細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞片及其利用方法
【專利摘要】通過改變構(gòu)成細(xì)胞片層疊體的細(xì)胞的種類、混合比例、接種的細(xì)胞數(shù)而改變細(xì)胞片層疊體內(nèi)的細(xì)胞的狀態(tài)，能夠最優(yōu)化促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，另外也能夠最優(yōu)化血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。
【專利說明】細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞片及其利用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及在藥物研發(fā)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物等領(lǐng)域中有用的、產(chǎn)生與血管新生有關(guān)的細(xì)胞因子的細(xì)胞片、構(gòu)建有高密度的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片、其制造方法以及其利用方法。本申請是以2011年2月28日所提出的日本專利申請(日本特愿2011-043198號)為基礎(chǔ)主張優(yōu)先權(quán)的申請。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，為了使受到損傷的生物體組織再生，各種各樣的再生醫(yī)療技術(shù)備受矚目。關(guān)于這些，以心肌組織的再生為例已經(jīng)進(jìn)行了多項(xiàng)研究，如:向心肌組織將心肌細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞直接注入并再生的方法；如后所述，在特殊的溫度響應(yīng)性基材上培養(yǎng)心肌組織細(xì)胞，使溫度變化，制成低損傷的心肌組織細(xì)胞片并移植進(jìn)行再生的方法(參照專利文獻(xiàn)I。)等，一部分細(xì)胞也開始轉(zhuǎn)向人的臨床研究。
[0003]專利文獻(xiàn)2中公開有:以心肌功能的改善、血管新生的促進(jìn)、心肌組織的再生為目的，將選自心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及骨骼肌成肌細(xì)胞的細(xì)胞作為移植片而進(jìn)行利用的方法。另外，專利文獻(xiàn)3中公開有:以心臟功能恢復(fù)為目的，將骨骼肌細(xì)胞組合物作為移植片而利用的方法。根據(jù)專利文獻(xiàn)2和3，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的例中，通過注入上述的移植片，確認(rèn)有心功能的恢復(fù)，顯示出其有效性。但是，專利文獻(xiàn)2和3中公開的細(xì)胞移植片均為注入細(xì)胞懸浮液的方法，被移植的細(xì)胞具有如下問題:從移植部位流出且難以控制移植部位，另外，由于移植的細(xì)胞壞死而不能進(jìn)行有效的移植等，期望更進(jìn)一步的改善。
[0004]作為解決上述問題的一種方法，開發(fā)出利用細(xì)胞片的移植法。預(yù)先，將成為移植片的細(xì)胞培養(yǎng)成片狀，將它們移植入功能降低的生物體組織，從而現(xiàn)有的細(xì)胞懸浮液注入法中常見的、細(xì)胞向移植部位周邊 的流出被抑制到最小限度，作為再生醫(yī)療的新技術(shù)而備受關(guān)注。
[0005]移植所利用的多數(shù)細(xì)胞片，使用包括人細(xì)胞在內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞中特別是附著依賴性的細(xì)胞而制作。為了制成細(xì)胞片，需要將動(dòng)物細(xì)胞在生物體外進(jìn)行培養(yǎng)，將它們暫時(shí)附著于基材表面上。接著，將培養(yǎng)的細(xì)胞不散開地剝離、保持其在基材表面上培養(yǎng)的形態(tài)而使之剝離,這是必不可少的。
[0006]作為細(xì)胞片的制作方法，專利文獻(xiàn)I中公開有一種新型的細(xì)胞培養(yǎng)法，在被對水的上限或下限臨界溶解溫度為O~80°C的高分子覆蓋基材表面的細(xì)胞培養(yǎng)支撐體上，在上限臨界溶解溫度(Upper critical solution temperature)以下或下限臨界溶解溫度(Lower critical solution temperature)以上培養(yǎng)細(xì)胞,其后設(shè)為上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，由此不進(jìn)行酶處理而使培養(yǎng)細(xì)胞剝離。另外，專利文獻(xiàn)4中公開有，利用該溫度響應(yīng)性細(xì)胞培養(yǎng)基材在上限臨界溶解溫度以下或下限臨界溶解溫度以上培養(yǎng)皮膚細(xì)胞，其后設(shè)為上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，由此使培養(yǎng)皮膚細(xì)胞以低損傷剝離。通過利用溫度響應(yīng)性細(xì)胞培養(yǎng)基材，能夠謀求對于現(xiàn)有的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行各種各樣的新型的拓展。[0007]進(jìn)一步，專利文獻(xiàn)5中發(fā)現(xiàn)，在用溫度響應(yīng)性聚合物覆蓋基材表面而成的細(xì)胞培養(yǎng)支撐體上培養(yǎng)心肌組織的細(xì)胞，得到心肌樣細(xì)胞片，其后，將培養(yǎng)液溫度設(shè)為上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，使培養(yǎng)的細(xì)胞片層疊體緊貼于聚合物膜，使之在該狀態(tài)下與聚合物膜一起剝離，以及將其用規(guī)定的方法使之三維結(jié)構(gòu)化，由此構(gòu)建出結(jié)構(gòu)缺陷少、在體外具備作為心肌樣組織的幾種功能的細(xì)胞片、以及三維結(jié)構(gòu)。然而，此處的方法中，細(xì)胞片的層疊并非無限地進(jìn)行，心肌樣細(xì)胞片中以3層左右、厚度為100 μ m左右為界限，如果為其以上的厚度，則存在只有培養(yǎng)基、間質(zhì)液擴(kuò)散細(xì)胞才能存活的問題點(diǎn)。為了制作具有其以上的厚度的細(xì)胞片，制作伴隨能夠向三維化的組織中運(yùn)送氧、營養(yǎng)的血管網(wǎng)的細(xì)胞片的技術(shù)的開發(fā)不可缺少，成為再生醫(yī)療領(lǐng)域的研究者等共同的課題。
[0008]將大鼠心肌細(xì)胞片移植到大鼠心肌梗塞模型時(shí)，由于改善了由缺血而降低的心功能，因此確認(rèn)了細(xì)胞片對于心肌的有效性(非專利文獻(xiàn)I)。另外，通過作為能夠臨床應(yīng)用的細(xì)胞的成肌細(xì)胞片、脂肪組織或來源于經(jīng)血的間充質(zhì)干細(xì)胞片，也確認(rèn)有心功能改善；顯示出來源于各種各樣的細(xì)胞種的細(xì)胞片的有效性(非專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4)。
[0009]將包含成肌細(xì)胞的細(xì)胞片移植至患病部位時(shí)，由細(xì)胞片穩(wěn)定并持續(xù)地分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(VEGF)、肝細(xì)胞增殖因子(HGF)等各種細(xì)胞因子，它們促進(jìn)血管新生，另外，由于基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(Stromal Cell-derived Factorl, SDF-1)等的分泌,干細(xì)胞被動(dòng)員至細(xì)胞片移植部位周邊，由此啟示了心功能改善的可能性(旁分泌效果)。進(jìn)一步，可以認(rèn)為由細(xì)胞片分泌的細(xì)胞 因子，也作用于細(xì)胞片層疊體自身，對細(xì)胞片層疊體內(nèi)部的血管網(wǎng)構(gòu)建也帶來影響(自分泌效果)。
[0010]以此為背景，非專利文獻(xiàn)5中公開有，作為得到具有100 μ m以上的厚度的細(xì)胞片層疊體的方法，在生物體內(nèi)將細(xì)胞片層疊，在細(xì)胞片內(nèi)新生出血管網(wǎng)時(shí)，進(jìn)一步將細(xì)胞片層疊，通過重復(fù)該操作，得到Imm厚的心肌片層疊體。其中，啟示出為了得到具有厚度的細(xì)胞片層疊體，需要對被層疊的細(xì)胞片內(nèi)的各細(xì)胞供給營養(yǎng)、氧。為了用非專利文獻(xiàn)5中公開的方法制作賦予了血管網(wǎng)的細(xì)胞片層疊體，有必需在生物體內(nèi)重復(fù)層疊細(xì)胞片而從生物體側(cè)衍生血管網(wǎng)的必要。每逢層疊細(xì)胞片都必須將移植部位開口，是一種向移植側(cè)施加大的負(fù)擔(dān)的方法。
[0011]為了在生物體外制作具有超過100 μ m的厚度的細(xì)胞片層疊體，在生物體外賦予血管網(wǎng)的技術(shù)的開發(fā)是不可或缺的。公開有將大鼠心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，能夠得到在細(xì)胞片內(nèi)形成有血管內(nèi)皮細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞片層疊體。將得到的細(xì)胞片層疊體移植于生物體內(nèi)時(shí)，在移植部周邊衍生出來源于細(xì)胞片的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的毛細(xì)血管，更厚的心肌組織的再生變得可能(非專利文獻(xiàn)6)。另外，通過構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，不僅能夠制作具有厚度的細(xì)胞片層疊體，通過形成的血管網(wǎng)，各種細(xì)胞因子有效地分泌于移植部周邊組織，由此也能夠期待移植后的治療效果的大幅提高。
[0012]如上所述，本領(lǐng)域中，為了在生物體外制作模仿了生物體組織的組織，賦予血管網(wǎng)的技術(shù)是必不可缺的，要求進(jìn)一步的改良。但是，到目前為止，嘗試構(gòu)建包含細(xì)胞片層疊體的三維生物體組織時(shí)，定量并且簡便地評價(jià)三維生物體組織內(nèi)所構(gòu)建的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的方法不存在。因此，對于最佳的構(gòu)建有血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片層疊體的設(shè)計(jì)方法尚無報(bào)道。因此，發(fā)明人等開發(fā)了將在細(xì)胞片層疊體內(nèi)作為三維結(jié)構(gòu)所構(gòu)建的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)用二維的解析手法進(jìn)行評價(jià)的技術(shù)(專利文獻(xiàn)6)。通過利用該技術(shù)，變得可能將細(xì)胞片層疊體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行簡單地評價(jià)。如果能夠發(fā)明設(shè)計(jì)預(yù)先構(gòu)建高密度的血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片層疊體的方法，則可以認(rèn)為不僅在生物體外也能夠穩(wěn)定地制作具有厚度的細(xì)胞片層疊體，促進(jìn)血管新生且能夠期待良好的治療效果的細(xì)胞片層疊體也變得能夠得到。
[0013]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0014]專利文獻(xiàn)
[0015]專利文獻(xiàn)1:日本特開平2-211865號公報(bào)
[0016]專利文獻(xiàn)2:日本特表2002-518006
[0017]專利文獻(xiàn)3:日本特表2003-505475
[0018]專利文獻(xiàn)4:日本特開平05-192138號公報(bào)
[0019]專利文獻(xiàn)5:日本再表2002-008387號公報(bào)
[0020]專利文獻(xiàn)6:國際公開2010/101225公報(bào)
[0021]非專利文獻(xiàn)
[0022]非專利文獻(xiàn)1:Transplantation、80、1586_1595、2005
[0023]非專利文獻(xiàn)2 J.Thorac.Cardiovasc.Surg.、130、1333-1341 (2005)
[0024]非專利文獻(xiàn)3:Nat.Med.、12、459_465 (2006)
[0025]非專利文獻(xiàn)4:Stem Cells、26、1695_1704 (2008)
