水果飲料中的益生菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及產(chǎn)生益生菌水果飲料的方法，所述益生菌水果飲料包含高活計數(shù)的酸適應(yīng)性益生菌，例如類干酪乳桿菌類干酪亞種(Lactobacillus?paracasei?subsp.paracasei)的菌株，并且涉及可通過此方法獲得的益生菌水果飲料。
【專利說明】水果飲料中的益生菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制備包含高計數(shù)的活益生菌的水果飲料的方法。本發(fā)明另外涉及可通過此方法獲得的益生菌水果飲料和酸適應(yīng)性益生菌用于制備益生菌水果飲料的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]已知一些細菌具有益生菌性質(zhì)，也就是說，當攝入足夠活量時，它們對宿主具有有益的保健效果。具體來說，屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的菌株已經(jīng)成為許多研究的主題,在許多領(lǐng)域中顯示預(yù)防性臨床效果以及對某些生理功能顯示預(yù)防性臨床效果。這些益生菌通常安全并且特別能夠促進腸內(nèi)微生物區(qū)系的適當運轉(zhuǎn)。對于滿足益生菌定義的細菌來說，除了要有明顯的證據(jù)表明其對消費者的健康具有正面效果外，它還必須能夠在腸內(nèi)存活并定殖并且能夠在嚴酷的食物生產(chǎn)和儲存過程中存活。臨床證據(jù)表明，益生菌的日劑量應(yīng)當為至少IO9CFU,以確保益生菌效倉泛。
[0003]益生菌產(chǎn)品的市場持續(xù)增長。益生菌已經(jīng)尤其被應(yīng)用于乳制品，其中乳酸菌相對較好地適應(yīng)所述培養(yǎng)基?，F(xiàn)在，橙汁以及其它類型的水果汁和含有水果醬和水果汁的飲料已經(jīng)被鑒定為益生菌培養(yǎng)物的重要載體，具有水果和益生菌的益處。
[0004]另外，不含有乳組分的水果飲料是給予諸如干酪乳桿菌431? (L.casei 431?)(Chr.Hansen, Hoersholm, Denmark)等低變應(yīng)原性益生菌的極佳方式。
[0005]然而，當將大量參考益生菌添加到例如橙汁中時，水果汁相當酸性的環(huán)境會導(dǎo)致初始細胞計數(shù)大大減小。為了在水果飲料中成功地應(yīng)用益生菌培養(yǎng)物，必須在貯存期間確保益生菌細胞的合適濃度。因此，認為增加益生菌培養(yǎng)物在橙汁和其它水果飲料中的存活非常關(guān)鍵。
[0006]產(chǎn)生含有有效量活乳桿菌的水果飲料的方法為現(xiàn)有技術(shù)，例如歐洲專利EP0113055已知，所述專利涉及包含以下步驟的方法:使水果汁與固體試劑接觸以去除抑菌性組分并且隨后使乳桿菌在4.0或更低pH下的水果汁中增殖。
[0007]然而，在所述水果飲料中，可能觀察到誘導(dǎo)產(chǎn)生使它們不適于消費的氣體和異味的細菌生長和/或活動。
[0008]美國專利申請US2010/0086646涉及基于新鮮植物汁和/或乳的食品，其包含活益生菌和pH介于3與4之間的膳食性質(zhì)子化弱一元酸，后者防止益生菌在食品中產(chǎn)生不正的味道和/或氣體。
[0009]PCT專利申請W02010/132017涉及包含益生菌的至少一種菌株和至少一種氣體形成減少劑的益生菌水果汁飲品，所述氣體形成減少劑選自西印度櫻桃(acerola)、石榴、蔓越莓、不老莓(arqnia)、黑醋栗、鼠李或接骨木果。
[0010]添加一元酸可影響食品的感官性質(zhì)并且還發(fā)現(xiàn)其負面地影響益生菌的存活率。添加酸形成減少劑也似乎負面地影響益生菌的存活率。此外，在食品中添加用于去除抑菌性化合物和/或用于減少不正的味道和/或氣體的試劑可被證明成本很高。[0011]因此，在所屬【技術(shù)領(lǐng)域】內(nèi)仍然需要提供用于產(chǎn)生具有高益生菌值的益生菌水果飲料的替代方法，其中所述益生菌水果飲料展現(xiàn)良好的味道，并且沒有異味和氣體產(chǎn)生，且其中所述益生菌水果飲料具有長貯存壽命。尤其需要不涉及添加可影響水果飲料感官品質(zhì)的固體試劑、一元酸或其它化合物的方法。
[0012]本發(fā)明提出產(chǎn)生水果飲料的替代方法，所述水果飲料包含在接種到所述水果飲料中之前已經(jīng)具有酸適應(yīng)性的益生菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的一個目標是提供含有能夠在水果飲料的酸性環(huán)境存活的穩(wěn)健益生菌的益生菌水果飲料。本發(fā)明的另一目標是提供具有良好的味道的益生菌水果飲料。本發(fā)明的又一目標是提供所述具有長貯存期的益生菌水果飲料。
[0014]為了在不添加過量益生菌的情況下在水果飲料中獲得高CFU/ml的益生菌，本發(fā)明的發(fā)明人一直在致力于對益生菌的酸耐受性進行改進，從而使所述益生菌對低PH具有穩(wěn)健抗性。
[0015]本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn):在可不進行pH穩(wěn)定的情況下，通過增殖一段時間使益生菌適應(yīng)酸，而不會顯著影響所得發(fā)酵產(chǎn)率。
[0016]酸適應(yīng)性益生菌可極其有用地作為益生菌組分用于添加到具有低pH(低于4.2)的水果飲料。其組合了益生菌的所有有益能力與水果的高營養(yǎng)值。
[0017]本發(fā)明方法不涉及向水果飲料中添加可能影響益生菌水果飲料的感官品質(zhì)的化學(xué)化合物。
[0018]因此，在第一個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生益生菌水果飲料的方法，所述方法包括:
[0019](a)使益生菌的至少一種菌株在增殖期間具有酸適應(yīng)性；
[0020](b)向水果飲料接種步驟(a)的酸適應(yīng)性益生菌的至少一種菌株；和
[0021](c)任選地包裝所述益生菌水果飲料。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，步驟(a)中的益生菌的酸適應(yīng)是通過以下步驟來實施:
[0023](i)在不進行pH穩(wěn)定的情況下，使所述益生菌的至少一種菌株在25°C到43°C且優(yōu)選地25°C到40°C范圍內(nèi)的溫度下在初始pH介于約6.0與約7.0之間的適宜培養(yǎng)基中增殖，所述培養(yǎng)基具有允許培養(yǎng)基達到介于約5.0到約4.0之間的pH的組分；
