體外確定個(gè)體患結(jié)直腸癌概率的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在外周血樣品中體外確定個(gè)體患結(jié)直腸癌概率的方法，使用待測(cè)個(gè)體基因的核酸表達(dá)產(chǎn)物的量與得自組成陽性對(duì)照的CRC患者組的相同基因的核酸表達(dá)產(chǎn)物的量及與得自組成陰性對(duì)照的CNC個(gè)體組的相同基因的核酸表達(dá)產(chǎn)物的量的比較；還涉及包含所述表達(dá)產(chǎn)物的特異性結(jié)合配偶體的試劑盒。
【專利說明】體外確定個(gè)體患結(jié)直腸癌概率的方法及試劑盒
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及檢測(cè)結(jié)直腸癌，特別涉及用于確定患這種癌癥的概率的方法及試劑盒。
[0002]背景
[0003]結(jié)直腸癌(CRC)也稱為結(jié)腸癌或大腸癌，是美國(guó)第五最常見癌癥形式，中國(guó)第四位常見癌癥及歐洲癌癥相關(guān)死亡的第三位因素。CRC早期檢測(cè)是成功治療及患者存活的關(guān)鍵，代表主要公共健康挑戰(zhàn)。事實(shí)上，CRC經(jīng)常是可治愈的，特別是當(dāng)在早期診斷時(shí)。在各個(gè)國(guó)家已有一些篩查策略。傳統(tǒng)CRC篩查測(cè)試包括大便潛血試驗(yàn)(F0BT)、乙狀結(jié)腸鏡檢測(cè)結(jié)腸鏡檢查、雙重對(duì)比鋇劑灌腸、或者直腸指檢。所有這些均具有優(yōu)點(diǎn)和限制，但是依從性仍低于預(yù)期，主要由于患者的不便或者不適。
[0004]尋找目的在于CRC早期檢測(cè)的外周血生物學(xué)標(biāo)記物幾年來成為焦點(diǎn)，特別是因?yàn)槠浞奖阈?。同時(shí)，只有極少研究支持基于血液的測(cè)試的可行性，這些研究發(fā)現(xiàn)血液中的基因生物學(xué)標(biāo)記物可以區(qū)分CRC患者和對(duì)照。這些研究基于流式細(xì)胞術(shù)，其是計(jì)數(shù)和檢查顯微顆粒如細(xì)胞的技術(shù)，所述技術(shù)通過將它們懸浮在液流中并用電子檢測(cè)裝置分析它們。
[0005]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在外周血樣品中，差異表達(dá)的基因代表重要的生物學(xué)標(biāo)記物。它們不使用經(jīng)典流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)，而是確定來自全血的基因的差異表達(dá)。通過分析全血中的轉(zhuǎn)錄物來確定基因表達(dá)水平是不尋常的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員普遍承認(rèn)，當(dāng)無特異性純化步驟時(shí)，非常難以獲取稀釋于RNA復(fù)雜混合物(總RNA)中的特異信息。本發(fā)明方法的優(yōu)勢(shì)還包括避免RNA純化步驟。
[0006]因此，本發(fā)明涉 及在外周血樣品中體外確定個(gè)體患結(jié)直腸癌概率的方法，所述方法包括步驟:
[0007]a)在外周血樣品中確定來自至少一種核酸序列且不超過7種核酸序列的至少一種表達(dá)產(chǎn)物的量，所述核酸序列選自SEQ ID NO: 1-11的序列，
[0008]b)將步驟a)中確定的所述表達(dá)產(chǎn)物的量與一組先前診斷為結(jié)直腸癌患者的個(gè)體的表達(dá)產(chǎn)物的參考量以及與一組先前確認(rèn)為非結(jié)直腸癌個(gè)體的個(gè)體的表達(dá)產(chǎn)物的參考量進(jìn)行比較，
[0009]c)進(jìn)行步驟b)結(jié)果的分析，其中:
[0010]-如果測(cè)試個(gè)體的結(jié)果接近或等于得自先前診斷為結(jié)直腸癌患者的個(gè)體組的結(jié)果，則該測(cè)試個(gè)體被分類為結(jié)直腸癌患者，而
[0011]-如果測(cè)試個(gè)體的結(jié)果接近或等于得自先前確認(rèn)為非結(jié)直腸癌個(gè)體的個(gè)體組的結(jié)果，則該測(cè)試個(gè)體被分類為非結(jié)直腸癌個(gè)體。
[0012]表達(dá)產(chǎn)物的量直接與由其核酸序列限定的基因的表達(dá)水平相關(guān)。
[0013]至少一種上述核酸的表達(dá)水平是確定個(gè)體是否是CRC的足夠信息。但是，在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟a)中，來自選自下組的核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物的量被確定:SEQ IDN0:USEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:6, SEQ IDN0:7 或 SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 和 SEQ ID NO:11。[0014]來自核酸的表達(dá)產(chǎn)物的量通過將所述表達(dá)產(chǎn)物與特異于每種表達(dá)產(chǎn)物的至少一種結(jié)合配偶體接觸而確定。
[0015]表達(dá)產(chǎn)物是指RNA轉(zhuǎn)錄物或多肽。因此，在本發(fā)明方法中，至少一種RNA轉(zhuǎn)錄物或至少一種多肽的量被確定。
[0016]術(shù)語RNA轉(zhuǎn)錄物是指總RNA，即直接得自外周血樣品或細(xì)胞裂解后間接得自血液樣品的編碼或非編碼RNA。特別地，總RNA包含轉(zhuǎn)移RNA (tRNA)，信使RNA (mRNA)，如從靶基因轉(zhuǎn)錄也從其他基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，以及核糖體RNA。
[0017]具體說明，當(dāng)RNA是胞內(nèi)RNA時(shí)，其可以通過裂解步驟從血液樣品中存在的細(xì)胞提取，以釋放待測(cè)個(gè)體細(xì)胞中含有的核酸。例如，可以使用如下專利申請(qǐng)中描述的裂解方法:W000/05338，涉及混合磁性及機(jī)械裂解，W099/53304,涉及電裂解，W099/15321，涉及機(jī)械裂解。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用其它熟知裂解方法，例如熱休克或滲透壓休克，或者使用離液劑如胍鹽的化學(xué)裂解(美國(guó)專利號(hào)5，234，809)。還可以提供額外步驟以從裂解步驟釋放的其它細(xì)胞組分分離核酸。這通常能夠濃縮核酸。
