一種檢測(cè)人杯狀病毒的三重?zé)晒舛縭t-pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型提供一種檢測(cè)人杯狀病毒的三重?zé)晒舛縍T-PCR試劑盒，由定量RT-PCR反應(yīng)液管、酶混合液管、引物探針混合液管、陰性對(duì)照品管、三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品管、三個(gè)陽性對(duì)照品管和盒體組成。標(biāo)準(zhǔn)品為GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)照品為陽性和陰性對(duì)照品。本實(shí)用新型試劑盒根據(jù)GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，設(shè)計(jì)合理，采用一步法三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，從標(biāo)本中準(zhǔn)確檢測(cè)出三種人杯狀病毒，操作簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確。
【專利說明】—種檢測(cè)人杯狀病毒的三重?zé)晒舛縍T-PCR試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種檢測(cè)熒光定量RT-PCR試劑盒，具體涉及一種一步法檢測(cè)人杯狀病毒的三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]人杯狀病毒(Human calicivirus, HuCVs)是引起兒童和成人非菌性急性腹灣的主要病原之一，僅次于輪狀病毒。它傳染性強(qiáng)，在世界各地廣泛傳播，尤其是對(duì)嬰幼兒健康影響較大。最早發(fā)現(xiàn)的人杯狀病毒是由美國學(xué)者Kapikin于1972年采用免疫電鏡方法從俄亥俄州諾瓦克地區(qū)一所學(xué)校暴發(fā)的胃腸炎病人糞便標(biāo)本中檢出，并以發(fā)現(xiàn)地將其命名為諾瓦克病毒。此后，人杯狀病毒在世界各地不斷被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)、抗原特性、宿主范圍和所致疾病的臨床癥狀，以及病毒基因組序列和和遺傳進(jìn)化分析的結(jié)果進(jìn)行病毒分類，2002年8月第八次ICTV確定人杯狀病毒包括兩個(gè)屬:諾如病毒屬(Norovirus，NV)和札如病毒屬(sapovirus, SV)。
[0003]諾如病毒毒株間具有很大核苷酸序列多樣性，依據(jù)基因結(jié)構(gòu)ORFl和0RF2之間的差異，諾如病毒分為5個(gè)基因組(G1-GV)，其中GI (以nonvalk-like virus為代表)和GII (以Snow Mountain virus為代表)是感染人類的兩個(gè)最常見的基因組。
[0004]札如病毒即札幌病毒，為單股正鏈RNA病毒，其原型毒株最早為1977年日本學(xué)者Chiba等從札幌某托兒所一系列的腹瀉爆發(fā)研究中所證實(shí)。此類病毒所致疾病主要與人和動(dòng)物的胃腸炎有關(guān)，不同年齡段人群都可感染，引起腹瀉，主要以嬰幼兒最為易感。札如病毒主要經(jīng)糞-口途徑傳播，在有些地區(qū)，札如病毒逐漸成為僅次于諾如病毒引起病毒性腹瀉的主要病因。
[0005]由于人杯狀病毒不能進(jìn)行細(xì)胞和組織培養(yǎng)，其檢測(cè)方法的發(fā)展受到了很大限制。傳統(tǒng)的杯狀病毒檢測(cè)方法主要有電鏡、放射免疫試驗(yàn)、酶免疫試驗(yàn)等，但這些方法均不夠敏感。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展，據(jù)此建立的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)人杯狀病毒，使得檢測(cè)靈敏度大大提高。目前的方法學(xué)檢測(cè)中，RT-PCR方法已成為檢測(cè)人杯狀病毒最敏感、也是應(yīng)用最廣泛的方法。
[0006]實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有全封閉單管擴(kuò)增、簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性好、實(shí)時(shí)定量、污染少等優(yōu)勢(shì)，克服了以往臨床診斷的缺陷，具有高度的特異性和敏感性，為臨床診斷提供了準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，可作為一種臨床病原診斷的有效、快速的檢測(cè)手段。但是單管實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)一種病原，不僅耗時(shí)耗力，也浪費(fèi)試劑耗材，因而建立可同時(shí)檢測(cè)多種病原的多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR診斷方法與診斷試劑尤其重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本實(shí)用新型的目的是提供一種檢測(cè)人杯狀病毒的三重?zé)晒舛縍T-PCR試劑盒，由定量RT-PCR反應(yīng)液管、酶混合液管、引物探針混合液管、陰性對(duì)照品管、三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品管、三個(gè)陽性對(duì)照品管和盒體組成。其中定量RT-PCR反應(yīng)液管包含有PCR反應(yīng)緩沖液、氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，酶混合液管包含耐熱Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，引物探針混合液管包含三種病毒的特異性引物和相應(yīng)的三種不同熒光標(biāo)記的探針。三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品管分別放置GI型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品、GII型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品、札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品；三個(gè)陽性對(duì)照品管分別放置GI型諾如病毒陽性對(duì)照品、GII型諾如病毒陽性對(duì)照品、札如病毒陽性對(duì)照品；陰性對(duì)照管包含高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，三個(gè)陽性對(duì)照品管分別為包含GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒的保守區(qū)基因序列的陽性質(zhì)粒樣品。引物探針混合液管需為棕色管。
