微生物菌體的運(yùn)輸方法
【專利摘要】本發(fā)明提供在能夠密閉的容器內(nèi)保存具有腈水合酶活性的微生物菌體的方法、以及使用該容器運(yùn)輸?shù)姆椒?；前述方法的特征在于，使填充有包含前述微生物菌體的懸浮液的前述容器內(nèi)的氣相部分占容器內(nèi)部總?cè)莘e的2%以上且20%以下。
【專利說明】微生物菌體的運(yùn)輸方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種方法，其在將具有腈水合酶活性的微生物菌體填充至密閉容器中運(yùn)輸時,通過使密閉容器內(nèi)部的氣相部分占總?cè)莘e的20%以下，由此在使腈水合酶活性保持穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行運(yùn)輸。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物產(chǎn)生的酶作為化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的催化劑而用于多種場合。尤其是，通過利用具有腈基的水合或水解能力的腈水合酶、腈水解酶等，能夠廉價地制造化學(xué)工業(yè)上重要的酰胺、羧酸、α-羥基羧酸等。進(jìn)一步，通過利用具有光學(xué)特異性水合或光學(xué)特異性水解能力的上述酶，制造作為醫(yī)藥、農(nóng)藥的重要制造原料的光學(xué)活性羧酸、氨基酸、α -羥基羧酸等也變得可能。
[0003]將微生物酶作為催化劑的化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，需要將培養(yǎng)以及收集的微生物菌體的酶的活性穩(wěn)定地維持至使用時為止。即，必須維持酶的活性，以避免由于保管或者運(yùn)輸時雜菌混入、腐敗、或者溶菌導(dǎo)致微生物酶的催化能力喪失或者降低。此處，通常通過在穩(wěn)定劑、代謝抑制劑、高濃度鹽類的存在下進(jìn)行保存，抑制微生物菌體保存時的微生物酶的失活、腐敗和溶菌，從而應(yīng)用于化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。不添加上述穩(wěn)定劑等的情況下，邊通過凍結(jié)、冷藏或者通氣攪拌維持酶的活性邊進(jìn)行保管或者運(yùn)輸。
[0004]專利文獻(xiàn)I (日本特開2004-305066號公報)中公開有通過添加腈類、酰胺類、羧酸類等穩(wěn)定劑的微生物菌體的保存方法；專利文獻(xiàn)2 (日本特開2005-295815號公報)中公開有通過添加疊氮化合物等代謝抑制劑的微生物菌體的保存方法；專利文獻(xiàn)3 (日本特開2001-149065號公報)中公開有通過將微生物菌體的培養(yǎng)液成分添加至懸浮液中的微生物菌體的保存方法。另外，專利文獻(xiàn)4 (日本專利第3163224號)中公開有通過添加高濃度無機(jī)鹽類的保存方法。進(jìn)一步，對于通過冷凍而進(jìn)行保存的方法，已知有專利文獻(xiàn)5 (日本特開2003-219870號公報)，對于通過通氣攪拌而進(jìn)行保存的方法，已知有專利文獻(xiàn)6 (日本特開 2003-144144 號公報)。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)1:日本特開2004-305066號公報
[0008]專利文獻(xiàn)2:日本特開2005-295815號公報
[0009]專利文獻(xiàn)3:日本特開2001-149065號公報
[0010]專利文獻(xiàn)4:日本專利第3163224號
[0011]專利文獻(xiàn)5:日本特開2003-219870號公報
[0012]專利文獻(xiàn)6:日本特開2003-144144號公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]發(fā)明要解決的問題[0014]到目前為止已知的保存方法中，使用穩(wěn)定劑等添加劑的方法由于在后面的工序中需要將添加劑等進(jìn)行分離，因此有對制品的品質(zhì)產(chǎn)生影響的擔(dān)心，且制造方法變得麻煩。以將菌體冷凍的方法保存的微生物菌體的懸浮液存在冷凍、融解操作麻煩等處理性的問題，另外有伴隨著該操作酶活性喪失或者降低的擔(dān)心。另外，從防止雜菌的増殖和菌體細(xì)胞的穩(wěn)定化的觀點出發(fā)，優(yōu)選冷藏下保存，但需要保持低溫的設(shè)備、電力，因此在冷卻成本方面的負(fù)擔(dān)重。將微生物菌體保存在高濃度無機(jī)鹽類水溶液中的方法，需要在使用時將菌體充分地洗滌，存在添加的無機(jī)鹽類、廢水處理花費(fèi)成本的缺點。也報告有通過通氣攪拌等使微生物菌體的酶活性被維持在一定程度，然而根據(jù)酶的不同，該效果并不相同，此外通氣和攪拌還需要動力，在成本方面的負(fù)擔(dān)也重。因此，在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，期望進(jìn)一步穩(wěn)定地保存具有腈水合酶活性的菌體的方法。 [0015]用于解決問題的方案