[0026]非專利文獻(xiàn)5:FASEB J.、20 (6),708-710 (2006)
[0027]非專利文獻(xiàn)6: J.Biochim.Biophysic.Res.Commun.、341、573_582 (2006)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0028]發(fā)明要解決的問題
[0029]本發(fā)明意圖在于確立:具有產(chǎn)生促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子的能力和/或高密度地構(gòu)建血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片層疊體的制作方法。即，本發(fā)明能夠提供:與現(xiàn)有的方法相比較產(chǎn)生促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子的能力優(yōu)異，和/或與以往相比較血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)被高密度構(gòu)建的細(xì)胞片層疊體。
[0030]用于解決問題的方案
[0031]本發(fā)明人等為了解決上述問題，從各種角度在討論的基礎(chǔ)上進(jìn)行了研究開發(fā)。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用溫度響應(yīng)性培養(yǎng)基材而得到的細(xì)胞片層疊體做出了與生物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)相近的特殊的環(huán)境。進(jìn)一步，發(fā)現(xiàn)通過改變構(gòu)成該細(xì)胞片層疊體的細(xì)胞的種類、混合比例、接種的細(xì)胞數(shù)而改變細(xì)胞片層疊體內(nèi)的細(xì)胞的狀態(tài)，能夠最優(yōu)化促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，另外能夠最優(yōu)化血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。本發(fā)明基于所述見解而完成。
[0032]即，本發(fā)明提供細(xì)胞片或其的層疊體、以及其利用方法，該細(xì)胞片的特征在于，為具有產(chǎn)生與促進(jìn)血管新生有關(guān)的細(xì)胞因子的能力的細(xì)胞片，構(gòu)成所述細(xì)胞片的細(xì)胞中至少含有成纖維細(xì)胞，并且包含骨骼肌成肌細(xì)胞(skeletal myoblast) 10%以上；和/或構(gòu)建有血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。
[0033]發(fā)明的效果
[0034]使用本發(fā)明所述的、制作細(xì)胞片層疊體的方法時(shí)，與現(xiàn)有提供的細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體相比較，與血管新生有關(guān)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生能力高，和/或在生物體外的環(huán)境下制作高密度地構(gòu)建有血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體變得可能；所述細(xì)胞片層疊體的特征在于，具有產(chǎn)生與促進(jìn)血管新生有關(guān)的細(xì)胞因子的能力；或具有產(chǎn)生與血管新生有關(guān)的細(xì)胞因子的能力且構(gòu)建有血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。另外，通過利用本發(fā)明而制作的細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體能夠成為心功能恢復(fù)能力高的移植材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1表示實(shí)施例1或者3中進(jìn)行的、血管網(wǎng)絡(luò)形成的定量評價(jià)的方法。綠(黑白畫面中，淡灰色的網(wǎng)狀部分)所表示的是血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0036]圖2為表示實(shí)施例1中進(jìn)行的、成肌細(xì)胞的密度對細(xì)胞片層疊體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成造成的影響的圖。綠(黑白畫面中，淡灰色的部分)所表示的是血管內(nèi)皮細(xì)胞。表示1.15 X IO5個(gè)/ cm2的接種密度的情況。
[0037]圖3為表示實(shí)施例1中進(jìn)行的、成肌細(xì)胞的密度對細(xì)胞片層疊體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成造成的影響的圖。綠(黑白畫面中，淡灰色的網(wǎng)狀部分)所表示的是血管內(nèi)皮細(xì)胞。表示2.3X105個(gè)/ cm2的接種密度的情況。
[0038]圖4為表示實(shí)施例1中進(jìn)行的、成肌細(xì)胞的密度對細(xì)胞片層疊體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成造成的影響的圖。綠(黑白畫面中，淡灰色的網(wǎng)狀部分)所表示的是血管內(nèi)皮細(xì)胞。表示4.6X105個(gè)/ cm2的接種密度的情況。
[0039]圖5為表示實(shí)施例1中進(jìn)行的、成肌細(xì)胞的密度對細(xì)胞片層疊體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成造成的影響的圖。表示Z軸方向的各細(xì)胞片層中存在的血管內(nèi)皮細(xì)胞的比例。各圖的I~5下面的數(shù)字為將最下層的細(xì)胞片作為第I層時(shí)的層數(shù)。d表示細(xì)胞片層疊體的厚度。
[0040]圖6為表示實(shí)施例2中 進(jìn)行的、成肌細(xì)胞的密度對促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力造成的影響的圖。表示培養(yǎng)開始第48小時(shí)的I細(xì)胞?每I日的細(xì)胞因子產(chǎn)量(pg)。
[0041]圖7為表示實(shí)施例2中進(jìn)行的、成肌細(xì)胞片的層疊枚數(shù)對促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力造成的影響的圖。表示培養(yǎng)開始第48小時(shí)的I細(xì)胞?每I天的細(xì)胞因子產(chǎn)量(pg)。
[0042]圖8為表示實(shí)施例2中進(jìn)行的、使成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞混合存在進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)的、促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子(VEGF、HGF)的各時(shí)間(24小時(shí)一 48小時(shí)、144小時(shí)一 168小時(shí))中的I細(xì)胞?每I天的產(chǎn)量的圖(a，b)。表示成肌細(xì)胞的myo下所示的數(shù)字表示細(xì)胞接種時(shí)混合存在的成肌細(xì)胞的比例。c和d為將a和b中得到的結(jié)果以成肌細(xì)胞的真正比例進(jìn)行校正的結(jié)果。
[0043]圖9為表示實(shí)施例2中進(jìn)行的、由混合存在有成肌細(xì)胞(myo)和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞片和細(xì)胞片層疊體產(chǎn)生的細(xì)胞因子(VEGF、HGF)的I細(xì)胞?每I天的產(chǎn)量的圖(a、b)。表示成肌細(xì)胞的myo下所示的數(shù)字表示細(xì)胞接種時(shí)混合存在的成肌細(xì)胞的比例。a和b中的紅色圓圈(黑白畫面中，棒狀圖中記載的〇標(biāo)記)表示5層的細(xì)胞片層疊體中的I細(xì)胞.每I天的細(xì)胞因子產(chǎn)量。c和d為將a和b中得到的結(jié)果以成肌細(xì)胞的真實(shí)比例進(jìn)行校正的結(jié)果。
[0044]圖10為表示實(shí)施例3中進(jìn)行的成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合比例對細(xì)胞片層疊體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成造成的影響的概略圖。[0045]圖11為表示實(shí)施例3中進(jìn)行的成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合比例對細(xì)胞片內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成造成的影響的照片。a為表示只有成肌細(xì)胞的細(xì)胞片內(nèi)所構(gòu)建的血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)(綠(黑白畫面中，淡灰色的網(wǎng)狀部分))的照片，b為表示包含成肌細(xì)胞50%、成纖維細(xì)胞50%的細(xì)胞片內(nèi)所構(gòu)建的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(綠(黑白畫面中，淡灰色的網(wǎng)狀部分))的照片。
[0046]圖12為表示實(shí)施例3中進(jìn)行的成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合比例在5層的細(xì)胞片層疊體內(nèi)對血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成造成的影響的照片。a為表示包含成肌細(xì)胞81%、成纖維細(xì)胞19%的細(xì)胞片內(nèi)所構(gòu)建的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(綠(黑白畫面中，淡灰色的網(wǎng)狀部分))的照片山為表示包含成肌細(xì)胞61%、成纖維細(xì)胞39%的細(xì)胞片內(nèi)所構(gòu)建的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(綠(黑白畫面中淡灰色的網(wǎng)狀部分))的照片；c為表示包含成肌細(xì)胞41%、成纖維細(xì)胞59%的細(xì)胞片內(nèi)所構(gòu)建的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(綠(黑白畫面中，淡灰色的網(wǎng)狀部分))的照片；d為表示包含成纖維細(xì)胞100%的細(xì)胞片內(nèi)所構(gòu)建的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(綠(黑白畫面中淡灰色的網(wǎng)狀部分))的照片。
[0047]圖13為表示實(shí)施例3中進(jìn)行的成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合比例在5層的細(xì)胞片層疊體內(nèi)對血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成造成的影響的照片。最上段的圖表示XY軸方向的血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)(綠(黑白畫面中淡灰色的網(wǎng)狀部分))的狀態(tài)。第2段的圖表示存在于Z軸方向的血管內(nèi)皮細(xì)胞(綠(黑白畫面中淡灰色的網(wǎng)狀部分))的狀態(tài)。第3段目的圖表表示存在于細(xì)胞片各層的血管內(nèi)皮細(xì)胞的比例。圖表示全部細(xì)胞片層疊結(jié)束后的培養(yǎng)開始96小時(shí)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)。為如下細(xì)胞片層疊體:越是左側(cè)的列，細(xì)胞片制作時(shí)所接種的成肌細(xì)胞的比例越多；越是靠近右側(cè)的列，成纖維細(xì)胞的比例越多(從左開始，成肌細(xì)胞的比例:100%、80%、60%、40%、20%、0%)。各圖的I~5下面的數(shù)字為將最下層的細(xì)胞片作為第I層時(shí)的層數(shù)。h表示細(xì)胞片層疊體的厚度。
