抗旱植物和使用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子制備其的方法
【專利摘要】提供了用于產(chǎn)生與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽有提高的耐受性和/或抗性的遺傳修飾植物的方法。此外，提供了與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽有提高的耐受性和/或抗性的遺傳修飾一年生或多年生作物植物，所述植物能夠在水缺乏或土壤鹽度的條件下實(shí)現(xiàn)較高的植物生物質(zhì)。
【專利說明】抗旱植物和使用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子制備其的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】【背景技術(shù)】[0001]在田間條件下，植物在生長、發(fā)育、生物質(zhì)積累和產(chǎn)量方面的表現(xiàn)取決于對環(huán)境變化和脅迫的適應(yīng)能力。非生物環(huán)境脅迫(例如干旱脅迫和鹽分脅迫)是植物生長和生產(chǎn)力的主要限制因素。暴露于鹽脅迫或干旱條件的植物通常植物材料、種子、果實(shí)和其他可食用產(chǎn)物的產(chǎn)量低。由這些脅迫造成的主要作物(例如稻、玉米和小麥)和林木的作物損失和作物產(chǎn)量損失代表了重要的經(jīng)濟(jì)和政治因素并且加劇了許多欠發(fā)達(dá)國家的食物短缺。開發(fā)耐脅迫和/或抗脅迫植物(尤其是樹木)是可解決或調(diào)解至少一些這些問題的策略。已知耐旱和/或抗旱是復(fù)雜的數(shù)量性特性，并且沒有實(shí)際的診斷標(biāo)志物。這種機(jī)制理解的缺乏使得難以設(shè)計轉(zhuǎn)基因方法來提高水或鹽脅迫耐受和/或抗性。
[0002]盡管產(chǎn)量有損失，但是通常植物展現(xiàn)出對抵抗氣候巨大變化(季節(jié)性變化和長期氣候變化二者)的顯著能力；尤其是在其生命期間經(jīng)受非常大的環(huán)境變化的樹木。該適應(yīng)環(huán)境的能力取決于其響應(yīng)于不利條件而被調(diào)控的數(shù)個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子。它們可直接影響靶基因或者較間接地通過控制發(fā)育過程(例如營養(yǎng)生長或開花轉(zhuǎn)變(floraltransition)的時間)來提高耐受環(huán)境脅迫的能力。真核生物中蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄需要RNA聚合酶II (pol II)和一組參與啟動子識別、轉(zhuǎn)錄泡形成和起始的五個通用轉(zhuǎn)錄因子(GTF) (I) ο pol II還依賴于多蛋白中介體共活化復(fù)合物(multiprotein Mediatorcoactivator complex),其將信號從啟動子結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子傳遞至pol II/GTF(2)。擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的中介體共活化復(fù)合物包含蛋白質(zhì)亞基的核心,一些亞基在其他真核生物中是保守的，而另一些對于植物是特異的(3)。前者中的一個是Med25，其在人細(xì)胞中被鑒定為例如VP16轉(zhuǎn)錄活化蛋白的靶標(biāo)。植物Med25最初被鑒定為PFTl，其為在響應(yīng)于次優(yōu)光條件來誘導(dǎo)開花的光受體通路中起作用的核蛋白(4)，之后被鑒定為茉莉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子并且對于一些死體營養(yǎng)型(necrotrophic)真菌病原體的感染是必需的(5)。
[0003]Medl8也被鑒定為由At2g22370編碼的擬南芥中介體復(fù)合物的亞基(3)。Medl8最初在酵母中被鑒定為Srb5，其為在表達(dá)最大pol II亞基(RNA聚合酶B) C端結(jié)構(gòu)域之截短形式的酵母中發(fā)現(xiàn)的冷敏感表型的抑制子(Thompson CM.，等，1993，Cell73 (7) =1361-75) 0MedlS與Med20結(jié)合并且這兩個亞基都由酵母的非必需基因所編碼。它們位于中介體復(fù)合物的頭部結(jié)構(gòu)(head module)中，其位于pol II全酶中pol II的最近端。
[0004]存在這樣的持續(xù)需要:鑒定在耐受脅迫的植物中表達(dá)的能夠在其宿主植物中調(diào)節(jié)脅迫抗性的基因以及優(yōu)選地在水缺乏和鹽脅迫的條件下尤其地賦予對環(huán)境脅迫的增加的耐受性和/或抗性的其他植物物種。本發(fā)明的一個目的是提供新的方法以賦予植物或植物細(xì)胞干旱和/或鹽脅迫耐受和/或抗性。本發(fā)明的另一個目的是提供與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比具有更強(qiáng)干旱和/或鹽脅迫抗性的遺傳修飾植物，從而實(shí)現(xiàn)更高的植物生物質(zhì)。[0005]發(fā)明概述
[0006]本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽的耐受性和/或抗性提高的遺傳修飾植物的方法，其包括以下步驟:
[0007]1.降低或消除植物細(xì)胞、植物或其部分中中介體亞基(Mediator subunit)的量或活性，
[0008]i1.生成和/或選擇與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽的耐受性和/或抗性提高的遺傳修飾植物，以及在允許所述植物生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其中所述植物為一年生或多年生作物植物。
[0009]所述方法可還包括:
[0010]ii1.使所述遺傳修飾植物分別與自身或另一植物自交或雜交，以產(chǎn)生種子；以及[0011 ] iv.由所述種子培養(yǎng)子代植物，其中所述子代植物對水缺乏和/或鹽的耐受性和/或抗性提高。
[0012]在所述方法的一個實(shí)施方案中，所述亞基為Med25多肽，其包含
[0013]a)活化子相互作用結(jié)構(gòu)域(activator-1nteracting domain),其包含在所述多肽C半端以(a)、(b)和(C)的順序定位的三種肽，并且其中所述肽是:
[0014](a):KY(V/I) KXffEGXLSGQRQGQPV (F/L/I) IX (K/R) (L/M) E (G/A) (Y/F) [SEQ ID NO:5]；
[0015](b):LA (A/S)XffPXXMQIVRLI(S/A)Q(D/E)HMNNKQYVGKADFLVFR(T/A)(M/L) (N/S)XHGFLXQLQ(E/D)KKL[SEQ ID NO:6];和
[0016](c):CAVIQLPSQTLL LS(V/M)(S/A)DKAXRLIGMLFPGDMVVFKPQ[SEQ ID NO:7],
[0017]其中X為任意氨基酸。當(dāng)在給定位置給出兩個或更多個氨基酸作為可替換選擇時，如果這些氨基酸之一以粗體給出，那么表明其在該位置是最高保守的氨基酸。
[0018]在該方法的另一方面中，肽(a)、(b)和(C)的氨基酸序列與SEQ ID NO:9的Med25多肽的相應(yīng)肽有至少80%的同一性。
[0019]在該方法的另一個方面中，所述Med25多肽還包含:
[0020]b) vffF-Α結(jié)構(gòu)域，其包含在所述多肽N半端以(Al)、(A2)、(A3)和(A4)的順序定位的四種肽，所述肽具有以下氨基酸序列:
[0021 ] Al:(E/D)(G/S/T)TAA(L/M/I)GP(Y/F)WXXXXX(D/E)Y (L/V/I)(D/E) (K/E) (I/M) (V/I)R(S/C/Y) [SEQ ID NO:1]；
[0022]A2: (E/D) (L/F) (S/A) (L/I)VX (F/Y) (H/N) XHGX (Y/L) (S/C) (A/G/S) XXVQR (S/T) (G/A)WT(K/R)DX (D/S/N)XF(L/F/I)XffLX(G/A/S)(I/L/M)XFXGGG(F/L)X(D/E)(A/V)(A/S)(I/T)XEGL(A/S)EAL(K/M)(M/I)(L/F)[SEQ ID NO:2]；
[0023]A3: (H/N) C (L/I/V) L(V/I) (A/T) A(S/N/T) NP (Y/H) XLXTPV (Y/F) [SEQ ID NO:3];和
[0024]A4:AEX (V/L) AXXFXXXX (V/I) SLS (V/I) (V/I) (S/C) PKQLP (T/K) (L/I) (K/R) X (I/L)(Y/F) (N/T) (A/S) (G/A) K (R/P) NX (Q/R) XXD (P/L) X (V/L/1) (D/E) [SEQ ID NO:4]。
[0025]在該方法的另一方面中，所述Med25多肽具有與選自SEQ ID NO:9、11、13、15、17、
19、21、23、25、27、29、31、33、35和37的序列有至少80%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0026]在所述方法的第二個實(shí)施方案中，所述亞基是Medl8多肽，其中所述多肽的氨基酸序列與選自 SEQ ID NO:39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69 和 71 的
序列有至少80%的氨基酸序列同一性。
[0027]在第一或第二實(shí)施方案的另一方面中，所述方法包括降低或消除至少一種核酸分子的表達(dá)，其中所述分子選自:組(i)編碼所述Med25多肽或所述MedlS多肽的核酸分子；或組(?)具有選自 SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 和 70 的核酸序列的核酸分子。
[0028]在第一或第二實(shí)施方案的另一方面中，所述方法包括選自以下的至少一個步驟:(a)將編碼能夠形成雙鏈核糖核酸分子之核糖核酸序列的核酸分子引入至少一個植物細(xì)胞中，其中所述雙鏈核糖核酸分子的至少17個核苷酸的片段具有這樣的核酸序列:其與選自組(i)或(ii)的核酸分子有至少50%的核酸序列同一性；(b)將RNAi或反義核酸分子引入至少一個植物細(xì)胞中，其中所述RNAi或反義核酸分子包含至少17個核苷酸的片段，其核酸序列與選自組(i)或(ii)的核酸分子有至少50%的核酸序列同一性；(c)將核酸構(gòu)建體引入至少一個植物細(xì)胞，所述構(gòu)建體能夠與包含選自組(i)或(ii)之核酸分子的內(nèi)源基因重組并沉默、失活或降低其活性；以及(d)在包含選自(i)或(ii)之核酸分子的內(nèi)源基因中引入或檢測非沉默突變。
[0029]在該方法的第一或第二實(shí)施方案的另一方面中，由以下中的任一個引起Med25多肽或MedlS多肽的量或活性的降低或消除:(i)所述植物細(xì)胞、植物或其部分的內(nèi)源基因的自然或誘發(fā)突變，任選地與EC0-TILLING或TILLING組合；(ii)內(nèi)源基因的T-DNA失活；
(iii)內(nèi)源基因的定點(diǎn)誘變或定向育種，其中所述內(nèi)源基因包含選自所述組(i)或(ii)的核酸分子。`
[0030]在第一或第二實(shí)施方案的另一方面中，該方法包括:(a)提供載體，其包含:(i)用于引入至少一個植物細(xì)胞的所述核酸分子；(ii)包含與所述核酸分子相融合的一個或更多個調(diào)控元件的側(cè)翼核酸分子，其中所述調(diào)控元件控制所述核酸分子的表達(dá)；以及(b)用所述載體轉(zhuǎn)化所述植物的至少一個細(xì)胞，以產(chǎn)生與相應(yīng)非轉(zhuǎn)化的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽的耐受性和/或抗性提高的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物。
[0031]在該方法的第一或第二實(shí)施方案的另一方面中，所述植物為以下中的任一種:(a)單子葉作物植物，其選自燕麥屬(Avena spp);稻屬(Oryza spp);大麥屬(Hordeum spp.)；小麥屬(Triticum spp.);黑麥屬(Secale spp.);短柄草屬(Brachypodium spp.);玉蜀黍?qū)?Zea spp.) ； (b)雙子葉作物植物,其選自黃瓜屬(Cucumis spp.);菜豆屬(Phaseolusspp.);大豆屬(Glycine spp.);苜蓿屬(Medicago spp.);蕓苔屬(Brassica spp.)和甜菜屬(Beta spp.) ； (c)闊葉樹,其選自刺槐(acacia)、桉樹、角樹、山毛櫸、桃花心木、胡桃木(walnut)、橡樹、柊木、柳樹、山核桃樹、樺樹、栗樹、楊樹、棺木、楓樹、美國梧桐(sycamore)、銀杏、棕櫚樹和美國楓香樹；(d)針葉樹，其選自柏樹、花旗松、冷杉、紅杉(sequoia)、鐵杉、雪松、杜松(juniper)、落葉松、松樹、赤松(redwood)、云杉和紫杉；(e)產(chǎn)果實(shí)的木本植物，其選自蘋果、李子、梨、香蕉、柑橘、獼猴桃、檸檬、櫻桃、葡萄、番木瓜、花生和無花果；以及(f)木本植物，其選自棉花、竹和橡膠植物。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植物是選自楊樹和桉樹的樹。
