甜瓜中的白粉病抗性提供基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及黃瓜屬科,尤其是甜瓜中的白粉病抗性提供基因，其中所述抗性由本發(fā)明的基因的受損提供。此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的受損的抗性賦予基因的植物及其種子、胚或其他繁殖材料。尤其是，本發(fā)明涉及白粉病抗性賦予基因，其中被所述抗性賦予基因編碼的氨基酸序列選自由SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.4、SEQ?ID?No.6、SEQ?ID?No.8、SEQ?ID?No.10、SEQ?ID?No.12和SEQ?ID?No.14、以及具有多于70%同一性、優(yōu)選多于80%同一性、更優(yōu)選多于90%同一性以及最優(yōu)選多于95%同一性的氨基酸序列組成的組。
【專利說明】甜瓜中的白粉病抗性提供基因
[0001]描述
[0002]本發(fā)明涉及甜瓜(Cucumis melo)的白粉病抗性提供基因，其中所述抗性由本發(fā)明的基因在表達(dá)或蛋白水平的受損提供。此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的抗性賦予基因的植物及其種子、胚或其他繁殖材料。
[0003]白粉病(PM)是屬于田地和溫室中的黃瓜屬(Cucumis)科的植物諸如甜瓜(甜瓜，melon)中已知的主要真菌疾病之一。
[0004]白粉病一般由白粉菌目(Erysiphales)的許多不同的真菌種引起。該病以如下區(qū)別性癥狀為特征:諸如在葉和莖上的白粉樣斑點(diǎn)。一般地說，較低的葉最易受侵襲，但霉可出現(xiàn)在植物暴露于地面上的任何部分。隨著該病的發(fā)展，斑點(diǎn)因大量孢子形成而變大變密，且霉沿著植物長(zhǎng)度如在莖甚至在果實(shí)上上下傳播。
[0005]被嚴(yán)重侵襲的葉可變得干燥且易碎，或者可以枯萎和死亡。由于這種感染，果實(shí)在大小上可以更小，數(shù)目更少，不大能夠成功儲(chǔ)存，日燒傷，不完全成熟，且具有不好的口味。它還可能使植物傾向于更易受其他病原體傷害。最終，植物可以死亡。
[0006]除了其他之外，白粉病可以由真菌蒼耳單絲殼(Sphaerotheca fuliginea)(最近重新命名:蒼耳單囊白粉菌(Podosphaera xanthii),還稱為白粉粉孢霉(Oidiumerysiphoides))和 / 或二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum DC)(最近重新命名:菊科白粉菌(Golovinomyces cichoracearum),還稱為菊粉抱菌(Oidium chrysanthemi))弓丨起。
[0007]考慮到黃瓜屬植物物 種諸如甜瓜的經(jīng)濟(jì)重要性，在本領(lǐng)域?qū)μ峁┌追鄄】剐蕴峁┗虼嬖诔掷m(xù)的需要。
[0008]鑒于本領(lǐng)域中的以上需要，除了其他目的之外，本發(fā)明的一個(gè)目的是滿足這種需要。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，除了其他目的之外，該目的由如所附權(quán)利要求1中限定的白粉病抗性賦予基因滿足。
[0010]具體地說，除了其他目的之外，本發(fā)明的這個(gè)目的由白粉病抗性賦予基因滿足，其中由所述抗性賦予基因編碼的氨基酸序列選自由SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.14、以及具有多于 70% 同一性、優(yōu)選多于80%同一性、更優(yōu)選多于90%同一性以及最優(yōu)選多于95%同一性諸如多于96%、97%、98%,99%的氨基酸序列組成的組；且其中所述抗性賦予基因是受損的。
[0011]除了其他目的之外，本發(fā)明的目的另外由白粉病抗性賦予基因滿足，其中從所述抗性賦予基因轉(zhuǎn)錄的CDNA序列選自由SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.13、以及具有多于 70% 同一性、優(yōu)選多于80%同一性、更優(yōu)選多于90%同一性以及最優(yōu)選多于95%同一性諸如多于96%、97%、98%、99%的cDNA序列組成的組；且其中所述抗性賦予基因是受損的。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的受損的抗性賦予基因意指提供減少的或甚至不存在的對(duì)由真菌引起的表現(xiàn)為葉和莖上的粉樣斑點(diǎn)的白粉病的易感性的基因，所述真菌諸如屬于白粉菌目諸如蒼耳單絲殼(最近重新命名:蒼耳單囊白粉菌，還稱為白粉粉孢霉)和/或二孢白粉菌的真菌。