[0048]圖14為表示實(shí)施例3中進(jìn)行的成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞混合存在的細(xì)胞片層疊體內(nèi)所達(dá)成的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的 構(gòu)建度的圖。L表示每Imm2的網(wǎng)絡(luò)的長度的總計(jì)；NT表示每Imm2的網(wǎng)絡(luò)的端點(diǎn)數(shù)；L / Nt為L除以Nt的值。帶有影子的區(qū)域表示包含成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞片層疊體中的最佳的構(gòu)建血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的混合比例的范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0049]本發(fā)明涉及分泌與促進(jìn)血管新生有關(guān)的細(xì)胞因子和/或構(gòu)建有高密度的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片或其的層疊體、以及其利用方法。本發(fā)明提供的細(xì)胞片層疊體與通過現(xiàn)有的方法制作的細(xì)胞片相比較，高濃度地產(chǎn)生選自血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、上皮生長因子(EGF)的至少一種促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子。另外，本發(fā)明能夠提供一種細(xì)胞片層疊體，其高濃度地分泌與促進(jìn)血管新生有關(guān)的細(xì)胞因子和/或具有最優(yōu)化的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。
[0050]作為評價(jià)通過本發(fā)明制作的細(xì)胞片層疊體內(nèi)所構(gòu)建的、高密度的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的手法，優(yōu)選使用細(xì)胞片層疊體、目標(biāo)細(xì)胞的二維解析細(xì)胞評價(jià)系統(tǒng)，用二維的解析手法以三維信息的形式得到目標(biāo)細(xì)胞的選自生死、增殖、游走以及分化的至少一種相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)(參照專利文獻(xiàn):國際公開2010 / 101225號公報(bào))。作為該二維解析裝置，只要是將細(xì)胞做成為二維的信息、平面的信息而得到的手法，就沒有特別的限定；例如，作為該裝置，可列舉出:突光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、實(shí)體顯微鏡、激光顯微鏡、共焦顯微鏡等顯微鏡類；酶標(biāo)儀裝置類、其他具有微鏡的裝置類等。觀察既可以在圖像上進(jìn)行，也可以在顯微鏡視野下通過目視而觀察。另外，對于其解析手法也是，只要是利用上述的裝置的通常的方法，就沒有特別的限定，可列舉出如下方法，例如:將細(xì)胞通過試劑、蛋白質(zhì)、基因等至少一種以上的方法進(jìn)行熒光染色和/或色素染色，用上述的顯微鏡類等觀察其染色程度。標(biāo)記細(xì)胞是指該進(jìn)行了熒光染色和/或色素染色的細(xì)胞。使用上述的評價(jià)方法，將通過本發(fā)明制作的細(xì)胞片層疊體進(jìn)行評價(jià)，由此期望能夠確認(rèn)能夠確實(shí)地制造出特征在于大量地產(chǎn)生促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子和/或構(gòu)建最佳的血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體。
[0051]為了制作本發(fā)明的細(xì)胞片層疊體，溫度響應(yīng)性基材變得必要。該基材是指對具有特定的表面的細(xì)胞培養(yǎng)基材在電子束照射下使溫度響應(yīng)性聚合物接枝化而成的基材。對于基材的材質(zhì)，沒有特別的限制，作為細(xì)胞附著表面，有將聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯的任意者或兩者以上組合而成的物質(zhì)。其中，特別是，聚苯乙烯為通常使用的細(xì)胞培養(yǎng)用基材，所以優(yōu)選?；牡母采w中所使用的溫度響應(yīng)性聚合物在水溶液中具有上限臨界溶解溫度或者下限臨界溶解溫度為0°c~80°C、更優(yōu)選為20°C~50°C。上限臨界溶解溫度或者下限臨界溶解溫度超過80°C時(shí)，存在細(xì)胞滅死的可能性而不優(yōu)選。另外，上限臨界溶解溫度或者下限臨界溶解溫度低于0°C時(shí)，通常細(xì)胞增殖速度極度地降低，或者細(xì)胞滅死，因而也不優(yōu)選。
[0052]本發(fā)明中使用的溫度響應(yīng)性聚合物可以為均聚物、共聚物的任意者。作為這樣的聚合物，可列舉出例如:日本特開平2-211865號公報(bào)所公開的聚合物。具體而言，例如，通過以下的單體的均聚或者共聚而得到。作為能夠使用的單體，可列舉出例如:(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或N，N- 二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物、或者乙烯基醚衍生物；為共聚物的情況下，可以使用其中的任意的兩種以上。更進(jìn)一步，也可以使用與上述單體以外的單體類的共聚物、聚合物之間的接枝或共聚、或者聚合物、共聚物的混合物。另外，也可以在不有損聚合物本來的性質(zhì)的 范圍內(nèi)進(jìn)行交聯(lián)。此時(shí)，因?yàn)楸慌囵B(yǎng)、剝離的物質(zhì)為細(xì)胞，所以分離在5°C~50°C的范圍內(nèi)進(jìn)行，所以作為溫度響應(yīng)性聚合物，可列舉出--聚-N-正丙基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度21°C)、聚-N-正丙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度27V)、聚-N-異丙基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度32°C )、聚-N-異丙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度43°C)、聚-N-環(huán)丙基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度45°C )、聚-N-環(huán)氧乙基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度約35°C )、聚-N-環(huán)氧乙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度約45°C)、聚-N-四氫糠基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度約28°C)、聚-N-四氫糠基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度約35V)、聚-N，N-乙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度56°C)、聚-N，N- 二乙基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度32°C)等。作為本發(fā)明中所使用的用于共聚的單體，可列舉出:聚丙烯酰胺、聚-N，N-二乙基丙烯酰胺、聚-N，N-二甲基丙烯酰胺、聚環(huán)氧乙烷、聚丙烯酸及其鹽、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯酸羥乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、羧甲基纖維素等含水聚合物等；沒有特別的限制。
[0053]對于本發(fā)明中所使用的、上述的各聚合物向基材表面覆蓋的方法，沒有特別的限制，可以通過例如:將基材與上述單體或聚合物通過電子束照射(EB)、Y射線照射、紫外線照射、等離子體處理、電暈處理、有機(jī)聚合反應(yīng)的任意者，或者通過涂布、混煉等物理吸附等而進(jìn)行。溫度響應(yīng)性聚合物在培養(yǎng)基材表面的覆蓋量在1.1~2.3μ g / cm2的范圍即可，優(yōu)選為1.4~1.9 μ g / cm2,進(jìn)一步優(yōu)選為1.5~1.8 μ g / cm2。覆蓋量少于l.lyg/ cm2時(shí)，即便給與刺激該聚合物上的細(xì)胞也難以剝離，工作效率顯著變差而不優(yōu)選。相反地，為2.3yg / cm2以上時(shí)，在該區(qū)域細(xì)胞難以附著，使細(xì)胞充分地附著變困難。這樣的情況下，如果在溫度響應(yīng)性聚合物覆蓋層上進(jìn)一步覆蓋細(xì)胞粘接性蛋白質(zhì)，基材表面的溫度響應(yīng)性聚合物覆蓋量為2.3μ g / cm2以上即可；此時(shí)的溫度響應(yīng)性聚合物的覆蓋量為9.0y g /cm2以下即可，優(yōu)選為8.0yg / cm2以下即可，更優(yōu)選7.0 μ g / cm2以下。溫度響應(yīng)性聚合物的覆蓋量為9.0yg / cm2以上時(shí)，即便在溫度響應(yīng)性聚合物覆蓋層上進(jìn)一步覆蓋細(xì)胞粘接性蛋白質(zhì)，細(xì)胞也難以附著而不優(yōu)選。對于這樣的細(xì)胞粘接性蛋白質(zhì)的種類，沒有任何限定，可列舉出例如:膠原蛋白、層粘連蛋白、層粘連蛋白5、纖維連接蛋白、基底膜等單獨(dú)、或兩種以上的混合物。另外，這些細(xì)胞粘接性蛋白質(zhì)的覆蓋方法只要根據(jù)常規(guī)方法即可，通常將細(xì)胞粘接性蛋白質(zhì)的水溶液涂布于基材表面，其后去除其水溶液而進(jìn)行沖洗的方法。本發(fā)明為欲使用盡可能利用溫度響應(yīng)性培養(yǎng)皿的細(xì)胞片本身的技術(shù)。因此，溫度響應(yīng)性聚合物層上的細(xì)胞粘接性蛋白質(zhì)的覆蓋量變得極多而不優(yōu)選。溫度響應(yīng)性聚合物的覆蓋量、以及細(xì)胞粘接性蛋白質(zhì)的覆蓋量的測定按照常規(guī)方法即可，可列舉出例如:使用FT-1R-ATR直接測量細(xì)胞附著部的方法；將預(yù)先標(biāo)簽化的聚合物用同樣的方法固定化，根據(jù)被固定化于細(xì)胞附著部的標(biāo)簽化聚合物量進(jìn)行推測的方法等，可以使用任意的方法。
[0054]本發(fā)明中，為了將培養(yǎng)的細(xì)胞片由溫度響應(yīng)性基材進(jìn)行剝離回收，將附著有被培養(yǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)基材的溫度設(shè)為培養(yǎng)基材上的覆蓋聚合物的上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，可以由此使之剝離。此時(shí)，既可以在培養(yǎng)液中進(jìn)行，也可以在其他的等滲液中進(jìn)行，可以根據(jù)目的而進(jìn)行選擇。以將細(xì)胞更快、更高效地進(jìn)行剝離、回收為目的，可以單獨(dú)或組合使用輕輕叩擊或搖晃基材的方法以及使用移液管而攪拌培養(yǎng)基的方法等。
[0055]作為溫度響應(yīng)性聚合物以聚(N-異丙基丙烯酰胺)為例而對以上的事項(xiàng)進(jìn)行說明。已知聚(N-異丙基丙烯酰胺)為具有31°C的下限臨界溶解溫度的聚合物，只要是游離狀態(tài)，在水中31°C以上的溫度下引起脫水合，聚合物鏈凝聚產(chǎn)生白色渾濁。相反地，31°C以下的溫度下聚合物鏈水合而成為溶解于水中的狀態(tài)。本發(fā)明中，該聚合物覆蓋于培養(yǎng)皿等基材表面被固定。因此，只要是31°C以上的溫度，基材表面的聚合物也同樣地進(jìn)行脫水合，聚合物鏈覆蓋于基材表面而被固定，因此基材表面變得表現(xiàn)出疏水性。相反地，31°C以下的溫度時(shí)，基材表面的聚合物水合，由于聚合物鏈覆蓋于基材表面且被固定，因此基材表面變得表現(xiàn)出親水性。此時(shí)的疏水的表面為細(xì)胞能夠附著、增殖的適度的表面；而親水的表面成為細(xì)胞不能附著程度的表面，培養(yǎng)中的細(xì)胞、或細(xì)胞片僅通過冷卻就即能夠剝離。
[0056]作為實(shí)施覆蓋的基材，可以使用全部的以通常細(xì)胞培養(yǎng)中所應(yīng)用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物為代表的通常能夠賦予形態(tài)的物質(zhì)，例如，除了上述以外的聚合物化合物、陶瓷類等。
[0057]對于本發(fā)明的培養(yǎng)基材的形狀，沒有特別的限定，可列舉出例如:皿、多孔板、燒瓶、多孔膜上培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)池之類形態(tài)的物質(zhì)、或者平膜狀的物質(zhì)等。作為實(shí)施覆蓋的基材，可列舉出:以通常細(xì)胞培養(yǎng)中使用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物為代表的通常能夠賦予形態(tài)的物質(zhì)，例如:上述以外的高分子化合物、陶瓷類等。