[0032]本發(fā)明提供了與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽耐受性和/或抗性提高的遺傳修飾一年生或多年生作物植物，其中所述植物具有量或活性降低的中介體亞基，并且其中所述植物的基因組包含選自以下中任一種的遺傳修飾:i)包含編碼Med25多肽或MedlS多肽之核酸分子的內(nèi)源基因中的非沉默突變；ii)插入所述基因組的轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含編碼能夠形成雙鏈核糖核酸分子之核糖核酸序列的核酸分子，其中所述雙鏈核糖核酸分子的至少17個核苷酸的片段與編碼Med25多肽或Medl8多肽的核酸分子有至少50%的同源性；iii)包含編碼Med25多肽或Medl8多肽之核酸分子的內(nèi)源基因中的突變，這是由將核酸構(gòu)建體引入至少一個植物細(xì)胞中所誘導(dǎo)的，所述構(gòu)建體能夠與所述內(nèi)源基因重組并沉默、失活或降低其活性，其中所述Med25具有與選自SEQ ID ΝΟ:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37之序列有至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且其中所述Medl8多肽具有選自SEQ ID NO:39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69 和 71 的氨基酸序列。
[0033]在另一方面，所述遺傳修飾植物為以下中的任一種:(a)單子葉,其選自燕麥屬；稻屬；大麥屬；小麥屬；黑麥屬；短柄草屬；玉蜀黍?qū)伲?b)雙子葉植物，其選自黃瓜屬；菜豆屬；大豆屬；苜蓿屬；蕓苔屬和甜菜屬；(C)闊葉樹，其選自刺槐、桉樹、角樹、山毛櫸、桃花心木、胡桃木、橡樹、涔木、柳樹、山核桃樹、樺樹、栗樹、楊樹、榿木、楓樹、美國梧桐、銀杏、棕櫚樹和美國楓香樹；(d)針葉樹，其選自柏樹、花旗松、冷杉、紅杉、鐵杉、雪松、杜松、落葉松、松樹、赤松、云杉和紫杉；(d)產(chǎn)果實(shí)的木本植物，其選自蘋果、李子、梨、香蕉、柑橘、獼猴桃、檸檬、樓桃、葡萄、番木瓜、花生和無花果；以及(e)木本植物，其選自棉花、竹和橡膠植物。
[0034]在另一個方面中，所述遺傳修飾植物與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽脅迫具有提高的耐受性，其中所述植物為選自楊樹和桉樹的闊葉樹并且其中所述植物的基因組包含插入所述基因組中的轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含編碼核糖核酸序列的核酸分子，其能夠形成具有SEQ ID No:82、83、84或84中任一個的雙鏈核糖核酸分子。
[0035]在另一方面，所述遺傳修飾植物為種子或其植物部分。
[0036]發(fā)明詳述
[0037]圖1.顯示Med25與每個轉(zhuǎn)錄因子ZFHD1、DREB2A和MYB樣(MYB-1ike)之間相互作用的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。
[0038]將具有(G4-AD-TF)或不具有(G4-AD)轉(zhuǎn)錄因子ZFHD1、DREB2A和MYB樣(之前在雙雜交篩選中分離)的pAD-GAL4_2.1獵物質(zhì)粒(prey plasmid)再轉(zhuǎn)化至酵母株AH109中，其包含表達(dá)具有和不具有與Med25551 ~_氨基酸結(jié)構(gòu)域融合之Gal4-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(G4-DBD和G4-DBD-Med25)的誘餌質(zhì)粒(bait plasmid) pGBKT7。將細(xì)胞鋪板在高嚴(yán)格培養(yǎng)基(SDTrp/-Leu/-His/-Ade)上并在30°C下孵育。實(shí)驗(yàn)顯示，Med25與轉(zhuǎn)錄因子(單獨(dú)不自活化報道基因)之間的相互作用是特異的。
[0039]圖2.與擬南芥Med25蛋白質(zhì)之保守結(jié)構(gòu)域的相互作用必需的DREB2A、ZFHDl和MYB樣蛋白質(zhì)的區(qū)域的鑒定。
[0040](A)用于雙雜交篩選的擬南芥Med25和Med25誘餌構(gòu)建體的總圖示:示出了調(diào)節(jié)子相互作用結(jié)構(gòu)域(regulator interaction domain,RID)、中介體結(jié)合von Willebrand因子A結(jié)構(gòu)域(vWF-A)和Gal4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(G4-DBD)的位置。
[0041 ] (B~D)雙雜交相互作用:示出了所使用的DREB2A⑶、ZFHDl (C)和MYB樣衍生物(D)。示出了 GAL4活化結(jié)構(gòu)域(G4-AD)、HA表位標(biāo)簽(HA)、DREB2A的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(AP2-ERF)、ZFHDl的鋅指二聚化結(jié)構(gòu)域(ZF)以及ZFHDl和MYB樣的DNA結(jié)合同源結(jié)構(gòu)域(HD)。在沒有色氨酸和亮氨酸的平板上的生長顯示出存在誘餌和獵物雙雜交質(zhì)粒二者。另外，在沒有腺嘌呤和組氨酸的平板上的生長表明表達(dá)了兩種報告基因。右圖說明了在沒有(左)和存在(右)Med25(誘餌構(gòu)建體)下的生長。
[0042]圖3.MED25、DREB2A.MYB 樣和 ZFHDl 基因的圖示。
[0043]分別為MED25、DREB2A、MYB 樣和 ZFHDl 基因的圖示以及在 med25 (Atlg25540,SALK_129555)、dreb2a(At5g05410, SAIL_365_F10)、myb 樣(At5g29000, SALK_079505)和zfhdl (Atlg69600, SAIL_818_D10)中T-DNA插入的位置。示出了編碼區(qū)(黑色框)、非翻譯區(qū)(灰色框)、啟動子區(qū)(白色框)和內(nèi)含子(實(shí)心黑線)。
[0044]圖4.擬南芥med25、dreb2a、zfhdl和MYB樣變體對鹽脅迫的應(yīng)答。
[0045]在4°C下將med25、dreb2a、zfhdl和MYB樣擬南芥變體的種子在具有不同濃度NaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)I天，之后在23°C下放置5天，其后對萌發(fā)進(jìn)行評分。獨(dú)立地處理每一個變體:(A)med25、(B) dreb2a> (C) zfhdl> (D)myb樣。對于每種處理和基因型，使用4板49顆籽苗(seedling)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示至少3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0046]圖5.鹽對小立碗蘚(Physcomitrella)野生型和med25a敲除株之集落生長的作用。
[0047]A.在正常光光強(qiáng)度(30ymol/m2s)下培養(yǎng)21天后來自3個med25a敲除株和野生型對照中的每一個的集落的代表性圖片。上列示出在具有0.15M NaCl的B⑶(1mm MgS04、
1.85mm KH2P04、10mm KN03 、45ym FeS04、lmm CaC12、I XHoagland ‘s2 號溶液和 0.8%瓊脂)上的生長。中間列示出作為滲透對照的具有0.30M甘露醇的BCD，以及底列為僅BCD (其中 BCD 培養(yǎng)基包含 ImM MgSO4U.85mM KH2PO4UOmM ΚΝ03、45μΜ FeSO4UmM CaCl2,I XHoagland‘s2號溶液)。B.在不同條件下野生型和med25a變體株的平均集落直徑。示出來自4個集落(WT)或12個集落(med25a)的平均值土S.E.Μ.。使用假設(shè)不齊方差的雙尾雙取樣t檢驗(yàn)測試觀察到的差異的顯著性。星號表示在P = 0.0014時差異顯著。
[0048]圖6.在短日間光照下生長的擬南芥med25變體相對于野生型的抗旱性。
[0049](A)在白光熒光管(40~70 μ mo 1.m_2.s—1)下于22 °C在短日間條件(9小時/15小時；白天/夜晚)下干旱脅迫后野生型和med25變體植物的表型。在與蛭石混合的土壤(2: I)上用正常澆水條件培養(yǎng)植物4周，之后分成兩組。一組(D，干旱)在同一光照條件下不澆水培養(yǎng)3周，之后再澆一次水。另一組(C，對照)在相同光照下以正常澆水條件培養(yǎng)4周。(B)再澆水后7天評估干旱脅迫后植物的存活率。對于每種基因型和處理，使用15株植物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0050]圖7.在長日間光照下生長的擬南芥med25變體相對于野生型的抗旱性。
[0051](LD).在白光突光管(40~70 μ mol.m 2.s O下于22°C對于LD (16小時/8小時；白天/夜晚)用正常澆水條件在與蛭石混合的土壤(2:1)上將植物培養(yǎng)3周。之后，一部分在相同光照條件下再培養(yǎng)3周但不澆水(D，干旱)，然后再澆一次水。在相同光照和澆水條件下培養(yǎng)另一部分植物(C，對照)。A.再澆水后7天在LD條件下一個干旱脅迫實(shí)驗(yàn)的圖片。B.在LD條件下再澆水后7天每種處理和基因型的最具代表性植物的圖片。
[0052]圖8.DREB2A在光量途徑(light quality pathway)中PhyB的下游起作用并且與Med25相比對開花時間具有相反作用。
[0053](A)在10 μ mol m-2s-l的紅光下培養(yǎng)所示基因型5天的6天齡籽苗的下胚軸長度。(B)在長日間條件(16小時白天/8小時夜晚；22°C/16°C)下生長的不同基因型的開花時間。對于每種處理和基因型，使用5板至少20株籽苗進(jìn)行(A)和(B)中的實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示至少3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。(C)在正常光照條件下對下胚軸長度的影響。在長日間條件下將在A和B中描述的野生型和變體植物培養(yǎng)4周。(D) DREB2A-中介體相互作用如何應(yīng)答于光量調(diào)節(jié)開花時間的模型。示出了 DREB2A的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)、阻遏結(jié)構(gòu)域(RD)、Med25相互作用結(jié)構(gòu)域(ID)和活化結(jié)構(gòu)域(AD)。MedX和MedY表示兩種目前尚未鑒定的中介體亞基。
[0054]圖9.med8、medl8和med25擬南芥T-DNA變體對鹽脅迫的抗性。在具有不同濃度NaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基上將所示變體的種子在4°C下培養(yǎng)I天，然后在23°C下放置5天，其后對萌發(fā)進(jìn)行評分。單獨(dú)處理每種基因型。對于每種處理和基因型，使用4板49株籽苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示至少3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。存活率以相對于野生型植物的存活％給出。
[0055]圖10.medl8擬南芥T-DNA變體對干旱脅迫的抗性。在正常澆水條件下將十五株Medl8缺陷型變體植物和十五株野生型植物培養(yǎng)4周，之后將植物分成兩組。一組在持續(xù)光照條件下不澆水培養(yǎng)3周，之后再澆一次水，再澆水后7天評估存活率。在相同光照條件和正常澆水條件下將對照組培養(yǎng)4周。數(shù)據(jù)表示3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0056]圖11.包含MED18構(gòu)建組的轉(zhuǎn)基因楊樹對暴露于干旱脅迫的抗性。
[0057](A)干旱脅迫之前和之后野生型(WT)和MED18轉(zhuǎn)基因構(gòu)建組405的生長速率。箭頭表示當(dāng)開始干旱脅迫的時間點(diǎn)；
[0058](B)在干旱脅迫期間生長的樹木的百分比；
[0059](C)干旱脅迫后每個構(gòu)建組`中楊樹的存活率。
[0060]將樹木轉(zhuǎn)移至土壤并在長日間光照條件(18小時，22°C /6小時，15°C ;白天/夜晚)下生長。6周后，使樹木不澆水生長7天，隨后澆水，其中4天后對存活率進(jìn)行評分。干旱脅迫之前每周和干旱脅迫期間每天對樹的大小進(jìn)行評分。每個品系使用3棵樹進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，5個品系屬于構(gòu)建組405，以及野生型樹15WT (克隆T89)。
[0061]1.中介體亞基在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中充當(dāng)樞紐(hub)
[0062]1.1 Med25
[0063]多肽Med25是構(gòu)成在植物中發(fā)現(xiàn)之中介體共活化復(fù)合物的蛋白質(zhì)亞基核心之一，并且在真核生物進(jìn)化中是廣泛保守的?，F(xiàn)在表明Med25作為樞紐來發(fā)揮作用，其整合來自數(shù)個不同環(huán)境線索的信號以控制發(fā)育。證明轉(zhuǎn)錄因子Dreb2A、ZFHDl和MYB樣均作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子來發(fā)揮作用，其通過與Med25相互作用以調(diào)節(jié)靶基因，所述靶基因編碼參與鹽脅迫和干旱耐受性的植物應(yīng)答的蛋白質(zhì)。出乎意料地，發(fā)現(xiàn)Med25的量或活性被降低或消除的植物表現(xiàn)出對水缺乏耐受性和/或抗性提高。
[0064]1.1I Medl8
[0065]多肽Medl8是構(gòu)成在植物中發(fā)現(xiàn)的中介體共活化復(fù)合物的蛋白質(zhì)核心中的另一亞基，并且其序列在真核生物進(jìn)化中也是廣泛保守的(圖9)。
[0066]出乎意料地，發(fā)現(xiàn)Medl8的量或活性被降低或消除的植物展現(xiàn)出對水缺乏和鹽脅迫二者耐受性和/或抗性提高。