[0024](ii)收獲酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株；
[0025](iii)任選地濃縮酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株；
[0026]和
[0027](iv)任選地冷凍或冷凍干燥酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株。
[0028]在優(yōu)選實施例中，步驟(i)中的所述培養(yǎng)基具有在增殖至少8小時后允許所述培養(yǎng)基達到介于約5.0與約4.0之間的pH的組分。
[0029]在又一優(yōu)選實施方案中,在步驟(iii)中，也就是說在收獲酸適應(yīng)性細菌后,濃縮酸適應(yīng)性益生菌菌株。
[0030]本發(fā)明的第二個方面涉及可通過根據(jù)第一個方面的方法獲得的益生菌水果飲料。本發(fā)明還涉及包含菌株類干酪乳桿菌類干酪亞種(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei) CRL431 (干酪乳桿菌431? )的益生菌水果飲料。
[0031]本發(fā)明的第三個方面涉及獲得酸適應(yīng)性益生菌菌株的培養(yǎng)物的方法，所述方法包括以下步驟:
[0032](a)在不進行pH穩(wěn)定的情況下，使益生菌在25 °C到43 V且優(yōu)選地25 °C到40 V范圍內(nèi)的溫度下在初始PH介于約6.0到約7.0之間的適宜培養(yǎng)基中增殖，所述培養(yǎng)基具有允許所述培養(yǎng)基達到介于約5.0到約4.0之間的pH的組分；
[0033](b)收獲所述酸適應(yīng)性益生菌菌株；
[0034](C)任選地濃縮所述酸適應(yīng)性益生菌菌株；和
[0035](d)任選地冷凍或冷凍干燥所述酸適應(yīng)性益生菌菌株。
[0036]在優(yōu)選實施例中，步驟(a)中的所述培養(yǎng)基具有在增殖至少8小時后允許所述培養(yǎng)基達到介于約5.0與約4.0之間的pH的組分。
[0037]在特別優(yōu)選的實施方案中，在步驟(C)中，也就是說在收獲酸適應(yīng)性益生菌后，濃縮酸適應(yīng)性益生菌菌株。
[0038]第四個方面涉及可通過根據(jù)本發(fā)明第三個方面的方法獲得的酸適應(yīng)性益生菌菌株的培養(yǎng)物。
[0039]第五個方面涉及根據(jù)本發(fā)明第四個方面的酸適應(yīng)性益生菌菌株的培養(yǎng)物用于產(chǎn)生益生菌水果飲料的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1圖解說明干酪乳桿菌431?對MRS培養(yǎng)基(Difco)的酸化。在ρΗ5.0、pH4.5和ρΗ4.0下通過離心收獲酸適應(yīng)性細胞。
[0041]圖2繪示干酪乳桿菌431?在大規(guī)模產(chǎn)生期間的細胞計數(shù)。
[0042]圖3圖解說明在產(chǎn)生期間非適應(yīng)性(菱形)或者適應(yīng)ρΗ4.0(三角形)或ρΗ5.0(正方形)并且隨后以低(5X107CFU/ml，實心符號)或高(I X 108CFU/ml，空心符號)濃度添加的干酪乳桿菌431?在添加到草莓/香蕉汁時的細胞計數(shù)。
[0043]圖4繪示在產(chǎn)生期間非適應(yīng)性(菱形)或者適應(yīng)ρΗ4.0 (三角形)或ρΗ5.0 (正方形)并且隨后以低(5X107CFU/ml，實心符號)或高(I X 108CFU/ml，空心符號)濃度添加的干酪乳桿菌431?在添加到熱帶果汁時的細胞計數(shù)。
[0044]圖5顯示在產(chǎn)生期間非適應(yīng)性(菱形)或者適應(yīng)ρΗ4.0 (三角形)或ρΗ5.0 (正方形)并且隨后以低(5X107CFU/ml，實心符號)或高(I X 108CFU/ml，空心符號)濃度添加的干酪乳桿菌43 I ?在添加到紅色果汁時的細胞計數(shù)。
[0045]圖6圖解說明在產(chǎn)生期間非適應(yīng)性(對照)、適應(yīng)ρΗ4.0,4.5或5.0并且隨后以1.5X108CFU/ml的濃度添加的干酪乳桿菌4.3丨?在添加到100%橙汁時的細胞計數(shù)。
[0046]圖7顯示在產(chǎn)生期間非適應(yīng)性(對照)和適應(yīng)ρΗ4.0、4.5或5.0并且隨后作為冷凍顆粒儲存在-50°C下并且通過傾倒平鋪(pour plating)對解凍培養(yǎng)物的活力進行定期測試的干酪乳桿菌43 I (K)的細胞計數(shù)。
[0047]圖8圖解說明在產(chǎn)生期間非適應(yīng)性(對照)或適應(yīng)ρΗ4.0、作為冷凍顆粒在_50°C下儲存6個月并且隨后添加到在8°C下儲存X軸上所示時段的橙汁的干酪乳桿菌43 I?的細胞計數(shù)。[0048]圖9繪示在產(chǎn)生期間非適應(yīng)性的細胞(正方形)或者適應(yīng)ρΗ4.0 (三角形)的細胞并且隨后儲存在8°C下的干酪乳桿菌431?在添加到橙汁時的細胞計數(shù)。
【具體實施方式】[0049]定義
[0050]在本上下文中，術(shù)語“水果汁”是指在不存在熱和溶劑時通過機械擠壓或浸潰新鮮水果制備的天然含于水果中的液體。“水果汁”可由一種類型的水果或多于一種類型的水果的混合物的汁組成。
[0051]術(shù)語“水果飲品”在本上下文中是指水果汁含量介于O到29%之間的飲料。
[0052]術(shù)語“花蜜(nectar)”在本上下文中是指水果汁含量介于30%到99%水果汁之間的飲料。
[0053]在本上下文中，術(shù)語“果醬”是指在不存在熱和溶劑時通過研磨、壓榨和/或過濾成粘稠液體或軟質(zhì)膏糊的稠度制備的水果?！肮u”是由100%水果制成，而不是僅僅由水果汁制成。
[0054]在本上下文中，術(shù)語“水果飲料”是指包含水果汁、水果濃縮物和/或水果醬的飲料。術(shù)語“水果飲料”涵蓋“水果汁”、“水果飲品”和“花蜜”，如本文所定義。“水果飲料”可含有果肉或已經(jīng)通過諸如離心等操作去除果肉。水果飲料可進一步含有例如燕麥、大豆、扁桃仁、乳清和/或非發(fā)酵乳，例如呈乳粉形式。在特別優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的水果飲料不含有乳品組分，例如乳。