[0058]進(jìn)一步，對于溫度響應(yīng)性聚合物向培養(yǎng)基材覆蓋的方法，沒有特別的限制，例如:根據(jù)日本特開平2-211865號公報(bào)所記載的方法即可。即，所述的覆蓋可以將基材和上述單體或聚合物通過電子束照射(EB)、Y射線照射、紫外線照射、等離子體處理、電暈處理、有機(jī)聚合反應(yīng)的任意者，或者通過涂布、混煉等物理的吸附等而進(jìn)行。
[0059]本發(fā)明中提供的細(xì)胞片層疊體為以細(xì)胞片單獨(dú)或與包含其他細(xì)胞的片組合的狀態(tài)被層疊的物質(zhì)即可。此時(shí)，利用兩種以上的不同的細(xì)胞時(shí)，得到在不同的細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞的流動(dòng)性變化的細(xì)胞片，或得到促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子產(chǎn)生高的細(xì)胞片，因而優(yōu)選。對于本發(fā)明中利用的細(xì)胞，沒有特別的限制，細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體內(nèi)的流動(dòng)性影響血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的成熟度，因此優(yōu)選由流動(dòng)性高的細(xì)胞與流動(dòng)性低的細(xì)胞組合而成的細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體。作為流動(dòng)性高的細(xì)胞，可列舉出:骨骼肌成肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、進(jìn)一步心肌細(xì)胞、表皮基底膜細(xì)胞等，沒有特別的限制。另外，作為流動(dòng)性低的細(xì)胞，可列舉出成纖維細(xì)胞、分化的表皮角化細(xì)胞，沒有特別的限定。通過將流動(dòng)性高的細(xì)胞和流動(dòng)性低的細(xì)胞混合，制作各種各樣的具有流動(dòng)性的細(xì)胞片層疊體變得可能。作為流動(dòng)性高的細(xì)胞和流動(dòng)性低的細(xì)胞的組合，例如:可以是包含肌組織的細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的組合，具體而言，也可以是由骨骼肌成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的組合，或者也可以是由心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的組合。制作由肌組織的細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的組合形成的細(xì)胞片時(shí)，制作作為使各種細(xì)胞混合存在的比例，以90%~25%的比例包含肌組織的細(xì)胞、以剩余的比例包含成纖維細(xì)胞的細(xì)胞片即可；優(yōu)選制作以75%~25%的比例包含肌組織的細(xì)胞、以剩余的比例包含成纖維細(xì)胞的細(xì)胞片；最優(yōu)選制作以60%~40%的比例包含肌組織的細(xì)胞、以剩余的比例包含成纖維細(xì)胞的細(xì)胞片。通過本發(fā)明，以最佳的細(xì)胞的混合比例制作的細(xì)胞片高濃度地產(chǎn)生選自血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、上皮生長因子(EGF)的至少一種促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子，另外，成為作為構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的場所具有最佳的流動(dòng)性的細(xì)胞片，因而優(yōu)選。
[0060]VEGF被稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子，為通常作為配體結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面存在的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子受體(VEGFR)的糖蛋白。作為刺激增殖、游走、分化，促進(jìn)纖溶酶原激活劑、膠原酶等蛋白酶活性以及膠原蛋白凝膠中的血管樣結(jié)構(gòu)形成的、所謂的血管新生的全部的步驟，在體內(nèi)(in vivo)促進(jìn)血管新生的因子而已知。VEGF具有使微小血管的血管通透性亢進(jìn)的作用，也涉及其他單核細(xì)胞.巨噬細(xì)胞的活性化。本發(fā)明的例的情況下，主要由骨骼肌成肌細(xì)胞分泌，在包含骨骼肌成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞片中，根據(jù)骨骼肌成肌細(xì)胞的比例，制作單位細(xì)胞的VEGF的產(chǎn)量多的細(xì)胞片?？梢哉J(rèn)為，由細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體產(chǎn)生的VEGF促進(jìn)細(xì)胞片層疊體的內(nèi)部的血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，另外，向患部移植時(shí)，向移植部周邊分泌VEGF，促進(jìn)移植部周邊的血管新生。
[0061]HGF被稱為肝細(xì)胞增殖因子，是具有如下特征的因子:通常由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生，主要作為控制上皮系細(xì)胞的增殖或功能的旁分泌因子起作用。HGF不僅在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在血管內(nèi)皮細(xì)胞也具有游走能力的促進(jìn)、管腔形成等形態(tài)形成誘導(dǎo)作用、抗細(xì)胞凋亡作用、血管新生作用以及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)作用等。本發(fā)明的例的情況下，HGF通過骨骼肌成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相互作用而被促進(jìn)分泌。在由骨骼肌成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞形成的細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體中，所包含的骨骼肌成肌細(xì)胞的比例為90%~25%、優(yōu)選為75%~25%、最優(yōu)選為60%~40%，這時(shí)制作出單位細(xì)胞的HGF產(chǎn)生量大的細(xì)胞片，故優(yōu)選。可以認(rèn)為，通過由細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體產(chǎn)生的HGF，促進(jìn)細(xì)胞片層疊體自身的內(nèi)部的血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、管腔形成，另外，向患部移植時(shí)，向移植部周邊分泌HGF，促進(jìn)移植部周邊的血管新生。
[0062]VEGF和HGF均為主要的促進(jìn)血管新生因子，在膠原蛋白凝膠、基底膜內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的二維評價(jià)中，觀測到:使兩因子作用時(shí)，對血管結(jié)構(gòu)的占有面積、全長造成影響，具有協(xié)同效應(yīng)(非專利文獻(xiàn):Xin et al., “Hepatocyte growth factor enhancesvascular endothelial growth factor-1nduced angiogenesis in vitro and invivo, ”Am.J.Pathol.，158，1111-1120(2001)、Sulpice et al.，“Cross-talk betweenthe VEGF-A and HGF signaling pathways in endothelial cells, ^Biol.Cell,101,525-539(2009))。因此，也可以為產(chǎn)生VEGF和HGF兩者的細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體。通過產(chǎn)生VEGF和HGF兩種因子，協(xié)同效應(yīng)被促進(jìn)，細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成被促進(jìn)，管腔形成等的形態(tài)形成誘導(dǎo)作用、血管新生作用被促進(jìn)，故優(yōu)選。在包含骨骼肌成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體中，所含的骨骼肌成肌細(xì)胞的比例為75%~25%、優(yōu)選為60%~40%，這時(shí)制作出單位細(xì)胞的VEGF和HGF產(chǎn)生量大的細(xì)胞片，故優(yōu)選?？梢哉J(rèn)為，通過由細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體產(chǎn)生的VEGF和HGF，在細(xì)胞片層疊體內(nèi)部，高密度的血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)、管腔形成被促進(jìn)，另外，向患部移植時(shí)，向移植部周邊分泌VEGF和HGF，促進(jìn)移植部周邊的血管新生。
[0063]本發(fā)明的方法中，制作細(xì)胞片時(shí)，接種的細(xì)胞數(shù)根據(jù)使用細(xì)胞的動(dòng)物種類、細(xì)胞種類而不同，為了制作本發(fā)明的例子的包含骨骼肌成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的一種或兩種細(xì)胞的細(xì)胞片，每片細(xì)胞片為1.0X IO5~7.0父105個(gè)/ Cm2即可，優(yōu)選為1.15X105~
4.6X IO5個(gè)/ cm2即可，進(jìn)一步優(yōu)選為1.5X IO5~4.3X IO5個(gè)/ cm2即可，最優(yōu)選為
2.0X IO5~3.9X IO6個(gè)/ cm2即可。制作伴隨著血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片或細(xì)胞片層疊體時(shí)，接種濃度為1.0父105個(gè)/ cm2以下時(shí)細(xì)胞密度低、血管內(nèi)皮細(xì)胞的游走過早、構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)變難，從實(shí)施 本發(fā)明的觀點(diǎn)出發(fā)不優(yōu)選。為6.0X105個(gè)/ cm2以上時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的游走變緩慢，不能構(gòu)建充分的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，從實(shí)施本發(fā)明的觀點(diǎn)出發(fā)不優(yōu)選。
[0064]該細(xì)胞片層疊體的流動(dòng)性不受本發(fā)明的目的的限定，可以認(rèn)為:例如成為以移植為目的的細(xì)胞片的指標(biāo)。例如，如實(shí)施例所述，結(jié)果為細(xì)胞片層疊體具有流動(dòng)性的程度越高，相應(yīng)地血管變得越容易從生物體側(cè)侵入，相應(yīng)地移植的細(xì)胞片層疊體越適合于生物體。另外，也期待在其他的細(xì)胞中，層疊體的流動(dòng)性高時(shí)，血管網(wǎng)容易侵入。
