絲體培養(yǎng)基；d、制備再生培養(yǎng)基；e、培養(yǎng)菌絲體；f、酶解細胞壁；g、分離原生質(zhì)體；h、原生質(zhì)體再生。本發(fā)明提供的四環(huán)素菌種選育的新方法，解決了四環(huán)素原生質(zhì)體菌落無法再生和產(chǎn)孢子能力低、不能傳代的問題。
文檔編號C12R1/485GK103060235SQ201210592699
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者張彩霞, 張曦 申請人:華北制藥股份有限公司