[0018]在本發(fā)明方法中，RNA轉(zhuǎn)錄物可以通過雜交、擴(kuò)增或測(cè)序檢測(cè)及量化。特別地，為檢測(cè)及量化，RNA轉(zhuǎn)錄物與至少一種探針或至少一種引物在預(yù)定條件下接觸，所述預(yù)定條件使得所述探針和/或所述引物與所述RNA轉(zhuǎn)錄物雜交。但是在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，制備RNA轉(zhuǎn)錄物的DNA拷貝，通過與至少一種探針或至少一種引物在預(yù)定條件下接觸，所述預(yù)定條件使得所述探針和/或所述引物與所述DNA拷貝雜交而確定所述DNA拷貝。
[0019]更精確地，在上述方法中，RNA轉(zhuǎn)錄物或DNA拷貝與至少一種雜交探針和至少一種引物接觸，更特別與至少一種雜交探 針和兩種引物接觸。
[0020]術(shù)語“雜交”是指這樣的過程，其中在合適條件下，兩個(gè)核苷酸片段以穩(wěn)定和特異性氫鍵結(jié)合以形成雙鏈復(fù)合物。這些氫鍵在互補(bǔ)腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))堿基之間形成(稱為A-T鍵)或者在互補(bǔ)的鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)堿基之間形成(稱為G-C鍵)。兩個(gè)核苷酸片段的雜交可以是完全的(稱為互補(bǔ)核苷酸片段或序列)，即在這個(gè)雜交過程中獲得的雙鏈復(fù)合物僅包含A-T鍵及C-G鍵。這個(gè)雜交可以是部分的(稱為足夠互補(bǔ)的核苷酸片段或序列)，即獲得的雙鏈復(fù)合物包含使得能形成雙鏈復(fù)合物的A-T鍵和C-G鍵，也包含不結(jié)合互補(bǔ)堿基的堿基。兩個(gè)核苷酸片段之間的雜交取決于使用的工作條件，特別取決于嚴(yán)格性。嚴(yán)格性特別定義為兩個(gè)核苷酸片段的堿基組成的函數(shù)，也通過兩個(gè)核苷酸片段之間的錯(cuò)配程度限定。嚴(yán)格性也可以取決于反應(yīng)參數(shù)，例如雜交溶液中存在的離子種類的濃度及類型，變性劑的性質(zhì)及濃度，和/或雜交溫度。所有這些數(shù)據(jù)均是熟知的并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定合適的條件。通常，根據(jù)要雜交核苷酸片段的長(zhǎng)度，雜交溫度在大約20和70°C之間，特別是在35和65°C之間，在濃度大約0.5-1M的鹽水溶液中。序列或核苷酸片段或寡核苷酸或多核苷酸是通過磷酸酯鍵組裝在一起的一系列核苷酸基序，特征在于天然核酸的信息序列，能夠與核苷酸片段雜交，該系列可以含有不同結(jié)構(gòu)的單體，可以得自天然核酸分子和/或通過遺傳重組和/或通過化學(xué)合成獲得?；蚴菃误w衍生物，其可以是核酸的天然核苷酸，其組成元件是糖、磷酸基團(tuán)和含氮堿基；在0嫩中，糖是脫氧-2-核糖，在RNA中，糖是核糖；根據(jù)涉及DNA或RNA，含氮堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；或者單體是在三種組成元件中的至少一種中被修飾的核苷酸；例如，修飾可以發(fā)生在堿基水平，修飾的堿基例如肌苷、甲基-5-脫氧胞苷、脫氧尿苷、二甲基氨基-5-脫氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脫氧尿苷或者任何其它能雜交的修飾堿基，或者修飾可以發(fā)生在糖水平，例如用聚酰胺置換至少一個(gè)脫氧核糖(P.E.Nielsen et al, Science, 254,1497-1500(1991))，或者修飾可以發(fā)生在磷酸基團(tuán)水平，例如其用酯特別選自二磷酸酯、烷基膦酸酯和芳基膦酸酯及硫代磷酸酯置換。
[0021]為本發(fā)明目的，術(shù)語“擴(kuò)增引物”是指包含5-100個(gè)核苷酸、優(yōu)選15-30個(gè)核苷酸的核苷酸片段，其允許起始酶促聚合，例如酶促擴(kuò)增反應(yīng)。術(shù)語“酶促擴(kuò)增反應(yīng)”是指通過至少一種酶的作用產(chǎn)生核苷酸片段的多個(gè)拷貝的過程。這種擴(kuò)增反應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可特別提及的是下述技術(shù):PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，如美國(guó)專利號(hào)4，683，195和美國(guó)專利號(hào)4，683，202所述，LCR(連接酶鏈反應(yīng))，如專利申請(qǐng)EP0201184中所述，RCR(修復(fù)鏈反應(yīng))，如專利申請(qǐng)W090/01069所述，專利申請(qǐng)W090/06995的3SR(自持續(xù)(self sustained)序列復(fù)制)，專利申請(qǐng)W091/02818的NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增)，美國(guó)專利號(hào)5，399，491的TMA (轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)及RT-PCR。
[0022]當(dāng)酶促擴(kuò)增是PCR時(shí)，其使用至少兩種特異于靶基因的擴(kuò)增引物，使得特異于靶基因的擴(kuò)增材料。特異于靶基因的材料優(yōu)選包含經(jīng)衍生自靶基因的信使RNA的逆轉(zhuǎn)錄獲得的互補(bǔ)DNA (稱為cDNA)，或者經(jīng)特異于靶基因的cDNA的轉(zhuǎn)錄獲得的互補(bǔ)RNA (稱為cRNA)。當(dāng)酶促擴(kuò)增是在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后進(jìn)行的PCR時(shí)，稱為RT-PCR。