[0067]II中介體亞基的結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域
[0068]I1.I Med25
[0069]Med25是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的中介體共活化復(fù)合物的亞基，其將信號從啟動子結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子傳達(dá)至pol II/GTF，這是控制基因轉(zhuǎn)錄所必需的。Med25是分子量為約80~120kDa的多肽，其特征在于多肽N半端的保守“vWF_A樣(vWF-A_like) ”結(jié)構(gòu)域(對應(yīng)于人中的核心中介體結(jié)合von Willebrand因子結(jié)構(gòu)域(vWF-A));和位于多肽C半端的保守活化子相互作用(ACID)結(jié)構(gòu)域(也稱為調(diào)節(jié)子相互作用結(jié)構(gòu)域，RID)。Med25的這兩個功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在植物中是保守的(參見表1):
[0070]植物中“vWF-A樣”結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸序列為:
[0071 ] (E/D) (G/S/T) TAA (L/M/I) GP (Y/F) WXXXXX (D/E) Y (L/V/I) (D/E) (K/E) (I/M) (V/I)R(S/C/Y)(6-29X)(E/D)(L/F)(S/A)(L/I)VX(F/Y)(H/N)XHGX(Y/L)(S/C) (A/G/S)XXVQR (S/T)(G/A)WT (K/R)DX(D/S/N)XF(L/F/I)XffLX(G/A/S)(I/L/M)XFXGGG(F/L)X(D/E)(A/V) (A/S)(I/T)XEGL(A/S)EAL(K/M)(M/I)(L/F)(15-17X)(H/N)C(L/I/V)L(V/I) (A/T)A (S/N/T)NP (Y/H)XLXTPV(Y/F)(21-23X)AEX (V/L)AXXFXXXX (V/I)SLS (V/I) (V/I) (S/C)PKQLP (T/K) (L/I)(K/R) X (I/L) (Y/F) (N/T) (A/S) (G/A) K (R/P) NX (Q/R) XXD (P/L) X (V/L/1) (D/E)。
[0072]以下具體示出的“vWF-A樣”結(jié)構(gòu)域內(nèi)的四個結(jié)構(gòu)域(Al至A4)具有最高保守的氨基酸序列:
[0073]vffF-Al:具有 SEQ ID NO:1 的
[0074](E/D) (G/S/T) TAA (L/M/I) GP (Y/F) WXXXXX (D/E) Y (L/V/I) (D/E) (K/E) (I/M) (V/I)R(S/C/Y)；
[0075]vffF-A2:具有 SEQ ID NO:2 的
[0076](E/D) (L/F) (S/A) (L/I)VX (F/Y) (H/N) XHGX (Y/L) (S/C) (A/G/S) XXVQR (S/T) (G/A)WT(K/R)DX(D/S/N)XF(L/F/I)XffLX(G/A/S)(I/L/M)XFXGGG (F/L)X (D/E)(A/V)(A/S) (I/T)XEGL(A/S)EAL(K/M)(M/I)(L/F)；
[0077]vffF-A3:具有 SEQ ID NO:3 的
[0078](H/N) C (L/1/V) L (V/I) (A/T) A (S/N/T) NP (Y/H) XLXTPV (Y/F)；
[0079]vffF-A4:具有 SEQ ID NO:4 的
[0080]AEX (V/L) AXXFXXXX (V/I) SLS (V/I) (V/I) (S/C) PKQLP (T/K) (L/I) (K/R) X (I/L) (Y/F) (N/T) (A/S) (G/A) K (R/P) NX (Q/R) XXD (P/L) X (V/L/1) (D/E)；
[0081]其中，X為任意氨基酸，選自丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。
[0082]優(yōu)選地，肽(Al)和肽(A2)通過長度為6至29個氨基酸殘基的肽連接。
[0083]優(yōu)選地，肽(A2)和肽(A3)通過長度為15至17個氨基酸殘基的肽連接。
[0084]優(yōu)選地，肽(A3)和肽(A4)通過長度為19至21個氨基酸殘基的肽連接。當(dāng)在給定位置給出兩個或更多個氨基酸作為可替換選擇時，如果這些氨基酸之一以粗體給出，那么表明其在該位置為最高保守氨基酸。
[0085]植物中“ACID結(jié)構(gòu)域”的保守氨基酸序列包含在Med25C半端以(a)、(b)和(C)的順序定位的3個肽序列:
[0086]肽(a):KY(V/I)KXWEGXLSGQRQGQPV(F/L/I) IX(K/R) (L/M)E(G/A) (Y/F) [SEQ IDNO:5][0087]肽(b):
[0088]LA (A/S) XffPXXMQIVRLI (S/A) Q (D/E) HMNNKQYVGKADFLVFR (T/A) (M/L) (N/S)XHGFLXQLQ(E/D)KKL[SEQ ID NO:6]
[0089]肽(c):
[0090]CAVIQLPSQTLLLS(V/M)(S/A)DKAXRLIGMLFPGDMVVFKPQ[SEQ ID NO:7]；
[0091]其中，X為任意氨基酸，選自丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。
[0092]優(yōu)選地，肽(a)和肽(b)通過長度為8至14個氨基酸殘基的肽連接。
[0093]優(yōu)選地，肽(b)和肽(C)通過長度為O至35個氨基酸殘基的肽連接。當(dāng)在給定位置給出兩個或更多個氨基酸作為可替換選擇時，如果這些氨基酸之一以粗體給出，那么表明其在該位置為最高保守氨基酸。
[0094]Med25多肽或其肽的氨基酸序列中的一些氨基酸殘基顯示保守性替換，例如在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)的組內(nèi)。保守性氨基酸替換通常不改變多肽的功能特性，最常見的替換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。
[0095]因此，本發(fā)明的Med25多肽包含兩個結(jié)構(gòu)域(“vWF_A樣”結(jié)構(gòu)域和“ACID結(jié)構(gòu)域”)，認(rèn)為其各自的功能有助于結(jié)合中介體復(fù)合物并且有助于與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，Med25借此充當(dāng)樞紐以在植物或植物細(xì)胞中控制對水缺乏的耐受性和/或抗性和/或鹽脅迫抗性?！皏WF-A樣”結(jié)構(gòu)域和“ACID”結(jié)構(gòu)域是Med25多肽內(nèi)的肽區(qū)域，其中“vWF_A樣”結(jié)構(gòu)域肽包含從最N端肽開始以連續(xù)順序的4種肽(具有氨基酸序列[SEQ ID NO:1、2、3和4])，“ACID”結(jié)構(gòu)域包含從最N端肽開始以連續(xù)順序的3種肽(具有氨基酸序列[SEQ ID NO:5、6 和 7])。
[0096]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Med25多肽包含
[0097]“vWF-A樣”結(jié)構(gòu)域，其包含連續(xù)順序的4種肽(具有氨基酸序列[SEQ ID NO:1、
2、3和4])，其中肽(Al) [SEQ ID NO:1]和肽(A2) [SEQ ID NO:2]通過長度為6至29個氨基酸殘基的肽連接；肽(A2) [SEQ ID NO:2]和肽(A3) [SEQ ID NO:3]通過長度為15至17個氨基酸殘基的肽連接；以及肽(A3) [SEQ ID NO:3]和肽(A4) [SEQ ID NO:4]通過長度為19至21個氨基酸殘基的肽連接；以及
[0098]“ACID”結(jié)構(gòu)域，其包含連續(xù)順序的3種肽(具有氨基酸序列[SEQ ID NO:5、6和
7])，其中肽(a) [SEQ ID NO:5]和肽(b) [SEQ ID NO:6]通過長度為8至14個氨基酸殘基的肽連接；肽(b) [SEQ ID NO:6]和肽(c) [SEQ ID NO:7]通過長度為O至35個氨基酸殘基的肽連接。本發(fā)明的Med25多肽優(yōu)選地具有約80至約120KDa的分子量。[0099]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Med25多肽為包含“vWF_A樣”結(jié)構(gòu)域和“ACID”結(jié)構(gòu)域二者的多肽，所述“vWF-A樣”結(jié)構(gòu)域包含具有氨基酸序列[SEQ ID NO:2、3、4和5]的4種肽，所述“ACID”結(jié)構(gòu)域包含具有[SEQ ID NO:6、7和8]的三種肽，其中，如使用下列序列比較算法之一或通過視檢所測量的，在以最高對應(yīng)性進(jìn)行比較和比對時，Med25多肽的“vWF-A樣”結(jié)構(gòu)域和“ACID”結(jié)構(gòu)域中每個肽的氨基酸序列分別與具有SEQ ID NO:9的葡萄(Vitis vinifera)Med25多肽的對應(yīng)結(jié)構(gòu)域有至少58%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高的氨基酸殘基序列同一'I"生。
[0100]術(shù)語“序列同一性百分比”是指相同長度的兩個氨基酸序列之間同源性程度的定量測量。當(dāng)待比較的兩個序列長度不同時，通過允許插入缺口或者多肽序列或核苷酸序列末端的截短來對它們進(jìn)行比對以給出最佳可行匹配。(Nref-Ndlf) 100可計算為<Nref>，其中Nd[iota]f是比對時兩個序列中不同殘基的總數(shù)，并且其中Nref是一個序列中的殘基數(shù)。一個或多個序列之間的序列同一'I"生百分比也可基于使用clustalW軟件(http://www.eb1.ac.uk/clustalff/index, html)白勺I:匕對。
[0101]Med25多肽(包含“vWF_A樣”結(jié)構(gòu)域和“ACID”結(jié)構(gòu)域二者，所述“vWF_A-樣”結(jié)構(gòu)域包含從最N端肽開始以連續(xù)順序的4種肽(具有氨基酸序列[SEQ ID NO:1、2、3和4])，所述“ACID”結(jié)構(gòu)域包含從最N端肽開始以連續(xù)順序的3種肽(具有氨基酸序列[SEQ IDNO:5、6和7])，其中Med25多肽的“vWF_A樣”結(jié)構(gòu)域和“ACID”結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分別與具有SEQ ID NO:9的葡萄Med25多肽的對應(yīng)結(jié)構(gòu)域分別有至少58%至80%的氨基酸序列同一性)的一個實(shí)例為選自以下的Med25:葡萄(GSVIVT0101193900) [SEQ ID NO:9];擬南芥(Atlg25540) [SEQ ID NO:11] ;二穗短柄草(Brachypodium distachyon) (Bradi4g27750.1)[SEQ ID NO:13];番木瓜(Carica papaya) (Cpa evm 模型 supercontigl211) [SEQ IDNO:15]；黃瓜(Cucumis sativus)(Cucsa283830)[SEQ ID NO: 17]；巨按(Eucalyptusgrandis)(預(yù)測)[SEQ ID NO:19];大豆(Glycine max) (Glyma02gl0880) [SEQ ID NO:21]；蔡藜苜猜(Medicago trunculata) (Medtr5g068600) [SEQ ID NO:23];猴面花(Mimulusguttatus)(mgvIaOO1668m)[S EQ ID NO:25]；水稻(Oryza sativa) (0s09gl3610)[SEQID NO:27];毛果楊(Populus trichocarpa) (P0PTR0010sl3870) [SEQ ID NO:29];楊屬(Populus) 2 (P0PTR_0008sl 1650) [SEQ ID NO:31];蜀黍(Sorghum bicolor) (Sb02g020790)[SEQ ID NO:33];小麥(Triticum aestivum) (EF029089) [SEQ ID NO:35];玉米(Zea mays)(GRMZM2G138178T01)[SEQ ID NO:37]；
[0102]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，Med25多肽與具有選自SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35 和 37 之氨基酸序列的 Med25 多肽有至少 70、75、80、85、90、95 的氨基酸序列百分比同一性。
[0103]I1.1I Medl8
[0104]Medl8是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的中介體共活化復(fù)合物的亞基，并且在酵母中其與Med20相互作用。Medl8是具有約20~25kDa之分子量的多肽，其特征在于高度保守的氨基酸序列(參見表2)，如使用序列比較算法或通過視檢測量的(如I1.1下限定的)，在以最高對應(yīng)性進(jìn)行比較和比對時,其與具有[SEQ ID N0:65]的蓖麻(Ricinus communis)Medl8多肽的氨基酸序列有至少70%、75%，優(yōu)選80%或85%，更優(yōu)選90%、91%、92%、93%、94%、95%,96%,97%,98%,99%,99.5%或更高的氨基酸殘基序列一致性。
