用于選擇性地殺傷細胞的生物活性核苷酸分子、其用途及應(yīng)用試劑盒的制作方法
【專利摘要】用于選擇性地殺傷細胞的生物活性核苷酸分子、其用途以及應(yīng)用試劑盒。目的在于，在廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域內(nèi)，盡可能有效、可靠和高效地殺傷生物體中的細胞，而不出現(xiàn)上文所述的已知的化學(xué)、物理、生物化學(xué)或分子生物學(xué)方法的缺點。根據(jù)本發(fā)明，生物活性核苷酸分子(8)經(jīng)設(shè)計，其具有與多個基因的mRNA(7、9、10、11)有結(jié)合能力的核苷酸序列，從而通過與其結(jié)合，引發(fā)多個(特別是大量的)用于細胞殺傷應(yīng)激狀態(tài)的“脫靶(off-target)”效應(yīng)，通過其，不依賴于用于減少單個基因的表達的分子的傳統(tǒng)插入，而巨大地影響細胞(2)，以至于殺死細胞或者在細胞(2)中啟動程序性細胞死亡(凋亡)。特別地，發(fā)現(xiàn)了這些分子用于有針對性地殺死腫瘤細胞或病毒感染的細胞，以及植物細胞和真菌細胞的用途。
【專利說明】用于選擇性地殺傷細胞的生物活性核苷酸分子、其用途及應(yīng)用試劑盒
[0001]本發(fā)明涉及可用于選擇性地殺傷細胞的基于核苷酸的生物活性分子、所述生物活性分子的用途以及用于應(yīng)用的應(yīng)用試劑盒。
[0002]用于選擇性地殺傷生物細胞的方法，利用物理學(xué)手段的常規(guī)方式，如UV輻射、熱等(Hsie AW, Brimer PA, Mitchell TJ, Gosslee DG.The dose-response relationshipfor ultraviolet-light—induced mutations at the hypoxanthine-guaninephosphoribosyItransferase locus in Chinese hamster ovary cells.Somatic CellGenet.19750ct ; I (4):383-9.；Gillespie EH、Gibbons SA.Autoclaves and theirdangers and safety in laboratories.J Hyg (Lond).1975Dec ;75 (3):475-87.),或化學(xué)物質(zhì)，例如酸、喊、甲醒(National Toxicology Program.Final Report on CarcinogensBackground Document for Formaldehyde.Rep Carcinog Backgr Doc.20IOJan ；(10-5981):1_512.)，其破壞細胞結(jié)構(gòu)本身。這些手段通常對環(huán)境有害并且?guī)缀醪荒茉谏矬w內(nèi)使用。為了在生物體中殺傷細胞，使用生物化學(xué)手段(蛋白質(zhì)抑制劑、拮抗劑、細胞抑制劑等)(Tanaka S, Arii S.Current Status of molecularly targeted therapy forhepatocellular Carcinoma:basic science.1nt J Clin Oncol.2010Jun ；15(3):235-41.Epub2010May27.)，其可以大大地影響細胞的生理并因此可以導(dǎo)致細胞的死亡。然而，這些方法卻沒有一個可以選擇性地殺傷生物體中的特定細胞類型，這是因為這些物質(zhì)對所有細胞同樣地起作用。
[0003]選擇性地影響細胞的一種分子生物學(xué)手段是使用短的、雙鏈RNA。這些所謂的siRNA(短干擾RNA)分子可以在被激活后以常規(guī)方式與目標基因的mRNA相互作用并與特定的核糖核酸內(nèi)切酶一起形成一種名稱為“RISC”(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。RISC復(fù)合物與靶mRNA結(jié)合，其中核酸內(nèi)切酶切割目標mRNA。以這種方式抑制基因表達并由此阻止目標蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
[0004]已經(jīng)描述了通過將特異于目標基因mRNA序列片段的短的(19_23bp)、雙鏈RNA分子(siRNA)引入真核細胞來抑制基因表達(Elbashir SM等人:Duplexes of21_nucleotideRNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature,2001May24,411 (6836) >494-8 ；Liu Y 等人:Efficient and isoform-selective Inhibition ofcellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry,2004Feb24>43(7)，1921-7 ;US5，898，031A ;US7，056，704B2)。