[0023]術(shù)語“雜交探針”是指包含至少5個(gè)核苷酸、如5-100個(gè)核苷酸、特別是10-75個(gè)核苷酸、如15-35個(gè)核苷酸和60-70個(gè)核苷酸的核苷酸片段，在給定條件下具有雜交特異性，從而與特異于靶基因的材料形成雜交復(fù)合物。在本發(fā)明中，特異于靶基因的材料可以是包括在衍生自靶基因的信使RNA中的核苷酸序列(稱為靶基因特異性mRNA)，包括在通過所述信使RNA的逆轉(zhuǎn)錄獲得的互補(bǔ)DNA中的核苷酸序列(稱為靶基因特異性cDNA)，或者包括在通過如上所述cDNA的轉(zhuǎn)錄獲得的互補(bǔ)RNA中的核苷酸序列(稱為靶基因特異性cRNA)。雜交探針可以包括標(biāo)記物用于其檢測(cè)。術(shù)語“檢`測(cè)”是指直接檢測(cè)如計(jì)數(shù)法，或者通過使用標(biāo)記物的檢測(cè)方法間接檢測(cè)?，F(xiàn)有許多檢測(cè)方法用于檢測(cè)核酸(參見例如Kricka et al.，Clinical Chemistry,1999, no45(4), p.453-458or Keller G.H.et al., DNA Probes,2ndEd.，Stockton Press, 1993, sections5and6, p.173-249)。術(shù)語“標(biāo)記物”是指能產(chǎn)生可被檢測(cè)信號(hào)的示蹤劑。這些示蹤劑的非限制性列表包括酶，其產(chǎn)生可以通過例如比色法、熒光或發(fā)光檢測(cè)的信號(hào)，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；生色團(tuán)如熒光、發(fā)光或染料化合物；電子致密基團(tuán)，可被電子顯微鏡或通過它們的電學(xué)性質(zhì)如導(dǎo)電性檢測(cè)，通過電流分析法或伏特計(jì)方法、或通過阻抗測(cè)量檢測(cè)；可以通過光學(xué)方法或物理方法檢測(cè)的基團(tuán)，所述光學(xué)方法例如衍射、表面等離子體共振或接觸角變化，所述物理方法例如原子力光譜學(xué)、隧道效應(yīng)等；放射活性分子如32P，35S或1251。
[0024]為本發(fā)明目的，雜交探針可以是“檢測(cè)”探針。在這種情況中，“檢測(cè)”探針由標(biāo)記物標(biāo)記。檢測(cè)探針可以特別是“分子信標(biāo)”檢測(cè)探針，如Tyagi&Kramer所述(Nature biotech,1996,14:303-308)。這些“分子信標(biāo)”在雜交期間發(fā)熒光。它們具有莖-環(huán)型結(jié)構(gòu)，含有熒光團(tuán)和“猝滅”基團(tuán)。特異的環(huán)序列與其互補(bǔ)靶核酸序列的結(jié)合導(dǎo)致莖解開及在合適波長(zhǎng)激發(fā)期間發(fā)射熒光信號(hào)。檢測(cè)探針特別可以是“報(bào)道探針”，包含根據(jù)NanoString?技術(shù)的“顏色編碼的條碼”。
[0025]為檢測(cè)雜交反應(yīng)，可以利用具有直接(特別是通過在靶序列內(nèi)摻入標(biāo)記物)或間接(特別是使用上述檢測(cè)探針)標(biāo)記的靶序列。特別是可以在雜交步驟之前進(jìn)行標(biāo)記和/或裂解靶序列的步驟，例如在酶促擴(kuò)增反應(yīng)期間使用標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸三磷酸。裂解可以特別是通過咪唑或者氯化錳的作用而進(jìn)行。靶序列也可以在擴(kuò)增步驟之后標(biāo)記，例如通過文件W091/19812中所述的夾心雜交技術(shù)雜交檢測(cè)探針。另一個(gè)特別優(yōu)選的標(biāo)記核酸的方法在申請(qǐng)F(tuán)R2780059中描述。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，檢測(cè)探針包含熒光團(tuán)及猝滅劑。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案雜交探針在其5’末端包含F(xiàn)AM (6-羧基-熒光素)或ROX (6-羧基-X-若丹明)熒光團(tuán)及在其3’末端包含猝滅劑(Dabsyl )。
[0027]雜交探針也可以是“捕獲”探針。在這種情況中，“捕獲”探針通過任何合適方式即直接或間接固定化或者可以固定化在固相基質(zhì)上，例如通過共價(jià)或吸附。作為固相基質(zhì)，可以使用合成材料或天然材料，任選化學(xué)修飾的，特別是多糖如基于纖維素的材料，例如紙、纖維素衍生物如醋酸纖維素和硝基纖維素或葡聚糖、聚合物、共聚物，特別是基于苯乙烯型單體、天然纖維如棉花及合成纖維如尼龍；無機(jī)材料如二氧化硅、石英、玻璃或陶瓷；膠乳；磁性顆粒；金屬衍生物，凝膠等。固相基質(zhì)可以是微滴定板形式，如申請(qǐng)W0-A-94/12670描述的膜形式或者顆粒形式。還可以在基質(zhì)上固定化一些不同的捕獲探針，每個(gè)特異于靶基因。特別地，可以使用其上可以固定化大量探針的生物芯片作為基質(zhì)。術(shù)語“生物芯片”是指尺寸小的固相基質(zhì)，許多捕獲探針可以附著于其上的預(yù)定位置。生物芯片或DNA芯片概念從1990年開始。其基于多學(xué)科技術(shù)，集成了微電子學(xué)、核酸化學(xué)、成像分析及信息技術(shù)。運(yùn)行原理是基于分子生物學(xué)基礎(chǔ):雜交現(xiàn)象，即兩個(gè)DNA和/或RNA序列的堿基的互補(bǔ)配對(duì)。生物芯片方法基于利用附著于固相基質(zhì)的捕獲探針，在探針上使得用熒光染料直接或間接標(biāo)記的靶核苷酸片段樣品起作用。捕獲探針特殊定位在基質(zhì)或芯片上，每個(gè)雜交給出與靶核苷酸片段相關(guān)的特定信息。所獲得的信息是累積的，使得可以例如量化一或多種靶基因的表達(dá)水平。為了分析靶基因的表達(dá)，可以制備包含多個(gè)探針的基質(zhì)，其相應(yīng)于被轉(zhuǎn)錄成mRNA的靶基因的全部或部分。為本發(fā)明目的，術(shù)語“低密度基質(zhì)”是指包含少于50個(gè)探針的基質(zhì)。為本發(fā)明目的，術(shù)語“中等密度基質(zhì)”是指包含50-10000個(gè)探針的基質(zhì)。為本發(fā)明目的，術(shù)語“高密度基質(zhì)”是指包含超過10000個(gè)探針的基質(zhì)。