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的受損的抗性賦予基因是突變的基因。本發(fā)明的基因的突變可通過不同的機(jī)制導(dǎo)致受損。例如，在蛋白質(zhì)編碼DNA序列中的突變可導(dǎo)致突變的、截短的或無功能的蛋白質(zhì)。在非編碼DNA序列中的突變可引起可變的剪接、翻譯或蛋白質(zhì)運(yùn)輸?？蛇x地，導(dǎo)致改變的基因轉(zhuǎn)錄活性的突變可導(dǎo)致蛋白的低水平或不存在，基因轉(zhuǎn)錄活性決定可用于翻譯成蛋白質(zhì)的mRNA的量。另外，基因功能的受損可在翻譯后即在蛋白質(zhì)水平上引起。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的受損還通過以下顯示:與本文提供的SEQ ID Nos.相比在含有在蛋白質(zhì)水平被突變的基因的甜瓜植物中觀察到白粉病抗性，或未觀察到本文提供的SEQ IDNos.的表達(dá)。
[0015]受損還在本文顯示為無功能的基因或蛋白質(zhì)。盡管本發(fā)明的基因的功能仍沒有被鑒定，無功能的基因或蛋白質(zhì)可通過在植物中確立白粉病抗性(無功能的)或白粉病易感性(有功能的)而容易確定。白粉病抗性(無功能的)植物通過以下顯示:與本文提供的SEQ IDNos.相比含有在蛋白質(zhì)水平被突變的基因，或未觀察到本文提供的SEQ ID Nos.的表達(dá)。
[0016]有功能和無功能的基因或蛋白質(zhì)還可以使用互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確定。例如，用本發(fā)明的基因或蛋白中的任何一種轉(zhuǎn)化抗白粉病的甜瓜植物，在該基因或蛋白有功能時(shí)將產(chǎn)生白粉病易感的甜瓜植物，而在該基因或蛋白無功能時(shí)該甜瓜植物將仍有抗性。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的白粉病抗性賦予基因在本發(fā)明的基因受損時(shí)提供了白粉病抗性。根據(jù)本發(fā)明的受損可通過以下顯示:在本文被鑒定為SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4、SEQID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12 或 SEQ ID N0.14 的有功能或非突變的蛋白質(zhì)的不存在或減少。在本領(lǐng)域中，許多機(jī)制已知導(dǎo)致基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯或蛋白質(zhì)水平的受損。
[0018]例如，在轉(zhuǎn)錄水平的受損可以是在轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和起始序列、終止序列或內(nèi)含子剪接序列中的一個(gè)`或更多個(gè)突變的結(jié)果。這些序列一般位于由SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11 或 SEQ IDN0.13所表示的編碼序列的5’、3’或這些編碼序列之內(nèi)。受損還可以由在本發(fā)明的基因中的缺失、重排或插入提供。
[0019]在翻譯水平的受損可以由提前終止密碼子或其他的RNA_>蛋白質(zhì)控制機(jī)制(諸如剪接)或影響例如蛋白質(zhì)折疊或細(xì)胞運(yùn)輸?shù)姆g后修飾提供。
[0020]在蛋白質(zhì)水平的受損可以由截短的、錯(cuò)誤折疊的或受干擾的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供。
[0021]不依賴于背后的機(jī)制，根據(jù)本發(fā)明的受損通過以下顯示:根據(jù)SEQ ID N0.2、SEQID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12 或 SEQ ID N0.14 的有功能的蛋白質(zhì)的減少或不存在。
[0022]根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的受損由在本發(fā)明的基因中導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物不存在的一個(gè)或更多個(gè)突變提供。如所示的，這些突變可引起在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的缺陷表達(dá)。
