專利名稱：用實時熒光定量pcr檢測nat2基因多態(tài)性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種用于檢測基因多態(tài)性的試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病。近10余年來，由于艾滋病的流行、移民和流動人口的增加、多種耐藥結(jié)核菌的增多，以及不少國家和地區(qū)對結(jié)核病控制的忽視等因素，全球結(jié)核病形勢急劇惡化，無論發(fā)達(dá)國家或發(fā)展中國家，結(jié)核病病人數(shù)都在增加。在世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核化療方案中，異煙肼、利福平、吡嗪酰胺是不可替代的一線抗結(jié)核藥，這些藥物對肝臟有一定毒性。藥物性肝損害是抗結(jié)核藥物最常見的毒副作用之一，也是結(jié)核患者停止化療的最常見原因之一?？菇Y(jié)核藥物性肝損害尤其是異煙肼所致肝損害已屢見不鮮，重癥肝炎的亦不少見，甚至產(chǎn)生致命后果。對于出現(xiàn)藥物性肝損害的結(jié)核患者是選擇繼續(xù)治療還是停用抗結(jié)核藥是個兩難選擇。異煙肼在肝內(nèi)通過N-乙酰化酶代謝為乙?；悷熾录岸拘暂^強的乙酰肼和異煙酸，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性和壞死；代謝過程中生成低分子自由基，也可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起藥物性肝炎。大量研究表明慢乙?；突颊呤褂卯悷熾聲r更容易出現(xiàn)較重肝損害。因此檢測NAT2基因，對其進行分型不僅可以預(yù)測結(jié)核患者發(fā)生肝損害的風(fēng)險，同時可以為個體化藥物治療提供指導(dǎo)。目前檢測基因多態(tài)性的方法很多，最常用的PCR-RFLP法，另外還有反向點雜交法、等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)、直接測序法等。后者是所有方法的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其費用昂貴，未廣泛使用。而PCR-RFLP法雖然費用較低，操作簡單，但特異性和敏感性都不太理想，且檢測時間較長。

實用新型內(nèi)容本實用新型提供一種能夠有效減少時間和成本的用于檢測NAT2基因多態(tài)性的試劑盒。本實用新型提供一種用實時熒光定量PCR檢測NAT2基因多態(tài)性的試劑盒，包括盒體、襯墊、裝有PCR反應(yīng)液的第一容器及裝有檢測NAT2基因堿基突變的探針的至少一個第二容器，所述襯墊具有多個容器孔，所述第一容器置于與其對應(yīng)的所述容器孔，所述第二容器置于與其對應(yīng)的所述容器孔，所述第二容器包括裝有檢測NAT2基因的第341位堿基突變的341探針的第二容器、裝有檢測NAT2基因的第481位堿基突變的481探針的第二容器、裝有檢測NAT2基因的第590位堿基突變的590探針的第二容器和裝有檢測NAT2基因的第857位堿基突變的857探針的第二容器中的一個或多個。進一步的，所述第二容器包括裝有檢測NAT2基因的第341位堿基突變的341探針的第二容器、裝有檢測NAT2基因的第481位堿基突變的481探針的第二容器、裝有檢測NAT2基因的第590位堿基突變的590探針的第二容器和裝有檢測NAT2基因的第857位堿基突變的857探針的第二容器中的多個。[0008]進一步的，所述第二容器包括裝有檢測NAT2基因的第341位堿基突變的341探針的第二容器及裝有檢測NAT2基因的第857位堿基突變的857探針的第二容器中的多個。進一步的，所述第二容器包括裝有檢測NAT2基因的第481位堿基突變的481探針的第二容器及裝有檢測NAT2基因的第590位堿基突變的590探針的第二容器。所述341、481、590、857探針均包括上游引物、下游引物、野生型探針及突變型探針。所述探針組由341、481、590和857探針中的多個組成。所述探針組由341探針和857探針組成。所述探針組由481探針和590探針組成。檢測時，用實時熒光定量PCR法檢測NAT2基因的試劑盒，其含有上述本實用新型的NAT2基因檢測用探針組。檢測時，用實時熒光定量PCR法檢測NAT2基因的多態(tài)性方法，包含下述(a)工序:以試樣中的DNA為模板，使用本實用新型的NAT2基因檢測用探針對，在反應(yīng)液中檢測上述NAT2基因的工序。一種多態(tài)性解析方法，其為解析NAT2中4個檢測突變位點的多態(tài)性方法，包括下述㈧ ⑶工序:(A)利用本實用新型的基因檢測的制造方法，在反應(yīng)液中檢測NAT2基因中的含有檢測對象位點的區(qū)域的工序；(B)準(zhǔn)備含有上述(I )工序的試樣模板和能夠與上述檢測對象位點雜交的探針的反應(yīng)液的工序；(C)改變上述反應(yīng)液中各成分的濃度、退火溫度，檢測上述試樣模板的擴增曲線熒光信號的工序；(D)隨擴增循環(huán)增多，熒光強度不斷累積，確定上述檢測對象位點多態(tài)性的工序。本實用新型的有益效果是:利用該試劑盒，可以在反應(yīng)液中特異且高效地檢測NAT2基因中的、含有檢測目標(biāo)多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7、NAT2*11)發(fā)生位點的目標(biāo)區(qū)域，從而能夠有效減少時間和成本。

