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針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽的抗體的制作方法

文檔序號:509961閱讀:414來源:國知局
針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽的抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題為提供針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽(APP-SP)的抗體。本發(fā)明提供針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽的抗體。
【專利說明】針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽的抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽的抗體。另外,本發(fā)明還涉及針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽的單克隆抗體以及生產(chǎn)所述抗體的雜交瘤。
【背景技術(shù)】
[0002]通常廣泛已知在生物體內(nèi)肽自身具有激素、神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)等各種各樣的機能。近年公開了這樣的肽中擔(dān)負(fù)多個生理作用的肽。以往,一直認(rèn)為被稱作信號肽的短肽領(lǐng)域只擔(dān)負(fù)使新合成蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移的作用,但是,近年,其他的生理作用相繼被公開(非專利文獻(xiàn)I)。
[0003]例如,已知鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin)的信號肽的一部分通過主要組織相容性復(fù)合體(MHC)被提呈至細(xì)胞表面(非專利文獻(xiàn)2)。對于該現(xiàn)象的生理學(xué)意義,考慮可能是為了監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)量或者正常的信號肽的生產(chǎn)比例的機制的一部分,但是沒有得出結(jié)論。
[0004]另外提示,降鈣素(calcitonin)的信號肽的一部分通過MHC被提呈至非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞的表面,細(xì)胞毒性T細(xì)胞將該信號肽作為表位識別,被期待涉及腫瘤疫苗的開發(fā)(非專利文獻(xiàn)3)。
[0005]如上所述,逐步知曉信號肽不僅作為將蛋白質(zhì)導(dǎo)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的簡單信號,而且具有新的生理?病理意義,不能否認(rèn)尚未進行研究的信號肽與何種重要的生理現(xiàn)象例如作為原因不明的疑難病的重要因素相關(guān)的可能性。
[0006]作為所述疑難病的一例,可以舉出阿爾茨海默病。阿爾茨海默病為以腦中的神經(jīng)細(xì)胞脫落、淀粉狀蛋白3蓄積、神經(jīng)原纖維變化為病理特征的進行性認(rèn)知癥?;谠摬±淼奶卣?,淀粉狀蛋白0為根本原因的假說普及,雖對阿爾茨海默病的診斷?治療方法進行了長年研究,但是,治療方法根本不明確,甚至發(fā)病機理也尚未明確。鑒于這樣的現(xiàn)狀,最近,逐漸提出了淀粉狀蛋白P原因說是否錯誤這樣的意見(非專利文獻(xiàn)4)。進而,存在提示淀粉狀蛋白P以外的因子與阿爾茨海默病發(fā)病相關(guān)的報道。
[0007]非專利文獻(xiàn)5中公開了,由淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的N末端到286殘基的區(qū)域促進神經(jīng)細(xì)胞的變性,筆者提到作為除淀粉狀蛋白P以外的阿爾茨海默病的原因物質(zhì)的可能性。
[0008]以往技術(shù)文獻(xiàn)
[0009]非專利文獻(xiàn)
[0010]非專利文獻(xiàn)1:Trends in Cell Biology, 1998, vol.8, pp.410-415