[0028]特異于希望去分析的靶基因的核酸的cRNA或cDNA然后與例如特異性捕獲探針雜交。雜交后，洗滌基質(zhì)或芯片，通過結(jié)合于例如熒光染料型標(biāo)記物的高親和性配體揭示標(biāo)記的cDNA或cRNA/捕獲探針復(fù)合物。例如用掃描儀讀取熒光，熒光分析用信息技術(shù)加工。例如，可以提及由Affymetrix公司開發(fā)的DNA芯片("Accessing GeneticInformation with High-Density DNA arrays"，M.Chee et al.，Science，1996，274，610-614.Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequenceanalysis"，A.Caviani Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，1994，91，5022-5026)，用于分子診斷。在這個(gè)技術(shù)中，捕獲探針通常尺寸小，大約25個(gè)核苷酸。生物芯片的其它例子在如下出版物中給出:G.Ramsay，Nature Biotechnology，1998，N0.16，p.40-44;F.Ginot，Human Mutation，1997，N0.10，p.1-10;J.Cheng et al, Molecular diagnosis，1996, N0.1 (3), p.183-200;T.Livache et al，Nucleic Acids Research，1994，N0.22(15)，p.2915-2921J.Cheng et al, Nature Biotechnology，1998，N0.16，p.541-546，或者美國(guó)專利號(hào)4，981，783，美國(guó)專利號(hào)5，700，637，美國(guó)專利號(hào)5，445，934，美國(guó)專利號(hào)5，744，305及美國(guó)專利號(hào)5，807，522。固相基質(zhì)的主要特征應(yīng)該是保持捕獲探針在靶核苷酸片段上的雜交特征，同時(shí)產(chǎn)生檢測(cè)方法的最小背景噪聲。可以分成三種主要制造類型用于將探針固定化在基質(zhì)上。
[0029]首先，第一種技術(shù)是沉積預(yù)合成的探針。探針的附著是通過微量移液器或微點(diǎn)(microdot)或通過噴墨裝置直接轉(zhuǎn)移而進(jìn)行。這項(xiàng)技術(shù)允許附著尺寸為幾個(gè)堿基(5-10個(gè))直至相對(duì)較大尺寸60個(gè)堿基(印刷)至幾百個(gè)堿基(微沉積)的探針。
[0030]印刷是噴墨打印機(jī)使用的方法的適應(yīng)。其基于以可達(dá)到4000滴/秒的速率推進(jìn)非常小的液滴(體積〈lnl)。印刷不涉及釋放液體的系統(tǒng)與其沉積的表面的任何接觸。
[0031]微沉積是將幾十至幾百個(gè)堿基的長(zhǎng)探針附著于玻片表面。這些探針通常從數(shù)據(jù)庫中提取并且呈擴(kuò)增及純化產(chǎn)物形式。這個(gè)技術(shù)使得可以產(chǎn)生被稱為微陣列的芯片，其在小于4cm2的表面積上攜帶大約I萬個(gè)DNA斑點(diǎn)，稱為識(shí)別區(qū)。然而不能忘記的是使用尼龍膜，被稱為“大陣列(macroarray)”,其攜帶通常被PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物,直徑為0.最大密度為25個(gè)斑點(diǎn)/cm2。這種非常靈活的技術(shù)被許多實(shí)驗(yàn)室使用。在本發(fā)明中，后一技術(shù)被認(rèn)為包括在生物芯片中。但是一定體積的樣品可以沉積在微滴定板每個(gè)孔的底部，如專利申請(qǐng)W0-A-00/71750和FR00/14896所述，或者一定數(shù)目的彼此分離的液滴可以沉積在同一皮氏皿的底部，如另一個(gè)專利申請(qǐng)F(tuán)ROO/14691所述。
[0032]將探針附著于基質(zhì)或芯片的第二種技術(shù)成為原位合成。這個(gè)技術(shù)導(dǎo)致在芯片表面直接產(chǎn)生短探針。其基于原位寡核苷酸合成(特別參見專利申請(qǐng)W089/10977和W090/03382)及基于寡核苷酸合成儀方法。其包括沿玻璃表面移動(dòng)反應(yīng)室，其中發(fā)生寡核苷酸延伸反應(yīng)。
[0033]最后，第三種技術(shù)成為光刻，其是Affymetrix開發(fā)的生物芯片的方法。其也是一種原位合成。光刻衍生自微處理器技術(shù)。芯片表面通過附著可以被光激活的光不穩(wěn)定化學(xué)基團(tuán)而修飾。一旦被照射， 這些基團(tuán)能夠與寡核苷酸的3’末端反應(yīng)。通過用限定形狀的掩飾(mask)保護(hù)這個(gè)表面，可以選擇性照射，因此激活芯片上希望附著4種核苷酸的一種或另一種的區(qū)域。相繼使用不同掩飾使得可以交替保護(hù)/反應(yīng)循環(huán)，因此在大約幾十平方微米(μπι2)的斑點(diǎn)上產(chǎn)生寡核苷酸探針。這個(gè)分辨率使得可以在幾平方厘米(cm2)的表面積上產(chǎn)生幾十萬個(gè)斑點(diǎn)。光刻具有優(yōu)勢(shì):以大批平行的方式，其能夠僅通過4χΝ個(gè)循環(huán)便產(chǎn)生N聚體芯片。所有這些技術(shù)均可以用于本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，上述步驟b)的至少一種特異性試劑包含至少一種雜交探針，其優(yōu)選固定化在基質(zhì)上。這個(gè)基質(zhì)優(yōu)選是如上所述的低、高或中等密度基質(zhì)。
[0034]在包含多個(gè)探針的基質(zhì)上的這些雜交步驟之前可以是如上所述酶促擴(kuò)增反應(yīng)步驟，以增加靶遺傳物質(zhì)的量。
[0035]確定靶基因的表達(dá)水平可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方案進(jìn)行。通常，靶基因的表達(dá)可以通過在給定時(shí)間檢測(cè)從靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA (信使RNA)而分析。
[0036]本發(fā)明優(yōu)選涉及通過根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方案檢測(cè)衍生自靶基因的mRNA而確定靶基因的表達(dá)水平。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，一些靶基因的表達(dá)水平通過檢測(cè)一些不同mRNA而被同時(shí)確定,每種mRNA衍生自一種祀基因。