[0055]在本上下文中，術(shù)語“酸適應(yīng)”(細菌)是指通過在培育期間逐漸暴露于下降中的PH水平使得耐受低pH的活細菌。因此，使益生菌菌株具有酸適應(yīng)性的過程通常包括在逐漸降低的PH水平(例如直到達到介于4.0與5.0之間的pH)存在下培養(yǎng)這些菌株。優(yōu)選地，經(jīng)受酸適應(yīng)的益生菌本身在其增殖期間會產(chǎn)生酸，所述酸在培養(yǎng)基中積累。更優(yōu)選地，產(chǎn)酸益生菌屬于乳酸菌的組。或者，如果經(jīng)受酸適應(yīng)的益生菌不會自然地產(chǎn)生酸，那么也可以通過從外部添加酸來降低pH。
[0056]酸適應(yīng)的過程，優(yōu)選地在不進行pH穩(wěn)定的情況下，通過使益生菌在培養(yǎng)基中增殖來實施。表達“不進行pH穩(wěn)定”意指不采取措施來抵消逐漸降低的pH。例如，在一個實施例中，接種益生菌的培養(yǎng)基通常不含有可在形成或添加酸后保持PH穩(wěn)定的緩沖劑?；蛘?，如果起始培養(yǎng)基含有某一濃度的緩沖劑，那么培養(yǎng)可持續(xù)到緩沖劑的能力耗盡，并且在培養(yǎng)期間不添加其它緩沖劑。具體來說，在培養(yǎng)期間不添加堿性化合物來中和降低的pH。
[0057]“異味”意指食品的異常味道。異味令消費者不悅，因此不是所尋求的。還可以在產(chǎn)品中檢測到所謂的“正面”氣味，例如水果類型的氣味。由于這些味道不會令消費者不悅，因此它們不會包含在根據(jù)本發(fā)明所定義的“異味”中。
[0058]在本上下文中，術(shù)語“包裝”益生菌水果飲料涉及對益生菌水果飲料進行最終包裝以獲得可由例如一人或一群人攝入的產(chǎn)品。因此，適宜包裝可為瓶或紙箱或類似物，并且適宜量可為例如IOml到5000ml，但目前優(yōu)選地，包裝中的量為50ml到1000ml，例如200ml到IOOOml0
[0059]術(shù)語“益生菌”是指以足夠量給予消費者用于在所述消費者中達成促進健康的效果的目的的活細菌。益生菌可作為離散劑型(例如作為膠囊、懸浮物等等)給予?；蛘撸嫔允澄锘蛏攀承匝a充物形式給予。益生菌能夠在攝入后在胃腸道條件下存活并且定殖于消費者的腸。已經(jīng)在所屬領(lǐng)域內(nèi)使用不同類型的細菌作為益生菌，包括屬乳桿菌屬的細菌，例如嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、類干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、干釀乳桿菌、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)和約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii);雙歧桿菌屬，例如動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)等等。也已經(jīng)從諸如大腸桿菌屬(Escherichia)和芽孢桿菌屬(Bacillus)等其它屬描述了益生菌菌株。
[0060]在本上下文中，術(shù)語“突變體”應(yīng)當理解為借助例如遺傳改造、輻射和/或化學(xué)處理得到的菌株，或可由本發(fā)明菌株(或母本菌株)借助例如遺傳改造、輻射和/或化學(xué)處理得到的菌株。突變體也可以為自發(fā)地發(fā)生的突變體。優(yōu)選地，突變體為功能上等效的突變體，例如與母本菌株具有基本上相同或改進的性質(zhì)(例如關(guān)于味道、后酸化、酸化速度和/或酸適應(yīng)能力)的突變體。此類突變體是本發(fā)明的一部分。尤其地，術(shù)語“突變體”是指通過使本發(fā)明菌株經(jīng)受任何常用的誘變處理(包括用諸如乙烷甲烷磺酸鹽(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)等化學(xué)誘變劑、UV光處理)獲得的菌株或自發(fā)地發(fā)生的突變體。突變體可能已經(jīng)受若干誘變處理(單次處理應(yīng)當理解為一個誘變步驟、之后篩選/選擇步驟)，但目前優(yōu)選地，實施不超過20次或不超過10次或不超過5次處理(或篩選/選擇步驟)。在目前優(yōu)選的突變體中，與母本菌株相比，細菌基因組中的小于5%或小于I %或甚至小于0.1 %的核苷酸已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪缓塑账?，或缺失?br> [0061]在本上下文中，術(shù)語“變體”應(yīng)當理解為功能等效于本發(fā)明菌株，例如具有基本上相同或改進的性質(zhì)(例如關(guān)于味道、后酸化、酸化速度和/或酸適應(yīng)能力)的菌株。所述變體，可使用合適的篩選技術(shù)鑒別，是本發(fā)明的一部分。
[0062]除非本文另外指明或者上下文明顯矛盾，否則在描述本發(fā)明的上下文中(尤其在下文權(quán)利要求書的上下文中)所用術(shù)語“一(a和an)”和“所述”以及類似指示物應(yīng)當理解為涵蓋單數(shù)與復(fù)數(shù)二者。除非另外說明，否則術(shù)語“包含”、“具有”、“包括”和“含有”應(yīng)當理解為開放性術(shù)語(也就是說，意指“包括但不限于”)。
[0063]除非本文另外指明，否則本文列舉的數(shù)值范圍僅僅打算作為個別地表示此范圍內(nèi)的各單獨值的簡略方法，并且各單獨值個別地并入本說明書中如同其在本文中被個別列舉一樣。除非本文另外指明或上下文明顯矛盾，否則，本文所描述的所有方法都可以任何適宜的順序?qū)嵤３橇硗庖?，否則，使用本文所提供的任何和所有實施例或?qū)嵗杂谜Z(例如，“諸如”)僅僅打算用于更好地闡明本發(fā)明，而并不對本發(fā)明范圍構(gòu)成限制。本說明書中的任何用語都不應(yīng)當理解為表明是實施本發(fā)明必不可少的任何非要求保護要素。
_4] 本發(fā)明的實施方案和方面
[0065]益生菌菌株(例如屬乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的那些)可用于飲料。然而，它們對酸性環(huán)境敏感并且在接種到PH4.2或更低的培養(yǎng)基中時活細胞計數(shù)快速減小。
[0066]本發(fā)明的發(fā)明人驚訝地觀察到，通過使益生菌菌株具有酸適應(yīng)性，可顯著增加其在水果飲料中的存活，所述水果飲料通常由于果酸而具有在3-4范圍內(nèi)的低pH。在水果飲料中，在最長達10周的冷儲存期間，酸適應(yīng)性益生菌的活力基本上不會受到低PH的影響，并且在所述細菌的冷凍儲存期間維持酸性環(huán)境中的高活力。