[0011]非專利文獻(xiàn)2:Science, 1992,vol.255,pp.1264-1266
[0012]非專利文獻(xiàn)3 !Proceedings of the National Academy of Science s of theUnited States of America,2008, vol.29, n0.105,pp.10119-10124
[0013]非專利文獻(xiàn)4:Nature,2008, vol.456, pp.161-164
[0014]非專利文獻(xiàn)5 =Nature, 2009,vol.457,pp.981-989
【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0016]非專利文獻(xiàn)5公開了,由淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的N末端到第286殘基的蛋白質(zhì)促進神經(jīng)變性,但是,沒有公開到該領(lǐng)域內(nèi)的哪個部分為神經(jīng)變性的本質(zhì)原因部分的程度。
[0017]解決技術(shù)問題的技術(shù)手段
[0018]由該淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的N末端到17殘基中含有序列編號I表示的信號肽(Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg Ala:APP_SP)。因此,APP-SP具有有助于阿爾茨海默病的發(fā)病的可能性,今后,在用于阿爾茨海默病的診斷、治療等方面,也可期待針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽(APP-SP)的抗體是有用的。
[0019]本發(fā)明的一個目的在于,提供針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽(APP-SP)的抗體。
[0020]也就是說,本發(fā)明如下所述。
[0021](I)
[0022]針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽的抗體。
[0023](2)
[0024]如(I)所述的抗體,上述信號肽為含有序列編號I的氨基酸序列的肽。
[0025](3)
[0026]如⑴或者⑵所述的抗體,其是采用含有序列編號I的氨基酸序列的肽而得到的。
[0027](4)
[0028]如⑴~(3)中任一項所述的抗體,為單克隆抗體。
[0029](5)
[0030]生產(chǎn)(4)所述單克隆抗體的雜交瘤。
[0031](6)
[0032]為受理編號(NITE ABP-1198)表示的雜交瘤。
[0033]發(fā)明效果`
[0034]通過本發(fā)明,可以提供針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽(APP-SP)的抗體。本發(fā)明的孔APP-SP抗體有可能能夠用于阿爾茨海默病的診斷、治療等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1表示實施例1中抗體效價的測定結(jié)果。
[0036]圖2表示競爭ELISA的測定結(jié)果。
[0037]圖3表示抗APP-SP單克隆抗體的ELISA測定結(jié)果。
[0038]圖4表示對于隨機APP-SP (序列編號2)的ELISA測定結(jié)果。
[0039]圖5表示圓點印跡法中的測定結(jié)果。
[0040]圖6表示參考例中的抗體效價測定結(jié)果。
【具體實施方式】[0041]以下,針對本發(fā)明,具體說明其優(yōu)選的方式。需要說明的是,本發(fā)明并不限于為了實施以下發(fā)明的方式,可以在本發(fā)明主旨的范圍內(nèi)進行各種變形來實施。
[0042]本發(fā)明的抗體為針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽(APP-SP)的抗體,該抗體優(yōu)選為特異地識別淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽的抗體。
