專利名稱：一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測及測序試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測試劑盒，尤其是涉及一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測及測序試劑盒。
背景技術(shù)：
腫瘤藥物5-Fu的合成和分解之間存在著精細(xì)的平衡機(jī)制，其中分解代謝占主導(dǎo)地位。二氫卩密唳脫氫酶(Dihydropyrimidine Dehydrogenase, DPD)作為5_Fu分解過程的關(guān)鍵酶，其活性高低直接決定了 5-Fu進(jìn)入合成代謝和產(chǎn)生核苷酸類似物的量。藥代動力學(xué)研究顯示，DH)活性缺乏可導(dǎo)致5-FU體內(nèi)清除受阻.半衰期顯著延長，分解減弱而合成增力口，導(dǎo)致5-Fu在血漿中濃度的升高，細(xì)胞毒性也相應(yīng)增強(qiáng)，從而引起毒副反應(yīng)的發(fā)生。與Dro酶活性相關(guān)的突變?yōu)镈ro(IVS14+1G > A)，它是最常見的Dro突變。該突變位于Dro第14號內(nèi)含子和外顯子結(jié)合處的恒定剪切位點(diǎn)，導(dǎo)致DPD mRNA缺失165個(gè)堿基，使其編碼的581-635位含55個(gè)氨基酸的片段丟失。對常規(guī)劑量5-FU即導(dǎo)致嚴(yán)重骨髓和胃腸道不良反應(yīng)的患者進(jìn)行DH)酶基因分析發(fā)現(xiàn)，DH)(IVS14+1G > A) (14號外顯子處G-A突變，導(dǎo)致外顯子14處I個(gè)165bp片段的丟失)是DH)活性被抑制從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性的根本原因。Dro外顯子14缺失突變的攜帶者，在使用5-FU治療時(shí)，發(fā)生嚴(yán)重毒副反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)是普通人群的10倍。因此，DPD(IVS14+1G > A)點(diǎn)突變檢測對于臨床腫瘤病人的個(gè)體化用藥及腫瘤發(fā)病機(jī)制研究至關(guān)重要。但目前臨床檢測的試劑原料需多方配備，實(shí)驗(yàn)過程分步進(jìn)行，耗時(shí)較長，容易污染，結(jié)果不可靠，所以探索一種檢測DPD(IVS14+1G > A)點(diǎn)突變快速可靠的方法已經(jīng)成為臨床實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)問題。

實(shí)用新型內(nèi)容為了解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型提供一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測及測序試劑盒，包括盒體I、盒蓋2、固定座3、上游引物TCCTCTGCAAAAATGTGAGAAGGGACC試劑瓶4、下游引物TCACCAACTTATGCCAATTCTC試劑瓶5、酶混合物試劑瓶6、去離子水試劑瓶7，Bigdye3. I試劑瓶8、5X測序緩沖液(5 X sequencing buffer)試劑瓶9。固定座3上設(shè)置有PCR管10、測序管11、加樣器吸頭12。所述盒蓋2采用抽拉的方式實(shí)現(xiàn)開合的作用。所述固定座3還設(shè)置有孔13?？?3設(shè)置用來分別將PCR管10、測序管11、加樣器吸頭12固定，以防止遺撒?？?3的形狀依據(jù)不同PCR管10、測序管11、加樣器吸頭12的形狀和大小而設(shè)置。所述引物濃度為5pmol/L。所述酶混合物包括濃度為O. 4mmol/L 的 dNTPs, 4mmol/L 的 Mg2+, 2xBuffer,I. 25U/25 μ I 的 HsTaq0本實(shí)用新型與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，具有如下積極有益的效果I、本試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、設(shè)計(jì)合理、使用方便、制造容易、檢測過程不易受污染；本試劑盒在檢測二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變時(shí)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。2、本試劑盒可以同時(shí)進(jìn)行二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變及測序，步驟更省略，效率更高。