圖1是本實施方式的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2、是本實施方式試劑盒對試樣f 4的檢測結(jié)果的圖片。
具體實施方式
下面通過具體實施方式
結(jié)合附圖對本實用新型作進一步詳細(xì)說明。如圖1所示，本實施方式試劑盒包括盒體1、襯墊2、裝有PCR反應(yīng)液的第一容器4及裝有檢測NAT2基因堿基突變的探針的至少一個第二容器3，所述襯墊2具有多個容器孔，所述第一容器4置于與其對應(yīng)的所述容器孔，所述第二容器3置于與其對應(yīng)的所述容器孔，所述第二容器3包括裝有檢測NAT2基因的第341位堿基突變的341探針的第二容器、裝有檢測NAT2基因的第481位堿基突變的481探針的第二容器、裝有檢測NAT2基因的第590位堿基突變的590探針的第二容器和裝有檢測NAT2基因的第857位堿基突變的857探針的第二容器中的一個或多個。本實施方式用于檢測NAT2基因多態(tài)性的試劑盒包括基因擴增用探針組，含有選自由探針對(1)-(4)所組成的組中的至少一對探針對，為還可以選擇任兩種探針。在后敘述，探針對(I )能檢測NAT2*5位點突變，探針對(II)能檢測NAT2*11位點突變，探針對(III)能檢測NAT2*6位點突變，探針對(IV)能檢測NAT2*7位點突變。如上所述，已知NAT2基因編碼N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，后者是人體內(nèi)重要的II相代謝酶，可催化芳香胺類和雜環(huán)胺類物質(zhì)的乙?；^程，在一些藥物代謝以及致癌物質(zhì)的滅活或活化過程中起重要作用。檢測NT2基因多態(tài)性對指導(dǎo)臨床藥物治療很有意義。目前檢測基因多態(tài)性的方法很多，常用的有PCR-RFLP法、反向點雜交法、等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)和直接測序法等。直接測序法是所有方法的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于費用昂貴，未廣泛使用。PCR-RFLP法雖然費用較低，操作簡單，但特異性和敏感性都不太理想，且檢測通量小，影響因素多，對于樣本量較大的研究不太適用。如何采用一種高效、特異、簡便的方法對NAT2基因多態(tài)性進行檢測非常重要。本實用新型采用熒光定量PCR方法結(jié)合Taqman探針可以高效、簡便的對NAT2基因多態(tài)性進行分析。上述探針對(I )如上所述，為含有包含下述(Y I )野生型探針、(T I I)突變型探針、(F I )的寡核苷酸的上游引物、(R I )的寡核苷酸的下游引物的一組探針對。(Y I )野生型探針:與序列號I中的、以第1063位的胸腺嘧啶(T) (T341C)作為探針檢測中心，向5 ‘端延伸第1056位鳥嘌呤堿基(G)，向3’端延伸至1068胞嘧啶堿基(C) 1070位鳥嘌呤堿基(G)的序列相同的至少一個寡核苷酸,該探針5 ‘端以突光報告基團標(biāo)記，該熒光報告基團可選擇CY5、ROX、FAM、HEX之一標(biāo)記，3’端以TAMRA淬滅標(biāo)記。(T I )突變型探針:與序列號I中的、以第1063位的突變堿基胞嘧啶堿基(C)(T341C)作為探針檢測中心，向5 ‘端延伸第1056位鳥嘌呤堿基(G)，向3’端延伸至1068胞嘧啶堿基(C) 1070位鳥嘌呤堿基(G)的序列相同的至少一個寡核苷酸。該探針5 ‘端以熒光報告基團標(biāo)記，該熒光報告基團可選擇CY5、ROX、FAM、HEX之一標(biāo)記，該標(biāo)記與野生型探針不相同以區(qū)分，3’端以TAMRA淬滅標(biāo)記。(F I )上游引物:與序列號I中的、以第1021位的胞嘧啶堿基(C)作為第一個堿基朝向5 ‘端延伸至第15 20個堿基區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，并以第1021位胞嘧啶堿基(C)作為3’末端。(R I )下游引物:與序列號I中的、以第1113位的腺嘌呤(A)作為第一堿基，朝向5 ‘端至第1100位的嘌呤(A) 第1095位的胸腺嘧啶(T)，朝向3 ‘端至第1116位胸腺嘧啶(T)區(qū)域互補的序列相同的至少一個寡核苷酸。序列號I的堿基序列是人類N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2基因的DNA序列，例如NCBI登錄號:N0.D10870所登錄的基因。