[0105]植物Medl8多肽的一個實(shí)例是選自以下的多肽:深山南芥(Arabidopsis Iyrata)[SEQ ID NO:39];擬南芥[SEQ ID NO:41] ;二穗短柄草[SEQ ID NO:43];番木瓜[SEQ IDNO:45];黃瓜[SEQ ID NO:47];巨桉[SEQ ID NO:49];大豆 I [SEQ ID NO:51];大豆 2 [SEQID NO:53];大豆 3[SEQ ID NO:55];木薯(Manihot esculenta) [SEQ ID NO:57];猴面花[SEQ ID NO:59];水稻[SEQ ID NO:61];毛果楊[SEQ ID NO:63];蓖麻[SEQ ID NO:65]；蜀黍[SEQ ID NO:67];葡萄[SEQ ID NO:69];和玉米[SEQ ID NO:71]；
[0106]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，Medl8多肽與具有選自SEQ ID NO:39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69 和 71 之氨基酸序列的 Medl8 多肽有至少 70、75、80、85、90、95的氨基酸序列百分比同一性。
[0107]I1.1II用于鑒定Medl8和Med25蛋白質(zhì)以及相應(yīng)基因的方法
[0108]可使用公開的BLAST資源鑒定具有SEQ ID NO:Z之Medl8蛋白質(zhì)或具有SEQ IDNO:10之Med25蛋白質(zhì)的直系同源物(ortholog)和旁系同源物(paralog)以及其相應(yīng)的基因/cDNA，隨后使用T-coffee程序以比對并選擇序列。實(shí)施例7中示例了這種鑒定和選擇方法的實(shí)現(xiàn)。
[0109]III編碼中介體亞基的核酸分子
[0110]II1.1 Med25
[0111]本發(fā)明的MED25核酸分子編碼部分I`1.1所定義的Med25多肽。
[0112]在一個實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明Med25多肽的MED25核酸分子是具有這樣的核酸序列的MED25核酸分子，所述核酸分子與選自以下的MED25核酸分子有至少60%、70 %、75 %、優(yōu)選 80 % 或 85 %、更優(yōu)選 90 %、91 %、92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98%、99%、99.5%或更高的核酸殘基序列同一性:葡萄(GSVIVT0101193900) [SEQ ID NO:
8];擬南芥(Atlg25540) [SEQ ID NO: 10] ; 二穗短柄草(Bradi4g27750.1) [SEQ ID NO:
12];番木瓜(Cpa evm 模型 supercontigl211) [SEQ ID NO: 14]；黃瓜(Cucsa283830)[SEQ ID NO:16];巨桉(預(yù)測)[SEQ ID NO:18];大豆(Glyma02gl0880) [SEQ ID NO:20];蒺藜苜蓿(Medtr5g068600) [SEQ ID NO:22];猴面花(mgv IaOO 1668m) [SEQ ID NO:24];水稻(0s09gl3610) [SEQ ID NO:26];毛果楊(P0PTR0010sl3870) [SEQ IDNO:28];楊M 2(P0PTR_0008sll650) [SEQ ID NO:30];蜀黍(Sb02g020790) [SEQ ID NO:32];小麥(EF029089) [SEQ ID NO:34];和玉米(GRMZM2G138178T01) [SEQ ID NO:36]。
[0113]II1.1I Medl8
[0114]本發(fā)明的MED18核酸分子編碼具有約20至約25Kda.分子量的Medl8多肽，其具有與選自以下的MED18核酸分子有至少60 %、70 %、75 %、優(yōu)選80 %或85 %、更優(yōu)選90 %、91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%或更高核酸殘基序列同一性的核酸序列:深山南芥[SEQ ID NO:38];擬南芥[SEQ ID NO:40] ;二穗短柄草[SEQ ID NO:42];番木瓜[SEQ ID NO:44];黃瓜[SEQ ID NO:46];巨桉[SEQ ID NO:48];大豆 I [SEQID NO:50];大豆2[SEQ ID NO:52];大豆3[SEQ ID NO:54];木薯[SEQ ID NO:56];猴面花[SEQ ID NO:58];水稻[SEQ ID NO:60];毛果楊[SEQ ID NO:62];蓖麻[SEQ ID NO:64]；蜀黍[SEQ ID NO:66];葡萄[SEQ ID NO:68];和玉米[SEQ ID NO:70]。
[0115]IV用于產(chǎn)生水缺乏耐受性和/或抗性和/或鹽脅迫抗性提高的本發(fā)明遺傳修飾植物的方法
[0116]中介體亞基(Med25和Medl8)充當(dāng)樞紐用于在植物或植物細(xì)胞中控制對水缺乏的耐受性和/或抗性和/或鹽脅迫抗性。根據(jù)本發(fā)明，植物或其細(xì)胞中Med25功能活性的降低使所述植物或植物細(xì)胞對水缺乏的耐受性和/或抗性提高。類似地，植物或其細(xì)胞中Medl8功能活性的降低使所述植物或植物細(xì)胞對水缺乏和鹽脅迫的耐受性和/或抗性提高。下列方法用于舉例說明在植物細(xì)胞中下調(diào)或沉默Med25或MedlS之功能活性的可替換方式，其中Med25多肽或Medl8多肽各由植物細(xì)胞基因組中的核酸分子編碼。
[0117]IV.1在MED25和MED18核酸分子(MED25基因和MED18基因)中誘導(dǎo)突變和TILLING
[0118]在MED25或MED18基因中可通過突變的方式(例如點(diǎn)突變)實(shí)現(xiàn)在植物細(xì)胞中分別編碼Med25和Medl8之MED25或MED18核酸分子(如上述部分III限定)的表達(dá)的下調(diào)或沉默?？蓪⑼蛔冸S機(jī)地引入植物細(xì)胞的基因組中，之后可通過特定的方法如TILLING(基因組中定向誘導(dǎo)局部損傷，Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)來選擇經(jīng)突變的植物細(xì)胞。對于TILLING，通過用化學(xué)誘變劑(例如EMS)處理植物組織(例如種子或其他可再生組織)的個體樣品來誘導(dǎo)突變。之后，從這些個體中制備基因組DNA并排布在庫(pool)中用于最初篩選。這些庫作為模板，用于使用擴(kuò)增MED25或MED18核酸分子之區(qū)域的引物進(jìn)行的PCR。對于該目的，可制備一系列引物，其序列與MED25或MED18核酸分子之上游鏈或下游鏈的區(qū)域互補(bǔ)，其中引物用來篩選MED25或MED18基因的長度。通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性和再退火，庫中的突變片段和野生型之間形成異源雙鏈體。這些異源雙鏈體為核酸酶CEL I切割的底物。消化后,用標(biāo)準(zhǔn)突光測序平板凝膠電泳(fluorescent sequencing slabgel electrophoresis)對所得產(chǎn)物進(jìn)行可視化。之后，將陽性庫再作為單個DNA篩選，從而鑒定突變植物和突變在序列中的大致位置。該位置信息增加了序列分析的有效性，因?yàn)椴贿@樣時雜合突變可以是難以鑒定的。高通量TILLING例如描述于Colbert等(2001)PlantPhysiology 126:480-484并且最近已經(jīng)施用于作物[綜述參見Slade和Knauf, TransgenicRes.2005Apr ；14(2):109-15] 0之后，根據(jù)Med25或Medl8的表達(dá)以及植物或其植物細(xì)胞中由于功能性Med25或MedlS的降低表達(dá)而對水缺乏的耐受性和/或抗性的提高，對攜帶(非沉默，11011-8；[16111:)1^1)25或1^1)18基因沉默突變(silencing mutation)的選定再生植物進(jìn)行篩選。認(rèn)為由于其基因組中的化學(xué)誘發(fā)突變而使MED25或MED18基因表達(dá)被下調(diào)或沉默的植物和植物細(xì)胞被“遺傳修飾”，由于它們不包含引入其基因組的轉(zhuǎn)基因，所以不認(rèn)為它們是重組植物或植物細(xì)胞。
[0119]IV.1I MED25 或 MED18 核酸分子(MED25 基因或 MED18 基因)中的 EC0-TILLING
[0120]在植物細(xì)胞中下調(diào)或沉默分別編碼Med25和Medl8之MED25或MED18核酸分子(如上述部分III所限定)的表達(dá)還可通過發(fā)生在自然植物類群中的自然突變所引起，這導(dǎo)致MED25或MED18基因的(非沉默)沉默突變。Eco-tilling采用TILLING方法以鑒定在植物類群中這些自然存在的突變(多態(tài)性)，而不是篩選植物中實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的突變。在EC0TILLING中采用的引物和方法與上述TILLING描述的那些(部分IV.1)相同。
[0121]IV.1ll MED25或MED18核酸分子(MED25基因或MED18基因)中的T-DNA插入
[0122]還可通過T-DNA 誘變[Koncz 等(1992)Plant Mol.Biol.20(5):963-976]獲得植物細(xì)胞中分別編碼Med25和Medl8的MED25或MED18核酸分子(如上述部分III所限定)的表達(dá)下調(diào)或沉默，其中T-DNA用于隨機(jī)地將突變引入植物基因組中，然后選擇在內(nèi)源MED25或MED18基因中包含(非沉默)沉默突變的植物。隨后可使用跨越MED25或MED18基因的PCR引物對系列通過PCR或其他高通量技術(shù)來鑒定其中內(nèi)源MED25或MED18基因發(fā)生突變的植物或植物細(xì)胞[Krysan 等，(1999)T_DNA as an insertional mutagen inArabidopsis, Plant Cell,11,2283-2290]。
[0123]IV.1V MED25或MED18核酸分子(MED25基因或MED18基因)中的定向誘變
[0124]表達(dá)不可翻譯形式之基因的載體(例如包含一個或更多個終止密碼子或者無義突變的序列)也可用于在植物細(xì)胞中下調(diào)或沉默分別編碼Med25和Medl8的MED25或MED18核酸分子(如上述部分III所限定)的表達(dá)。用于產(chǎn)生這種構(gòu)建體的方法描述于美國專利N0.5，583，021。特別地,可通過將提前終止密碼子(premature stop codon)引入基因中來制備這種構(gòu)建體。進(jìn)行靶向DNA插入的一種方式是通過使用如W02006078431中描述的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA整合機(jī)制。該技術(shù)是基于這樣的可能性:通過將整合酶與DNA結(jié)合蛋白(拴蛋白，tethering protein)有效連接來改變逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子整合酶特異的整合位點(diǎn)。整合酶的改造優(yōu)選在核酸水平上進(jìn)行(通過PCR改變編碼整合酶序列的野生型)。因此，整合酶復(fù)合物可針對基因組DNA的期望部分(MED25或MED18基因內(nèi))，從而產(chǎn)生MED25或MED18基因中的(非沉默)沉默突變。
[0125]IV.V用于沉默Med25或Medl8表達(dá)的反義轉(zhuǎn)基因
[0126]可通過將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化入宿主植物獲得宿主植物中自然存在的MED25或MED18基因的表達(dá)的下調(diào)或沉默，所述轉(zhuǎn)基因包含編碼Med25或MedlS多肽或者其部分的核酸分子(如上述部分III所限定)，或者其核酸序列為編碼Med25或MedlS多肽或者其部分之核酸分子的反義序列的分子。多種傳統(tǒng)的正義和反義技術(shù)為本領(lǐng)域所知，例如，如在Lichtenstein 和 Nellen (1997), Antisense Technology:A Practical Approach IRLPress at Oxford University, Oxford,England中所述。反義方法的目的是使用與革巴向基因互補(bǔ)的序列來阻斷其表達(dá)并建立 這樣的突變細(xì)胞系或生物體，其中單個選定蛋白質(zhì)的水平被選擇性降低或消除。對于反義抑制，以與包含啟動子序列(包含在轉(zhuǎn)基因內(nèi))的核酸分子相反的方向(即相對于編碼序列反義)排列編碼Med25或MedlS或者其部分的核酸分子(如上述部分III所限定；例如cDNA)。當(dāng)穩(wěn)定引入植物細(xì)胞的基因組時，所述轉(zhuǎn)基因不需要對應(yīng)全長MED25或MED18cDNA或基因，并且不需要與待轉(zhuǎn)化植物類型中存在的MED25或MED18cDNA或基因相同。核酸分子的反義序列僅需要能夠與編碼Med25或Medl8的基因或RNA雜交。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)基因包含較短長度的反義核酸分子時，對于有效的反義抑制而言，將需要較高程度的與編碼Med25或Medl8之內(nèi)源序列的核酸序列同一性[優(yōu)選至少50、60、70、80、85、90、95或100%核酸序列同一性]。盡管可利用多種長度的反義核酸分子，但是優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因中的引入的反義分子將具有15~30個核苷酸的長度，例如16~28個核苷酸、17~26個核苷酸或18~24個核苷酸的長度，并且隨著反義分子長度增加，會通常觀察到反義抑制的加強(qiáng)。優(yōu)選地，反義分子的長度將大于100個核苷酸。反義核酸分子的轉(zhuǎn)錄(如所述)導(dǎo)致產(chǎn)生這樣的RNA分子，其反向互補(bǔ)從植物細(xì)胞內(nèi)源MED25或MED18基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子。對于在植物細(xì)胞中施用的基因表達(dá)反義調(diào)節(jié)的更詳盡描述，參考美國專利N0.5，107, 065，其內(nèi)容以其全部并入本文。