[0065]制作細(xì)胞片層疊體時(shí)，對于層疊單層的細(xì)胞片的位置、順序、層疊次數(shù)，沒有特別的限制，根據(jù)被覆蓋或補(bǔ)充的組織，可以適宜變更為使用來源于粘接性強(qiáng)的滑膜的細(xì)胞片等。另外，層疊次數(shù)為10次以下即可，優(yōu)選為8次以下，進(jìn)一步優(yōu)選為4次以下即可。層疊次數(shù)變多時(shí)，氧、營養(yǎng)成分難以到達(dá)層疊的中心部的細(xì)胞片而不優(yōu)選。此時(shí)，可以通過細(xì)胞片層疊體內(nèi)構(gòu)建血管網(wǎng)的方法來防止。對于構(gòu)建血管網(wǎng)的方法，沒有特別的限定。例如:可以通過將只由血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的細(xì)胞片或以一定比例包含血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞片夾雜于通過本發(fā)明的方法制作的細(xì)胞片之間，或者層疊于最上層、或者敷于最下層的方法而制作；也可以通過預(yù)先在培養(yǎng)基材上接種血管內(nèi)皮細(xì)胞，在接種的血管內(nèi)皮細(xì)胞上層疊細(xì)胞片的方法而制作。通過在預(yù)先接種于培養(yǎng)基材上的血管內(nèi)皮細(xì)胞上層疊細(xì)胞片的方法制作細(xì)胞片層疊體時(shí)，接種的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)的個(gè)數(shù)根據(jù)層疊的細(xì)胞的種類、血管內(nèi)皮細(xì)胞的種類而變化，例如為0.1~5.0 X IO4個(gè)/ Cm2即可，優(yōu)選為0.3~3.0 X IO4個(gè)/ cm2即可，最優(yōu)選為0.5~2.0X IO4個(gè)/ cm2即可。0.1X IO4個(gè)/ cm2以下時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)不能充分地形成，另外，為5.0XlO4A/ cm2以上時(shí)，血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)過密地形成而不優(yōu)選。
[0066]對于制作本發(fā)明的細(xì)胞片層疊體的方法，也沒有特別的限定，例如，通過使培養(yǎng)細(xì)胞以片狀剝離，根據(jù)需要使用培養(yǎng)細(xì)胞遷移夾具而使培養(yǎng)細(xì)胞片之間層疊而得到。此時(shí)，對于培養(yǎng)基的溫度，只要覆蓋于培養(yǎng)基材表面的前述聚合物具有上限臨界溶解溫度時(shí)為其溫度以下、或者前述聚合物具有下限臨界溶解溫度時(shí)為其溫度以上，沒有特別的限制。但是不用說，在培養(yǎng)細(xì)胞不增殖的低溫區(qū)域、或者培養(yǎng)細(xì)胞滅死的高溫區(qū)域中的培養(yǎng)是不切實(shí)際的。對于除了溫度以外的培養(yǎng)條件，按照常規(guī)方法進(jìn)行即可，沒有特別的限制。例如:對于使用的培養(yǎng)基，可以是血管內(nèi)皮細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基；可以是骨骼肌成肌細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基；也可以是成纖維細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基；可以是廣泛的粘附細(xì)胞的培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；也可以是此后添加與血管新生有關(guān)的I或多個(gè)細(xì)胞因子的培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞的種類而制作的培養(yǎng)基，成為適應(yīng)各自的細(xì)胞培養(yǎng)特性的組成(例如，添加細(xì)胞因子等)。特別是，血管內(nèi)皮細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有與血管新生有關(guān)的細(xì)胞因子，與廣泛的粘附細(xì)胞的培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比較是高價(jià)的。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞片層疊體自身產(chǎn)生促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子，因此即便使用沒添加促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，細(xì)胞片層疊體內(nèi)也構(gòu)建有血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。即便使用廉價(jià)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，也能夠制作伴隨著血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成的細(xì)胞片層疊體，最終移植中涉及的成本降低。另外，細(xì)胞片層疊體自身分泌促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子，所以在移植部位周邊也促進(jìn)血管新生，能夠期待成為治療效果高的移植材料。這些培養(yǎng)基，既可以是添加有公知的胎牛血清(FCS)等血清的培養(yǎng)基，也可以是沒有添加這樣的血清的無血清培養(yǎng)基。另外，所使用的培養(yǎng)細(xì)胞遷移夾具只要能夠捕捉剝離的細(xì)胞片，就沒有特別的限定；可列舉出例如:多孔膜或紙、橡膠等膜類或板類、海綿體類等；為了容易地進(jìn)行層疊操作，也可以利用帶有柄的夾具上安裝有多孔膜或紙、橡膠等膜類或板類、海綿體類等的夾具。
[0067]本發(fā)明的細(xì)胞片層疊體是這樣的:從覆蓋有溫度響應(yīng)性聚合物的細(xì)胞培養(yǎng)基材上剝離、根據(jù)需要使用培養(yǎng)細(xì)胞遷移夾具而得到的培養(yǎng)細(xì)胞片，培養(yǎng)時(shí)不會(huì)受到中性蛋白酶、胰蛋白酶等所代表的蛋白質(zhì)分解酶帶來的損傷，培養(yǎng)時(shí)所形成的細(xì)胞-基材間的基底膜樣蛋白質(zhì)也不會(huì)受到酶帶來的破壞；另外，保持細(xì)胞-細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的缺陷少并且強(qiáng)度高。
[0068]本發(fā)明中，對于構(gòu)建有血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片層疊體的利用方法，沒有特別的限定，可以通過例如:將構(gòu)成細(xì)胞片層疊體的細(xì)胞設(shè)為成肌細(xì)胞，將標(biāo)記細(xì)胞設(shè)為進(jìn)行了熒光標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過熒光顯微鏡追蹤標(biāo)記細(xì)胞的游走性，由此評價(jià)血管網(wǎng)構(gòu)建。
[0069]本發(fā)明的細(xì)胞沒有特別的限定，可列舉出例如:動(dòng)物、昆蟲、植物等的細(xì)胞、細(xì)菌類。其中，動(dòng)物細(xì)胞大多有市售而優(yōu)選。作為動(dòng)物細(xì)胞的來源，可列舉出:人、猴、狗、貓、兔、大鼠、裸鼠、小鼠、豚鼠、豬、羊、中國倉鼠、牛、狨猴、非洲綠猴等，沒有特別的限定。另外，上述的各種細(xì)胞可以為由胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)分化而得到的細(xì)胞，沒有任何限定。
[0070]對于本發(fā)明所利用的細(xì)胞沒有特別的限定，例如:可以為將細(xì)胞通過試劑、蛋白、質(zhì)、基因等至少一種以上的方法而熒光染色和/或色素染色而成的細(xì)胞。[0071]對于人，只要利用本發(fā)明所示的細(xì)胞片層疊體，所移植的細(xì)胞片層疊體在人的生物體內(nèi)能長時(shí)間表現(xiàn)出功能。接著，通過被剝離的細(xì)胞片層疊體的大小、形狀、或兩者能夠控制功能的表達(dá)量。這樣的細(xì)胞片層疊體，例如其構(gòu)成細(xì)胞為心肌細(xì)胞、心成肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，能應(yīng)用于選自心力衰竭、缺血性心臟病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥大型心肌病、擴(kuò)張期肥大型心肌病和擴(kuò)張型心肌病組成的組的心臟的疾病或者伴隨障礙的各疾患的治療、或以心肌壁的重建為目的而使用；根據(jù)使用的細(xì)胞種類而適宜地特定移植目的地，沒有特別限制。
[0072]實(shí)施例
[0073]以下，基于實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。
[0074][實(shí)施例1]
[0075]構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞和成肌細(xì)胞片的共培養(yǎng)系統(tǒng)(專利文獻(xiàn):國際公開2010 /101225號公報(bào))。圖1表示細(xì)胞片內(nèi)所構(gòu)建的血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成的定量的評價(jià)方法。將細(xì)胞片內(nèi)所構(gòu)建的血管內(nèi)皮細(xì)胞(綠)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行圖像處理，推導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)的長度(L)和網(wǎng)絡(luò)的端點(diǎn)數(shù)(Ντ)。該系統(tǒng)為通過將網(wǎng)絡(luò)的長度(L)除以端點(diǎn)數(shù)(Nt) (L / Ντ)，能夠比較血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建度。
[0076](高密度.低密度成肌細(xì)胞片的血管內(nèi)皮細(xì)胞的行為分析)
[0077]使用上述的系統(tǒng)，將細(xì)胞密度不同的細(xì)胞片和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，研究細(xì)胞密度的不同對于內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成造成的影響。另外，觀察內(nèi)皮細(xì)胞的形狀、結(jié)合度，預(yù)測各自條件下的網(wǎng)絡(luò)形成過程。
[0078](實(shí)驗(yàn)條件)
[0079]制作接種密度為1.1 5X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2 (超低密度)、2.3X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2 (低密度)、4.6X105細(xì)胞數(shù)/cm2 (高密度)的單層成肌細(xì)胞片，用細(xì)胞示蹤橙(CellTrackerOrange)(紅)染色后，層疊為5層。培養(yǎng)96小時(shí)后，將內(nèi)皮細(xì)胞用抗CD31抗體進(jìn)行染色并觀察網(wǎng)絡(luò)(圖2、圖3、圖4、圖5)。實(shí)驗(yàn)條件如下。
[0080](初代細(xì)胞培養(yǎng))
[0081]細(xì)胞培養(yǎng)使用Corning Incorporated.制造的聚苯乙烯制培養(yǎng)容器(225cm2T-flask)0成肌細(xì)胞培養(yǎng)中，在培養(yǎng)面涂布層粘連蛋白(Sigma Corporation.制)。層粘連蛋白涂布面如下制作:將層粘連蛋白的利用磷酸緩沖溶液(PBS、SigmaCorporation.制)稀釋20倍的溶液以每25cm2培養(yǎng)面Iml進(jìn)行添加，37°C *5%C02存在下孵育I小時(shí)，由此使蛋白吸附后，用PBS洗滌而制作。
[0082](單層傳代培養(yǎng))
[0083]實(shí)驗(yàn)中使用支架依賴性人骨骼肌成肌細(xì)胞(CambleXCorporation.制)和正常人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Lonza Corporation.制)，在CO2培養(yǎng)箱(MC0-17A1、三洋電機(jī)株式會(huì)社制)內(nèi)在37°C、5%C02氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)。成肌細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基使用分別添加了抗生素-抗真菌齊Li 100 X (Invitrogen 公司制)lvol%、1MHEPES buffer (Sigma Corporation.制)2vol%、胎牛血清(以下，F(xiàn)BS、GIBC0公司制)10vol%的Dulbecco’s改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基(DMEM、Sigma Corporation.制)、(以下 DMEM(10%FBS))。初代?傳代培養(yǎng)中，將包含 0.1%的膜蛋白酶(Sigma Corporation.制)和 0.02% 的 EDTA (乙二胺四乙酸 Ethlenediaminetetra-acetic acid、Sigma Corporation.制)的膜蛋白酶溶液以每Icm2培養(yǎng)面積ImL進(jìn)行滴加，37°C下使之反應(yīng)3分鐘，將細(xì)胞剝離。向懸浮狀的細(xì)胞中加入與胰蛋白酶等量的胰蛋白酶抑制劑溶液(Wako Pure Chemical Industries、Osaka、Japan),使酶分散反應(yīng)停止。在IOOOrpm、室溫下進(jìn)行5分鐘的離心分離而回收細(xì)胞，進(jìn)一步將通過培養(yǎng)基再懸浮的細(xì)胞懸浮液以存活細(xì)胞濃度1.0 X IO3細(xì)胞數(shù)/cm2接種至培養(yǎng)面，以深度成為2mm的方式加入培養(yǎng)基。另外，培養(yǎng)基交換每24小時(shí)進(jìn)行。