[0008]陰性對(duì)照為高溫高壓滅菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水，陽性對(duì)照為GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的陽性質(zhì)粒樣品。
[0009]三重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)用上游引物和下游引物以及相應(yīng)的特異性探針序列如下:
[0010]上游引物NVG1-F: 5，-ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’
[0011]下游引物NVG1-R:5’ -TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’
[0012]特異性探針NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’
[0013]上游引物NVGI1-F: 5’ -GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3’
[0014]下游引物NVGI1-R:5’ -CGACGCCATCTTCATTCACA-3’
[0015]特異性探針NVGI1-P: 5’ -HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3’
[0016]上游弓I 物 SV-F: 5，-CAGGCTCTCGCCACCTACA-3，
[0017]下游引物SV-R:5-TGCCCTCCATCTCAAACACTATT-3’
[0018]特異性探針SV-P: 5，-R0X-CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3 ’
[0019]上述標(biāo)準(zhǔn)品包括GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品，其保守區(qū)基因序列如下:
[0020]GI型諾如病毒病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
[0021]ATGGCAAGCC ATGTTCCGTT GGATGCGGTT CCATGACCTT GGTTTGTGGA
[0022]CAGGAGATCG CAATCTCCTG CCCGAATTTG TAAATGATGA TGGCGTCTAA
[0023]GGACGCCCCT CAAAGCGCTG ATGGCGCAA
[0024]GII型諾如病毒病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
[0025]ACGTGCCAAG ACAAGAGCCA ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCGGATCTG
[0026]AGCACGTGGG AGGGCGATCG CAATCTGGCT CCCAGTTTTG TGAATGAAGA
[0027]TGGCGTCGAA TGACGCCACT CCATCTAA
[0028]札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
[0029]AACACCAACT ATGACCAGGC TCTCGCCACC TACAATGCTT GGTTCATAGG
[0030]TGGTACAGTA CCTGACCCAG TGGGTTACAC TGAAGGAACC CACAAAATAG
[0031]TGTTTGAGAT GGAGGGCAAT GGCTCCAACT CAGA。
[0032]本實(shí)用新型提供的熒光定量試劑盒需保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融；引物探針混合液需避光條件下保存。弓I物探針混合液管為棕色管。
[0033]本實(shí)用新型試劑盒的使用方法:在每次標(biāo)本檢測(cè)中均應(yīng)設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)品用高溫高壓滅菌的DEPC水稀釋為I X IO3-1 X 108copies/ml。
[0034]糞便或肛拭子樣本核酸的提取:取0.2g或200 μ I糞便樣本加到EP管中，加入1.5ml的生理鹽水，震蕩混勻3次，每次10s，然后室溫靜置lOmin，以8000r/min離心5min。吸取200μ I上清加入到EP管中，進(jìn)行核酸提?。桓厥米訕?biāo)本要在標(biāo)本運(yùn)輸(保存)液中充分?jǐn)噭?dòng)(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，可以直接吸取200ul上清加到EP管中，進(jìn)行核酸提取。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acidextraction KitII 或 QIAGEN 公司的 QIAamp DNA Stool Mini Kit,按照試劑盒說明書進(jìn)行提取，取5ul已抽提的待測(cè)樣品核酸作為模板。
[0035]核酸的檢測(cè):取5ul已抽提的待測(cè)樣品核酸作為模板。反應(yīng)總體積為25μ 1，其中定量RT-PCR反應(yīng)液12.5 μ 1，酶混合液I μ 1，引物探針混合液(20 μ mol/L，包含三種病毒的特異性引物和相應(yīng)的三種熒光探針)共4.5 μ 1，模板5 μ 1，加水補(bǔ)足至25 μ I。在ΑΒΙ7500熒光定量PCR儀(或者其他三色熒光以上的PCR儀)上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為:反轉(zhuǎn)錄50°C , 30min ；95°C 5min熱啟動(dòng)，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進(jìn)行三重?zé)晒鈾z測(cè)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