[0016]本發(fā)明人等對于將由培養(yǎng)、收集而得到的微生物菌體的懸浮液廉價并且穩(wěn)定地運(yùn)輸?shù)臈l件進(jìn)行深入了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過將運(yùn)輸中使用的容器內(nèi)部的氣相設(shè)為20%以下，能夠穩(wěn)定地將具有腈水合酶活性的菌體保存和運(yùn)輸，至此完成本發(fā)明。
[0017]即，本發(fā)明為在能夠密閉的容器內(nèi)保存具有腈水合酶活性的微生物菌體的方法，其特征在于，使填充有包含前述微生物菌體的懸浮液的前述容器內(nèi)的氣相部分占容器內(nèi)部總?cè)莘e的2%以上且20%以下。
[0018]另外，本發(fā)明為一種使用能夠密閉的容器運(yùn)輸具有腈水合酶活性的微生物菌體的方法，其特征在于，使填充有包含前述微生物菌體的懸浮液的前述容器內(nèi)的氣相部分占容器內(nèi)部總?cè)莘e的2%以上且20%以下。
[0019]本發(fā)明的方法中，優(yōu)選將所述容器內(nèi)的氣相部分的比例設(shè)為5%以上且20%以下。另外，前述保存或運(yùn)輸?shù)臏囟葹槔绫c~35°C的溫度。進(jìn)一步，所述菌體懸浮液的分散介質(zhì)為有機(jī)酸水溶液，作為有機(jī)酸可列舉出例如丙烯酸。
[0020]發(fā)明的效果
[0021]根據(jù)本發(fā)明，通過按照使容器內(nèi)部的氣相部分為2%以上且20%以下的方式填充菌體懸浮液，由此能夠在室溫下、無攪拌的情況下在維持腈水合酶等的酶活性的狀態(tài)下保存和運(yùn)輸大量的菌體。進(jìn)一步，本發(fā)明提供能夠?qū)F(xiàn)有的保存方法中必需的勞動力、冷卻成本大幅地削減，能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)的微生物菌體的保存方法。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明涉及在能夠密閉的容器內(nèi)保存具有腈水合酶活性的微生物菌體的方法、以及使用能夠密閉的容器運(yùn)輸微生物菌體的方法。本發(fā)明的方法中，按照使容器內(nèi)的氣相部分為容器內(nèi)部總?cè)莘e的2%以上且20%以下的方式填充包含前述微生物菌體的懸浮液。
[0023]需要說明的是，本說明書中引用的文獻(xiàn)以及公開公報、專利公報等專利文獻(xiàn)作為參照而引入本說明書中。另外，2011年I月14日申請的、作為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本特愿2011-005780號(JP2011-005780)的權(quán)利要求書、說明書、附圖以及說明書摘要所公開內(nèi)容，其整體作為參照而引入本說明書中。
[0024]本發(fā)明中，具有腈水合酶活性的微生物菌體具有生產(chǎn)目標(biāo)酶催化劑并在菌體內(nèi)蓄積或分泌于菌體外的性質(zhì)。該微生物包含由自然界分離的微生物以及基因重組微生物。作為這樣的微生物的代表例，可列舉出例如:歸屬于具有腈水合酶活性的紅球菌(Rhodococcus)屬、戈登菌(Gordona)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、假諾卡氏菌(Pseudonocardia)屬、嗜熱菌(Geobacillus)屬的微生物菌體。進(jìn)一步可列舉出導(dǎo)入這些微生物的腈水合酶基因的重組微生物菌體。其中工業(yè)上優(yōu)選紅球菌屬、戈蘭登屬以及導(dǎo)入這些微生物的腈水合酶基因的重組大腸桿菌以及重組紅球菌屬細(xì)菌。例如:作為紅球菌屬微生物的具體例，可列舉出日本特公平6-55148號公報中記載的紫紅紅球菌J-1株(Rhodococcus rhodochrous J-1)。該株的保藏號為“FERM BP-1478”，于 1987 年 9 月 18 日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)(以下，本說明書中相同))。