[0084]內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基使用EBM-2 (Lonza制)(以下EBM)。初代.傳代培養(yǎng)中，將包含 0.1% 的膜蛋白酶(Sigma Corporation.制)和 0.02% 的 EDTA (Ethlenediaminetetra-acetic acid、Sigma Corporation.制)的膜蛋白酶溶液以每lcm2培養(yǎng)面積ImL進(jìn)行滴加，37°C下使之反應(yīng)5分鐘，將細(xì)胞剝離。向懸浮狀的細(xì)胞中加入與胰蛋白酶等量的胰蛋白酶抑制劑溶液(Wako Pure Chemical Industries、Osaka、Japan),使酶分散反應(yīng)停止。在1450rpm、室溫下進(jìn)行5min的離心分離而回收細(xì)胞,進(jìn)一步將通過培養(yǎng)基再懸浮的細(xì)胞懸浮液以存活細(xì)胞濃度2.5 X IO3細(xì)胞數(shù)/cm2接種至培養(yǎng)面，以深度成為2mm的方式加入培養(yǎng)基。另外，培養(yǎng)基交換每48小時(shí)進(jìn)行。
[0085](成肌細(xì)胞片和內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng))
[0086]作為細(xì)胞培養(yǎng)基材，使用聚苯乙烯制的35mm培養(yǎng)皿(culture dish) (CorningIncorporated.制)和溫度響應(yīng)性培養(yǎng)容器(24孔微孔，CellSeed公司制)。溫度響應(yīng)性培養(yǎng)容器是指使聚苯乙烯面接枝聚合有N-異丙基丙烯酰胺的培養(yǎng)面；將321:作為臨界點(diǎn)，表面可逆地變化為疏水性、親水性，因此能夠通過溫度變化容易地使細(xì)胞由培養(yǎng)面剝離且維持細(xì)胞間粘接。
[0087]成肌細(xì)胞片的制作如下進(jìn)行:37°C下預(yù)孵育24小時(shí)后，以成為鋪滿的方式，向溫度響應(yīng)性培養(yǎng)容器中以1.15 X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2、2.3 X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2、4.6 X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2的量接種成肌細(xì)胞。24小時(shí)后，20°C、5%C02氣氛下進(jìn)行30分孵育，將剝離的細(xì)胞片由上部用明膠凝膠進(jìn)行回收。其成為I層 的細(xì)胞片，重復(fù)細(xì)胞的剝離.回收，由此制作多層片。
[0088]片共培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建按照以下的順序進(jìn)行。預(yù)先，將內(nèi)皮細(xì)胞在35mm培養(yǎng)皿(culture dish)中進(jìn)行24小時(shí)前培養(yǎng)。此處，培養(yǎng)基使用包含20%FBS的EBM培養(yǎng)基，內(nèi)皮細(xì)胞的接種密度設(shè)為0.5X IO4細(xì)胞數(shù)/cm2。前培養(yǎng)后，在包含內(nèi)皮細(xì)胞的皿(dish)上搭載多層的成肌細(xì)胞片，20°C、加濕狀態(tài)下靜置2小時(shí)(細(xì)胞片向皿上的轉(zhuǎn)印)，導(dǎo)入包含10%FBS的DMEM，37°C下靜置I小時(shí)(明膠溶解)，接著進(jìn)行培養(yǎng)基交換，開始培養(yǎng)。
[0089]細(xì)胞質(zhì)染色如下進(jìn)行，為了知道組織的高度，此外檢查成肌細(xì)胞的流動(dòng)時(shí)，為了將片用顏色區(qū)分，將成肌細(xì)胞在片制作前進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)的染色。將包含0.1%的胰蛋白酶(Sigma Corporation.制)和 0.02% 的 EDTA (Ethlenediamine tetra-acetic acicUSigmaCorporation.制)的胰蛋白酶溶液以每Icm2培養(yǎng)面積ImL進(jìn)行滴加,37°C下使之反應(yīng)3分鐘，將細(xì)胞剝離。向懸浮狀的細(xì)胞中添加與胰蛋白酶等量的胰蛋白酶抑制劑溶液(WakoPure Chemical Industries、Osaka、Japan),使酶分散反應(yīng)停止。通過 lOOOrpm、室溫下進(jìn)行5分鐘的離心分離而回收細(xì)胞，進(jìn)一步對通過無血清培養(yǎng)基懸浮的細(xì)胞懸浮液添加等量的無血清培養(yǎng)基稀釋的 10 μ M CellTracker Orange CMTMR(Molecular probes 制)(或者 CellTracker green CMFDA(Molecular probes 制))，制成為 5mM 的細(xì)胞不蹤染料(CellTrakcer Dye)。37°C、5%C02氣氛下靜置15分鐘后，以lOOOrpm、在室溫下進(jìn)行5分鐘的離心分離而回收細(xì)胞，再次用DMEM10%FBS進(jìn)行懸浮后，以1.15X105細(xì)胞數(shù)/cm2、2.3X105細(xì)胞數(shù)/cm2、4.6 X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2的量接種。
[0090]抗體染色如下進(jìn)行，為了在混合有成肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的組織內(nèi)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞、進(jìn)行觀察，通過 Anti_CD31 (鼠單克隆抗人 Mouse MonoclonalAnt1-Human CD31、DAK0 公司制)進(jìn)行抗體染色。CD31為存在于內(nèi)皮細(xì)胞的分子量IOOkD的識(shí)別糖蛋白的抗體。將細(xì)胞用PBS進(jìn)行洗滌后，加入4%多聚甲醛.磷酸緩沖液(和光純藥株式會(huì)社制)，4°C下靜置一晚而固定。用PBS將培養(yǎng)面洗滌2次，加入用PBS稀釋過的0.l%Triton X-100，對細(xì)胞賦予透過性。用PBS洗滌2次后，浸潰于PBS稀釋的0.1%牛血清白蛋白(和光純藥株式會(huì)社制)I小時(shí)。其后,浸潰于用0.1%牛血清白蛋白稀釋至40倍的ant1-⑶31抗體中，4°C下靜置一晚。用PBS洗滌2次，在用0.1%牛血清白蛋白稀釋至200倍的第二抗體(AlexaFluor (R) 488goat ant1-mouse IgG, Molecular Probes 制)中，室溫下浸潰 I 小時(shí)。PBS 中洗漆2次后，滴加Slow fade (Molecular Probes公司制)1、2滴,加蓋玻璃蓋片(IWAKI公司制)，通過共焦顯微鏡(EX-20、0LYNPUS公司制)取得三維圖像，進(jìn)行細(xì)胞觀察。
[0091](細(xì)胞行為的評價(jià)順序)
[0092]血管網(wǎng)絡(luò)的定量評價(jià):將用激光共聚焦顯微鏡取得的網(wǎng)絡(luò)的照片使用ImagePioPIus將網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行二維圖像解析(圖1)。通過由目視決定的閾值進(jìn)行二值化，計(jì)算使用形態(tài)學(xué)過濾器(Morphological filter)細(xì)線化而成的圖像的網(wǎng)絡(luò)的長度(L)和端點(diǎn)數(shù)(Nt),進(jìn)行各自的網(wǎng)絡(luò)的比較。
[0093]培養(yǎng)96小時(shí)后，通過網(wǎng)絡(luò)度(網(wǎng)絡(luò)長度/端點(diǎn)數(shù))定量評價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的值。結(jié)果，超低密度片中，不進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)形成就不能解析(圖2)。低密度片中L/NT的平均值為
1.12mm/tips、高密度片中為0.54mm/tips，高密度片的情況下與低密度片相比較，大約成為二分之一的值(圖3、圖4)。另外，網(wǎng)絡(luò)長度L (mm)沒有見到不同，而端點(diǎn)數(shù)Nt (tips)在高密度片情況下取約2倍的值 。
[0094]將培養(yǎng)96小時(shí)后的內(nèi)皮細(xì)胞在各層中的分布不于圖5?？梢姷兔芏绕屑s7成的內(nèi)皮細(xì)胞存在于第5層；另一方面，高密度片中，內(nèi)皮細(xì)胞多分布于第I層和第5層。
[0095]由圖3和圖4，分別在高密度片(4.6X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2)、低密度片(2.3X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2)中，網(wǎng)絡(luò)長度L (mm)沒有差別，因此可以認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)相同。另一方面，可以認(rèn)為由于端點(diǎn)數(shù)Nt (tips)在高密度片中増加，所以在高密度片內(nèi)，內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接惡化。內(nèi)皮細(xì)胞在片內(nèi)與成肌細(xì)胞一起工作，在水平方向形成網(wǎng)絡(luò)，但高密度片與低密度片相比較，流動(dòng)性小，因此可以認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞的水平方向的游走被抑制而網(wǎng)絡(luò)的連接惡化。
[0096]另外，觀察到低密度、高密度片分別在第5層有內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)塊。作為能夠結(jié)塊的理由，可以認(rèn)為是因?yàn)樵谄瑑?nèi)部游走的內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)片上部，一部分增殖。高密度片中，與低密度片相比較，第5層的分布減少，因此可以認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞在垂直方向的游走被抑制(圖5)。
[0097][實(shí)施例2]
[0098](依賴于培養(yǎng)狀態(tài)的成肌細(xì)胞的細(xì)胞因子生成能力)
[0099]5層細(xì)胞片為由鋪滿形成的單層片立體地重疊而成的立體組織，可以說三維也是密密地鋪滿的狀態(tài)。細(xì)胞由于接觸抑制而成為一時(shí)喪失增殖性的狀態(tài)。為了理解以鋪滿狀態(tài)被立體培養(yǎng)的片形成細(xì)胞的細(xì)胞因子生成，與更單純的體系、即通常的平面培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞因子特性進(jìn)行比較。培養(yǎng)狀態(tài)可看作是根據(jù)低密度、高密度、片、層疊片和細(xì)胞的疏密培養(yǎng)、平面.立體培養(yǎng)而成為分層結(jié)構(gòu)。對于該分層結(jié)構(gòu)研究單位細(xì)胞的細(xì)胞因子生成。
[0100]將成肌細(xì)胞以1.0XlO4細(xì)胞數(shù)/cm2、8.0X IO4細(xì)胞數(shù)/cm2、2.3X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2(與片相同的接種密度)的密度進(jìn)行接種，提取培養(yǎng)初期的48小時(shí)(即，從開始培養(yǎng)48小時(shí)后)的培養(yǎng)基，檢測VEGF、HGF的生成量。利用通過臺(tái)盼藍(lán)染色算出的細(xì)胞數(shù)而進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，作為單位細(xì)胞的平均生成水平而進(jìn)行比較。