[0037]通過擴(kuò)增，可以如下確定靶基因表達(dá)水平:1)在從全血中提取總RNA (包含轉(zhuǎn)移RNA (tRNA)、核糖體RNA (rRNA)和信使RNA (mRNA))之后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄步驟以獲得所述mRNA的互補(bǔ)DNA (cDNA).例如，這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行，可以從RNA片段獲得互補(bǔ)DNA片段?？梢蕴貏e使用來自AMV (禽類成髓細(xì)胞瘤病毒)或來自MMLV (莫羅尼鼠白血病病毒)的逆轉(zhuǎn)錄酶。當(dāng)更希望僅獲得mRNA的cDNA時(shí)，這個(gè)逆轉(zhuǎn)錄步驟在包含僅胸腺嘧啶堿基(polyT)的核苷酸片段存在下進(jìn)行,polyT通過互補(bǔ)性與mRNA的polyA序列雜交，以形成polyT-polyA復(fù)合物，作為由逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的起始點(diǎn)。然后獲得與衍生自靶基因的mRNA互補(bǔ)的cDNA (靶基因特異性cDNA)及與衍生自非靶基因的基因的mRNA互補(bǔ)的cDNA (非特異于靶基因的cDNA)。2)特異于靶基因的擴(kuò)增引物與靶基因特異性cDNA及非特異于靶基因的cDNA接觸。特異于靶基因的擴(kuò)增引物與靶基因特異性cDNA雜交，來自靶基因的mRNA來源的cDNA的已知長(zhǎng)度的預(yù)定區(qū)域被特別擴(kuò)增。非特異于靶基因的cDNA不被擴(kuò)增，然后獲得大量靶基因特異性cDNA。為本發(fā)明目的，可提及“靶基因特異性cDNA”或“來自革巴基因的mRNA來源的 cDNA(cDNAs originating from the mRNAs derived from thetarget gene)”，兩者并無差別。這個(gè)步驟可以特別通過PCR型擴(kuò)增反應(yīng)或通過上述任何其它擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行。通過PCR，還可以同時(shí)擴(kuò)增一些不同的cDNA，每個(gè)cDNA特異于不同靶基因，使用一些不同擴(kuò)增引物，每個(gè)引物特異于一個(gè)靶基因，然后進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增。3)靶基因的表達(dá)通過檢測(cè)及量化上述步驟2)中獲得的靶基因特異性cDNA確定。這個(gè)檢測(cè)可以在靶基因特異性cDNA根據(jù)它們的大小電泳遷移后進(jìn)行。遷移的凝膠及介質(zhì)可以包括溴化乙錠以允許在給定遷移時(shí)間后將凝膠置于UV (紫外)線桌臺(tái)上通過光信號(hào)發(fā)射而直接檢測(cè)靶基因特異性cDNA。靶基因特異性cDNA量越大，光信號(hào)越亮。這些電泳技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。靶基因特異性cDNA也可以用進(jìn)行直至飽和的擴(kuò)增反應(yīng)獲得的量化范圍而檢測(cè)及量化。為了考慮可能在各個(gè)步驟期間觀測(cè)到的酶效率的差異(逆轉(zhuǎn)錄、PCR等)，各組患者的靶基因的表達(dá)可以通過同時(shí)確 定“管豕”基因的表達(dá)而標(biāo)準(zhǔn)化，管豕基因的表達(dá)在各組患者中是相似的。通過獲得靶基因表達(dá)與管家基因表達(dá)的比率，即通過獲得靶基因特異性cDNA的量與管家基因特異性cDNA的量的比率，由此可以校正各個(gè)實(shí)驗(yàn)間的任何差異。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以特別參考下列出版物:Bustin S A, J Mol Endocrinol, 2002, 29:23-39;GiuliettiA Methods，2001，25:386-401。
[0038]通過雜交，靶基因的表達(dá)可以通過如下方式確定:1)在從全血中提取總RNA之后，進(jìn)行如上述逆轉(zhuǎn)錄步驟，以獲得與衍生自靶基因的mRNA互補(bǔ)的cDNA(靶基因特異性cDNA)和與衍生自除了靶基因之外的基因的mRNA互補(bǔ)的cDNA(非特異于靶基因的cDNA)。2)將所有cDNA均與其上固定了特異于其表達(dá)希望被分析的靶基因的捕獲探針的底物接觸，以進(jìn)行靶基因特異性cDNA與捕獲探針之間的雜交反應(yīng)，非特異于靶基因的cDNA與捕獲探針不雜交。雜交反應(yīng)可以在固體底物上進(jìn)行，包括上述所有材料。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，將雜交探針固定在底物上。優(yōu)選地，底物是如上文定義的低_、高-或中等密度的底物。雜交反應(yīng)也可以在如上述靶基因特異性cDNA的酶擴(kuò)增組成的步驟之后進(jìn)行，以獲得大量的靶基因特異性cDNA及增加靶基因特異性cDNA與特異于靶基因的捕獲探針雜交的可能性。雜交反應(yīng)也可以在如上述標(biāo)記和/或裂解靶基因特異性cDNA的步驟之后進(jìn)行，例如使用標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸三磷酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。裂解可以特別通過咪唑和二氯化錳的作用而進(jìn)行。靶基因特異性cDNAye可以在擴(kuò)增步驟之后標(biāo)記，例如根據(jù)如文獻(xiàn)W0-A-91/19812中所述夾心雜交技術(shù)與標(biāo)記的探針 雜交而進(jìn)行。其它優(yōu)選的標(biāo)記和/或裂解核酸的特定方法在專利申請(qǐng) W099/65926、W001/44507、W001/44506、W002/090584、W002/090319 中描述。3)隨后進(jìn)行檢測(cè)雜交反應(yīng)的步驟。所述檢測(cè)通過將其上特異于靶基因的捕獲探針與靶基因特異性cDNA雜交的底物與用標(biāo)記物標(biāo)記的“檢測(cè)”探針接觸，并檢測(cè)由該標(biāo)記物發(fā)出的信號(hào)而進(jìn)行。當(dāng)靶基因特異性cDNA已經(jīng)預(yù)先用標(biāo)記物標(biāo)記時(shí)，直接檢測(cè)該標(biāo)記物發(fā)出的信號(hào)。
[0039]靶基因的表達(dá)也可以通過如下方式確定:1)在從全血中提取總RNA之后，進(jìn)行如上述逆轉(zhuǎn)錄步驟，以獲得所述生物材料的mRNA的cDNA。隨后使用T7聚合酶進(jìn)行該cDNA的互補(bǔ)RNA的聚合化，所述聚合酶在啟動(dòng)子的控制下，使得可以從DNA模板中獲得互補(bǔ)RNA。然后獲得特異于靶基因的mRNA的cDNA的cRNA (稱作靶基因特異性cRNA)和非特異于靶基因的mRNA的cDNA的cRNA。2)將所有cRNA均與其上固定了特異于其表達(dá)希望被分析的靶基因的捕獲探針的底物接觸，以進(jìn)行靶基因特異性cRNA與捕獲探針之間的雜交反應(yīng)，非特異于靶基因的cRNA與捕獲探針不雜交。當(dāng)需要同時(shí)分析一些靶基因的表達(dá)時(shí)，可以將一些不同的捕獲探針固定在底物上，每個(gè)探針均特異于一個(gè)靶基因。雜交反應(yīng)也可以在如上述標(biāo)記和/或裂解靶基因特異性cRNA組成的步驟之后進(jìn)行。3)隨后進(jìn)行由檢測(cè)雜交反應(yīng)組成的步驟。所述檢測(cè)可以通過將其上特異于靶基因的捕獲探針與靶基因特異性cRNA雜交的底物與用標(biāo)記物標(biāo)記的“檢測(cè)”探針接觸，并檢測(cè)由所述標(biāo)記物發(fā)出的信號(hào)而進(jìn)行。當(dāng)靶基因特異性cRNA已經(jīng)預(yù)先用標(biāo)記物標(biāo)記時(shí)，直接檢測(cè)由該標(biāo)記物發(fā)出的信號(hào)。當(dāng)使用其上雜交了大量探針的生物芯片類型底物時(shí)，使用cRNA是特別有利的。