[0025]腈水合酶是指具有水解腈化合物并生成對應(yīng)的酰胺化合物能力的酶。作為編碼腈水解酶的核酸及其序列的例子，可列舉出前述專利文獻(xiàn)2所述的核酸及其序列。這樣的核酸通過通常的分子生物學(xué)的手法能夠?qū)胫廖⑸锛?xì)胞內(nèi)(關(guān)于這些分子學(xué)的手法，參照以下:Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning:A Laboratory Manual，，2ndEdition(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
[0026]本發(fā)明中，“能夠密閉的容器”是指為了供于運(yùn)輸和/或保存，填充微生物懸浮液后能夠密閉的容器。只要是運(yùn)輸時內(nèi)容物不在容器內(nèi)外進(jìn)行移動的容器，無論怎樣的形式都沒有關(guān)系，為了用于工業(yè)目的，可以使用鼓形罐、儲存器(container)、槽車等。對于所述容器的容量雖沒有特別的限定，為了用于工業(yè)目的，優(yōu)選200L。對于容器的材質(zhì)也沒有特別的限定，為了用于工業(yè)目的，優(yōu)選為聚乙烯、聚丙烯等塑料容器、鐵.不銹鋼等金屬制的容器。以下，將本發(fā)明中使用的容器稱為“密閉容器”。
[0027]本發(fā)明中，將容器內(nèi)部氣相部分的比例設(shè)為2%以上且20%以下。“2%以上且20%以下”是指:在密閉容器靜置狀態(tài)下，該容器中不存在菌體液的氣相部分的容積比例為總?cè)莘e的2%以上且20%以下。 對于所述氣相部分的氣體組成，沒有特別的限定，出于工業(yè)的理由，通常通入空氣。另外，氣相部分通常在容器內(nèi)的上部。
[0028]通常，使用密閉容器保存或運(yùn)輸液體時，可根據(jù)狀況自由地設(shè)定液體的填充率，而本發(fā)明中，氣相部分相對于容器容積為20%以下。其中，低于2%時，內(nèi)容物由于溫度變化而膨脹、收縮時，有引起容器的變形的擔(dān)心。因此，運(yùn)輸時密閉容器內(nèi)部的氣相部分相對于容器容積可以設(shè)為2~20%、3~20%、4~20%、5~20%等，更優(yōu)選為3~15%、進(jìn)一步優(yōu)選為
4~10%。
[0029]本發(fā)明中，“保存”是指將菌體懸浮液填充于密閉容器內(nèi)后進(jìn)行密閉并且靜置。另外，運(yùn)輸后至實際上使用為止進(jìn)行靜置也包含于“保存”。保存期間為:填充懸浮液起至運(yùn)輸開始為止的時間(保存I)、以及運(yùn)輸結(jié)束起至現(xiàn)場開始使用為止的時間(保存2)。例如:保存I的情況下為I小時~180天，保存2的情況下為I小時~180天，對這些期間沒有限定。另外，本發(fā)明中，“運(yùn)輸”是指使用密閉容器而移動菌體懸浮液的意思。通常地，在卡車、叉車、槽車、船上堆疊密閉容器而移動。
[0030]關(guān)于保存中以及運(yùn)輸中的溫度，為了抑制菌體以及酶的腐敗.分解而更優(yōu)選低溫。具體而言，在冰點~35°C、優(yōu)選冰點~30°C、更優(yōu)選冰點~20°C、進(jìn)一步優(yōu)選冰點~10°C下進(jìn)行。此處，“冰點”是指菌體懸浮液的固體狀態(tài)和液體狀態(tài)的平衡溫度，是根據(jù)懸浮液的組成、保存容器內(nèi)的壓力而變化的溫度。[0031]本發(fā)明中，在前述保存期間后，腈水合酶活性殘留運(yùn)輸開始前的90%以上、優(yōu)選為95%以上、更優(yōu)選為98%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為99%以上、最優(yōu)選為100%。腈水合酶活性的殘留率可以通過該【技術(shù)領(lǐng)域】已知的任一種方法而測定，例如:能夠通過對保存開始前和保存后的丙烯酰胺相對于底物(例如:丙烯腈)的生成反應(yīng)速度等進(jìn)行比較而進(jìn)行測定。[0032]本發(fā)明中，懸浮液的分散介質(zhì)是指作為保存對象的微生物菌體的懸浮中所使用的溶液。該分散介質(zhì)優(yōu)選為有機(jī)酸水溶液。該有機(jī)酸水溶液的有機(jī)酸濃度為任意的，但過低時會導(dǎo)致酶活性的降低，另一方面，過高時在其后的工序中將其除去時操作變得麻煩，因此優(yōu)選為10~100mmol/L。
[0033]本發(fā)明中，浸潰液的組成只要是不阻礙酶活性的有機(jī)酸水溶液就沒有特別的限定。作為有機(jī)酸，可以列舉出例如:丙烯酸、甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、草酸、羧酸；其中，從維持丙烯酰胺的品質(zhì)的觀點出發(fā)，優(yōu)選為丙烯酸。