[0067]另外，當將酸適應(yīng)性益生菌添加到水果飲料(例如紅色水果、熱帶水果和草莓/香蕉)的水果飲料時，未檢測到異味。
[0068]因此，本發(fā)明在第一個方面涉及通過向水果飲料接種酸適應(yīng)性益生菌的至少一種菌株來產(chǎn)生益生菌水果飲料的方法。
[0069]適用于本發(fā)明的水果飲料的實例是具有低pH值的那些，特別是包含柑橘類水果汁(例如橙汁、葡萄柚汁、酸橙汁和柑橘汁以及其混合物)的那些。水果飲料的其它實例包括包含蘋果汁的水果飲料。
[0070]適用于本發(fā)明中的水果飲料可例如為水果汁、來自濃縮物的水果汁、水果飲品和任選地包含水果醬和/或水的花蜜。
[0071]水果汁和/或水果醬在水果飲料中的總含量通常介于約20重量％到約99.99重量％之間，優(yōu)選地介于約30重量％到95重量％之間，更優(yōu)選地介于約40重量％到90重量％之間，仍更優(yōu)選地介于約50重量%到80重量%之間且最優(yōu)選地60重量％到70重量%之間。
[0072]在一個實施方案中，本發(fā)明的水果飲料基本上不含有乳組分，但可包含蔬菜汁、蔬菜濃縮物和/或蔬菜醬。
[0073]在一個實施方案中，這些水果飲料的pH在介于3.2與4.2之間、優(yōu)選地介于3.5與3.9之間的范圍內(nèi)。
[0074]在一個優(yōu)選實施方案中，整個或部分水果飲料是由選自由以下組成的組的水果制成:草莓、香蕉、葡萄、橙子、蘋果、芒果、桃、藍莓、菠蘿、酸橙、覆盆子和黑醋栗以及其混合物。
[0075]根據(jù)本發(fā)明一優(yōu)選實施方案，水果飲料包含草莓醬、香蕉醬、葡萄汁、橙汁、芒果醫(yī)、桃醫(yī)和藍毒醫(yī)。
[0076]根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案，水果飲料包含菠蘿汁、橙汁、香蕉醬、芒果醬和酸橙汁。
[0077]根據(jù)本發(fā)明再一優(yōu)選實施方案，水果飲料包含覆盆子醬、黑醋栗汁、藍莓醬、葡萄汁、草莓醬和香蕉醬。
[0078]在不進行pH穩(wěn)定的情況下通過增殖使至少一種益生菌在適宜培養(yǎng)基中具有酸適應(yīng)性。在一個實施方案中，在不進行pH穩(wěn)定的情況下使至少一種益生菌在25°C到43°C范圍內(nèi)、優(yōu)選地在25°C到40°C范圍內(nèi)的溫度下在初始pH介于約6.0與約7.0之間的培養(yǎng)基中增殖，所述培養(yǎng)基具有優(yōu)選地在增殖至少8小時后允許所述培養(yǎng)基達到介于約5.0與約
4.0之間的pH的組分，從而產(chǎn)生酸適應(yīng)性益生菌的至少一種菌株；收獲酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株；優(yōu)選地濃縮酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株；并且任選地冷凍或冷凍干燥酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株。
[0079]用于使益生菌具有酸適應(yīng)性的培養(yǎng)基優(yōu)選地具有在益生菌增殖期間允許所述培養(yǎng)基達到介于約5.0與約4.0之間的pH的組分。此意指，培養(yǎng)基的pH由于益生菌產(chǎn)生酸而降低，或者通過連續(xù)或逐漸添加酸到培養(yǎng)物而降低。因此，培養(yǎng)基不含有在介于約5.0與約4.0之間的pH下會分解或以其它方式變得無效或甚至有毒的任何基本組分。培養(yǎng)基的基本組分是益生菌增殖所需的化合物，例如營養(yǎng)素、碳源和氮源、維生素等等。
[0080]在優(yōu)選實施方案中，用于增殖的培養(yǎng)基包含至少0.4%酵母提取物和至少2%糖。
[0081]可用于益生菌、尤其乳酸菌增殖的適宜培養(yǎng)基為所屬領(lǐng)域內(nèi)所熟知。例如，如果所欲使用的益生菌是乳酸菌，那么可使用用于乳酸菌的任何商購培養(yǎng)基，例如乳桿菌MRS (deMaruRogosa和Sharpe)培養(yǎng)基?？捎糜谝嫔鲋车膶嵗訫RS培養(yǎng)基含有1.0%蛋白胨、
0.8%肉膏、0.4%酵母提取物、2.0 %葡萄糖、0.5%三水乙酸鈉、0.1%聚山梨醇酯80 (也稱為Tween80)、0.2%磷酸氫二鉀、0.2%檸檬酸三銨、0.02%七水硫酸鎂和0.005%四水硫酸錳，在25°C下pH為6.0-7.0。當使用此培養(yǎng)基使益生菌具有酸適應(yīng)性時，特別優(yōu)選地，省去磷酸氫二鉀組分，以使得盡管在細菌產(chǎn)生酸后或在從外部添加酸后，但所述培養(yǎng)基仍不能提供穩(wěn)定pH。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，從上述MRS培養(yǎng)基省去磷酸氫二鉀組分與三水乙酸鈉組分二者。然而，如本文其它地方所概述，也可以在用于使益生菌具有酸適應(yīng)性的培養(yǎng)基中維持緩沖組分。在此情況下，在緩沖能力已經(jīng)耗盡后將發(fā)生pH下降。益生菌的培養(yǎng)將不包括堿的任何外部添加。
[0082]通常，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員會了解用于益生菌增殖的適宜培養(yǎng)基。含有或不含有緩沖組分的上述培養(yǎng)基適于起子培養(yǎng)物(例如體積為約IOOmU約500mL、約IOOOmLJS2000mL、約4000mL或更大的起子培養(yǎng)物)以及大規(guī)模細菌培養(yǎng)物(例如體積超過50L、超過100L、超過200L或超過400L的培養(yǎng)物)增殖。所述大規(guī)模培養(yǎng)物通常會在發(fā)酵器中實施。適宜培養(yǎng)基的使用在下文實施例1中進行例示。
[0083]培養(yǎng)基的初始pH是培養(yǎng)基在添加益生菌之前的pH。在優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)基的初始PH介于約6.0與7.0之間、優(yōu)選地介于約6.2與約6.6之間。
[0084]在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選地在益生菌增殖至少6小時、至少8小時、至少10小時后且更優(yōu)選地在益生菌增殖至少12小時后，培養(yǎng)基達到介于約5.0與約4.0之間的pH。在特別優(yōu)選的實施方案中，在至少8小時后，培養(yǎng)基達到介于約5.0與約4.0之間的pH。