[0040]當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物是多肽時(shí)，可以通過將其與如下文定義的至少一種特異性配體接觸而進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將表達(dá)的多肽與如下文定義的至少兩種特異性配體接觸。特異性配體例如是指稱作“Nanofitin?”的抗體或親和性蛋白質(zhì)。
[0041]Nanofitin是具有競(jìng)爭(zhēng)特性的親和性蛋白質(zhì)。其存在與看題相似的競(jìng)爭(zhēng)性親和性。
[0042]術(shù)語“抗體”涵蓋了多克隆抗體，單克隆抗體，人源化抗體，重組抗體。其產(chǎn)生方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
[0043]本發(fā)明還包括在體外確定個(gè)體患有結(jié)腸癌的可能性的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種特異于至少一種核酸序列的結(jié)合配偶體且不超過7種特異于7種核酸序列的7種表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合配偶體，其中至少一種結(jié)合配偶體特異于選自SEQ ID NO: 1-11的至少一種核酸序列的至少一種表達(dá)產(chǎn)物。
[0044]特別地，所述試劑盒包含7種結(jié)合配偶體的組合，其特異于具有SEQ ID NO:SEQ IDNO:1、SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:6,SEQ IDN0:7 或 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 所示序列的 7 種核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。
[0045]在試劑盒中，特異性結(jié)合配偶體包含:
[0046]-至少一種雜交探針，
[0047]-或者至少一種雜交探針和至少一種引物，或者
·[0048]-至少一種雜交探針和兩種引物，或者
[0049]-至少一種特異性配體或至少兩種特異性配體，如抗體和/或親和性蛋白。
[0050]最后，本發(fā)明涉及至少一種針對(duì)至少一種核酸序列的至少一種表達(dá)產(chǎn)物的特異性結(jié)合配偶體且不超過7種針對(duì)7種核酸序列的7種表達(dá)產(chǎn)物的特異性結(jié)合配偶體在制備用于體外確定個(gè)體患結(jié)直腸癌概率的組合物中的用途，所述至少一種核酸序列具有選自SEQID NO: 1-11所示核酸序列的序列。[0051]特別地，使用7種特異性結(jié)合配偶體的組合，所述7種特異性結(jié)合配偶體特異于具有 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ IDNO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 及 SEQ ID NO: 11 所示序列的7種核酸序列的7種表達(dá)產(chǎn)物。
[0052]特異性結(jié)合配偶體包含:
[0053]-至少一種雜交探針，
[0054]-或至少一種雜交探針及至少一種引物，或
[0055]-至少一種雜交探針及兩種引物，或
[0056]-至少一種特異性配體或至少兩種特異性配體，如抗體和/或親和性蛋白。
實(shí)施例
[0057]I)材料及方法
[0058]1.患者及樣品收集
[0059]在2006年至2010年期間從161個(gè)結(jié)直腸癌患者(CRC)及148個(gè)結(jié)腸鏡陰性對(duì)照患者(CNC)收集外周血樣品。CRC患者在中國(guó)FDUSCC的結(jié)直腸外科募集。根據(jù)國(guó)際防癌聯(lián)盟(UICC)推薦的國(guó)際腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(--Μ)系統(tǒng)對(duì)腫瘤分期?；颊呶唇邮苁中g(shù)前放療或化療?；加羞z傳性結(jié)直腸癌或炎性腸病(克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎)的患者被排除在本研究之外。已用結(jié)腸鏡證實(shí)無任何息肉或結(jié)直腸癌癥狀的CNC從上海地區(qū)社區(qū)醫(yī)院和FDUSCC登記加入。對(duì)于每個(gè)患者，將2.5ml外周血收集進(jìn)PAXgene? Blood RNA試管(PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, CH)并根據(jù)廠商指導(dǎo)加工。
[0060]研究涉及兩個(gè)獨(dú)立的參加者群組。群組I由100個(gè)CRC患者和100個(gè)CNC組成。對(duì)于CRC患者，在結(jié)腸鏡后至少一周于手術(shù)前在FDUSCC收集血液樣品。對(duì)于CNC，在結(jié)腸鏡前一周在上海地區(qū)社區(qū)醫(yī)院收集血液樣品。分析來自這些樣品的基因表達(dá)譜作為訓(xùn)練集以尋找與CRC相關(guān)的顯著基因及鑒別分子特征。群組2包括61個(gè)CRC患者和48個(gè)CNC。樣品以與群組I相同方式收集。群組2用作獨(dú)立測(cè)試集以證實(shí)群組I中觀測(cè)到的特征表現(xiàn)。
[0061]2.RNA提取及微陣列實(shí)驗(yàn)