[0034]本發(fā)明懸浮液的制備中，具有腈水合酶活性的微生物菌體可以使用該【技術(shù)領(lǐng)域】公知的任一種濃縮方法進(jìn)行濃縮，優(yōu)選通過膜分離或離心分離而進(jìn)行濃縮。使用膜分離進(jìn)行濃縮時，優(yōu)選使用具有0.02~0.45μπι孔徑的膜。這樣的膜為市售品，可列舉出例如:中空纖維膜組件(KURARAY C0.，LTD,孔徑0.05 μ m、表面積39000m2)等。另外，通過離心分離進(jìn)行濃縮時，優(yōu)選使用分離板型連續(xù)離心分離機(jī)。
[0035]以下，通過實施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明的實施方法，但是這些實施例的目的在于示出本發(fā)明，對本發(fā)明沒有限定作用。以下的實施例以及比較例中的％這一表述，如沒有特別的說明則為質(zhì)量％。
[0036]實施例
[0037]實施例1以及2、比較例I
[0038]培養(yǎng)
[0039]將具有腈水合酶活性的紫紅紅球菌J 一 I株(Rhodococcus rhodochrous J-1:FERM BP-1478)使用包含葡萄糖2質(zhì)量％、尿素I質(zhì)量％、蛋白胨0.5質(zhì)量％、酵母提取物0.3%、氯化鈷0.05質(zhì)量％的培養(yǎng)基(pH7.0)進(jìn)行需氧培養(yǎng)。
[0040]保存用菌體懸浮液的制備
[0041]將培養(yǎng)后的微生物菌體通過離心分離(12000rpm、20分鐘)進(jìn)行回收后，使用0.1%丙烯酸鈉水溶液(PH7.0)進(jìn)行洗滌。向洗滌后的菌體中添加上述水溶液而得到菌體懸浮液(以干燥菌體計為10質(zhì)量％)。
[0042]菌體懸浮液的保存
[0043]將通過上述方法制備的菌體懸浮液115mL (實施例1)以及70mL (比較例I)加入至總?cè)莘e120mL的聚乙烯制容器中并密封，作為運(yùn)輸?shù)哪Ｐ停?0°C、120rpm下振蕩3周。另外，將通過上述方法制備的菌體懸浮液190L (實施例2)加入至容積200L的聚乙烯制鼓形容器中并密封，在室溫下靜置3個月。
[0044]腈水合酶活性的測定
[0045]就腈水合酶活性而言，使用通過上述方法剛剛制備的菌體懸浮液、制備后振蕩3周或靜置的懸浮液、由這些懸浮液中所包含的菌體的丙烯酰胺生成反應(yīng)速度而算出。將作為底物的丙烯腈水溶液添加至菌體懸浮液而起始反應(yīng)，10°c下振蕩10分鐘后，進(jìn)行菌體的過濾分離和添加磷酸使反應(yīng)停止，通過氣相色譜(GC-14B，島津制作所)進(jìn)行分析。分析條件為:使用填充有Porapack PSCffaters K.K.)的Im玻璃柱，柱溫度210°C、檢測器使用230°C的FID。以下，將以第O天時的反應(yīng)速度為I的相對反應(yīng)速度示于表1中。
[0046][表1]
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種在能夠密閉的容器內(nèi)保存具有腈水合酶活性的微生物菌體的方法，其特征在于，使填充有包含所述微生物菌體的懸浮液的所述容器內(nèi)的氣相部分占容器內(nèi)部總?cè)莘e的2%以上且20%以下。
2.一種使用能夠密閉的容器運(yùn)輸具有腈水合酶活性的微生物菌體的方法，其特征在于，使填充有包含所述微生物菌體的懸浮液的所述容器內(nèi)的氣相部分占容器內(nèi)部總?cè)莘e的2%以上且20%以下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述容器內(nèi)的氣相部分的比例為5%以上且20%以下。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項所述的方法，其中，所述保存或運(yùn)輸?shù)臏囟葹楸c~35 °C的溫度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4的任一項所述的方法，其中，所述菌體懸浮液的分散介質(zhì)為有機(jī)酸水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述有機(jī)酸為丙烯酸。
【文檔編號】C12N9/78GK103620030SQ201280005129
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月14日
【發(fā)明者】竹內(nèi)雅人, 渡邊文昭 申請人:三菱麗陽株式會社