[0043]本發(fā)明中,所謂“淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽”(或者,有時表示為“APP-SP”)的含義為,由(a)序列編號I記載的氨基酸序列表示的肽。該序列中,在描述為Met (M)時表示游離(free)的蛋氨酸或者S-甲基蛋氨酸,氨基酸按照IUPAC的命名法由I個文字或者3個文字的表述來表不。
[0044]淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽可以為天然由來的游離的肽,也可以為按照以往公知的方法制備的肽。在肽合成的領(lǐng)域中,具有含有序列編號I的氨基酸序列的肽是既可以采用以往公知的方法化學(xué)合成,也可以采用微生物等利用重組技術(shù)合成的肽。
[0045]由本發(fā)明得到的識別APP-SP的抗體可以為多克隆抗體,也可以為單克隆抗體。根據(jù)近年的研究結(jié)果(例如,參照非專利文獻(xiàn)5),淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的含有信號肽部分的N末端區(qū)域顯示促進神經(jīng)細(xì)胞變性的作用,以作為阿爾茨海默病的原因物質(zhì)被關(guān)注的APP-SP為抗原的抗體,將來可期待于能夠應(yīng)用于阿爾茨海默病的解析、診斷、治療等。
[0046]本發(fā)明的針對APP-SP的抗體為使用含有APP-SP的抗原作為抗原而得到的抗體,可以使用例如,
[0047](a)含有序列編號I的氨 基酸序列的肽,或者
[0048](b)含有序列編號I的氨基酸序列中,I個或者多個氨基酸被替換、缺失、添加以及/或者插入后的氨基酸序列的肽,作為抗原。
[0049]優(yōu)選,通過使用含有序列編號I的氨基酸序列的肽作為抗原而得到的抗體識別APP-SP。
[0050]抗原抗體反應(yīng)可以通過使用上述抗原,像以往公知的那樣,向被免疫動物給予作為抗原的物質(zhì)來進行。
[0051 ] 通過給予作為抗原的物質(zhì),弓丨起被免疫動物中的免疫反應(yīng),從而可以生產(chǎn)本發(fā)明的針對APP-SP的抗體。
[0052]作為被免疫動物,沒有特殊限定,但是,可以舉出作為實驗動物使用的豚鼠、大鼠、小鼠、兔以及棉羊等。
[0053]作為抗原的給予方案,沒有特殊限定,但是,可以舉出例如,皮下、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉以及皮內(nèi)等給予途徑。作為抗原的給予方案,沒有特殊限定,但是,可以通過例如,以2周的給予間隔,給予抗原約2~10次,從而生產(chǎn)針對APP-SP的抗體。
[0054]也可以根據(jù)給予方案適當(dāng)?shù)?、由被免疫動物采集血清樣本確認(rèn)抗體的生產(chǎn)量,確認(rèn)是否充分引起免疫反應(yīng)。
[0055]最終免疫后,可以由被免疫動物采集血清,通過以往公知的方法精制得到抗APP-SP 抗體。
[0056]用于初次免疫、追加免疫的抗原給予量,沒有特殊限定,但是,作為與APP-SP相當(dāng)?shù)目乖慕o予量,可以為例如,每只小鼠給予10~200 ii g。
[0057]給予抗原時,也可以同時給予佐劑。作為所述佐劑,可以使用能夠以高效價引起免疫反應(yīng)的以往公知的佐劑??梢耘e出例如,完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、氫氧化鋁等。[0058]通過本發(fā)明的抗體的制備方法,可以得到多克隆抗體,接著,通過以往公知的方法精制抗體,能夠得到純度高的抗體。
[0059]另外,通過由生產(chǎn)抗體的被免疫動物的脾臟或者淋巴結(jié)等采集生產(chǎn)抗體的細(xì)胞,可以制備雜交瘤,另外,也能夠得到單克隆抗體。
[0060]為了得到本發(fā)明的針對APP-SP的抗體,可以使用如下抗原溶液。
[0061]作為抗原溶液是含有為了得到針對APP-SP的抗體的抗原的溶液,作為抗原而使用:
[0062](a)含有序列編號I的氨基酸序列的肽,或者
[0063](b)含有序列編號I的氨基酸序列中,I個或者多個氨基酸被替換、缺失、添加以及/或者插入后的氨基酸序列的肽時,
[0064]可以使用含有該肽與PEG類表面活性劑的肽膠束凝集體溶液作為抗原溶液。
[0065]本發(fā)明中,作為“PEG類表面活性劑”,只要是分子內(nèi)具有聚乙二醇(P EG)結(jié)構(gòu)的表面活性劑即沒有特殊限定。