[0085]益生菌可由于發(fā)酵期間乳酸的產(chǎn)生而引起增殖期間的pH下降。在優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明方法中的培養(yǎng)基允許此PH下降，因為盡管在增殖期間形成乳酸，但所述培養(yǎng)基不含有或基本不含有保持PH穩(wěn)定的任何緩沖劑。
[0086]優(yōu)選地，在25°C到43°C范圍內(nèi)、優(yōu)選地在25 V到40°C范圍、更優(yōu)選地在30 V到40°C范圍內(nèi)且最優(yōu)選地在約37°C的溫度下，在不進行pH穩(wěn)定的情況下使益生菌增殖。
[0087]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，益生菌的至少一種菌株屬于屬乳桿菌屬或雙歧桿菌屬。
[0088]在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，益生菌的至少一種菌株屬于類干酪乳桿菌種。如果使用類干酪乳桿菌，那么用于增殖的溫度優(yōu)選為37°C或38°C。
[0089]菌株類干酪乳桿菌類干酪亞種CRL431 (干酪乳桿菌431? )依照國際承認用于專利程序目的的微生物保藏布達佩斯條約(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedure)于1994年I月24日以保藏號ATCC55544保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Tissue type Collection Center)(10801University Blvd, Manassas,VA20110,USA)。該眾所周知的益生菌可以產(chǎn)品名稱Probio-Tec? F-DVS干酪乳桿菌-43 I ?物品編號501749和以產(chǎn)品名稱Probio-Tec? C-Powder-30物品編號687018商購自Chr.Hansen A/S(10_12Boege Alle, DK_2970Hoersholm, Denmark)。
[0090]在本發(fā)明的甚至更優(yōu)選的實施方案中，益生菌的至少一種菌株選自由以下組成的組:以保藏號ATCC55544保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的類干酪乳桿菌類干酪亞種菌株CRL431 (干酪乳桿箾43 I ? )、其突變體和其變體。
[0091]收獲和濃縮酸適應(yīng)性益生菌的方法為所屬領(lǐng)域內(nèi)所熟知。例如，細菌的收獲可通過離心細菌培養(yǎng)物以去除培養(yǎng)基上清液來完成。離心應(yīng)當足夠輕緩以避免破壞細菌。通過離心收獲細胞的方法眾所周知，并且包括例如在2000Xg到6000Xg下離心2-20分鐘。也可以通過已經(jīng)在細菌發(fā)酵的背景下描述的其它技術(shù)(例如過濾，例如錯流過濾)收獲細菌。用于濃縮的方法同樣為所屬領(lǐng)域內(nèi)已知。例如，細菌的濃縮可以通過離心和隨后以較小的體積再懸浮、冷凍干燥或膜過濾技術(shù)(例如經(jīng)由柱或過濾器過濾)完成。
[0092]通常，以以下的量(初始CFU/ml)向水果飲料接種酸適應(yīng)性益生菌的至少一種菌株:約 I X 104CFU/ml 到 I X 1010CFU/ml 的量、更優(yōu)選地以約 I X 105CFU/ml 到 I X 109CFU/ml的量且甚至更優(yōu)選地以約lX106CFU/ml到lX108CFU/ml的量。
[0093]令人驚訝地，在進行上述酸性條件適應(yīng)后，益生菌的活力特別高并且在4-10°C的溫度下儲存數(shù)個月時間后仍然很高。在一個實施方案中，在水果飲料中在8°C的溫度下儲存至少30天后，例如在8°C的溫度下儲存至少42天后，例如在8°C的溫度下儲存至少70天后,酸適應(yīng)性益生菌的至少一種菌株的活力是初始CFU/ml的至少50%。
[0094]在優(yōu)選實施方案中，在上述儲存條件下,酸適應(yīng)性益生菌的至少一種菌株的活力是初始CFU/ml的至少60%，優(yōu)選為初始CFU/ml的至少70%，且更優(yōu)選為初始CFU/ml的至少 80%。
[0095]根據(jù)所屬領(lǐng)域內(nèi)的標準方法，通過對瓊脂板進行菌落計數(shù)，通過定量連續(xù)稀釋液中的菌落形成單位(CFU)數(shù)，來測量活細胞數(shù)。適宜培養(yǎng)基和培育條件在下文實施例中給出。
[0096]在收獲和/或濃縮后，任選地冷凍或冷凍干燥酸適應(yīng)性細菌。例如，可在約_20°C，優(yōu)選地在約-80°C或更低下冷凍益生菌。冷凍程序優(yōu)選地盡可能快地實施，優(yōu)選地通過休克冷凍來實施，以避免細胞損害。休克冷凍可例如通過將含有細菌的容器傾倒入液氮中來實施。因此，在特別優(yōu)選的實施方案中，將酸適應(yīng)性益生菌在約_196°C下休克冷凍。用于冷凍干燥的方法也為所屬領(lǐng)域內(nèi)所熟知。在冷凍干燥期間，將材料冷凍并且隨后降低周圍壓力以使冷凍材料中的水從固相直接升華到氣相。在冷凍或休克冷凍酸適應(yīng)性細菌后，可將細菌儲存在約_20°C、約_55°C、約_80°C或在液氫中在-196°C。特別優(yōu)選地，將酸適應(yīng)性細菌儲存在約-55 °C。
[0097]根據(jù)本發(fā)明實施方案，將益生菌水果飲料方便地包裝在含有IOml到5000ml (例如50ml到IOOOml或200ml到1000ml)產(chǎn)品的密封包裝中。
[0098]在第二個方面，本發(fā)明涉及可通過根據(jù)本發(fā)明第一個方面的方法獲得的益生菌水果飲料，其中所述益生菌水果飲料包含酸適應(yīng)性益生菌的至少一種菌株。
[0099]在一個實施方案中，在8°C的溫度下儲存至少30天后，例如在8°C的溫度下儲存至少42天后，益生菌的至少一種菌株以約I X 104CFU/ml到I X 1010CFU/ml的量，更優(yōu)選地以約 I X 105CFU/ml 到 I X 109CFU/ml 的量且甚至更優(yōu)選地以約 I X 106CFU/ml 到 I X 108CFU/ml的量存在于水果飲料中。
[0100]根據(jù)所屬領(lǐng)域內(nèi)的標準方法，通過對瓊脂板進行菌落計數(shù)，通過定量連續(xù)稀釋液中的菌落形成單位(CFU)數(shù)，來測量活細胞計數(shù)。適宜培養(yǎng)基和培育條件在下文實施例中