[0127]IV.VI用于沉默Med25或Medl8表達(dá)的RNAi轉(zhuǎn)基因[0128]可通過“RNA干擾”或“RNAi”獲得宿主植物中自然存在的MED25或MED18基因的下調(diào)或沉默表達(dá)=RNAi利用雙鏈RNA分子或短發(fā)夾RNA來改變與其具有基本或完全同源性之核酸序列的表達(dá)。術(shù)語“RNAi下調(diào)”指一種或更多種RNAi物質(zhì)介導(dǎo)的核酸序列表達(dá)的降低。術(shù)語“RNAi物質(zhì)(RNAi species)”指引發(fā)RNAi的獨(dú)特RNA序列。然而，在植物中，由RNAi引起的基因沉默可在植物細(xì)胞之間傳播，因此RNA干擾的作用在植物中是系統(tǒng)性的和可遺傳的。對于通過dsRNA的轉(zhuǎn)錄在植物中進(jìn)行RNAi基因抑制的詳細(xì)信息，參考美國專利N0.6，506，559、美國專利申請公開N0.2002/0168707A1以及美國專利申請序列號 09/423，143 (參見 W098/53083)、序列號 09/127，735 (參見 W099/53050)和序列號09/084, 942 (參見W099/61631)，其所有通過引用以其全部并入本文。
[0129]可使用包含作為啟動子起作用的核酸分子的轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)MED25或MED18基因通過RNA干擾的抑制，所述啟動子與包含MED25或MED18基因(包含如上述部分III所限定的核酸分子)基因組DNA和cDNA區(qū)段的正義和反義元件的核酸分子有效連接，例如，至少約17個核苷酸的區(qū)段，如至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500或至少750個核苷酸，或者如至少lkb、如至少1，5kb、至少2kb、至少2.5kb或如至少3kb,其中，正義和反義DNA組分可直接連接,或通過可在轉(zhuǎn)錄的RNA雜交以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時形成環(huán)的人工DNA區(qū)段或內(nèi)含子連接。所述轉(zhuǎn)錄的核糖核酸分子的至少17個核苷酸的片段與編碼Med25多肽或Medl8多肽的核酸分子有至少50、60、70、80、85、90、95或100%的核酸序列同一性。啟動子可選自組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性啟動子，其與包含正義和反義元件的所述核酸分子有效地5’ (5-prime)連接。這種核酸分子已經(jīng)由Brummel D.A.等，Plant Journal2003, 33,第 10 793-800 頁進(jìn)行了描述。
[0130]在另一個實(shí)例中，構(gòu)建的人工小RNA是驅(qū)動模仿小RNA之功能的RNA分子的表達(dá)的啟動子以及被重組引入的設(shè)定基因特異性的序列(Niu等，2006.Science2006，第24卷:1420-1428)。小RNA可以是自然存在的并且僅過表達(dá)。
[0131]在本發(fā)明的一個特定實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體或重組DNA構(gòu)建體還在轉(zhuǎn)錄盒前包含強(qiáng)組成型啟動子，所述轉(zhuǎn)錄盒由部分靶基因、其后的植物功能性內(nèi)含子、其后的反向的相同部分靶基因組成。轉(zhuǎn)錄盒之后是終止`子序列。優(yōu)選的載體是這樣的類型，以反向重復(fù)方向插入本發(fā)明的一種核苷酸序列。
[0132]目前基于RNAi方法的優(yōu)選核酸構(gòu)建體是稱為25pK7GWIWG2(I)的載體。該載體描述于 Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plants transformation,Karimi, M.等，Trends In plant Sciences,第 7 卷第 5 期第 193-195 頁。同一基本類型的載體更早地描述于 Wesley S.V.等，Construct design for efficient, effective andhigh-throughput gene silencing in plants.Plant Journal2001,27,第 581-590 頁。
[0133]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，作為MED25或MED18基因一部分的任何序列或本文所述相應(yīng)mRNA的任何序列可用于下調(diào)這種mRNA的水平。在給出的序列不代表全長mRNA情況下，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)(例如Sambrook等描述的技術(shù))克隆全長mRNA。對找到更多楊屬基因mRNA轉(zhuǎn)錄本相關(guān)序列重要的最近資源是公布的毛果楊基因組，以及描述于 Tuskan 等 2006 的資源(G.A Tuskan 等，2006.The genome of BlackCottonwood, Populus tricocarpa (Torr.&Gray).Science 第 313 卷第 5793 期，第 1596-1604頁)。[0134]IV.VII構(gòu)建用于沉默Med25或Medl8表達(dá)的載體
[0135]通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很好地構(gòu)建本發(fā)明的載體并設(shè)計重組基因表達(dá)的方案。對于制備載體的一般方案的更詳細(xì)描述，參照Molecular Cloning:a LaboratoryManual-第二版，Sambrook 等，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0136]V對水缺乏的耐受性和/或抗性和/或鹽脅迫抗性提高的根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾植物細(xì)胞、植物或其部分
[0137]特征在于對水缺乏的耐受性和/或抗性和/或鹽脅迫抗性提高的根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾或轉(zhuǎn)基因植物可以是一年生植物或多年生植物。優(yōu)選地，一年生或多年生植物是具有農(nóng)業(yè)重要性的作物植物，因而非作物植物和沒有農(nóng)業(yè)價值的植物(非作物植物(雜草)如擬南芥屬(Arabidopsis spp.)不涵蓋在本發(fā)明內(nèi))。一年生作物植物可以是單子葉植物，選自燕麥屬(燕麥(Avena sativa));稻屬(例如水稻；0ryza bicolour);大麥屬(大麥(Hordeum vulgare));小麥屬(例如小麥)；黑麥屬(黑麥(Secale cereale));短柄草屬(例如二穗短柄草)；玉蜀黍?qū)?例如玉米)；或雙子葉植物，選自黃瓜屬(例如黃瓜)；大豆屬(例如大豆)；苜蓿屬(例如蒺藜苜蓿)；龍頭花屬(Mimulus spp.);蕓苔屬(例如完菁(Brassica rapa);歐洲油菜(Brassica napus);花椰菜(Brassica oleraceae));甜菜(Beta vulgaris)。
[0138]優(yōu)選地，多年生植物為木本植物或木本物種。所述木本植物可以是闊葉樹植物,例如選自:刺槐、桉樹、角樹、山毛櫸、桃花心木、胡桃木、橡樹、涔木、柳樹、山核桃樹、樺樹、栗樹、楊樹、棺木、楓樹、美國梧桐、銀杏、棕櫚樹和美國楓香樹。來自楊柳科(Salicaceae)的闊葉樹植物(例如柳樹、楊樹和白楊包括其變種)是特別有意義的，因?yàn)檫@兩組包括了快速生長的樹木物種或木本灌木，它們被特別地栽培用于提供木材和加熱用的生物燃料。
[0139]在另一些實(shí)施方案中，所述木本植物是針葉樹，其可選自柏樹、花旗松、冷杉、紅杉、鐵杉、雪松、杜松、落葉松、松樹、赤松、云杉和紫杉。
[0140]在另一些實(shí)施方案中，所述木本植物是產(chǎn)果實(shí)的植物，其可選自蘋果、李子、梨、香蕉、柑橘、獼猴桃、檸檬、櫻桃、葡萄、番木瓜、花生和無花果。
[0141]或者，木本植物可選自棉花、竹和橡膠植物。本發(fā)明延伸至通過本文中所述方法獲得的上述遺傳修飾或轉(zhuǎn)基因植物的任何植物細(xì)胞，以及所有植物部分，其包括植物的可收獲部分、其種子和繁殖體，以及植物外植體或植物組織。本發(fā)明還涵蓋包含根據(jù)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的植物、其部分、植物細(xì)胞或植物子代。本發(fā)明還延伸至涵蓋通過任意上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或完整植物的子代，唯一的要求是子代與通過根據(jù)本發(fā)明的方法在親本中產(chǎn)生的展現(xiàn)出相同的基因型和/或表型特征。
[0142]應(yīng)注意，本發(fā)明方面之一的上下文中描述的實(shí)施方案和特征也適用于本發(fā)明的另一些方面。因此，一個實(shí)施方案的定義經(jīng)過必要的變更適用于包含或涉及所述一個實(shí)施方案的所有其他實(shí)施方案。例如在給出有關(guān)DNA構(gòu)建體或序列的定義時，這些定義也適用于產(chǎn)生植物的方法，包含DNA構(gòu)建體的載體、植物細(xì)胞、植物，反之亦然。有關(guān)植物所述的DNA構(gòu)建體也適用于所有其他實(shí)施方案。
[0143]VI本發(fā)明遺傳修飾植物的水缺乏和/或鹽脅迫耐受性/抗性特性
[0144]本文中使用的“水缺乏”意指這樣的時期，當(dāng)植物可獲得的水不能以植物消耗的速率補(bǔ)充。長期水缺乏通俗地稱為干旱。如果對于植物生長速率而言有可用的地下水儲庫，那么缺乏降雨或灌溉可能不會立即產(chǎn)生水脅迫。然而，在干燥土壤中生長的植物可能在水缺乏的最小時期內(nèi)遭受不利影響。嚴(yán)重的水脅迫可引起枯萎和植物死亡；中等干旱可引起產(chǎn)量降低、生長萎縮或發(fā)育遲緩。水脅迫耐受性需要與對照植物對比。例如，本發(fā)明的植物與對照植物相比可在水缺乏的情況下存活并且產(chǎn)量更高。在實(shí)驗(yàn)室中和田間試驗(yàn)中，可通過給予本發(fā)明的植物和對照植物比最佳澆水對照植物更少的水來模擬干旱并測量特性差異。通常，對照植物是與測試的遺傳修飾或轉(zhuǎn)基因植物品系(line)或品種(variety)相同的植物，缺乏表征遺傳修飾或轉(zhuǎn)基因植物的給予特定特性的重組DNA。合適的對照植物可以是用于產(chǎn)生本文遺傳修飾或轉(zhuǎn)基因植物的親本品系。在一些情況中，對照植物可以是包含空載體或標(biāo)志物基因但不包含待評估之轉(zhuǎn)基因中表達(dá)的本發(fā)明的重組多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物品系。
[0145]灌溉土壤的水的鹽濃度可有用地表示為在水中溶解鹽(w/w)的百萬分之份數(shù)。新鮮水通常具有小于1，OOOppm的鹽；淡鹽水通常具有1，OOOppm至3，OOOppm ;中度鹽水通常具有3，OOOppm至10，OOOppm ;濃鹽水通常具有10，OOOppm至35，OOOppm ;而海水通常具有35，OOOppm的鹽。對淡鹽水到中度鹽水土壤耐受的植物是有利的。
[0146]VII培育具有水缺乏和/或鹽脅迫耐受性/抗性特性的遺傳修飾植物
[0147]根據(jù)本發(fā)明獲得的任意遺傳修飾或轉(zhuǎn)化植物可用于常規(guī)培育方案或體外植物繁殖以產(chǎn)生更多的具有相同特征的遺傳修飾或經(jīng)轉(zhuǎn)化植物和/或可用于將同一特征引入相同或相關(guān)物種的其他品種中。以該方式，賦予水缺乏和/或鹽脅迫耐受性/抗性的遺傳修飾基因或轉(zhuǎn)基因可通過例如(標(biāo)志物輔助)雜交轉(zhuǎn)移至優(yōu)異的(商業(yè)相關(guān))的作物品種。另外，本發(fā)明的植物可進(jìn)一步用疊加的特性來改進(jìn)，例如，根據(jù)本發(fā)明的具有水缺乏和/或鹽脅迫耐受性/抗性特性的遺傳修飾或轉(zhuǎn)化植物可與農(nóng)業(yè)上感興趣的其他特性進(jìn)行疊加。
實(shí)施例
[0148]實(shí)施例1脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與`擬南芥Med25保守ACID結(jié)構(gòu)域相互作用
[0149]1.1雙雜交篩選方法
[0150]該方法用于篩選和鑒定通過與擬南芥Med25 ACID結(jié)構(gòu)域相互作用來進(jìn)行操縱的植物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。誘館包含擬南芥(Arabidopsis)Med25的第551~680位氨基酸,該區(qū)域?qū)?yīng)于人Med25中VP16相互作用結(jié)構(gòu)域(參見參考文獻(xiàn)6的圖3B)。誘餌與包含由雙雜交篩選中花序分生組織、花分生組織和花芽產(chǎn)生之cDNA文庫的獵物一起使用。
[0151]根據(jù)Matchmaker雙雜交系統(tǒng)3 (CL0NTECH)的說明進(jìn)行酵母雙雜交篩選。使用擬南芥cDNA文庫⑶4-16作為模板和以下引物通過PCR擴(kuò)增編碼Med25之551~680位氨基酸的擬南芥Med25(Atlg25540)開放閱讀框(ORF) 1651~2040位核苷酸序列來構(gòu)建誘餌:
[0152]AtMed25-EcoR1-aa551-fwd(5/ -GGG GAC MG TTT GTA CAA AAA AGC AGGCTc cgaatt cAC TTC ACA ATC CAA ATA TGT GAA-3' ) [SEQ ID NO:72]和