[0101]將由培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)提取的培養(yǎng)基求出的單位細(xì)胞的VEGF、HGF的生成量示于圖6中。由用ELISA檢測出的濃度和培養(yǎng)基體積求出總生成量，由上述細(xì)胞密度和培養(yǎng)皿面積得到的總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化而算出。為了進(jìn)行比較，一并記載將成肌細(xì)胞5層片的培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)的生成量用細(xì)胞數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的值。細(xì)胞密度越大單位細(xì)胞生成量增大，特別是以鋪滿的密度(1.9 X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2)計(jì)，VEGF成為最大。該結(jié)果表示，通過取密密的鋪滿狀態(tài)，成肌細(xì)胞的VEGF生成能力增大?？梢哉J(rèn)為5層片培養(yǎng)的值也與之接近，只用鋪滿狀態(tài)的細(xì)胞制作的片作為移植材料在VEGF分泌能力(分泌效率)這一點(diǎn)是有效的。
[0102]另一方面，如圖7所示，可知雖然細(xì)胞片制作法不同，但伴隨著細(xì)胞片的層疊數(shù)上升，與上述的結(jié)果同樣地，VEGF、HGF的生成量也都上升。這可以認(rèn)為是，伴隨著細(xì)胞片內(nèi)的細(xì)胞密度的變化的細(xì)胞的游走性產(chǎn)生差別，其結(jié)果代謝變化；結(jié)果，生成量變化。
[0103]由以上可知，成肌細(xì)胞移植中，與使用單細(xì)胞進(jìn)行相比，以細(xì)胞片狀、特別是以層疊細(xì)胞片的結(jié)構(gòu)供給細(xì)胞從患部的細(xì)胞因子生成量的觀點(diǎn)出發(fā)是有效的。
[0104]可知由骨骼肌組織提取并分離的成肌細(xì)胞群中混合有成纖維細(xì)胞(Rhoadset al.、“SatelIite cell-mediated angiogenesis in vitro coincides withhypoxia-1nducible factor pathway、，，Am J.Physiol.Cell Physiol.、296、C1321_C1328、(2009))。成纖維細(xì)胞存在于各種組織中，炎癥反應(yīng)時(shí)移動(dòng)至患部對于治療起作用。特別是可以認(rèn)為，通過活躍地生成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM;Extracellular matrix)、細(xì)胞因子,對于生物體組織的結(jié)構(gòu)保持、細(xì)胞的生理學(xué)狀態(tài)的維持起作用(Tomasak et al.、“Myofibroblastsand mechano-regulation of connective tissue remodeling、，，Nat.Rev.Mol.CellBiol.,3,349-363(2002))。因此，混合的成纖維細(xì)胞有可能對細(xì)胞片整體的力學(xué)的性質(zhì)、片內(nèi)的成肌細(xì)胞的游走性.分化帶來影響。但是，對于片整體的性質(zhì)和所含的成纖維細(xì)胞的比例的關(guān)系現(xiàn)在還未知。以高比例包含成纖維細(xì)胞時(shí)，存在對于與細(xì)胞間粘接有關(guān)的膜蛋白質(zhì)或ECM的表達(dá)?形成模式、細(xì)胞游走性起作用的細(xì)胞因子類的分泌模式變化的可能性。
[0105]因此，將由成肌細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的混合細(xì)胞制作的5層細(xì)胞片接種于聚苯乙烯面，進(jìn)行片培養(yǎng)，由每24小時(shí)提取的培養(yǎng)基通過ELISA(Enzyme_Linked ImmunosorbentAssay)法測定細(xì)胞因子類分泌量。使成肌細(xì)胞的比例變化至100%、75%、50%，研究這些細(xì)胞因子的成肌細(xì)胞純度依賴性。
[0106]對細(xì)胞片所具有的旁分泌效果中的、被稱為具有促進(jìn)血管新生效果的細(xì)胞因子類進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的評價(jià)。作為片移植后對心患病部通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞(和血液中所含的內(nèi)皮前體細(xì)胞)的游走性而促進(jìn)移植組織內(nèi)血管新生的靶標(biāo)，可列舉出:有生長因子(Growth factor)類的VEGF、HGF。每24小時(shí)取得培養(yǎng)基，由在各時(shí)點(diǎn)取得的培養(yǎng)基得到的吸光度求出檢測濃度，乘以培養(yǎng)基體積，由此作為片樣品在24小時(shí)生成的各因子的質(zhì)量而進(jìn)行評價(jià)(圖8a、b)。
[0107].實(shí)驗(yàn)條件[0108]細(xì)胞:人骨骼肌成肌細(xì)胞、Np6(Lot number4F1618; Lonza, Inc.)
[0109]人真皮成纖維細(xì)胞、Np8(Lot number3C0243; Cascade Biologies, Inc.)
[0110]培養(yǎng)基:DMEM(10%FBS)
[0111]培養(yǎng)面:聚苯乙烯培養(yǎng)皿(5層片培養(yǎng))、24孔(well)溫度響應(yīng)性培養(yǎng)面(片形成；CellSeed, Inc.)、涂布層粘連蛋白的聚苯乙烯培養(yǎng)面(成肌細(xì)胞增殖)
[0112]培養(yǎng)環(huán)境:37°C、包含5%C02的空氣(in air)
[0113]接種密度:2.3 X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2 (片形成)
[0114]片培養(yǎng)時(shí)間段:48小時(shí)、168小時(shí)
[0115]培養(yǎng)基體積:1.76mL (5層片培養(yǎng)、培養(yǎng)基深度0.2cm)
[0116]培養(yǎng)基交換:每24小時(shí)
[0117]提取試樣--每24小時(shí)的培養(yǎng)基(ELISA)
[0118]祀標(biāo):VEGF(血管內(nèi)皮生長因子，Vascularendothelial growth factor)
[0119]HGF (肝細(xì)胞生長因子，Hepatocyte growth factor)
[0120]如圖8a、b所示， VEGF、HGF在培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)以濃度計(jì)在500~5000pg/mL的范圍內(nèi)被檢測出；與能夠觀測到的、例如通過添加VEGF、HGF對內(nèi)皮細(xì)胞的游走性或網(wǎng)絡(luò)形成產(chǎn)生促進(jìn)效果的數(shù)量級(VEGF:3000pg/mL~10ng/mL;HGF ；2500~5000pg/mL)部分地一致(Pepper et al.、“Potent synergism between vascular endothelial growthfactor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis invitro、，T3iochem.Biophys.Res.Com.、189、824_831 (1992)、Bussolino et al.、“Hepatocytegrowth factor is a potent angiogenic factor which stimulates endothelial cellmotility and growth、”J.Cell Biol.、119、629_641 (1992))。伴隨著成纖維細(xì)胞混合,VEGF生成減少，但HGF生成增大。這些明顯的變化對于成纖維細(xì)胞混合率幾乎顯示出線形的變化，因此啟示主要由成肌細(xì)胞分泌VEGF、由成纖維細(xì)胞分泌HGF?？梢哉J(rèn)為VEGF的蛋白質(zhì)分泌能力中，成肌細(xì)胞片混合有成纖維細(xì)胞時(shí)對于內(nèi)皮細(xì)胞不優(yōu)選但對于HGF分泌能力是相反的；細(xì)胞片中的成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞可能存在有最佳的含有平衡。
[0121]由以上觀測到，5層成肌細(xì)胞片的培養(yǎng)中，由含有成纖維細(xì)胞導(dǎo)致的對各細(xì)胞因子特性的調(diào)整。此處，成肌細(xì)胞群本來混合有成纖維細(xì)胞，通過雙重抗體染色(成肌細(xì)胞:肌間線蛋白(desmin);成纖維細(xì)胞:TE_7antigen)成肌細(xì)胞總數(shù)被評價(jià)為78.2±2.1%。因此，關(guān)于圖8a、b，將培養(yǎng)初期的48h的細(xì)胞因子生成量相對于實(shí)際的成肌細(xì)胞總數(shù)Rm在圖Sc、d中再做圖。
[0122]檢測含有真皮成纖維細(xì)胞對于作為5層細(xì)胞片的模仿體系的、高密度培養(yǎng)中的成肌細(xì)胞的效果。將成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分別以100:0,75:25,50:50、25:75、0:100進(jìn)行混合而調(diào)整細(xì)胞群(細(xì)胞片的體系中，使用包含超過50%的真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞群，則不能形成片)。將這些細(xì)胞群以高密度(1.9 X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2)接種，提取培養(yǎng)24-48小時(shí)(SP，從開始培養(yǎng)起24-48小時(shí)后)的培養(yǎng)基，測定VEGF和HGF的生成量。用由計(jì)數(shù)而求出的細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，作為單位細(xì)胞的生成量而進(jìn)行比較。將結(jié)果示于圖10。為了進(jìn)行比較而搭載的5層片的培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)的VEGF和HGF的生成，顯示出與高密度培養(yǎng)相近的混合率依賴性。VEGF生成量伴隨著成纖維細(xì)胞的混合表現(xiàn)出單調(diào)減少，而對于HGF生成量以50%混合表現(xiàn)出最大值。因此，可以認(rèn)為對于VEGF生成，主要成肌細(xì)胞起作用；HGF通過成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的相互作用而協(xié)同地生成(圖9)。
[0123][實(shí)施例3]
[0124](對于成肌.成纖維細(xì)胞混合片的內(nèi)皮細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)形成)
[0125]在內(nèi)皮細(xì)胞上搭載成肌細(xì)胞片和成肌?成纖維細(xì)胞混合片而進(jìn)行共培養(yǎng)?？芍?xì)胞片自體具有的片流動(dòng)性、細(xì)胞因子分泌模式等特性通過成纖維細(xì)胞混合而被調(diào)整，可以認(rèn)為這些對血管內(nèi)皮細(xì)胞賦予周圍環(huán)境的調(diào)整。因此，對于混合片能夠?qū)W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成帶來怎樣的影響進(jìn)行研究(圖10)。
[0126]圖11表示使用骨骼肌成肌細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的混合片的網(wǎng)絡(luò)形成的結(jié)果。共培養(yǎng)48小時(shí)(B卩，將骨骼肌成肌細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的混合片、與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)開始起48小時(shí)后)時(shí)，成肌細(xì)胞50%混合片一者比成肌細(xì)胞100%片還能夠形成密的多分枝的均質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