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[0101]在第三個方面，本發(fā)明涉及在不進行pH穩(wěn)定的情況下通過增殖獲得培養(yǎng)物的酸適應(yīng)性益生菌菌株的方法。在優(yōu)選實施方案中，在不進行PH穩(wěn)定的情況下，使益生菌在250C到43°C范圍內(nèi)、更優(yōu)選地在25°C到40°C范圍內(nèi)的溫度下在初始pH介于約6.0與約7.0之間的培養(yǎng)基中增殖，所述培養(yǎng)基具有在增殖至少8小時后允許培養(yǎng)基達到介于約5.0與約4.0之間的pH的組分，從而產(chǎn)生酸適應(yīng)性益生菌；收獲所述酸適應(yīng)性益生菌；濃縮所述酸適應(yīng)性益生菌；并且任選地冷凍或冷凍干燥所述酸適應(yīng)性益生菌。
[0102]在一個優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)基包含至少0.4%酵母提取物和至少2%糖。
[0103]培養(yǎng)基的初始pH是培養(yǎng)基在添加益生菌之前的pH。在優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)基的初始PH介于約6.2與約6.6之間。
[0104]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在益生菌增殖至少10小時后,優(yōu)選地在益生菌增殖至少12小時后，培養(yǎng)基達到介于約5.0與約4.0之間的pH。
[0105]在優(yōu)選實施方案中，益生菌屬于屬乳桿菌屬或雙歧桿菌屬。
[0106]在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，益生菌的至少一種菌株屬于類干酪乳桿菌種。
[0107]在本發(fā)明的甚至更優(yōu)選的實施方案中，益生菌的至少一種菌株選自由以下組成的組:以保藏號AT< 14保藏在美國培養(yǎng)物保藏中心的類干酪乳桿菌類干酪亞種菌株CRL431 (干酪乳桿1143 I (L))、其突變體和其變體。
[0108]本發(fā)明的第四個方面涉及根據(jù)本發(fā)明第三個方面的酸適應(yīng)性益生菌菌株的培養(yǎng)物。
[0109]第五個方面涉及根據(jù)第四個方面的培養(yǎng)物用于產(chǎn)生益生菌水果飲料的用途。
[0110]在一個優(yōu)選實施方案中，益生菌水果飲料具有最多4.2的pH。
[0111]通過以下非限制性實施例進一步說明本發(fā)明。
[0112]實施例
[0113]實施例1.酸適應(yīng)性干酪乳桿菌431?的產(chǎn)生
[0114]向來自Difco的MRS培養(yǎng)基(編號288110)接種1% (V/V)來自凍存物的干酪乳桿菌43丨?。使所述培養(yǎng)物在37°C下生長過夜直到pH低于3.9，并且將其儲存在5°C直到使用。將此過夜培養(yǎng)物用于接種4L(1%，V/V)MRS培養(yǎng)基(Difco)并且在37°C下培育過夜直到PH低于3.9，并且將其儲存在5°C下直到使用。進行此預(yù)接種步驟以獲得足量的接種物用于發(fā)酵。向含有10°C的400L適宜培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器接種整個體積的預(yù)接種物。通過將溫度增加到35°C來起始發(fā)酵并且在發(fā)酵時監(jiān)測pH的降低作為碳水化合物產(chǎn)生乳酸的代謝的指示。在此PH下降期間，細胞逐漸適應(yīng)低pH。在？冊.0、4.5和4.0下通過離心收獲酸適應(yīng)性細胞。根據(jù)收獲點發(fā)酵時間介于10-17小時之間(圖1)。
[0115]立即將濃縮細胞團冷凍在液氮(_196°C )中并且儲存在_55°C下直到使用。
[0116]實施例2.用于酸適應(yīng)性干酪乳桿菌431?的收獲標準的優(yōu)化
[0117]為了獲得最大的活細胞數(shù)，如下確定最佳收獲標準。向生物反應(yīng)器接種預(yù)接種物并且如實施例1中所描述來起始發(fā)酵。從接種后11小時(對應(yīng)于pH4.5)開始，每30分鐘取發(fā)酵物樣品，直到pH低于4.0，并且通過測定菌落形成單位(CFU)數(shù)來評估活力(圖2)。通過在MRS瓊脂中傾倒平鋪合適的10倍稀釋液、之后在37°C下厭氧培育3天來測定CFU。
[0118]細胞計數(shù)增加直到接種后12h(對應(yīng)于4.24的pH)，并且在整個發(fā)酵期間，都保持在恒定水平。此表明，細胞是穩(wěn)健的并且甚至在PH下降到低于4.0時，仍然是活的。將pH< 4.0確定為在可行的處理時間內(nèi)提供適應(yīng)酸且為活的足量細胞的最佳收獲標準。
[0119]實施例3.添加有適應(yīng)性干酪乳桿菌431?的各種水果飲料的存活和感官品質(zhì)
[0120]使用根據(jù)實施例1中描述的程序產(chǎn)生的干酪乳桿菌4?(^λ種由以下成分構(gòu)成的基于水果的不同飲料:
[0121]草莓和香蕉汁(ΡΗ3.75)
[0122]31%草莓醬
[0123]26%香蕉醬
[0124]葡萄汁、橙汁、芒果醬、桃醬和藍莓醬，補足到100%
[0125]熱帶果汁(ρΗ3.88)
[0126]32%菠蘿汁
[0127]32% 橙汁
[0128]26%香蕉醬
·[0129]7%芒果醬
[0130]3%酸橙汁
[0131]紅色水果汁(ρΗ3.55)
[0132]16%不同的紅色水果(覆盆子醬、黑醋栗汁、藍莓醬)
[0133]葡萄汁、草莓醬及香蕉醬，補足到100%
[0134]在鹽水蛋白胨中稀釋益生菌培養(yǎng)物的F-DVS以確保，通過將1% v/v的接種物添加到不同水果汁的紙箱中獲得5Χ 107CFU/ml或I X 108CFU/ml的初始細胞計數(shù)。向果汁接種適應(yīng)pH4.0或pH5.0的干酪乳桿菌431?和作為對照的非適應(yīng)性的干酪乳桿菌43 I?。作為感官分析的對照，向紙箱接種相同體積的鹽水蛋白胨。將接種的果汁避光儲存在8°C下。通過在MRS瓊脂中傾倒平鋪合適的10倍稀釋液、之后在37°C下厭氧培育3天來定期測定干酪乳桿菌43 I?的細胞計數(shù)。感官評估是在儲存期間由3個經(jīng)過培訓(xùn)的感官評估人組成的小組來實施。
[0135]圖3、4和5中對不同果汁中干酪乳桿菌43丨⑧的細胞計數(shù)進行了圖解說明。酸適應(yīng)性干酪乳桿菌431?細菌未受到在PH3.5-3.9的酸性環(huán)境中儲存至少30天的影響，而非適應(yīng)性的干酪乳桿菌431?細菌在水果飲料中的活力低了 1000倍。