[0062]用PAXgene? Blood RNA系統(tǒng)(PreAnalytix)根據(jù)廠商指導(dǎo)提取總RNA。用分光光度計(jì)在260nm光密度測(cè)量總RNA數(shù)量，質(zhì)量用RNA6000Nano LabChip? Kit在BioAnalyzer Agilent2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, U.S.A.)上評(píng)估。僅分析具有7-10的RNA完整性數(shù)目(RNA Integrity Number)的樣品。50ng總RNA然后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄并且用Ribo-SPIA?技術(shù)用WT-0vation? RNA擴(kuò)增系統(tǒng)(NuGEN TechnologiesInc., San Carlos, CA, U.S.A.)根據(jù)廠商標(biāo)準(zhǔn)方案線性擴(kuò)增成單鏈cDNA,產(chǎn)物用QIAquick?PCR純化試劑盒(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)純化。2微克擴(kuò)增純化的cDNA隨后用RQlRNase-Free DNase (Promega Corp., Fitchburg, WI, U.S.A.)片段化并且用生物素化脫氧核苷三憐酸經(jīng)末端轉(zhuǎn)移酶(Roche Diagnostics Corp.，Indianapoli, IN, U.S.A.)和GeneChip? DNA 標(biāo)記試劑(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, U.S.A)標(biāo)記。標(biāo)記的 cDNA在雜交爐640 (Agilent Technologies)中以每分鐘60轉(zhuǎn)、50°C、18小時(shí)雜交到GeneChipHG U133Plus2.0 陣列(Affymetrix)上。HG U133Plus2.0 陣列含有 54675 個(gè)探針集，代表大約39000個(gè)最佳鑒定的人基因。在雜交后，陣列被洗滌并用GeneChip? FluidicsStation450 (Affymetrix)根據(jù) Affymetrix 方案 EukGE_WS2v4 染色。陣列用 GeneChip?
掃描儀 3000 (Affymetrix)掃描。
[0063]3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0064]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Affymetrix質(zhì)量控制參數(shù)建議進(jìn)行微陣列數(shù)據(jù)質(zhì)量控制。Affymetrix表達(dá)陣列根據(jù)Robust Mult1-chip Average法(RMA)進(jìn)行全局預(yù)加工,使用背景校正、分位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化及中位數(shù)平滑總結(jié)(median polish summarization) (Irizarry RA et al.，Biostatistics203;4:249-64)。
[0065]對(duì)于群組I數(shù)據(jù)，具有極端信號(hào)強(qiáng)度(低于log2(50)或高于2E14)的探針集被過濾掉。然后，用Entrez基因數(shù)據(jù)庫(Maglot D et al., Nucleic AcidsResearch2007;35:D26-31)的信息進(jìn)行基于生物學(xué)知識(shí)的過濾。除去沒有Entrez基因ID注釋的探針集。對(duì)于作圖為相同Entrez基因ID的多個(gè)探針集，僅保留具有最大Inter Quantile Range值的探針集。在兩步過濾后，保留9859個(gè)探針集進(jìn)行下游分析。為降低批次效應(yīng)可能性，將Combat方法用于過濾的表達(dá)數(shù)據(jù)(Johnson WE et al.,Biostatistics2007; 8:118-27)。通過微陣列的顯著性分析(SAM)方法進(jìn)行差異表達(dá)基因(DEG)分析(False Discovery Rate=0.05;Type= “Two class unpaired” ； teststatistic= “t-statistic，，;number of permutations=l, 000) (Tusher VG et al., PNASUSA2001,98:5116-21)。顯著性基因選擇及預(yù)測(cè)模型構(gòu)建用RFE-SVM方法使用5倍交叉確認(rèn)方法進(jìn)行。在訓(xùn)練集的200個(gè)樣品中，隨機(jī)選擇160個(gè)形成學(xué)習(xí)集；用RFE-SVM評(píng)分的范圍從I到100個(gè)基因的不同大小產(chǎn)生預(yù)測(cè)模型；模型表現(xiàn)用其余40個(gè)樣品評(píng)估。這個(gè)方法重復(fù)1000次。我們的結(jié)果提不用基于100個(gè)基因的SVM預(yù)測(cè)|旲型可實(shí)現(xiàn)最大97%精確度。特征大小優(yōu)化考慮預(yù)測(cè)表現(xiàn)、特征復(fù)雜性及經(jīng)濟(jì)性。最后，我們鑒別了 7種核心基因滿足我們的目標(biāo)表現(xiàn)，整體精確度為90%。所述7種基因經(jīng)t-檢驗(yàn)P值、變化倍數(shù)、生物學(xué)功能選擇并且不與年齡或性別因素相關(guān)。`
[0066]II)結(jié)果
[0067]1.結(jié)直腸癌和對(duì)照患者群的特征
[0068]在兩個(gè)群組中的309個(gè)參加者中，有161個(gè)CRC患者和148個(gè)CNC?；颊叩娜丝诮y(tǒng)計(jì)學(xué)及臨床特征總結(jié)在表I中。
[0069]表1:患者的臨床特征
[0070]
【權(quán)利要求】