序列號I (人NAT2基因序列從第841個-1740個堿基)TTAACATGCA TTGTGGGCAA GCCATGGAGT TGGGCTTAGA GGCTATTTTTGATCACATTG TAAGAAGAAA CCGGGGTGGG TGGTGTCTCCAGGTCAATCA ACTTCTGTAC TGGGCTCTGA CCACAATCGG TTTTCAGACCACAATGTTAG GAGGGTATTT TTATATCCCT CCAGTTAACA AATACAGCACTGGCATGGTT CACCTTCTCC TGCAGGTGAC CATTGACGGC AGGAATTACA[0040]TTGTCGATGC TGGGTCTGGA AGCTCCTCCC AGATGTGGCA GCCTCTAGAATTAATTTCTG GGAAGGATCA GCCTCAGGTG CCTTGCATTTTCTGCTTGAC AGAAGAGAGA G GAATCTGGT ACCTGGACCAAATCAGGGGA GAGCAGTATA TTACAAACAA AGAATTTCTTAATTCTCATC TCCTGCCAAA GAAGAAACAC CAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCT CGAACAATTG AAGATTTTGAGTCTATGAAT ACATACCTGC AGACGTCTCC AACATCTTCATTTATAACCA CTTCATTTTG TTCCCTGCAG ACCCCAGAAGGGGTTTACTGTTTGGTGGGC TTCAT CCTCA CCTATAGAAAATTCAATTAT AAAGACAATA CAGATCTGGTCGAGTTTAAAACTCTCACTG AGGAAGAGGT TGAAGAAGTG CTGAAAAATATATTTAAGAT TTCCTTGGGG AGAAATCTCG TGCCCAAACCTGGTGATGGATCCCTTACTA TTTAGAATAA GGAACAAAATAAACCCTTGTGTATGTATCA CCCAACTCAC TAATTATCAACTTATGTGCT ATCAGATATC CTCTCTACCC TCACGTTATT TTGAAGAAAATCCTAAACAT CAAATACTTT CATCCATAAA AATGTCAGCA上述探針對(I )為用于檢測序列號I中的第1063位堿基突變(T-C)，即NAT2*5，其相當(dāng)于NAT2基因mRNA的第341位堿基，因此本實用新型中探針對(I )也稱為341探針。探針對(I )的各引物和探針的序列如下:
權(quán)利要求1.一種用實時熒光定量PCR檢測NAT2基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于:包括盒體、襯墊、裝有PCR反應(yīng)液的第一容器及裝有檢測NAT2基因堿基突變的探針的至少一個第二容器，所述襯墊具有多個容器孔，所述第一容器置于與其對應(yīng)的所述容器孔，所述第二容器置于與其對應(yīng)的所述容器孔，所述第二容器包括裝有檢測NAT2基因的第341位堿基突變的341探針的第二容器、裝有檢測NAT2基因的第481位堿基突變的481探針的第二容器、裝有檢測NAT2基因的第590位堿基突變的590探針的第二容器和裝有檢測NAT2基因的第857位堿基突變的857探針的第二容器中的一個或多個。
2.如權(quán)利要求1所述的用實時熒光定量PCR檢測NAT2基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于:所述第二容器包括裝有檢測NAT2基因的第341位堿基突變的341探針的第二容器、裝有檢測NAT2基因的第481位堿基突變的481探針的第二容器、裝有檢測NAT2基因的第590位堿基突變的590探針的第二容器和裝有檢測NAT2基因的第857位堿基突變的857探針的第二容器中的多個。
3.如權(quán)利要求2所述的用實時熒光定量PCR檢測NAT2基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，所述第二容器包括裝有檢測NAT2基因的第341位堿基突變的341探針的第二容器及裝有檢測NAT2基因的第857位堿基突變的857探針的第二容器中的多個。
4.如權(quán)利要求2所述的用實時熒光定量PCR檢測NAT2基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，所述第二容器包括裝有檢測NAT2基因的第481位堿基突變的481探針的第二容器及裝有檢測NAT2基因的第590位堿基突變的590探針的第二容器。
專利摘要本實用新型公開了一種用實時熒光定量PCR檢測NAT2基因多態(tài)性的試劑盒，包括反應(yīng)液及探針組，所述探針組由341探針、481探針、590探針和857探針中的一個或多個組成，所述341、481、590、857探針均包括上游引物、下游引物、野生型探針及突變型探針。利用該試劑盒，可以在反應(yīng)液中特異且高效地檢測NAT2基因中的、含有檢測目標(biāo)多態(tài)性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7、NAT2*11)發(fā)生位點的目標(biāo)區(qū)域，從而能夠有效減少時間和成本。
文檔編號C12M1/34GK202968561SQ2012204473
公開日2013年6月5日 申請日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月3日
發(fā)明者駱子義, 鄔宇美 申請人:駱子義, 鄔宇美