圖I為本實(shí)用新型的整體結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本實(shí)用新型進(jìn)行進(jìn)一步說明。如圖I所示，本實(shí)用新型的一個(gè)實(shí)施例為一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測及測序試劑盒，包括盒體I、盒蓋2、固定座3、上游弓I物TCCTCTGCAAAAATGTGAGAAGGGACC試劑瓶
4、下游引物TCACCAACTTATGCCAATTCTC試劑瓶5、酶混合物試劑瓶6、去離子水試劑瓶7。固定座3上設(shè)置有PCR管10、測序管11、加樣器吸頭12。固定座3還設(shè)置有孔13?？?3設(shè)置用來分別將PCR管10、測序管11、加樣器吸頭12固定，以防止遺撒。孔13的形狀依據(jù)不同PCR管10、測序管11、加樣器吸頭12的形狀和大小而設(shè)置。所述引物濃度為5umol/L。所述酶混合物包括濃度為O. 4mmol/L 的 dNTPs, 4mmol/L 的 Mg2+, 2xBuffer,
I.25U/25 μ I 的 HsTaq0操作方法I)取模板 DNA取病人全血1ml，常規(guī)提取DNA，取Iul DNA作為模板。2)反應(yīng)體系將各反應(yīng)物質(zhì)按照如下反應(yīng)體系進(jìn)行配比
模板DNAI ul
上下游引物各I ul
酶混合物15 ul
去離子水UdH2O) 9 ul 總體積25 ul3)反應(yīng)將反應(yīng)體系中各物質(zhì)在中混合，按照如下程序反應(yīng)95°C 5min, I 個(gè)循環(huán)950C 30sec —62°C 40sec — 72°C 40sec，35 個(gè)循環(huán)，72 °C 7min，l 個(gè)循環(huán)。4°C 保溫。4°C保存，2%瓊脂糖電泳，EB染色分析，目的帶為333bp。4) PCR產(chǎn)物純化使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。[0031]5) PCR產(chǎn)物測序反應(yīng)使用ABI公司試劑進(jìn)行測序反應(yīng)。6)測序產(chǎn)物純化每管加入2ul 3M的NaAC至PCR管底；每管加入50ul 100%酒精，震蕩混勻，室溫避光放置15min ；12，OOOXg 4°C離心30min，用移液槍吸盡上清；每管加入70ul 70%酒精，12，OOOXg 4°C離心15min，用移液槍吸盡上清；室溫?fù)]發(fā)凈酒精，加入10 μ L Hi-DiFormamide溶解DNA ；溶解后的樣品需要在95°C變性4min，迅速置冰中冷卻4min后，上樣電泳。7)結(jié)果判斷使用ABI3500自帶軟件進(jìn)行分析。綜上所述，本實(shí)用新型所述的實(shí)施方式僅提供一種最佳的實(shí)施方式，本實(shí)用新型的技術(shù)內(nèi)容及技術(shù)特點(diǎn)已揭示如上，然而熟悉本項(xiàng)技術(shù)的人士仍可能基于本實(shí)用新型所揭示的內(nèi)容而作各種不背離本發(fā)明創(chuàng)作精神的替換及修飾；因此，本實(shí)用新型的保護(hù)范圍不限于實(shí)施例所揭示的技術(shù)內(nèi)容，故凡依本實(shí)用新型的形狀、構(gòu)造及原理所做的等效變化，均涵蓋在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求1. 一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測及測序試劑盒，其特征在于，包括盒體(I)、盒蓋⑵、固定座⑶、上游引物5' -TCCTCTGCAAAAATGTGAGAAGGGACC-3'試劑瓶⑷、下游引物5 , -TCACCAACTTATGCCAATTCTC-3 ,試劑瓶(5)、酶混合物試劑瓶(6)、去離子水試劑瓶(7)，固定座(3)上設(shè)置有PCR管(10)、測序管(11)、加樣器吸頭(12)、孔(13)。
專利摘要本實(shí)用新型公開一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測及測序試劑盒，包括盒體1、盒蓋2、固定座3、上游引物5′-TCCTCTGCAAAAATGTGAGAAGGGACC-3′試劑瓶4、下游引物5′-TCACCAACTTATGCCAATTCTC-3′試劑瓶5、酶混合物試劑瓶6、去離子水試劑瓶7，固定座3上設(shè)置有PCR管10、測序管11、加樣器吸頭12、孔13。本試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、設(shè)計(jì)合理、使用方便、制造容易、檢測過程不易受污染；本試劑盒在檢測一種二氫嘧啶脫氫酶基因點(diǎn)突變及測序時(shí)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK202519266SQ2012201646
公開日2012年11月7日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者馮繼鋒, 吳建中, 唐金海, 王卓, 馬蓉 申請人:馮繼鋒, 吳建中, 唐金海, 王卓, 馬蓉