[0127]本研究中，來源于人骨骼肌組織的成纖維細(xì)胞難以到手，因此至今為止通過混合來源于人真皮的成纖維細(xì)胞來檢測含有成纖維細(xì)胞對于成肌細(xì)胞片的效果。通過細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架分布或特異的標(biāo)記的評價(jià)中，報(bào)告有來源于骨骼肌、真皮、肺、皮下組織的成纖維細(xì)胞均具有類似的形質(zhì)(Xin et al.、“Hepatocyte growth factor enhances vascularendothelial growth factor-1nduced angiogenesis in vitro and in vivo、，，Am.J.Pathol.,158,1111-1120(2001) )0然而，成肌細(xì)胞(myoblast)含有來源于骨骼肌組織的成纖維細(xì)胞，實(shí)際上根據(jù)其批次不同而混入的程度不同。被指為再生醫(yī)療中不可或缺的來自患者本人的細(xì)胞增殖的過程中，成纖維細(xì)胞含量具有增大的可能性。因此，得到本來含有的來源于骨骼肌的成纖維細(xì)胞帶來的影響的見解，對于作為移植材料的細(xì)胞片的特性評價(jià)是重要的。因此，使用通過醫(yī)學(xué)部的工程研究團(tuán)隊(duì)所保持的細(xì)胞，研究對網(wǎng)絡(luò)形成的影響。
[0128]為了進(jìn)行片移植的 臨床實(shí)驗(yàn)，使用從同一患者提取的、成肌細(xì)胞批次(片形成時(shí)，成肌細(xì)胞純度80% (批次A)、10% (批次B)的兩種)，分別將其以100:0,75:25、50:50混合，由此制備成肌細(xì)胞比率分別為80%、62%、45%的細(xì)胞懸浮液(通過抗體染色確認(rèn)除了成肌細(xì)胞以外，為來源于骨骼肌的成纖維細(xì)胞)。使用它們制作5層細(xì)胞片，檢測與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)的網(wǎng)絡(luò)形成(圖12)。
[0129].實(shí)驗(yàn)條件
[0130]細(xì)胞:人骨骼肌成肌細(xì)胞、Np3 (Lot hMB21A;肌間線蛋白陽性81%)
[0131]人骨骼肌成肌細(xì)胞、Np3 (Lot hMB21;肌間線蛋白陽性0%)
[0132]人胳帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、Np4(Lot4F0709; Lonza、Walkersville、MD、USA)
[0133]培養(yǎng)基:DMEM (10%FBS;成肌細(xì)胞)
[0134]培養(yǎng)面:聚苯乙烯培養(yǎng)皿(5層片培養(yǎng))、24孔(well)溫度響應(yīng)性培養(yǎng)面(片形成；CellSeed、Inc.)、涂布層粘連蛋白的聚苯乙烯培養(yǎng)面(成肌細(xì)胞增殖)
[0135]培養(yǎng)環(huán)境:37°C、包含5%C02的空氣(in air)
[0136]接種密度:2.3 X IO5細(xì)胞數(shù)/cm2 (片形成)
[0137]培養(yǎng)基體積:1.76mL (5層片培養(yǎng)，培養(yǎng)基深度0.2cm DMEM/10%FBS)
[0138]培養(yǎng)基交換:每24小時(shí)
[0139]共培養(yǎng)時(shí)間段:48小時(shí)
[0140]染色試劑:抗⑶-31抗體(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記)、CellTracker Orange CMTMR (片形成細(xì)胞.細(xì)胞質(zhì)染色)
[0141]觀察:共焦激光掃描顯微鏡(XlO)
[0142]圖12和圖13登載使用了共焦激光掃描顯微鏡的觀察照片。能夠觀察到，相比于與成肌細(xì)胞81%片的共培養(yǎng)，成纖維細(xì)胞含量增大的61%、41%片中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)密且更均勻地形成?？芍?，細(xì)胞片形成中，成肌細(xì)胞:成纖維細(xì)胞的混合比例以成肌細(xì)胞為基準(zhǔn)計(jì)，優(yōu)選為100%以下且40%以上。至少關(guān)于成肌細(xì)胞片的網(wǎng)絡(luò)形成，可以認(rèn)為來源于骨骼肌的成纖維細(xì)胞也賦予與來源于真皮的成纖維細(xì)胞類似的效果。
[0143]至今為止，由細(xì)胞片的細(xì)胞因子生成的測定已確認(rèn)，伴隨著成纖維細(xì)胞在成肌細(xì)胞群的含有，VEGF, HGF的生成模式被調(diào)制成逆方向。均被稱為主要的促進(jìn)血管新生因子，在例如膠原蛋白凝膠、基底膜內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)系的二維的評價(jià)中，可觀測到兩因子作用于血管結(jié)構(gòu)的占有面積、全長的協(xié)同效應(yīng)。另外可以認(rèn)為，對于內(nèi)皮細(xì)胞，通過與細(xì)胞骨架相關(guān)的信號有關(guān)，由此HGF對于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的分支結(jié)構(gòu)起作用(Sulpice et al.、“Cross-talkbetween the VEGF-A and HGF signaling pathways in endothelial cells、，T3iol.Cell、101,525-539(2009) )0因此，這兩因子可能在內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生信號中具有相輔助的作用；通過與混合片的共培養(yǎng)觀測到的對于網(wǎng)絡(luò)形成的效果，暗示有參與的可能性(圖14)。
[0144]通過將成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的構(gòu)成比率、以及細(xì)胞的接種濃度最優(yōu)化，可知不止細(xì)胞片層疊體內(nèi)外的細(xì)胞因子產(chǎn)生能提高、血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建被高度化。將細(xì)胞片內(nèi)構(gòu)建有血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片移植時(shí)，與移植部周邊的血管網(wǎng)迅速地連接，治療效果高。另外，現(xiàn)在進(jìn)行的對心疾病患者的通過成肌細(xì)胞片的治療可以認(rèn)為是利用由細(xì)胞片分泌的細(xì)胞因子等的旁分泌效果。因此，可以認(rèn)為通過本發(fā)明制作的細(xì)胞因子產(chǎn)量高、高度地構(gòu)建有血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片取得了更好的治療效果。
[0145]產(chǎn)業(yè)h的可利用件
[0146]只要是本發(fā)明所示的制造方法，就能夠得到分泌促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子和/或構(gòu)建有血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞片層置體。這不僅與治療效果聞的移植片的提供有關(guān)，進(jìn)一步與制作具有厚度的細(xì)胞片層疊體也有關(guān)，可用于各種各樣的組織的再生醫(yī)療中。
[0147]附圖標(biāo)記說明
[0148]RG:綠色的體積元(voxel)占I枚圖像切片的比例(RG:Ratio of green voxel)
[0149]d:拍攝的細(xì)胞片層疊體的厚度
[0150]Rm:前細(xì)胞數(shù)中的成肌細(xì)胞所含的比例
[0151]z:片厚度[μ m]
[0152]L:血管網(wǎng)絡(luò)長度占I圖像的總計(jì)[mm/mm2]
[0153]Nt:血管網(wǎng)絡(luò)每lmm2的端點(diǎn)數(shù)的個(gè)數(shù)[tip/mm2]
[0154]L/NT:將 L 除以 Nt 的值。[mm/tip]
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞片或其的層疊體，其特征在于，所述細(xì)胞片具有產(chǎn)生與促進(jìn)血管新生有關(guān)的細(xì)胞因子的能力，構(gòu)成所述細(xì)胞片的細(xì)胞中至少包含有成纖維細(xì)胞，并且包含骨骼肌成肌細(xì)胞10%以上。
2.根據(jù)利要求I所述的細(xì)胞片或其的層疊體，其中，成纖維細(xì)胞來源于骨骼肌肌肉組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體，其中，以75%~25%的比例含有骨骼肌成肌細(xì)胞，細(xì)胞因子為血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(VEGF)和/或肝細(xì)胞增殖因子(HGF)。
4.一種細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體，通過在進(jìn)行接種的血管內(nèi)皮細(xì)胞上重疊權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片或細(xì)胞層疊體而構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體，其中，該細(xì)胞從生物體組織中提取。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體，其中，選自骨骼肌成肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的至少一種細(xì)胞來源于自體組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體，其中，細(xì)胞為進(jìn)行了熒光標(biāo)記的細(xì)胞。
8.—種權(quán)利要求1~7的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片的制造方法，其特征在于，在表面覆蓋有水合力在O~80°C的溫度范圍內(nèi)變化的聚合物的細(xì)胞培養(yǎng)支撐體上，在聚合物的水合力弱的溫度區(qū)域培養(yǎng)該細(xì)胞 ，其后，使培養(yǎng)液變化至聚合物的水合力變強(qiáng)的狀態(tài)的溫度而使培養(yǎng)的細(xì)胞以片狀剝離。
9.一種權(quán)利要求1~7的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片的制造方法，其中，每I層細(xì)胞片所接種的細(xì)胞為 1.0X IO5 ~7.0X IO5 個(gè) / Cm2。
10.一種權(quán)利要求1~7的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片層疊體的制造方法，其特征在于，將剝離的細(xì)胞片進(jìn)一步層疊在其他的片狀培養(yǎng)細(xì)胞上，或者重復(fù)該操作而將細(xì)胞片層疊。
11.一種權(quán)利要求8~10的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體的制造方法，其中，剝離方法中，不實(shí)施通過蛋白質(zhì)分解酶進(jìn)行的處理而由細(xì)胞培養(yǎng)支撐體剝離。
12.—種權(quán)利要求8~11的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體的制造方法，其中，剝離方法為如下方法:在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在培養(yǎng)細(xì)胞上緊貼載體，與載體一起剝離。
13.—種權(quán)利要求8~12的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體的制造方法，其中，水合力在O~80°C的溫度范圍內(nèi)變化的聚合物為聚(N-異丙基丙烯酰胺)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1~7的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體，其用于將得到的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體移植入生物體內(nèi)的心臟的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體，其中，將得到的細(xì)胞片或該細(xì)胞片的層疊體用于以下用途:選自由心力衰竭、缺血性心臟病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥大型心肌病、擴(kuò)張期肥大型心肌病和擴(kuò)張型心肌病組成的組的至少一種心臟的疾患或障礙的治療，或者心肌壁重建的移植。
【文檔編號】C12M3/04GK103476439SQ201280010876
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月28日
【發(fā)明者】紀(jì)之岡正博, 齋藤充弘, 澤芳樹, 清水達(dá)也, 岡野光夫 申請人:學(xué)校法人東京女子醫(yī)科大學(xué), 國立大學(xué)法人大阪大學(xué)