[0066]作為PEG類表面活性劑,可以舉出,作為親水性部分結(jié)構(gòu)的PEG與,作為疏水性部分結(jié)構(gòu)的膽固醇骨架、碳原子數(shù)8~20的飽和或者不飽和的脂肪族烴骨架等之間,通過與PEG末端的醇性羥基的醚鍵、酯鍵等而共價鍵合的化合物。
[0067]作為PEG部分的重復(fù)結(jié)構(gòu)(乙二醇結(jié)構(gòu))的聚合度,為例如70以下,也可以為60以下。
[0068]作為PEG類表面活性劑,可以舉出,例如,選自以下述式表示的組的至少I種化合物等。
[0069]化I
[0070]

H。卜。
mX
[0071](式中,m為O~10的整數(shù),η為10~70的整數(shù)。χ為30~60的整數(shù)。)
[0072]式中,η或者χ表示重復(fù)結(jié)構(gòu)的聚合度。
[0073]作為選自以上述式表示的組的至少I種化合物所示的PEG類表面活性劑,可以舉出,上述式中,χ為50的CS-050,m為1、η為60的PEG60,η為36的PEG36,η為24的PEG24,η為12的PEG12等。
[0074]上述肽與含有PEG類表面活性劑的溶液之間的混合沒有特殊限定,只要將上述肽混合入含有PEG類表面活性劑的溶液中即可。
[0075]接著,混合佐劑作為肽膠束凝集體溶液,通過將上述肽作為抗原給予至被免疫動物,可以得到抗APP-SP抗體。
[0076]作為佐劑,可以舉出,例如,完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、氫氧化鋁等。
[0077]混合佐劑時,優(yōu)選使用超聲波處理裝置形成乳液。[0078]對于肽膠束凝集體溶液,為了統(tǒng)一肽膠束凝集體的粒度分布也可以進行整粒,也可通過例如由凝膠過濾色譜、利用濾膜的過濾等方法統(tǒng)一粒度。
[0079]肽膠束凝集體的粒度可以為5 μ m~200 μ m,也可以為5 μ m~100 μ m。
[0080]肽膠束凝集體的粒度可以使用日機裝社制的動態(tài)光散射粒度測量裝置進行測定。
[0081]作為以往公知的方法,在希望制作針對肽的抗體時,使用載體蛋白質(zhì)共價結(jié)合有多個肽的抗原。
[0082]該肽與載體蛋白質(zhì)的結(jié)合可以通過以往公知的方法形成。
[0083]作為載體蛋白質(zhì),可以舉出,例如,匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清清蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、小鼠血清白蛋白(MSA)、兔血清白蛋白(RSA)等。
[0084]使載體蛋白質(zhì)結(jié)合上述肽時,可以在上述肽的N末端添加半胱氨酸等,使用與載體蛋白質(zhì)結(jié)合的連接物(linker)。
[0085]作為所述連接物,只要是能夠與載體蛋白質(zhì)以及添加了半胱氨酸的肽相共價結(jié)合的連接物即沒有特殊限定,但是,可以舉出,例如具有N-羥基琥珀酰亞胺活化酯(NHS酯)、馬來酰亞胺、碳二亞胺等官能基團的連接物。
[0086]本發(fā)明中,使載體蛋白質(zhì)上載有抗原部位而得到針對APP-SP的抗體的情況下,如實施例公開的那樣,作為抗原,使用(a)含有序列編號I的氨基酸序列的肽那樣的具有APP-SP全長肽的肽時,不能得到針對APP-SP的抗體。
`[0087]為了得到本發(fā)明的抗體,作為抗原的給予方法,沒有特殊限定,但是,也可以測定抗體效價,給予抗原直到能夠獲得所希望的抗體效價。
[0088]抗體效價可以通過吸光度測定。抗體效價可以通過使用由被免疫動物適當(dāng)采集的血液樣本測定,優(yōu)選使用通過離心分離等除去夾雜物的血清樣本。
[0089]抗體效價沒有特殊限定,但是,可以通過ELISA(enzymelinked immu nosorbentassay:酶聯(lián)免疫吸附測定)等以往公知的方法測定。
[0090]通過追加免疫得到顯示所期望的抗體效價的血清時,通過以往公知的方法精制,可以得到抗APP-SP抗體。
[0091]抗體的精制中,可以使用例如,離子交換色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜等色譜精制,鹽析等方法,按照這樣由血清樣本得到的抗體為識別APP-SP的多克隆抗體。
[0092]對于多克隆抗體的抗原特異性可以通過ELISA等方法確認(rèn)。