[0005]借助于這樣的分子，并未阻止基因的閱讀和mRNA的產(chǎn)生，而是通過siRNA來起始降解祀mRNA的細胞自身機制。最后，如上文所述，壓制特定蛋白質(zhì)的形成，而不損害其他基因的表達(轉(zhuǎn)錄后基因沉默)。
[0006]對于siRNA的目前的應(yīng)用，通常需要單獨壓制細胞中單個基因的表達。因此不希望其中多個基因同時地或非特異地被關(guān)閉的效應(yīng)，因而需要對siRNA的序列進行設(shè)定，從而阻止這些效應(yīng)。
[0007]還開發(fā)了這樣的方法，用siRNA在體內(nèi)轉(zhuǎn)染目標組織經(jīng)強化的細胞(Ikeda等人，“Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA，，，Pharmaceutical Research,Vol.23, N0.8, August2006)或通過結(jié)合經(jīng)細胞特異剪切以獲得取得細胞特異性的短肽(W02008 / 098569A2)。通過使用經(jīng)修飾的siRNA分子，可以實現(xiàn)選擇性地在特定細胞中降低或者壓制基因的表達。
[0008]如果所使用的siRNA序列特異于對細胞存活很重要的基因，則由此可以導(dǎo)致細胞的死亡。此過程可以通過所述的機制(任選也是細胞特異性地)來進行應(yīng)用。
[0009]然而，缺點是，單個基因或幾個基因的關(guān)閉常常并不必然會導(dǎo)致這些細胞的死亡；為此通常必須特異性地同時關(guān)閉多個基因，以獲得所希望的效應(yīng)。例如，對于治療性應(yīng)用而言期望的會是，細胞是否可以被siRNA分子直接殺傷。借此可以非常特異性地殺傷腫瘤細胞或病毒感染的細胞，特別通過使用所述的方法。
[0010]此外，經(jīng)常存在這樣的問題，在腫瘤細胞或病毒感染的細胞的基因組中，常發(fā)生突變，因此所使用的SiRNA分子可成為無活性的并由此無法對細胞產(chǎn)生所期望的影響或至少不能被有效利用。
[0011]本發(fā)明的目標在于，在廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域內(nèi)，盡可能有效、可靠且高效地殺傷生物體中的細胞，而不出現(xiàn)上文所述的已知的化學(xué)、物理、生物化學(xué)或分子生物學(xué)方法中本身的缺點。
[0012]根據(jù)本發(fā)明所提供的是生物活性核苷酸分子(例如基于RNA、siRNA、PNA、DNA或LNA的)，其具有與多個其所靶向的基因的mRNA有結(jié)合能力的核苷酸序列，從而通過與這些基因的結(jié)合，引發(fā)多個(更特別是大量的)用于細胞殺傷應(yīng)激狀態(tài)的“脫靶(off-target)”效應(yīng)。
[0013]術(shù)語“生物活性核苷酸分于”包含根據(jù)本發(fā)明的核苷酸分子，其在所有本文所述的條件和應(yīng)用下發(fā)揮其功能。特別是，根據(jù)本發(fā)明的生物活性核苷酸分子通過引發(fā)所謂的“脫靶”效應(yīng)來發(fā)揮其活性。引發(fā)細胞殺傷應(yīng)激狀態(tài)的“脫靶”效應(yīng)，其在本發(fā)明的背景下理解為這樣的生物活性或過程，其中一個核苷酸序列具有多個靶mRNA序列并潛在地影響多個基因的表達或者不依賴于對基因表達的影響而引發(fā)細胞應(yīng)激。
[0014]通過該應(yīng)激狀態(tài)，不依賴于用于減少單個基因表達的核苷酸分子特別是siRNA的常規(guī)應(yīng)用，而通過非特異性的核苷酸序列大大地影響細胞，從而殺傷細胞或在細胞中啟動程序性細胞死亡(凋亡)。
[0015]雖然如本文開頭所述，具有用于結(jié)合mRNA的核苷酸序列的核苷酸分子(例如基于siRNA的)是熟知的，然而，那些核苷酸序列每個均是特異性地針對于一個或幾個基因的mRNA，以通過與所靶向的目標基因選擇性地結(jié)合，而在細胞中實施確定的基因操縱并以這種方式實施基因定向的細胞影響。
[0016]通過本發(fā)明，對所述核苷酸序列進行有目的的設(shè)計，以便可以對接多個、更特別是大量的基因的mRNA，如果需要，也并不依賴于這些可結(jié)合的基因的mRNA目前是否實際上存在于細胞中。所提議要實現(xiàn)的mRNA-結(jié)合的主要目標因而并不是上文所述的針對細胞活性的基因操縱，而是要用大量的(實際上是任何的)核苷酸分子的mRNA-結(jié)合引發(fā)盡可能多的“脫靶”效應(yīng)，其此前是為了盡可能地避免或減輕目標明確的基因影響。通過盡可能多的“脫靶”效應(yīng)，產(chǎn)生對于細胞而言過大的應(yīng)激狀態(tài)，其是目標細胞不能承受的并且通過其可有目的性地殺傷上述的目標細胞(不是通過有目的性的基因表達操縱，而是通過普通的應(yīng)激)。
[0017]用基因結(jié)合必然的和已知的方式產(chǎn)生的和作用于細胞活性的特定基因影響因此是附帶的效應(yīng)，并且如過需要，可以根據(jù)基因影響的作用，進一步促進細胞作用(在上述的根據(jù)本發(fā)明的有目的性的應(yīng)激狀態(tài)之外)。