[0023]根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的受損由在本發(fā)明的基因中導(dǎo)致無功能的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的一個(gè)或更多個(gè)突變引起。無功能的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物可以例如由提前終止密碼子、不正確的翻譯或翻譯后加工或由插入、缺失或氨基酸變化引起。[0024]利用分子生物學(xué)方法，本發(fā)明的基因的受損還可以通過基因沉默例如利用本發(fā)明的基因的siRNA或敲除完成。在本發(fā)明的背景下還考慮了基于EMS或其他能夠隨機(jī)改變核酸成為其他核苷酸的致突變的化合物的方法。此類突變的檢測(cè)通常涉及高靈敏度解鏈曲線分析或基于核苷酸測(cè)序的TILLING程序。
[0025]本發(fā)明涉及在核苷酸水平或氨基酸水平具有多于70%、優(yōu)選多于80%、更優(yōu)選多于90%以及最優(yōu)選多于95%序列同一'丨生的核苷酸和氨基酸序列。
[0026]將本文使用的序列同一性定義為在本發(fā)明序列的全長(zhǎng)上的相同的連續(xù)的比對(duì)的核苷酸或氨基酸的數(shù)目除以本發(fā)明序列的全長(zhǎng)的核苷酸或氨基酸的數(shù)目，再乘以100%。
[0027]例如，與SEQ ID N0.1具有80%同一性的序列在SEQ ID N0.1的1713個(gè)核苷酸的總長(zhǎng)度上包括1370或1371個(gè)相同的比對(duì)的連續(xù)核苷酸，即1370或1371/1713 X 100%=80%。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的基因衍生自甜瓜。
[0029]根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及在其基因組中包含本發(fā)明的受損的白粉病抗性賦予基因的甜瓜植物，即不表達(dá)選自由以下組成的組的有功能的蛋白質(zhì)的植物:SEQ ID N0.2、SEQID N0.4、SEQ ID N0.6, SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.14、以及具有多于70%同一性、優(yōu)選多于80%同一性、更優(yōu)選多于90%同一性以及最優(yōu)選多于95%同一性的氨基酸序列。
[0030]一般地且優(yōu)選地，本發(fā)明的植物對(duì)于本發(fā)明的受損基因來說將是純合的，即包含兩個(gè)受損的白粉病抗性賦予基因，其中從所述抗性賦予基因轉(zhuǎn)錄的cDNA序列選自由SEQID N0.USEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11 和 SEQ IDN0.13、以及具有多于70%同一' 丨生、優(yōu)選多于80%同一'丨生、更優(yōu)選多于90%同一'丨生以及最優(yōu)選多于95%同一性的cDNA序列組成的組。
[0031]考慮到本發(fā)明的植物的益處，即，提供在甜瓜植物中的白粉病抗性，本發(fā)明還涉及能夠提供本發(fā)明的白粉病抗性甜瓜植物的種子、植物部分或繁殖材料，所述種子、植物部分或繁殖材料包含一個(gè)或更多個(gè)本發(fā)明的白粉病抗性賦予基因，即，受損的白粉病抗性賦予基因，其中從所述抗性賦予基因轉(zhuǎn)錄的cDNA序列選自由SEQ ID N0.USEQ ID N0.3、SEQ IDN0.5, SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.9, SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.13、以及具有多于 70% 同一性、優(yōu)選多于80%同一性、更優(yōu)選多于90%同一性以及最優(yōu)選多于95%同一性的cDNA序列組成的組。
[0032]根據(jù)又另一方面，本發(fā)明涉及選自由以下組成的組的分離的核苷酸序列:SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11 和 SEQ IDN0.13、以及具有多于70%同一'丨生、優(yōu)選多于80%同一'丨生、更優(yōu)選多于90%同一'丨生以及最優(yōu)選多于95%同一'丨生的核苷酸序列。
[0033]根據(jù)仍另一方面，本發(fā)明涉及選自由以下組成的組的分離的氨基酸序列:SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12 和 SEQ IDN0.14、以及具有多于70%同一I"生、優(yōu)選多于80%同一I"生、更優(yōu)選多于90%同一I"生以及最優(yōu)選多于95%同一'丨生的氨基酸序列。