[0093]在已知得到識別APP-SP的抗體的情況下,可以通過以往公知的方法,由被免疫動物的脾臟或者淋巴結(jié)等采集生產(chǎn)抗體的細(xì)胞。通過使用所得到的生產(chǎn)抗體的細(xì)胞進行細(xì)胞融合,可以得到雜交瘤(融合細(xì)胞)。通過使生產(chǎn)抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(myelomacells)融合,可以得到雜交瘤。
[0094]作為與生產(chǎn)抗體的細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞,可以使用小鼠等動物的通常能夠獲得的細(xì)胞株。
[0095]作為骨髓瘤細(xì)胞,可以舉出例如,P3-X63-Ag8_Ul、SP2/0_Agl4等。
[0096]使細(xì)胞融合后,通過篩選,可以選擇性地僅增殖雜交瘤。作為篩選方法,優(yōu)選用HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)。此時,為了有助于雜交瘤的增殖,也可以與胸腺細(xì)胞等飼養(yǎng)細(xì)胞一起培養(yǎng)。得到的雜交瘤生產(chǎn)的抗體的抗原特異性可以將培養(yǎng)上清通過ELISA等公知的方法測定而確認(rèn),從而可以僅選擇能夠確認(rèn)所期望的抗體生產(chǎn)的雜交瘤。接著,通過克隆得到的雜交瘤,除去混合存在的目的以外的細(xì)胞,可以得到含有單克隆的雜交瘤。作為克隆的方法,可以舉出例如,有限稀釋法、軟瓊脂法、纖維蛋白凝膠法等。得到的雜交瘤可以通過以往公知的方法冷凍保存。由克隆后的雜交瘤,可以通過以往公知的方法制備單克隆抗體。例如,可以在小鼠的腹腔內(nèi)使雜交瘤增殖,精制含有單克隆抗體的腹水而制備。另外,也可以用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤,通過精制該培養(yǎng)上清來制備。
[0097]本發(fā)明中得到的抗體,在使用小鼠作為被免疫動物時,作為小鼠抗體,可以通過以往公知的方法,成為嵌合抗體、人源化抗體、人抗體。特別是,識別APP-SP的嵌合抗體、人源化抗體,人抗體是對于阿爾茨海默病的治療有效的抗體。
[0098]實施例
[0099]以下,通過實施例進一步具體說明本發(fā)明。但是,本發(fā)明并不限于這些實施例。
[0100]實施例1:抗APP-SP單克隆抗體的制作
[0101](I)肽(APP-SP)的合成
[0102]委托GL生物有限公司(上海),通過Fmoc固相合成法進行人淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽(APP-SP,序列編號I)的化學(xué)合成。
[0103]化學(xué)合成的肽(APP-SP),通過采用ODS柱,使用了含有0.1 %三氟乙酸(TFA)的水/乙腈(MeCN)作為流動相的濃度梯度法進行精制。
[0104](2)抗原溶液的制作和免疫操作
[0105]使用下述式(I)表示的PEG60(polypure社制)作為PEG類表面活性劑,調(diào)制由
(I)化學(xué)合成的APP-SP,達(dá)到0.8mg/mL APP-SP、I % PEG60,得到APP-SP可溶化的混合水溶液。
[0106]式⑴:
[0107]
【權(quán)利要求】
1.一種抗體,其是針對淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì)的信號肽的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體,其中,所述信號肽是含有序列編號I的氨基酸序列的肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的抗體,其是使用含有序列編號I的氨基酸序列的肽而得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的抗體,其是單克隆抗體。
5.一種雜交瘤,其生產(chǎn)權(quán)利要求4所述的單克隆抗體。
6.一種雜交瘤,其 由受理編號(NITE ABP-1198)表示。
【文檔編號】C12P21/08GK103492415SQ201280004580
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月7日
【發(fā)明者】福島均, 花村雅人, 丹羽干夫, 岡本雅次, 直江智子, 吉田徹彥 申請人:精工愛普生株式會社, 東亞合成株式會社
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