[0036]突光定量結(jié)果報(bào)告:①GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒檢測(cè)的各自CT值對(duì)應(yīng)相應(yīng)的熒光標(biāo)記的病毒，檢測(cè)樣本CT值為40、0和無數(shù)值時(shí)，報(bào)告為陰性。②檢測(cè)樣本Ct值< 35時(shí):報(bào)告為相應(yīng)病毒陽性。③檢測(cè)樣本Ct值> 35且小于40的樣本,建議復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果Ct值< 37者，依據(jù)②的判斷標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告為相應(yīng)病毒陽性。根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本各種病毒的量(copies/ml)。
[0037]本實(shí)用新型的有益之處是:運(yùn)用一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，采用GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒高度特異的引物和熒光標(biāo)記探針，開發(fā)研制用于GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒三重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)試劑盒。該實(shí)用新型是通過一個(gè)PCR反應(yīng)，可以從糞便或肛拭子標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)出是否有GI型諾如病毒、GII型諾如病毒或札如病毒存在，比傳統(tǒng)的普通PCR和單重?zé)晒舛縋CR方法更便捷迅速。同時(shí)，對(duì)檢測(cè)的病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)準(zhǔn)確定量，對(duì)臨床上病毒性腹瀉的患者，提供早期明確診斷，區(qū)分病毒感染的種類及滴度，為臨床治療方案的制定提供參考依據(jù)；同時(shí)還可應(yīng)用于病毒性腹瀉中杯狀病毒分子流行病學(xué)的研究。本實(shí)用新型采用的單管一步法三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，能夠一管內(nèi)一次反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)出GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒，相比傳統(tǒng)的單管單病原實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，不僅大大的節(jié)省了試劑耗材、檢測(cè)時(shí)間，而且同樣具備較高的特異性和靈敏度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為本試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0039]圖2為本試劑盒同時(shí)檢測(cè)三種病毒陽性的實(shí)例，其中I為GI型諾如病毒、2為GII型諾如病毒、3為札如病毒。
[0040]圖3為本試劑盒檢測(cè)GI型諾如病毒的靈敏度，從左到右(1-6)依次為108、IO7, IO6,ΙΟ5、104、103copies/ml。
[0041]圖4為本試劑盒GI型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0042]圖5為本試劑盒檢測(cè)GII型諾如病毒的靈敏度，從左到右(1-6)依次為108、107、ΙΟ6、ΙΟ5、104、103copies/ml。
[0043]圖6為本試劑盒GII型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。[0044]圖7為本試劑盒檢測(cè)札如病毒的靈敏度，從左到右(1-6)依次為108、107、106、105、104、103copies/ml。
[0045]圖8為本試劑盒札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0046]本實(shí)用新型結(jié)合下面具體實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步說明，但這些實(shí)施例僅限于說明本實(shí)用新型而不限制本實(shí)用新型的范圍。
[0047]實(shí)施例1
[0048]參見圖1，一種檢測(cè)人杯狀病毒的三重?zé)晒舛縍T-PCR試劑盒，由定量RT-PCR反應(yīng)液管1、酶混合液管2、引物探針混合液管3、陰性對(duì)照品管4、三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品管5、三個(gè)陽性對(duì)照品管6和盒體7組成。
[0049]其中定量RT-PCR反應(yīng)液管I包含有PCR反應(yīng)緩沖液、氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物；酶混合物管2包含耐熱Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶；引物探針混合液管3包含GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒三種病毒的特異性引物和相應(yīng)的三種熒光標(biāo)記的探針；三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品管5分別放置GI型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品、GII型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品、札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品；三個(gè)陽性對(duì)照品管6分別放置GI型諾如病毒陽性對(duì)照品、GII型諾如病毒陽性對(duì)照品、札如病毒陽性對(duì)照品。