[0034]本發(fā)明還涉及一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的白粉病抗性賦予基因、一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的分離的核苷酸序列、或一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的分離的氨基酸序列用于提供白粉病抗性的甜瓜植物(甜瓜)的用途。如所示的，本發(fā)明的用途是基于本文描述的基因在表達(dá)或蛋白質(zhì)水平的受損，且可以通過本發(fā)明提供的cDNA和氨基酸序列任選地聯(lián)合白粉病抗性的存在或不存在的確定和/或聯(lián)合互補(bǔ)測(cè)定而容易地確定。
[0035]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的以下實(shí)施例中將進(jìn)一步描述本發(fā)明。在該實(shí)施例中，參考附圖，其中:
[0036]圖1:示出了導(dǎo)致對(duì)于白粉病易感性途徑的功能獲得的35S::CmKIPl_cDNA (稱為35S::CmMlol_cDNA)的互補(bǔ)測(cè)定的結(jié)果。對(duì)于擬南芥(Arabidopsis)野生型、Atmlo2/6和Atmlo2/6/12突變體示出了在接種后12天患病的葉區(qū)域的百分比，該數(shù)據(jù)表示2個(gè)個(gè)體的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。對(duì)于 Atmlo2+35S::CmKIPl_cDNA、Atmlo2/6+35S::CmKIPl_cDNA和Atmlo2/6/12+35S::CmKIPl_cDNA,該數(shù)據(jù)分別表不4、4和9個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)化體(primarytransformant)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差；
[0037]圖2:示出了導(dǎo)致對(duì)于白粉病易感性途徑的功能獲得的35S::CmKIPl_cDNA (稱為35S::CmMlol_cDNA)的互補(bǔ)測(cè)定的結(jié)果。將對(duì)于Atmlo2/6和Atmlo2/6/12突變體和初級(jí)轉(zhuǎn)化體 Atmlo2+35S::35S:: CmKIPl_cDNA、Atmlo2/6+35S:: 35S:: CmKIPl_cDNA 和Atmlo2/6/12+35S::35S:: CmKIPl_cDNA觀察到的抗性水平呈現(xiàn)為與擬南芥野生型的表型進(jìn)行比較；
[0038]圖3:示出了導(dǎo)致對(duì)于白粉病易感性途徑的功能獲得的Atmlo2/6/12與35S::CmKIP2_cDNA的互補(bǔ)。(A)高氏白粉菌(G.0rontii)在哥倫比亞野生型的葉上的易感的相互作用表型；透明的菌絲和分生孢子梗發(fā)育。(B)高氏白粉菌在Atmlo2/6/12的葉上的抗性相互作用表型；在葉表面上的孢子已經(jīng)萌發(fā)但沒有觀察到進(jìn)一步的發(fā)育。(C，D，E)在與35S::CmKIP2_cDNA互補(bǔ)后對(duì)Atmlo2/6/12觀察到的中間相互作用表型；對(duì)于一些初級(jí)轉(zhuǎn)化體，萌發(fā)的孢子沒有進(jìn)一步發(fā)育(C)，對(duì)于其他的初級(jí)轉(zhuǎn)化體，觀察到了孢子的萌發(fā)，菌絲的確發(fā)育且形成了分生孢子 梗(D，E)。
實(shí)施例
[0039]實(shí)施例1擬南芥(Arabidopsis thaliana) Atmlo突變植物的互補(bǔ)
[0040]材料和方法
[0041 ] 使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將甜瓜CmKIP基因的全長(zhǎng)cDNA克隆在pBINPLUS或Gateway載體中處于35S啟動(dòng)子的控制下。
[0042]為了分析所鑒定的甜瓜白粉病抗性基因在植物中(in planta)的功能，經(jīng)由Nottingham Arabidopsis Stock Centre (University of Nottingham, Sutton BoningtonCampus, Loughborough, LE125RD, United Kingdom, http://arabidopsis.1nfo/),獲得擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Col)、突變系NACS ID N9707(mlo2-5單突變體)、N9710(mlo2-5、mlo6-2雙突變體)和N9715 (mlo2-5、mlo6-2、mlol2-l三突變體)的種子。