[0018]因此，通過可結(jié)合目標基因的核苷酸序列的選擇并不是或者至少并不主要是用作有目的地基因操縱以對細胞產(chǎn)生影響的目標效應(yīng)，而是通過基因結(jié)合可達到的“脫靶”效應(yīng)及用其在細胞中引起的應(yīng)激狀態(tài)的指定作用的目標效應(yīng)。
[0019]為了產(chǎn)生上述的“脫靶”效應(yīng)，對核苷酸序列進行選擇，從而使這些核苷酸序列不像傳統(tǒng)方式那樣針對一個目標基因，而是針對盡可能多的目標基因。由此產(chǎn)生對于大量基因有毒性作用的核苷酸干擾并巨大地影響細胞的生理學(xué)。
[0020]在細胞中可以將上述應(yīng)用與實現(xiàn)細胞特異性的已知機制組合應(yīng)用，以及與已知的穩(wěn)定性的可能性(例如siRNA的)組合應(yīng)用，以改善核苷酸分子的吸收。
[0021]所述核 苷酸序列不限于作為傳統(tǒng)siRNA使用；也可以將短的(10_20bp)雙鏈RNA、長的(20-300bp)雙鏈或單鏈RNA、DNA或化學(xué)類似物，例如PNA，與上述核苷酸序列一起使用。
[0022]除了上述的“脫靶”效應(yīng)的誘導(dǎo)，也可以通過已知的應(yīng)激誘導(dǎo)的核苷酸序列依次促進生物活性核苷酸分子的細胞毒性作用(FEDOROV Y等人，Off-target effcts by siRNAcan induce toxic phenotype.RNA(2006)，12:1188-1196.)。
[0023]通過合適的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，例如納米粒子、聚乙烯亞胺或脂質(zhì)，可以以已知的方式將活性物質(zhì)分子引入細胞中。
[0024]為了更好地被轉(zhuǎn)移入或轉(zhuǎn)移至細胞，以及為了其穩(wěn)定性或為了其檢測，還可以將所述分子結(jié)構(gòu)與其他物質(zhì)(例如作為載體系統(tǒng)的納米粒子或熒光色素)相連接。
[0025]生物活性核苷酸分子適合于選擇性地殺傷真核細胞，特別是動物細胞、植物細胞或真菌細胞，以及病毒感染的細胞和原核細胞。
[0026]在生物活性核苷酸分子的應(yīng)用中，也可以將它們與蛋白酶抑制劑組合使用。
[0027]有利地，用于生物活性核苷酸分子的應(yīng)用和施用的應(yīng)用試劑盒至少由下列組成:
[0028]-至少一個安剖瓶(安剖瓶A)，其包含所述生物活性分子并且還可包含:
[0029]-至少一個其它的具有轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，例如細胞滲透性肽、納米粒子、聚乙烯亞胺或脂質(zhì)的安剖瓶(安剖瓶B)，
[0030]-至少一個其它的安剖瓶(安剖瓶C)，其包含用于與生物活性分子結(jié)合的其它成分，或轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，
[0031]-用于安剖瓶A、B和C的內(nèi)容物的稀釋緩沖液和反應(yīng)緩沖液，
[0032]-一個或多個探針或注射器，其具有針頭和其它所需材料，用于將安剖瓶內(nèi)容物的混合物注射至包含目標細胞的培養(yǎng)基中，以及
[0033]-用于使用和施用的說明書。
[0034]下面，將根據(jù)附圖中所述的實施例更詳細地說明本發(fā)明。
[0035]其表明:
[0036]圖1:一個已知的siRNA的示意圖，其被引入細胞中，特異于一個mRNA并且壓制目標基因的表達。[0037]圖2:—個根據(jù)本發(fā)明的siRNA的示意圖，其被引入細胞中并在其中盡可能多地引發(fā)非特異性的RNAi效應(yīng)(脫靶效應(yīng))。
[0038]圖3:—個siRNA的示意圖，其被引入細胞中且目的不是在其中減少基因的表達和降解mRNA，而是通過在細胞中經(jīng)siRNA的特異性序列剪切而引起應(yīng)激反應(yīng)以導(dǎo)致細胞死亡。
[0039]在圖1中描繪了通常的和已知的SiRNAl的機制，所述siRNA被引入細胞2中(參見圖標箭頭的描繪)并且具有特異于與第一基因的mRNA3特異性結(jié)合的核苷酸序列(未作詳盡描繪)。隨后，該SiRNAl被并入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)(未作詳盡描繪)中，后者使siRNA分開為其兩個單鏈并且siRNA的反義鏈與RISC —起附加至第一 mRNA3。隨后，基因特異的第一mRNA3被切割并片段化，由此壓制了基于第一mRNA3的目標基因的表達(比較圖1中第一 mRNA7的降解)。之后，未被占據(jù)的并且裝配在RISC中的siRNAl此時附加至距離最近的細胞2中存在的特異性的第一 mRNA3并同樣將其降解。因此，其目標為，每個siRNAl僅與特異性的第一 mRNA3結(jié)合并將其降解。其它細胞2中還存在的另外的第二mRNA4、另外的第三mRNA5和另外的第四mRNA6則總是相對于siRNAl的第一 mRNA3或未作詳盡描繪的核苷酸序列完好地保留，從而mRNA4-6的基因其表達不被改變。這些方法是熟知的。 [0040]作為比較，圖2表示根據(jù)本發(fā)明的siRNA8的機制，所述siRNA8被引入細胞2中(也參見圖標箭頭描繪)，其中再次示例性地存在第一 mRNA3、第二 mRNA4、第三mRNA5以及第四mRNA6。