[0153]AtMed25-Sall-aa680-rev(5; -GGG GAC GAG TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTg gtcgac tta ATT TGG AAT TTG TGG TTT AAA CA-3/ )[SEQ ID NO:73]。
[0154]通過用EcoRI 和 Sail (Fermentas,Burlington, Ontario, Canada)消化質(zhì)粒和載體二者來將PCR產(chǎn)物克隆至Gal4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)載體pGBKT7并使用Jetquick PCR純化試劑盒(Genomed, Gmbh, Lohme, Germany)純化。根據(jù)手冊，用 T4DNA 連接酶(Invitrogen)進(jìn)行經(jīng)消化質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的連接，轉(zhuǎn)化至TOPlO細(xì)胞中，在LB瓊脂板(25 μ g卡那霉素/ml)上針對卡那霉素抗性進(jìn)行選擇。通過DNA測序分析來自所得克隆的質(zhì)粒。通過使用如Clontech手冊所述的乙酸鋰法，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109 (MATa> trpl_901、leu2-3、112、ura3_52、his3_200、gal4 Λ、gal80 Λ、LYS2:: GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3、GAL2UAS-GAL2TATAADE2,URA3::MELlUAS_MELlTATA_lacZ、MEL1)。
[0155]將包含cDNA文庫(CD4-30)的獵物克隆至Gal4活化結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒pAD-GAL4_2.1中。從擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)獲得 CD4-30 文庫(參見 http://www.arabidopsis.0rg/abrc/catalog/cdnalibrary 1.html)和 cDNA 文庫 CD4_16(11)。大腸桿菌(Escherichia coli)菌株TOPlO (F-mcrA Δ (mrr-hsdRMSmcrBC) (()80lacZAM15 Δ lacX74 nupG recAl araD139Δ (ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR)endAlλ -)(Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)用于細(xì)菌中的克隆。
[0156]由于HIS3 啟動子的泄露(leakiness)，用 pGBKT7-Med2 5 551 ~68Q 或空 pGBKT7 轉(zhuǎn)化的酵母AH109 二者都能夠在SD/-Trp/-His板上生長。然而，添加0.5mM3-氨基-1，2，4-三唑完全抑制了 HIS3報告基因的自活化/泄露。使細(xì)胞在SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上生長也完全抑制了生長。通過使用單克隆抗myc —抗的western印跡確證來自誘館質(zhì)粒的相
等表達(dá)。
[0157]將包含誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Med25551~680的AH109的新鮮集落接種至50ml SD/-Trp中并在30°C下孵育過夜。將培養(yǎng)物接種至1.7升2X YPDA培養(yǎng)基中并在30°C下震蕩孵育直到0D600為~0.6。使來自培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀并使其為感受態(tài)，與2mg cDNA文庫轉(zhuǎn)化進(jìn)質(zhì)粒PAD-GAL4-2.1中，然后根據(jù)Matchmaker GAL4雙雜交系統(tǒng)3用戶手冊(Clontech)中文庫級轉(zhuǎn)化的說明鋪板。將轉(zhuǎn)化混合物涂布在包含60mlSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp (QDO)的80號(140mm)板上進(jìn)行高嚴(yán)格選擇。將轉(zhuǎn)化混合物的稀釋級分涂布在六個包含SD/-Leu/-Trp的板上用于轉(zhuǎn)化效率的評估。培養(yǎng)14~16天后，將在QDO上出現(xiàn)的酵母集落再鋪板到Y(jié)PD上，然后在質(zhì)粒分離之前將單集落 再鋪板到QDO培養(yǎng)基上。
[0158]1.2陽性獵物質(zhì)粒的分離和鑒定
[0159]對約2.5X IO6個cDNA克隆進(jìn)行了篩選。采用Matchmaker GAL4雙雜交系統(tǒng)3用戶手冊(Clontech)中描述的溶壁酶(Iyticase)方法從QDO上培養(yǎng)的集落中分離PAD-GAL4-2.Ι-cDNA 質(zhì)粒(來自 cDNA 文庫 CD4-30)，并轉(zhuǎn)化至 T0P10 (Invitrogen)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化子鋪板到補(bǔ)充有羧芐青霉素(100 μ g/ml)的LB-瓊脂上。隨后，將從這些T0P10克隆中分離的PAD-GAL4-2.Ι-cDNA構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化至AH109細(xì)胞中，繼而用pGBKT7_Med25551~680或空PGBKT7進(jìn)行轉(zhuǎn)化并鋪板到QDO培養(yǎng)基上用于評估陽性克隆。對陽性獵物質(zhì)粒進(jìn)行測序并使用 BLAST (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast)搜索 GenBank。所有陽性 cDNA獵物克隆都來源于三種不同基因(Atlg69600，At5g29000和At5g05410)之一(圖1)，表明篩選飽和。
[0160]1.3與擬南芥Med25ACID結(jié)構(gòu)域相互作用的cDNA編碼蛋白的表征
[0161]經(jīng)鑒定的3種類型的雙雜交陽性克隆編碼轉(zhuǎn)錄因子:DREB2A (At5g05410)、ZFHDl(Atlg69600)和MYB樣(At5g29000)。這些轉(zhuǎn)錄因子之前均未與光量途徑相關(guān)。相反地，DREB2A屬于還包含DREBlA-C和DREB2B的蛋白質(zhì)家族。它們與參與干旱和冷脅迫應(yīng)答的脫水應(yīng)答兀件/C-重復(fù)(dehydration-response element/C-repeat, DRE/CRT)基序相結(jié)合(6)。全長DREB2A的過表達(dá)不會導(dǎo)致下游基因的活化。然而，缺乏阻遏結(jié)構(gòu)域(RD:參見下文)的DREB2A的過表達(dá)導(dǎo)致生長遲緩表型和圓形的顏色稍深的具有短葉柄的葉子(7)。ZFHDl 屬于一個蛋白質(zhì)家族，其與 EARLY RESPONSIVE TO DEHYDRATION STRESS I (ERDl)基因的啟動子區(qū)相結(jié)合并且引起數(shù)個脅迫可誘導(dǎo)基因的上調(diào)以及干旱耐受性相當(dāng)大的提高
(8)。最后，MYB樣蛋白尚未詳細(xì)研究，但是其在轉(zhuǎn)錄組分析中被鑒定為在經(jīng)受干旱和熱脅迫組合的植物中特異性表達(dá)的454個轉(zhuǎn)錄子之一(9)。
[0162]實(shí)施例2:與擬南芥Med25之保守ACID結(jié)構(gòu)域相互作用的Dreb2A、ZFHDl和MYB樣的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。
[0163]使用雙雜交試驗(yàn)鑒定了每個轉(zhuǎn)錄因子中與Med2 5 551 ~_區(qū)域相互作用所需的的區(qū)域(圖2A)。顯示DREB2A的169~254位氨基酸為與Med2 5 551 ~68(l相互作用所需的最小結(jié)構(gòu)域(圖2B)。由于該結(jié)構(gòu)域與之前鑒定的DREB2A中包含254~335位氨基酸的TAD或位于136~165位氨基酸的RD均不重疊(7)，所以可能這些結(jié)構(gòu)域具有分別的功能。然而，I~169位氨基酸的DREB2A區(qū)域(其包含RD)對DREB2A和Med2 5 551~68(|之間相互作用有不利作用。相比之下，在之前鑒定的ZFHDl中的TAD (I~102位氨基酸)(8)和與Med2 5 551~_相互作用的最小區(qū)域(I~132位氨基酸)之間發(fā)現(xiàn)了良好的相關(guān)性(圖2C)。MYB樣中Med25551 ~_相互作用結(jié)構(gòu)域位于103~309位氨基酸的區(qū)域(圖2D)。對于該蛋白，之前未報道過TAD，但是MYB樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)位于184~248位氨基酸之間，其與位于227~291位氨基酸之間的同源結(jié)構(gòu)域樣區(qū)域重疊。
[0164]實(shí)施例3:缺乏Dreb2A、ZFHDl、MYB樣或Med25的擬南芥突變體對鹽脅迫敏感
[0165]Columbia登陸中的擬南芥屬突變體(獲自擬南芥生物資源中心(ABRC))在編碼DREB2A、ZFHD1和MYB樣的基因以及MED25/PFT1基因中具有T-DNA插入(圖3)。種子儲存號 N629555 (med25)、N873547 (dreb2a)、N579505 (myb 樣)和 N877090 (zfhdl)獲自諾丁漢擬南芥儲存中心(Nottingham Arabidopsis Stock Center, NASC)。在篩選 SalkT-DNA 插入品系之后鑒定所有的突變體(12)。使用在 http://signal, salk.edU/tdnaprimers.2.html給出的引物序列鑒定不同突變體的純合植物并用于本文描述的實(shí)驗(yàn)。
[0166]當(dāng)將這些突變體植物的種子用于在不同NaCl濃度下萌發(fā)時，所有突變體與野生型相比具有降低的萌發(fā)百分比，這與鹽脅迫敏感性的提高一致(圖4)。_(125突變體對鹽脅迫的敏感性至少與轉(zhuǎn)錄因子突變體一樣明顯，這與由雙雜交數(shù)據(jù)所示的轉(zhuǎn)錄因子和Med25之間的相互作用一致。該新發(fā)現(xiàn)的med25的表型強(qiáng)烈地支持這一觀點(diǎn)，Med25在DREB2A、ZFHDl和MYB樣的下游發(fā)揮作用。zfhdl、myb樣和med25突變體比dreb2a突變體示出對NaCl更高的敏感性。
[0167]實(shí)施例4.在陸生植物中Med25在鹽脅迫抗性中的功能是保守的。
[0168]所有的有胚植物(陸生植物)具有應(yīng)對干旱和鹽脅迫的生理系統(tǒng)。通過證明在苔蘚小立碗蘚(Physcomitrella patens)中刪除該基因的作用顯示出Med25在脅迫抗性中的作用在植物進(jìn)化期間是保守的。Med25的關(guān)鍵作用(在苔蘚和擬南芥這樣不同的植物形式中調(diào)節(jié)干旱耐受性)非常有力地證明了 Med25蛋白負(fù)責(zé)在植物界所有成員中調(diào)節(jié)干旱耐受性。
[0169]4.1小立碗蘇(Physcomitrella)中的革巴向基因破壞[0170]通過基因靶向進(jìn)行編碼編碼完整小立碗蘚Med25蛋白之單個基因(PpMED25A)的刪除(10)。小立碗蘚基因組包含兩種AtMED25相關(guān)序列:PpMED25A(Phypal_l:170131)編碼完整的Med25蛋白，而PpMED25B(Phypal_l:92911)是明顯假基因(apparentpseudogene)，其在外顯子7具有兩個終止密碼子之前的移框，以及在外顯子7末端開始并在內(nèi)含子10結(jié)束的2104bp的刪除。該刪除移除了對應(yīng)于PpMED25A的253~559位密碼子的序列并建立了第三個移框。從基因組DNA中PCR擴(kuò)增了 PpMED25A基因并將其克隆至PRS426質(zhì)粒的EcoRI位點(diǎn)。之后將包含hpt標(biāo)志物的選擇盒插入PpMED25A的兩個BglII位點(diǎn)之間，導(dǎo)致刪除了密碼子43~838(878的)。通過Swal消化，從載體中釋放靶向構(gòu)建體，之后轉(zhuǎn)化至苔蘚原生質(zhì)體中(10),然后在其中在3011^/1潮霉素13(5181]^ H3274)的存在下選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。
[0171]4.2小立碗蘚Med25敲除突變體展現(xiàn)出鹽敏感性
[0172]選定的小立碗蘚med25a敲除突變體對鹽具有提高的敏感性，與野生型相比在0.15M NaCl的存在下顯示出集落直徑減小了 32% (圖5)。滲透對照(0.3M甘露醇)的存在下沒發(fā)現(xiàn)作用。因此，Med25在鹽脅迫抗性中的作用是一種古老的功能，其在早期的有胚植物中已經(jīng)存在。
[0173]實(shí)施例5.缺乏Med25的擬南芥突變體對干旱的抗性。
[0174]在抑制了開花的短日間生長條件下測試了 med25突變體的干旱耐受性，從而以避免該突變體(參考文獻(xiàn)10)的延遲開花表型間接影響其對干旱的敏感性。出乎意料地，我們發(fā)現(xiàn)med25突變體與野生型植物相比具有干旱抗性(86.2%存活，相比野生型植物的33.3%)(圖6)。另外，Med25突變體在長日間生長條件下顯示出同樣的表型(圖7)。ZFHDl或DREB2A之組成型活化形式的過表達(dá)導(dǎo)致了干旱抗性(14、15)。因此，Med25與ZFHDl和DREB2A相比在調(diào)節(jié)植物對干旱的應(yīng)答中具有相反功能。