[0136]30天儲存期間的感官評估顯示，與添加有對應(yīng)體積的鹽水蛋白胨的相同水果飲料相比，添加有干酪乳桿菌431?的任一種水果飲料都沒有感官變化。
[0137]實施例4.橙汁中的干酪乳桿菌43〗?在適應(yīng)Ξ種不同的PH值時的存活
[0138]使用根據(jù)實施例1中描述的程序產(chǎn)生的干酪乳桿菌431?接種100%橙汁(pH3.8)。在鹽水蛋白胨中稀釋益生菌培養(yǎng)物的F-DVS以確保通過將1% v/v的接種物添加到橙汁的紙箱中獲得1.5X108CFU/ml的初始細胞計數(shù)。向果汁接種適應(yīng)pH4.0、pH4.5或pH5.0的干酪乳桿菌431?和作為對照的非適應(yīng)性的干酪乳桿菌431?。將果汁在8°C下避光儲存42天并且定期取樣，以供通過在MRS瓊脂中傾倒平鋪合適的10倍稀釋液、之后在37°C下厭氧培育3天來測定細胞計數(shù)。
[0139]如圖6中所圖解說明，當在產(chǎn)生期間適應(yīng)pH4.0、4.5或5.0時，干酪乳桿菌431?的細胞計數(shù)相當恒定，而非適應(yīng)性的干酪乳桿菌431?則觀察到顯著的細胞計數(shù)減小。
[0140]實施例5.適應(yīng)性干酪乳桿菌431在冷序儲存期間的穩(wěn)定性.[0141]將根據(jù)實施例1產(chǎn)生的干酪乳桿菌431?作為冷凍顆粒儲存在-50°C，并且定期測試其活力。通過在MRS瓊脂中傾倒平鋪合適的10倍稀釋液、之后在37°C下厭氧培育3天對解凍培養(yǎng)物進行細胞計數(shù)測定。如圖7中所圖解說明，在產(chǎn)生期間，非適應(yīng)性以及適應(yīng)pH4.0、4.5或5.0的干酪乳桿菌43 I ?的細胞計數(shù)在至少6個月內(nèi)非常恒定。
[0142]本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，包括本發(fā)明人已知用于實施本發(fā)明的最佳模式。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀前述說明后可以明了那些優(yōu)選實施方案的各種變化形式。本發(fā)明人期望所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員適當采用所述變化形式，并且所述發(fā)明人打算以不同于本文具體描述的方式來實施本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括適用法律所允許的本文所附權(quán)利要求書中所引述標的物的所有修改形式和等效形式。此外，除非本文另有指明或上下文明顯矛盾，否則本發(fā)明涵蓋在所有可能的變化形式中上述要素的任一組合。
[0143]實施例6.果汁中的干酪乳桿菌431?在長期冷凍儲存后的存活
[0144]作為冷凍顆粒在-50°C下儲存6個月后，測定在產(chǎn)生期間適應(yīng)pH4.0的干酪乳桿菌431批次在100%橙汁中的存活。在鹽水蛋白胨中稀釋益生菌培養(yǎng)物的F-DVS以確保，通過將1% (v/v)的接種物添加到橙汁的紙箱中獲得108CFU/ml的初始細胞計數(shù)。作為對照，向100%橙汁的其它紙箱中添加在-50°C下儲存6個月的非適應(yīng)性的干酪乳桿菌431?。將果汁在8°C下避光儲存并且定期取樣，以供通過在MRS瓊脂中傾倒平鋪合適的10倍稀釋液、之后在37°C下厭氧培育3天來測定干酪乳桿菌43 I ?細胞計數(shù)。
[0145]如圖8中所圖解說明，當在產(chǎn)生期間適應(yīng)PH4.0，在_50°C下儲存6個月并且隨后在橙汁中冷儲存6周時，干酪 乳桿菌431?的細胞計數(shù)相當恒定。相反，當在-50°c下儲存6個月并且添加到橙汁時，非適應(yīng)性的干酪乳桿菌431?觀察到顯著的細胞計數(shù)減小。此圖解說明，在產(chǎn)生期間適應(yīng)PH4.0的干酪乳桿菌431?在橙汁中的良好存活甚至在培養(yǎng)物在-50°c長期冷凍儲存后仍然得以維持。
[0146]實施例7.適應(yīng)性干酪乳桿菌431?在100%橙汁中的長期儲存穩(wěn)定性
[0147]使用根據(jù)實施例1中描述的程序產(chǎn)生的干酪乳桿菌431?接種100%橙汁(pH3.8)。在鹽水蛋白胨中稀釋益生菌培養(yǎng)物的F-DVS以確保，通過將1% v/v的接種物添加到果汁的紙箱中獲得約108CFU/ml的初始細胞計數(shù)。向果汁接種適應(yīng)pH4.0的干酪乳桿菌431?或作為對照的非適應(yīng)性的“對照”干酪乳桿菌431?。將橙汁在8°C下避光儲存70天并且定期取樣，以供通過在MRS瓊脂中傾倒平鋪合適的10倍稀釋液、之后在37°C下厭氧培育3天來測定細胞計數(shù)。
[0148]如圖9中所圖解說明，當在產(chǎn)生期間適應(yīng)pH4.0并且隨后在橙汁中冷儲存長達10周時，干酪乳桿菌431?的細胞計數(shù)相當恒定。相反，當在橙汁中冷儲存時，非適應(yīng)性的干酪乳桿菌431?從儲存3周的第一次取樣點觀察到顯著的細胞計數(shù)減小。此圖解說明，甚至在長達10周的冷儲存后，適應(yīng)pH4.0的干酪乳桿菌431?在橙汁中的存活仍然極好。
[0149]參考文獻
[0150]歐洲專利EP0113055[0151]美國專利申請案US2010/0086646
[0152]PCT 專利申請案 W02010/132017
[0153]此專利文件中引述的所有參考文獻都以整體引用的方式并入本文中。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)生益生菌水果飲料的方法，所述方法包括: (a)使益生菌的至少一種菌株在增殖期間進行酸適應(yīng)； (b)向水果飲料接種步驟(a)的酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株；和 (C)任選地，包裝所述益生菌水果飲料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)中的酸適應(yīng)包括: (i)在不進行PH穩(wěn)定的情況下，使益生菌的所述至少一種菌株在25°C到43°C范圍內(nèi)、優(yōu)選地在25°C到40°C范圍內(nèi)的溫度下在具有初始pH介于約6.0與約7.0之間的適宜培養(yǎng)基中增殖，所述培養(yǎng)基具有允許所述培養(yǎng)基達到介于約5.0與約4.0之間的pH的組分； (?)