[0050]陰性對(duì)照為高溫高壓滅菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水，陽性對(duì)照為GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的陽性質(zhì)粒樣品。
[0051]本試劑盒需保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融；引物探針混合液需避光條件下保存。引物探針混合液管為棕色管。
[0052]三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)用上游引物和下游引物以及相應(yīng)的特異性探針序列如下:
[0053]上游引物NVG1-F: 5，-ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’
[0054]下游引物NVG1-R:5’ -TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’
[0055]特異性探針NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’
[0056]上游引物NVGI1-F: 5’ -GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3’
[0057]下游引物NVGI1-R:5’ -CGACGCCATCTTCATTCACA-3’
[0058]特異性探針NVGI1-P: 5，-HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3，
[0059]上游引物SV-F: 5，-CAGGCTCTCGCCACCTACA-3 ’
[0060]下游引物SV-R: 5-TGCCCTCCATCTCAAACACTATT-3，
[0061 ]特異性探針 SV-P: 5，-R0X-CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3 ’
[0062]所述的三種標(biāo)準(zhǔn)品基因序列如下:
[0063]GI型諾如病毒病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
[0064]ATGGCAAGCC ATGTTCCGTT GGATGCGGTT CCATGACCTT GGTTTGTGGA
[0065]CAGGAGATCG CAATCTCCTG CCCGAATTTG TAAATGATGA TGGCGTCTAA
[0066]GGACGCCCCT CAAAGCGCTG ATGGCGCAA
[0067]GII型諾如病毒病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
[0068]ACGTGCCAAG ACAAGAGCCA ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCGGATCTG
[0069]AGCACGTGGG AGGGCGATCG CAATCTGGCT CCCAGTTTTG TGAATGAAGA[0070]TGGCGTCGAA TGACGCCACT CCATCTAA
[0071]札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
[0072]AACACCAACT ATGACCAGGC TCTCGCCACC TACAATGCTT GGTTCATAGG
[0073]TGGTACAGTA CCTGACCCAG TGGGTTACAC TGAAGGAACC CACAAAATAG
[0074]TGTTTGAGAT GGAGGGCAAT GGCTCCAACT CAGA。
[0075]實(shí)施例2
[0076]I材料與方法
[0077]1.1臨床標(biāo)本與病毒核酸:
[0078]GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的臨床樣本來源于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院以及浙江省內(nèi)其他幾家醫(yī)院腹瀉患者的糞便或肛拭子標(biāo)本，樣本采集后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。陽性核酸均通過基因測(cè)序確認(rèn)。
[0079]1.2引物與探針
[0080]從美國的NCBI基因庫上下載了涵蓋國內(nèi)外GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的多條基因序列。利用DNAman軟件對(duì)其進(jìn)行了同源性比較，確定以上病毒基因組的保守區(qū)。使用Primer Express3.0軟件在其保守區(qū)設(shè)計(jì)高度特異性的引物與Taqman探針，弓丨物和探針序列均通過Blast驗(yàn)證，具有較好特異性。引物和探針序列如下，:
[0081 ]上游引物 NVG1-F: 5，-ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’
[0082]下游引物NVG1-R:5’ -TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3，
[0083]特異性探針NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’
[0084]上游引物NVGI1-F: 5’ -GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3’
[0085]下游引物NVGI1-R:5，-CGACGCCATCTTCATTCACA-3’
[0086]特異性探針NVGI1-P: 5，-HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3，