`[0175]使用qRT-PCR在野生型以及med25和dreb2A突變體中研究干旱誘導(dǎo)的rd29a和rd29b mRNA (7)。在med25突變體中應(yīng)答于干旱強(qiáng)烈地上調(diào)(150至3200倍)并且在dreb2A突變體中應(yīng)答于干旱嚴(yán)重地下調(diào)了 rd29a和rd29b 二種mRNA (圖6C)。另外，在med25突變體中應(yīng)答于干旱強(qiáng)烈地上調(diào)了 Dreb2A mRNA。因此，干旱應(yīng)答表型與這些脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)有關(guān)。
[0176]實(shí)施例6.擬南芥Dreb2A蛋白參與控制開花時間的光量途徑。
[0177]顯示與Med25相互作用的3種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(DREB2A、ZFHD1和MYB樣)之前僅被示出對不同類型的脅迫應(yīng)答。然而，Med25本身最初被鑒定為在調(diào)節(jié)光量控制之開花時間的PhyB途徑中充當(dāng)下游效應(yīng)子的PFTl。每種突變體的下胚軸長度應(yīng)答和葉片數(shù)目(這是開花時間的測量)揭示MYB樣和zfhdl突變體與野生型一樣，而dreb2a突變體的表型與med25突變體的相反(圖7)。由于dreb2a具有早期開花表型(與phyB相當(dāng))，這說明DREB2A可在phyB途徑中發(fā)揮功能。這對于DREB2A轉(zhuǎn)錄因子是之前未經(jīng)鑒定且出乎意料的功能，并且支持這一理論，通過DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，PhyB間接作用于Med25 (PFTl)。
[0178]實(shí)施例7.Medl8或Med25表達(dá)沉默的轉(zhuǎn)基因楊屬樹木
[0179]7.1鑒定直系同源物并選擇相應(yīng)基因的方法
[0180]使用Phytozome的BLAST資源(用于綠色植物比較基因組學(xué)的工具)(JG1-聯(lián)合基因組研究院(Joint Genome Institute)和CG1-整合基因組學(xué)中心(Center forIntegrative Genomics))鑒定擬南芥Medl8和Med25基因的同源序列。使用TBLASTN算法，將擬南芥MedlS和Med25多肽的氨基酸序列針對毛果楊的基因組序列(JG1-聯(lián)合基因組研究院和 Tuskan,等 Science 15 September 2006:第 313 卷.第 5793 期，第 1596-1604 頁)進(jìn)行blast。使用BLASTN和TBLASTX算法再對編碼顯示與擬南芥中介體蛋白同源之蛋白質(zhì)的毛果楊基因序列進(jìn)行blast，以評估毛果楊中是否存在與中介體基因同源的更多基因。Clustal X2.0.12 版(Larkin 等(2007).Bioinformatics, 23, 2947-2948)用于多重比對并用于產(chǎn)生經(jīng)鑒定序列的系統(tǒng)發(fā)生樹。與靴值分析(bootstrapping analysis)組合的這些聚類方法鑒定了具有最相似遺傳特征和進(jìn)化關(guān)系的基因。將Vector NTI Advance?.軟件套件(Invitrogen?)中的工具用于序列評估的比對、裝配和改變。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，這些方法可(組合地)用于在其他植物中鑒定直系同源基因。
[0181]將楊屬DB EST數(shù)據(jù)庫中的 BLAST 資源(Sterky,等,.Proc NatlAcad Sci USA.2004Sep 21 ；101 (38):13951-6)用于鑒定雜交白楊(歐洲山楊(Populus tremula) X美洲山楊(P.tremuioides))中的選定直系同源基因。通過使用Vector NT丨Advance?軟件套件(Invitrogen?)中的工具裝配、比對并評估經(jīng)鑒定的EST序列。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，這些方法可(組合地)用于在其他植物中鑒定直系同源蛋白以及表達(dá)的基因序列(例如cDNA)和編碼這些蛋白質(zhì)的基因。
[0182]7.2楊屬中的Medl8直系同源物
[0183]使用擬南芥Medl8序列(AT2G22370)作為查詢物BLAST檢索毛果楊基因組，產(chǎn)生了一個單一基因模型(P0PTR_0007s05200)。P0PTR_0007s05200具有預(yù)測的217個氨基酸的蛋白質(zhì)序列，其與AT2G22370在100%的序列上具有83%同一性和94%陽性，因此是毛果楊中最接近的直系同源物。
[0184]在雜交白楊(歐洲山楊X美洲山楊)中鑒定了單個EST(EST:A041 P22)，其在P0PTR_0007s05200a編碼序列的375bp上示出99%同一性，從而是雜交白楊中Medl8的預(yù)測直系同源物。將EST:A041P22的序列用于設(shè)計擴(kuò)增兩個獨(dú)立RNAi構(gòu)建體之片段的引物。
[0185]7.3楊屬中的Med25直系同源物
[0186]使用擬南芥Med25序列(AT1G25540)作為查詢物BLAST檢索毛果楊基因組，產(chǎn)生了兩個基因模型，P0PTR_0010sl3870和P0PTR_0008sll650，其為毛果楊中的預(yù)測直系同源物。P0PTR_0010sl3870預(yù)測的797個氨基酸的蛋白質(zhì)序列在84%的序列上與AT1G25540具有65 %同一性和77 %陽性，而P0PTR_0008s11650預(yù)測的851個氨基酸的蛋白質(zhì)序列在79%的序列上與AT1G25540具有66 %同一1注和78%陽性。P0PTR_0008sll650和P0PTR_0010sl3870基因模型序列在超過2kb的編碼DNA序列上有91%同一性，并且它們編碼的蛋白質(zhì)序列在699個氨基酸上有89 %同一性。因此，假定P0PTR_0010sl3870和P0PTR_0008sll650是毛果楊中的旁系同源物并且它們二者為擬南芥基因AT1G25540的直系同源物。
[0187]Med25(P0PTR_0008sll650 和 P0PTR_0010sl3870)的評估產(chǎn)生了一組 EST 序列，示出與聚類:P0PLAR.8697和單元素集合:C066P63中包含的兩個旁系同源物的很高的同源性?？捎玫腜opDB片斷重疊群(contig)和群集(assemblage)分析未完全分開雜交白楊中的旁系同源物序列。然而，選擇了兩個EST，與P0PTR_0010sl3870最相同的EST:S067A01 (在 740bp 上 98% 同一性)和與 P0PTR_0008sll650 最相同的 EST:UB64CPC07 (在487bp上98%同一性)。將其序列用于設(shè)計擴(kuò)增兩個單獨(dú)RNAi構(gòu)建體之片段的引物。
[0188]7.4克隆用于沉默MED18和MED25基因的RNAi構(gòu)建體
[0189]將Gateway?技術(shù)(Invitrogen?)用于克隆過程。設(shè)計基因特異性引物并用Gateway? attB重組位點(diǎn)連接。
[0190]用于Medl8RNAi構(gòu)建體的Gateway克隆引物:
[0191 ] KR939_Fl_attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCAAGCAAGAATGTGCTTAGATTG[SEQ ID NO:74]
[0192]KR939_Rl_attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAACACCTGGTTTTGACAAGTGCAG[SEQ ID NO:75]
[0193]KR940_Fl_attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGGGGTTGTTCCTACTGCCG[SEQID NO:76]
[0194]KR940_Rl_attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCCAGCATCAAGCGGATAACTAG[SEQ ID NO:77]
[0195]用于Med25RNAi構(gòu)建體的Gateway克隆引物:
[0196]KR941_Fl_attB2:GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGGTGTCTCTTCTGGTATGAACACG [SEQ ID NO:78]
[0197]KR941_Rl_attBl:GGGGACAAGTTTGT`ACAAAAAAGCAGGCTTGGTAACTGGATTACTGCACAAAGC[SEQ ID NO:79]
[0198]KR942_Fl_attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAATGACGTCTTCTGTGCCTGC [SEQ ID NO:80]
[0199]KR942_Rl_attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCACCCATTCCACTTTGTACC[SEQ ID NO:81]
[0200]通過PCR從EST cDNA克隆模板中擴(kuò)增選定的RNAi基因片段(即兩種Med25RNAi [SEQ ID NO:82 和 83]和兩種 Medl8RNAi [SEQ ID NO:84 和 85])，隨后重組至pD0NR?-201載體(Invitrogen?)中，產(chǎn)生Entry克隆。之后將片段重組至RNAi目的載體(destination vector)(pK7GWIWG2(I))(Karimi, Μ.等，Trends In plant Sciences,第 7卷第5期第193-195頁)。RNAi構(gòu)建體插入至植物宿主中將在CaMV35S啟動子的控制下引起反向雙鏈發(fā)夾RNA的組成型表達(dá)。
[0201]7.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化以插入RNAi轉(zhuǎn)基因
[0202]將CaMV35S反向重復(fù)DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，隨后轉(zhuǎn)化進(jìn)雜交白楊(歐洲山楊X美洲山楊)克隆T89中，下文稱為“楊樹”，然后再生，基本如Nilsson等(1992)Transgenic Researchl, 209-220所述。每個構(gòu)建體產(chǎn)生大約15~20個獨(dú)立的品系。使用一個構(gòu)建體產(chǎn)生的一組這樣的轉(zhuǎn)基因樹木品系在下文稱為“構(gòu)建組”。每個構(gòu)建組內(nèi)的每個轉(zhuǎn)基因品系(例如KR555-2B、KR555-3A、KR555-2B等)是不同的轉(zhuǎn)化事件，因此很可能具有插入至植物基因組中不同位置的重組DNA。這使得一個構(gòu)建組內(nèi)不同的品系存在部分差異。例如，已知當(dāng)使用本文中所用類型的RNAi構(gòu)建體時，不同的轉(zhuǎn)化事件會產(chǎn)生具有不同基因下調(diào)水平的植物。
[0203]在每個構(gòu)建組的獨(dú)立品系中通過q-PCR測定medl8或med25基因表達(dá)水平。選擇每個構(gòu)建體的五個品系用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。在三個品系中基因表達(dá)被強(qiáng)烈地下調(diào)而在兩個品系中基因表達(dá)被下調(diào)地較少。在無菌條件下收獲每個轉(zhuǎn)基因楊樹品系的一片葉子并直接冷凍于液氮中。將冷凍的葉子研磨成粉末，之后將IOOmg粉末用于使用RNEasy植物小提試劑盒(Qiagen)的總RNA提取。使用iScript cDNA合成試劑盒(Bio-Rad)將一微克總RNA用于mRNA的RT-PCR。使所得cDNA用作DNA模板通過q_PCR用于擴(kuò)增特定中介體基因。在具有 Light Cycler480SYBRGreen I Master (Roche Diagnostics GmbH)的 LightCycler480 (Roche)中使用用于medl8品系的下述引物:
[0204]medl8P0P-940 Fwd:ACTGTCCACGCTCCATGTAACAGA[SEQ ID NO:86]，
[0205]medl8P0P-940 Rev:ACAAATCCACCTCATAACTCATAA[SEQ ID NO:87]，
[0206]medl8P0P Fwd:AGATGCTAAAACTACATGCATTG[SEQ ID NO:88]，
[0207]medl8P0P Rev:CGGTGCAAGATATTCGCAGAAAGA[SEQ ID NO:89]，
[0208]和用于med25品系的下述引物:
[0209]med25-Pt942Fwd:AACTGTATTTTCATCTGGGCA[SEQ ID NO:90]，
[0210]med25-Pt942rev:CAGACCACTCATTGCGATTGG[SEQ ID NO:91]，
[0211]med25P0P Fwd:AGATGCTAAAACTACATGCCATTG[SEQ ID NO:92]，
[0212]med25P0P Rev:AGCAATGTCTGAGATGGTAACTGG[SEQ ID NO:93]以及
[0213]18S Fwd:CTATCAACTTTCGATGGTAGG[SEQ ID NO:94]和
[0214]18S Rev:CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT[SEQ ID NO:95]
[0215]進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0216]將18S RNA作為內(nèi)標(biāo)用于歸一化模板量的差異。通過Light Cycler 480軟件releasel.5.0SP3 (Roche)監(jiān)測并分析實(shí)時 dsDNA 擴(kuò)增。