[0043]將這些種子培養(yǎng)在土壤中，提取DNA并且利用在所述突變側(cè)翼的引物(表I)的PCR測(cè)定篩選4周大的植物中所述突變的存在，如在The Arabidopsis Information Resource(TAIR, http://www.arabidopsis.0rg/index, jsp)所述的。
[0044]表1:用來鑒定野生型基因與在擬南芥突變系中的突變的Mlo同源物的引物對(duì)(5’到 3，)。
[0045]引物對(duì)野生型基因引物對(duì)突變基因
【權(quán)利要求】
1.白粉病抗性賦予基因，其中被所述抗性賦予基因編碼的氨基酸序列選自由SEQIDN0.2、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12 和 SEQ IDN0.14、以及具有多于70%同一I"生、優(yōu)選多于80%同一I"生、更優(yōu)選多于90%同一I"生以及最優(yōu)選多于95%同一性的氨基酸序列組成的組；且其中所述抗性賦予基因是受損的。
2.白粉病抗性賦予基因，其中從所述抗性賦予基因轉(zhuǎn)錄的cDNA序列選自由SEQIDN0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11 和 SEQ IDN0.13、以及SEQ ID N0.17、以及具有多于70%同一性、優(yōu)選多于80%同一性、更優(yōu)選多于90%同一性以及最優(yōu)選多于95%同一性的cDNA序列組成的組；且其中所述抗性賦予基因是受損的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或根據(jù)權(quán)利要求2所述的白粉病抗性賦予基因，其中所述受損是導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物不存在的在所述基因中的一個(gè)或更多個(gè)突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或根據(jù)權(quán)利要求2所述的白粉病抗性賦予基因，其中所述受損是導(dǎo)致無功能的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的在所述基因中的一個(gè)或更多個(gè)突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或根據(jù)權(quán)利要求2所述的白粉病抗性賦予基因，其中所述受損是基因沉默。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的白粉病抗性賦予基因，其中所述基因衍生自甜瓜(Cucumis melo)。
7.在其基因組中包含權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)限定的受損的白粉病抗性賦予基因的甜瓜植物，其中所述受損提供白粉病抗性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的在其基因組中包含權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)限定的受損的白粉病抗性賦予基因的植物的種子、植物部分或繁殖材料，其中所述受損提供在所述植物中的白粉病抗性。
9.分離的核苷酸序列，選自由SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.13、以及具有多于70%同一性、優(yōu)選多于80%同一'I"生、更優(yōu)選多于90%同一'丨生以及最優(yōu)選多于95%同一'丨生的核苷酸序列組成的組。
10.分離的氨基酸序列，選自由SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.14、以及具有多于70%同一性、優(yōu)選多于80%同一性、更優(yōu)選多于90%同一性以及最優(yōu)選多于95%同一性的氨基酸序列組成的組。
11.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)限定的白粉病抗性賦予基因、根據(jù)權(quán)利要求9的分離的核苷酸序列、或根據(jù)權(quán)利要求10的分離的氨基酸序列用于提供抗白粉病的甜瓜植物的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103459413SQ201280011052
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月1日
【發(fā)明者】P·J·迪爾加得, 利奧諾拉·約翰娜·格爾特魯達(dá)·范恩克沃特, 卡琳·英格伯格·波斯楚馬, 馬里努斯·威廉·普林斯 申請(qǐng)人:安莎種子公司, 科因股份有限公司