[0041]所提出的siRNAS包含由一個或多個下列核苷酸序列組成的鏈(出于清楚目的，未作詳盡描繪):
【權(quán)利要求】
1.生物活性核苷酸分子，具有至少一個目的在于結(jié)合mRNA的核苷酸序列以用于選擇性地影響細胞，其特征在于，所述核苷酸分子(8)的所述至少一個核苷酸序列針對多個基因的mRNA(3、4、5、6)結(jié)合能力進行設(shè)計，以通過所述核苷酸分子與所述基因的mRNA(3、4、5、6)的結(jié)合來引發(fā)多個、特別是大量的用于細胞殺傷應(yīng)激狀態(tài)的以毒性方式作用于細胞(2)的“脫靶”效應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的生物活性核苷酸分子，其特征在于，RNA、siRNA,PNA、DNA或LNA被用作核苷酸并且具有10-300bp的大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的生物活性核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子(8)包含特定的序列，其本身且也未與mRNA相結(jié)合而引起細胞中的應(yīng)激反應(yīng)，如AAA、UUU、GCCA、
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的生物活性核苷酸分子，其特征在于，所述(8)，特別是為了將其引入細胞(2)中，與分子如細胞滲透性肽結(jié)合或者被整合至試劑如聚乙烯亞胺、納米粒子或脂質(zhì)中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中的一個或多個的生物活性核苷酸分子，其特征在于，所述(8)
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的生物活性核苷酸分子，其選自⑶CUAUCAGCACAAUtt(SEQID NO:1)、GCUUAACUGUAUCUGGAGCtt (SEQ ID NO:2)、UUAACUGUAUCUGGAGCtt (SEQ IDNO:3)、AACUGUAUCUGGAGCtt (SEQ ID NO:4)、GCUCACCAAUGGAGAtt (SEQ ID NO:5)、GGCUGAACAAAGGAGAtt(SEQ ID NO:6)和 UGGCUGGCUGGCUGGCtt(SEQ ID NO:7)。
7.藥物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至6之一的生物活性核苷酸分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6之一的生物活性核苷酸分子，其用于腫瘤疾病或病毒引起的疾病的治療和/或預(yù)防。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至6的生物活性核苷酸分子用于選擇性地殺傷真核細胞特別是動物細胞、植物細胞或真菌細胞的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至6的生物活性核苷酸分子用于選擇性地殺傷病毒感染的細胞的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至6的生物活性核苷酸分子用于選擇性地殺傷原核細胞的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至6的生物活性核苷酸分子的用途，其特征在于，所述生物活性核苷酸分子與蛋白酶抑制劑組合使用。
13.用于使用和施用根據(jù)權(quán)利要求1至5的生物活性核苷酸分子的應(yīng)用試劑盒，其至少由下列所組成: -至少一個安剖瓶(安剖瓶A)，其包含所述生物活性分子并且還可以包含: -至少一個其他的具有轉(zhuǎn)染系統(tǒng)例如細胞滲透性肽、納米粒子、聚乙烯亞胺或脂質(zhì)的安剖瓶(安剖瓶B)， -至少一個其他的安剖瓶(安剖瓶C)，其包含用于與所述生物活性分子或轉(zhuǎn)染系統(tǒng)結(jié)合的其它成分， -用于安剖瓶A、B的內(nèi)容物的稀釋緩沖液和反應(yīng)緩沖液， -一個或多個探針或注射器，其具有針頭和其它所需材料，用于將安剖瓶內(nèi)容物的混合物注射至包含目標細胞的培養(yǎng)基中，以及-用于使用和施用的說明書 。
【文檔編號】C12N15/113GK103597075SQ201280006049
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月21日
【發(fā)明者】T·珀爾曼, R·岡瑟 申請人:耶拿市弗里德里?！は沾髮W(xué)