[0217]7.6攜帶用于沉默MED18或MED25表達(dá)之RNAi轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因樹木的生長和表型分析
[0218]將轉(zhuǎn)基因楊樹品系與其野生型對照(Wt)樹木一起在溫室中在長日間條件(18小時，22°C/6小時，15°C;白天/夜晚)下在土壤上進(jìn)行培養(yǎng)。在上述相同的條件下在溫室中平行培養(yǎng)生長組中多個野生型樹木(15棵樹木)和包含數(shù)個構(gòu)建組的多個轉(zhuǎn)基因樹木(即3棵樹木/品系和5個品系/構(gòu)建組)。在每個生長組內(nèi)進(jìn)行野生型樹木和構(gòu)建組之間的全部比較。進(jìn)行直接測量、采樣和分析并且對其數(shù)據(jù)分析例如生長增加、木材密度、木材形態(tài)、木材化學(xué)組成、生物質(zhì)產(chǎn)量、干旱脅迫耐受性、鹽脅迫耐受性等的顯著變化。
[0219]在楊樹中對干旱抗性測試了 MED18的一個構(gòu)建組(具有5個不同的品系)。將轉(zhuǎn)基因楊樹品系與其野生型對照(WT) —起在溫室中在長日間條件(18小時，22°C /6小時，15°C;白天/夜晚)下在土壤上進(jìn)行培養(yǎng)。使樹木在自動澆水條件下培養(yǎng)6周，之后不澆水培養(yǎng)7周。該干旱時期之后，對樹木再澆水用于記錄其存活率。在最初的6周期間每周并且在干旱脅迫期間每天測量樹木的生長(圖11)。MED18的構(gòu)建組405比WT具有更高的生長表型(圖11A)。另外，組405樹木的持續(xù)生長顯示出它們比WT樹木對干旱脅迫具有更低的敏感性(圖1lA和B)。對樹木再澆水后4天記錄存活率。405組與WT樹木相比具有較高的存活率(> 66.6%的樹木)(圖11C)。
[0220]實(shí)施例8.缺乏Medl8的擬南芥突變體對干旱和鹽脅迫有抗性
[0221]比較在MED8、MED18和MED25各基因中具有T-DNA插入的三種擬南芥突變體(沉默各基因的表達(dá))對鹽脅迫的抗性。在4°C下將每種突變體基因型的種子在具有不同濃度
【權(quán)利要求】
1.用于產(chǎn)生與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽脅迫耐受性提高的遺傳修飾植物的方法，其包括以下步驟: a.降低或消除植物細(xì)胞、植物或其部分中中介體亞基的量或活性， b.生成和/或選擇與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽耐受性提高的遺傳修飾植物，以及在允許所述植物生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其中所述植物為一年生或多年生作物植物。
2.權(quán)利要求1的方法，所述方法的步驟還包括: c.使所述遺傳修飾植物分別與自身或另一植物進(jìn)行自交或雜交，以產(chǎn)生種子；以及 d.由所述種子培養(yǎng)子代植物，其中所述子代植物對水缺乏或鹽脅迫具有提高的耐受性和/或抗性。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述亞基為Med25多肽，所述Med25多肽包含 1.活化子相互作用結(jié)構(gòu)域，其包含在所述多肽C半端以(a)、(b)和(C)的順序定位的三種肽，其中所述肽是:
(a)KY(V/I)KXffEGXLSGQRQGQPV(F/L/I)IX(K/R)(L/M)E(G/A)(Y/F)
[SEQ ID NO:5]；
(b):LA(A/S)XffPXXMQIVRLI(S/A)Q(D/E)HMNNKQYVGKADFLVFR
(T/A) (M/L) (N/S) XHGFLX`QLQ (E/D) KKL[SEQ ID NO:6];和
(c):CAVIQLPSQTLLLS(V/M)(S/A)DKAXRLIGMLFPGDMVVFKPQ
[SEQ ID NO:7]， 其中X為任意氨基酸，并且其中肽(a)、(b)和(c)的氨基酸序列與具有SEQ ID NO:9之Med25多肽的相應(yīng)肽有至少80%的同一性。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述Med25多肽具有與選自SEQID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37之序列有至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述Med25多肽具有選自SEQID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35 和 37 的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述亞基是Medl8多肽，并且其中所述多肽的氨基酸序列與選自 SEQ ID NO:39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69 和 71 的序列有至少80%的氨基酸序列同一性。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述Medl8多肽具有選自SEQID NO:39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69 和 71 的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)的方法，其包括降低或消除至少一種核酸分子的表達(dá)，其中所述分子選自: a.編碼根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)的Med25多肽或Medl8多肽的核酸分子，
b.具有選自SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 和 70 的核酸序列的核酸分子。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述方法包括選自以下的至少一個步驟:(a)將編碼能夠形成雙鏈核糖核酸分子之核糖核酸序列的核酸分子引入至少一個植物細(xì)胞，其中所述雙鏈核糖核酸分子的至少17個核苷酸的片段具有這樣的核酸序列，所述核酸序列與選自權(quán)利要求8所述組(i)或(ii)的核酸分子有至少50%的核酸序列同一性；(b)將RNAi或反義核酸分子引入至少一個植物細(xì)胞，其中所述RNAi或反義核酸分子包含具有這樣的核酸序列的至少17個核苷酸的片段，所述核酸序列與選自權(quán)利要求8所述組(i)或(ii)的核酸分子有至少50%的核酸序列同一性；(c)將核酸構(gòu)建體引入至少一個植物細(xì)胞，所述構(gòu)建體能夠與包含選自權(quán)利要求8所述組(i)或(ii)之核酸分子的內(nèi)源基因重組并沉默、失活或降低其活性；以及⑷在包含選自權(quán)利要求8所述組⑴或(ii)之核酸分子的內(nèi)源基因中引入或檢測非沉默突變。
10.權(quán)利要求8的方法，其中降低或消除Med25多肽或MedlS多肽的量或活性由以下中的任一個導(dǎo)致: a.所述植物細(xì)胞、所述植物或其部分的內(nèi)源基因中的自然或誘導(dǎo)突變，并且任選地與ECO-TILLING 或 TILLING 組合； b.內(nèi)源基因的T-DNA失活； c.內(nèi)源基因的定點(diǎn)誘變或定向育種， 其中，所述內(nèi)源基因包含選自權(quán)利要求8所述組(i)或(ii)的核酸分子。
11.權(quán)利要求8或9的方法，所述方法包括:(a)提供載體，所述載體包含:(i)用于引入至少一個植物細(xì)胞的所述核酸分子；(ii)包含與所述核酸分子融合的一個或更多個調(diào)控元件的側(cè)翼核酸分子，其中所述調(diào)控元件控制所述核酸分子的表達(dá)；以及(b)用所述載體轉(zhuǎn)化所述植物的至少一個細(xì)胞，以產(chǎn)生與相應(yīng)非轉(zhuǎn)化的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽脅迫耐受性提高的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物。
12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物為以下中的任一種:(a)單子葉作物植物，其選自燕麥屬(Avena spp);稻屬(Oryza spp);大麥屬(Hordeum spp.);小麥屬(Triticum spp.);黑麥屬(Secale spp.);短柄草屬(Brachypodium spp.);玉蜀黍?qū)?Zeaspp.) ; (b)雙子葉作物植物,其選自黃瓜屬(Cucumis spp.);菜豆屬(Phaseolus spp.);大豆屬(Glycine spp.);苜蓿屬(Medicago spp.);蕓苔屬(Brassica spp.)和甜菜屬(Betaspp.) ； (c)闊葉樹，其選自刺槐、桉樹、角樹、山毛櫸、桃花心木、胡桃木、橡樹、涔木、柳樹、山核桃樹、樺樹、栗樹、楊樹、榿木、楓樹、美國梧桐、銀杏、棕櫚樹和美國楓香樹；(d)針葉樹，其選自柏樹、花旗松、冷杉、紅杉、鐵杉、雪松、杜松、落葉松、松樹、赤松、云杉和紫杉；(e)產(chǎn)果實(shí)的木本植物，其選自蘋果、李子、梨、香蕉、柑橘、獼猴桃、檸檬、櫻桃、葡萄、番木瓜、花生和無花果；以及(f)木本植物，其選自棉花、竹和橡膠植物。
13.與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽脅迫耐受性提高的遺傳修飾一年生或多年生作物植物，其中所述植物具有量或活性降低的中介體亞基，并且其中所述植物的基因組包含選自以下任一種的遺傳修飾: i)包含編碼MedlS多肽之核酸分子的內(nèi)源基因中的非沉默突變； ii)插入所述基因組的轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含編碼能夠形成雙鏈核糖核酸分子之核糖核酸序列的核酸分子，其中所述雙鏈核糖核酸分子的至少17個核苷酸的片段與編碼Medl8多肽的核酸分子有至少50%的同源性； iii)包含編碼Medl8多肽之核酸分子的內(nèi)源基因中的突變，其通過將核酸構(gòu)建體引入至少一個植物細(xì)胞而誘導(dǎo)，所述構(gòu)建體能夠與所述內(nèi)源基因重組并沉默、失活或降低其活性， 其中所述 Medl8 多肽具有與選自 SEQ ID NO:39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、.61、63、65、67、69和71之序列有至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求13的遺傳修飾植物，其中所述植物為以下中的任一種:(a)單子葉，其選自燕麥屬；稻屬；大麥屬；小麥屬；黑麥屬；短柄草屬；玉蜀黍?qū)伲?b)雙子葉植物，其選自黃瓜屬；菜豆屬；大豆屬；苜蓿屬；蕓苔屬和甜菜屬；(c)闊葉樹，其選自刺槐、桉樹、角樹、山毛櫸、桃花心木、胡桃木、橡樹、涔木、柳樹、山核桃樹、樺樹、栗樹、楊樹、榿木、楓樹、美國梧桐、銀杏、棕櫚樹和美國楓香樹；(d)針葉樹，其選自柏樹、花旗松、冷杉、紅杉、鐵杉、雪松、杜松、落葉松、松樹、赤松、云杉和紫杉；(e)產(chǎn)果實(shí)的木本植物，其選自蘋果、李子、梨、香蕉、柑橘、獼猴桃、檸檬、櫻桃、葡萄、番木瓜、花生和無花果；以及(f)木本植物，其選自棉花、竹和橡膠植物。
15.與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽脅迫耐受性提高的遺傳修飾植物，其中所述植物為Med25多肽的量或活性降低的闊葉樹，所述闊葉樹選自:刺槐、桉樹、角樹、山毛櫸、桃花心木、胡桃木、橡樹、涔木、柳樹、山核桃樹、樺樹、栗樹、楊樹、榿木、楓樹、美國梧桐、銀杏、棕櫚樹和美國楓香樹，并且其中所述植物的基因組包含選自以下中任一種的遺傳修飾: i)包含編碼Med25多肽之核酸分子的內(nèi)源基因中的非沉默突變； ii)插入所述基因組的轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含編碼能夠形成雙鏈核糖核酸分子之核糖核酸序列的核酸分子，其中所述雙鏈核糖核酸分子的至少17個核苷酸的片段與編碼Med25多肽的核酸分子有至少50%的同源性； iii)包含編碼Med25多肽之核酸分子的內(nèi)源基因中的突變，其通過將核酸構(gòu)建體引入至少一個植物細(xì)胞而誘導(dǎo)，所述構(gòu)建體能夠與所述內(nèi)源基因重組并沉默、失活或降低其活性， 其中所述 Med25 具有與選自 SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37之序列有至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求15的遺傳修飾植物，其與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽脅迫有提高的耐受性，其中所述植物為選自桉樹和楊樹的闊葉樹，其中所述Med25具有與選自SEQ ID NO:19,29和31之序列有至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求14或16的遺傳修飾植物，其與相應(yīng)非遺傳修飾的野生型植物相比對水缺乏和/或鹽脅迫有提高的耐受性，其中所述植物的基因組包含插入所述基因組的轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含編碼核糖核酸序列的核酸分子，所述核糖核酸序列能夠形成具有SEQ IDNo:82、83、84和84中任一個的雙鏈核糖核酸分子。
18.權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)的遺傳修飾植物，其中所述植物為種子或其植物部分。
【文檔編號】C12N15/82GK103502454SQ201280005505
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月18日
【發(fā)明者】斯特凡·比約克隆德, 塞利娜·達(dá)瓦納, 尼爾斯·埃爾溫, 奧韋·尼爾森 申請人:瑞典樹木科技公司