收獲酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株； (iii)任選地，濃縮酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株； 和 (iv)任選地，冷凍或冷凍干燥酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(i)中的所述培養(yǎng)基包含至少2%糖和至少0.4%酵母提取物。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中在步驟(b)中，向所述水果飲料接種以下量(初始CFU/ml水果飲料)的酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株:約I X 104CFU/ml水果飲·料到I X 1010CFU/ml水果飲料的量、更優(yōu)選地以約I X 105CFU/ml水果飲料到I X 109CFU/ml水果飲料的量且甚至更優(yōu)選地以約I X 106CFU/ml水果飲料到I X 108CFU/ml水果飲料的量。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中在所述水果飲料中在8°C的溫度下儲存至少30天后，例如在8°C的溫度下儲存至少42天后，例如在8°C的溫度下儲存至少70天后，酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株的活力是初始CFU/ml水果飲料的至少50%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中酸適應(yīng)性益生菌的所述至少一種菌株的活力是所述初始CFU/ml水果飲料的至少60%，例如為所述初始CFU/ml水果飲料的至少70%，例如為所述初始CFU/ml水果飲料的至少80%。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述益生菌水果飲料的pH在3.2到4.2范圍內(nèi)，例如在3.5到3.9范圍內(nèi)。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中益生菌的所述至少一種菌株選自由乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中益生菌的所述至少一種菌株屬于類干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)菌種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中益生菌的所述至少一種菌株選自由以下組成的組:以保藏號ATCC55544保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Tissue TypeCollection)的類干酪乳桿菌類干酪亞種(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)菌株CRL431 (干酪乳桿菌431 ?(L.casei 431 ?))、其突變體和其變體。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述益生菌水果飲料包含20重量％到99.99重量％的水果汁和/或水果醬。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述水果飲料是由選自由以下組成的組的水果制成:草莓、香蕉、葡萄、橙子、蘋果、芒果、桃、藍莓、菠蘿、酸橙、覆盆子和黑醋栗以及其混合物。
13.—種益生菌水果飲料，其能通過根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法獲得。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的益生菌水果飲料，其中在8°C的溫度下儲存至少30天后，益生菌的所述至少一種菌株以約lX104CFU/ml到lX10lclCFU/ml的量、更優(yōu)選地以約I X 105CFU/ml 到 I X 109CFU/ml 的量且甚至更優(yōu)選地以約 I X 106CFU/ml 到 I X 108CFU/ml 的量存在于所述水果飲料中。
15.一種獲得酸適應(yīng)性益生菌菌株的培養(yǎng)物的方法，所述方法包括以下步驟: (a)在不進行pH穩(wěn)定的情況下，使益生菌菌株在25°C到43°C范圍內(nèi)、優(yōu)選地在25°C到40°C范圍內(nèi)的溫度下，在具有初始pH介于約6.0與約7.0之間的適宜培養(yǎng)基中增殖，所述培養(yǎng)基具有允許所述培養(yǎng)基達到介于約5.0與約4.0之間的pH的組分； (b)收獲細胞； (C)任選地，濃縮所述細胞；和 (d)任選地，冷凍或冷凍干燥所述細胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中步驟(a)中的所述培養(yǎng)基包含至少2%糖和至少0.4%酵母提取物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15和16中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述益生菌菌株屬于乳桿菌屬或雙歧桿菌屬 。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述益生菌菌株屬于類干酪乳桿菌菌種。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述益生菌菌株選自由以下組成的組:以保藏號ATCC55544保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的類干酪乳桿菌類干酪亞種菌株CRL431 (干酪乳桿菌431? )、其突變體和其變體。
20.一種酸適應(yīng)性益生菌菌株的培養(yǎng)物，其能通過根據(jù)權(quán)利要求15到19中任一權(quán)利要求所述的方法獲得。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的酸適應(yīng)性益生菌菌株的培養(yǎng)物在用于產(chǎn)生益生菌水果飲料中的用途。
【文檔編號】A23L1/30GK103857297SQ201280006072
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月21日
【發(fā)明者】蒂娜·霍恩貝克, C·T·戈特利布, T·M·索爾森, P·索姆 申請人:科.漢森有限公司