[0087]上游引物SV-F: 5，-CAGGCTCTCGCCACCTACA-3 ’
[0088]下游引物SV-R: 5-TGCCCTCCATCTCAAACACTATT-3，
[0089]特異性探針SV-P: 5，-R0X-CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3 ’
[0090]以上引物和探針委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0091]1.3病毒核酸的提取與標(biāo)準(zhǔn)品定量標(biāo)準(zhǔn):
[0092]取0.2g或200 μ I糞便樣本加到EP管中，加入1.5ml的生理鹽水，震蕩混勻3次，每次10s，然后室溫靜置lOmin，以8000r/min離心5min。吸取200 μ I上清加入到EP管中，米用 Geneaid 公司的 Viral Nucleic Acid extraction KitII 或 QIAGEN 公司的 QIAampDNA Stool Mini KU，按照試劑盒說明書進(jìn)行提取，取5ul已抽提的待測(cè)樣品核酸作為模板。合成各病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品片段，將其連接到質(zhì)粒載體PMDTM19-T Simple VectorCTaKaRa公司)上。轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)。鑒定后提取質(zhì)粒DNA,利用NanoDrop ND-2000Spectrophotometer測(cè)量質(zhì)粒DNA的濃度，確定DNA的拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品定量母液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將標(biāo)準(zhǔn)品定量母液稀釋至所需最高濃度，并做十倍稀釋至最低濃度，低溫保存?zhèn)溆谩?br> [0093]1.4三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化:
[0094]反應(yīng)總體積為25 μ 1，其中定量RT-PCR反應(yīng)液12.5 μ 1，酶混合液I μ 1，引物探針混合液(20 μ mol/Ι，包含四種病毒的特異性引物和相應(yīng)的三種種熒光探針)共4.5μ1，模板5μ 1，DEPC水補(bǔ)足至25μ I。在ΑΒΙ7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為:反轉(zhuǎn)錄50°C , 30min ；95°C 5min熱啟動(dòng)，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進(jìn)行三重?zé)晒鈾z測(cè)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判斷:選擇熒光檢測(cè)模式FAM、HEX、ROX熒光基線調(diào)整取3_15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)平均值，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對(duì)照品的最高點(diǎn)，樣本呈典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陽性。無典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。體系的優(yōu)化試驗(yàn)，在以相同濃度陽性核酸為模板的反應(yīng)體系中，引物濃度從I?20 μ Μ，探針濃度從I?20 μ Μ，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據(jù)最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度增加值(ARn)選擇最佳引物和探針濃度。
[0095]1.5三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)
[0096]選擇GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒的陽性核酸(均通過基因測(cè)序鑒定)和近期來源于浙江省多家醫(yī)院的臨床樣本提取核酸，用GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法驗(yàn)證方法的特異性；利用傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存的輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒、EV71、CoxA16、CoxB病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒等毒株，提取核酸后用本試劑盒檢測(cè)，驗(yàn)證其是否存在交叉反應(yīng)。對(duì)已標(biāo)定拷貝數(shù)(copies/ml)的GI型諾如病毒(108copies/ml)、GII型諾如病毒(108copies/ml)和札如病毒(108COpieS/ml)分別稀釋后，平行進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，比較其靈敏度，并據(jù)此建立檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外，對(duì)每一個(gè)指定濃度的陽性核酸稀釋液作6次重復(fù)檢測(cè)，得到的Ct值計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。
[0097]2 結(jié)果
[0098]2.1三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系及條件