1.在外周血樣品中體外確定個(gè)體患結(jié)直腸癌概率的方法，所述方法包括步驟: a)在外周血樣品中確定來自至少一種核酸序列且不超過7種核酸序列的至少一種表達(dá)產(chǎn)物的量，所述核酸序列選自SEQ ID NO: 1-11， b)將步驟a)中確定的所述表達(dá)產(chǎn)物的量與一組先前診斷為結(jié)直腸癌患者的個(gè)體的所述表達(dá)產(chǎn)物的參考量以及與一組先前確認(rèn)為非結(jié)直腸癌個(gè)體的個(gè)體的所述表達(dá)產(chǎn)物的參考量進(jìn)行比較， c)對(duì)步驟b)的結(jié)果進(jìn)行分析，其中: -如果測(cè)試個(gè)體的結(jié)果接近或等于得自先前診斷為結(jié)直腸癌患者的個(gè)體組的結(jié)果，則該測(cè)試個(gè)體被分類為結(jié)直腸癌患者，而 -如果測(cè)試個(gè)體的結(jié)果接近或等于得自先前確認(rèn)為非結(jié)直腸癌個(gè)體的個(gè)體組的結(jié)果，則該測(cè)試個(gè)體被分類為非結(jié)直腸癌個(gè)體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟a)中，來自所述至少一種核酸的至少一種表達(dá)產(chǎn)物的量通過將所述表達(dá)產(chǎn)物與特異于所述表達(dá)產(chǎn)物的至少一種結(jié)合配偶體接觸而確定。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中在步驟a)中，來自選自下組的核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物的量被確定:SEQ ID NO:USEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 或 SEQID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)產(chǎn)物是至少一種RNA轉(zhuǎn)錄物或者至少一種多肽。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述表達(dá)產(chǎn)物是至少一種mRNA。
6.權(quán)利要求5 的方法，其中所述RNA轉(zhuǎn)錄物通過雜交、通過擴(kuò)增或通過測(cè)序檢測(cè)及量化。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述RNA轉(zhuǎn)錄物與至少一種探針和/或至少一種引物在預(yù)定條件下接觸，所述預(yù)定條件使得所述探針和/或所述引物與所述RNA轉(zhuǎn)錄物雜交。
8.權(quán)利要求6的方法，其中制備所述RNA轉(zhuǎn)錄物的DNA拷貝，且將所述DNA拷貝與至少一種探針和/或至少一種引物在預(yù)定條件下接觸，所述預(yù)定條件使得所述探針和/或所述引物與所述DNA拷貝雜交。
9.權(quán)利要求4的方法，其中通過與至少一種特異性配體，特別是抗體或親和性蛋白，接觸而檢測(cè)所表達(dá)的多肽。
10.權(quán)利要求9的方法，其中將所表達(dá)的多肽與至少兩種特異性配體，特別是兩種抗體或兩種親和性蛋白或一種抗體及一種親和性蛋白，接觸。
11.用于體外確定個(gè)體患結(jié)直腸癌概率的試劑盒，包含至少一種特異于至少一種核酸序列的至少一種表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合配偶體且不超過7種特異于7種核酸序列的7種表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合配偶體，其中所述至少一種結(jié)合配偶體特異于選自SEQ ID NO: 1-11所示核酸序列的至少一種核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其包含7種結(jié)合配偶體的組合，它們特異于具有SEQIDNO:1、SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:6,SEQ IDN0:7 或 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 所示序列的 7 種核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述至少一種特異性結(jié)合配偶體包含至少一種雜交探針。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述特異性結(jié)合配偶體包含至少一種雜交探針及至少一種引物。
15.權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述特異性結(jié)合配偶體包含至少一種雜交探針及兩種引物。
16.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述至少一種特異性結(jié)合配偶體包含至少一種特異性配體、特別是一種抗體或一種親和性蛋白。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述特異性結(jié)合配偶體包含至少兩種特異性配體、特別是兩種抗體或兩種親和性蛋白或一種抗體及一種親和性蛋白。
18.至少一種針對(duì)至少一種核酸序列的至少一種表達(dá)產(chǎn)物的特異性結(jié)合配偶體且不超過7種針對(duì)7種核酸序列的7種表達(dá)產(chǎn)物的特異性結(jié)合配偶體在制備用于體外確定個(gè)體患結(jié)直腸癌概率的組合物中的用途，所述至少一種核酸序列具有選自SEQ ID N0:1-11所示核酸序列的序列。
19.權(quán)利要求18的用途，其是7種特異性結(jié)合配偶體的組合的用途，所述7種特異性結(jié)合配偶體特異于具有 SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:5或SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10和 SEQ IDNO: 11所示序列的7種核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。
20.權(quán)利要求18的用途，其中所述至少一種特異性結(jié)合配偶體包含至少一種雜交探針。
21.權(quán)利要求20的用途，其中所述特異性結(jié)合配偶體包含至少一種雜交探針及至少一種引物。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述特異性結(jié)合配偶體包含至少一種雜交探針及兩種引物。
23.權(quán)利要求18的用途，其中所述至少一種特異性結(jié)合配偶體包含至少一種特異性配體、特別是抗體或親和性蛋白。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述特異性結(jié)合配偶體包含至少兩種特異性配體、特別是兩種抗體或兩種親和性蛋白或一種抗體及一種親和性蛋白。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103443295SQ201280015168
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月25日
【發(fā)明者】葉迅, 吳非, 徐清華, 劉芳, 孟夏, B·穆然 申請(qǐng)人:生物梅里埃公司