[0099]該方法的反應(yīng)總體積為25 μ 1，其中其中定量RT-PCR反應(yīng)液12.5 μ 1，酶混合液I μ 1，引物探針混合液(20 μ mol/l，包含四種病毒的特異性引物和相應(yīng)的四種種熒光探針)共4.5μl，模板5μl，DEPC水補(bǔ)足至25μl。在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為:反轉(zhuǎn)錄50°C , 30min ；95°C 5min熱啟動(dòng)，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進(jìn)行三重?zé)晒鈾z測(cè)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。可獲得最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度。
[0100]2.2特異性試驗(yàn)
[0101]本實(shí)用新型建立的一步法三重?zé)晒舛縍T-PCR方法對(duì)GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒具有較好的特異性，近期采集的臨床標(biāo)本也檢測(cè)出陽性反應(yīng)。GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒引物探針與其他病毒如輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒、EV71、CoxA16XoxB病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒等均無交叉反應(yīng)。該方法同時(shí)檢測(cè)三種病毒陽性的結(jié)果參見圖2，其中I為GI型諾如病毒，2為GII型諾如病毒，3為札如病毒。
[0102]2.3敏感性試驗(yàn)。
[0103]對(duì)GI型諾如病毒、GII型諾如病毒、札如病毒敏感性檢測(cè)試驗(yàn)，將已標(biāo)定拷貝數(shù)(copies/ml)的GI型諾如病毒(108copies/ml)、GII型諾如病毒(108copies/ml)和札如病毒(108COpieS/ml)分別十倍梯度稀釋后，用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果該方法檢測(cè)敏感性分別達(dá)到103、103、103和103copies/ml。結(jié)果參見圖3、圖5、圖7。取實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR產(chǎn)物5 μ 1，120V電壓電泳20min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。根據(jù)其檢測(cè)靈敏度，建立各病毒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中圖4為檢測(cè)GI型諾如病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線(斜率=-3.745，R2=0.998)，圖6為檢測(cè)GII型諾如病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線(斜率=-4.306，R2=0.999)、圖8為檢測(cè)札如病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線(斜率=-3.717，R2=0.998)。[0104]2.4重復(fù)性試驗(yàn)
[0105]分別取GI型諾如病毒(終濃度為106copies/ml)、GII型諾如病毒(106copies/ml )、札如病毒(106copies/ml),按10倍梯度稀釋成3個(gè)不同的濃度，對(duì)每一個(gè)濃度的樣本作6個(gè)重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測(cè)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.155~0.363之間，變異系數(shù)均低于1.275%，具有較好的重復(fù)性(結(jié)果參見表1)。
[0106]表1三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)病毒核酸的重復(fù)性試驗(yàn)
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)人杯狀病毒的三重?zé)晒舛縍T-PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒由定量RT-PCR反應(yīng)液管(I)、酶混合液管(2)、引物探針混合液管(3)、陰性對(duì)照品管(4)、三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品管(5)、三個(gè)陽性對(duì)照品管(6)和盒體(7)組成，三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品管(5)分別放置GI型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品、GII型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品、札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品；三個(gè)陽性對(duì)照品管(6)分別放置GI型諾如病毒陽性對(duì)照品、GII型諾如病毒陽性對(duì)照品、札如病毒陽性對(duì)照品；陰性對(duì)照管(4)包含高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，三個(gè)陽性對(duì)照品管(6)分別為包含GI型諾如病毒、GII型諾如病毒和札如病毒的保守區(qū)基因序列的陽性質(zhì)粒樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)人杯狀病毒的三重?zé)晒舛縍T-PCR試劑盒，其特征在于，引物探針混合液管(3)為棕色管。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK203382766SQ201220675431
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月10日
【發(fā)明者】陳瑜, 李蘭娟, 謝國良, 崔大偉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)