核酸的定量、高度多重檢測的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了在多重的單個腔室反應中檢測和定量樣品中靶標核酸的方法。提供了把信號背景優(yōu)化降低到接近高效陣列的耗材整合腔室，及其使用方法。本發(fā)明的特征是設置成使用所述耗材以實施所述方法的裝置和系統(tǒng)。
【專利說明】核酸的定量、高度多重檢測[0001 ] 聯(lián)邦資助的研究與開發(fā)下作出發(fā)明的權利聲明
[0002]本發(fā)明是在美國國土安全部第HSHQDC-10-C-00053號基金資助下進行。政府對本發(fā)明擁有某些權利。
[0003]相關申請的交叉參考
[0004]本申請涉及2011年2月18日提交的美國臨時專利申請第61/463，580號和2011年11月17日提交的美國臨時專利申請第61/561，198號的優(yōu)先權，所述專利申請通過引用全文納入本文以用于所有目的。
【技術領域】
[0005]本發(fā)明是實時DNA擴增、檢測和定量的領域，以及相關耗材(consumable)、裝置和系統(tǒng)(包含陣列)。
技術背景
[0006]實時PCR通常用于生物樣品中感興趣核酸的檢測。實時PCR的綜述見例如MTevfikDorak (編者)(2OO6) Real-time PCR(Advanced Methods)(實時 PCR (高級方法))TF公司(Taylor&Francis)，第一版 ISBN-10:041537734X ISBN-13:978-0415377348，和 Logan等(編者)(2009) Real-Time PCR:Current Technology and Applications (實時 PCR:現(xiàn)有技術和應用)，Caister 學術出版社，第一版 ISBN-10:1904455395，ISBN-13:978-1904455394。其他細節(jié)也見例如 Gelfand 等，“Homogeneous Assay System Using The NucleaseActivity of A Nucleic Acid Polymerase (使用核酸聚合酶的核酸酶活性的均勻測試系統(tǒng))，，USP5, 210，015; Leone 等，(1995) " Molecular beacon probes combined withamplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA (分子信標探針與NASBA擴增的結合能均勻 實時檢測RNA) " Nucleic Acids Res.26:2150-2155;和 Tyagi 和 Kramer (1996) “Molecular beacons: probes that fluoresce uponhybridization (分子信標:基于雜交的突光探針)’^Nature Biotechnologyl4:303-308。通常，用于在單反應容器(如多孔板的孔)中檢測各樣品多于一個靶標核酸的單細胞多重技術(multiplexing)，這是使用對各擴增子特異性的自體淬滅PCR探針例如TAQMAN?或分子信標探針來實現(xiàn)。一旦在溶液中結合擴增子，或一旦PCR中探針的降解，所述探針不淬滅(unquench)，而生成檢測信號。所述探針用不同波長的熒光團標記，使得多重技術在單個“單罐式”反應中多至約5個靶標。由于實踐光譜范圍和標記釋放限制，難于實現(xiàn)各反應多于約5個探針。這嚴重限制了單個反應的多重技術，進而嚴重限制了各樣品能篩選多少個靶標和提高了在檢測感興趣多個靶標中的成本和設備復雜性。
[0007]核酸陣列代表多重檢測擴增產(chǎn)物的另一種方法。更常見地，在樣品上進行擴增反應，并且擴增子在核酸陣列上分別檢測。例如Sorge“Methods for Detection of a TargetNucleic Acid Using A Probe Comprising Secondary Structure (使用包含二級結構探針檢測靶標核酸的方法)”US 6，350，580提出了通過從擴增混合物中純化探針并且檢測探針來捕獲基于擴增釋放的探針。這種生成和檢測擴增子的多重步驟方法使得實時分析擴增混合物是不現(xiàn)實的。
[0008]也提出了在捕獲核酸存在下擴增反應物的多種方法。例如，Kleiber等“Integrated Method and System for Amplifying And Detecting Nucleic Acids (擴增和檢測核酸的整體方法和系統(tǒng))”US 6, 270, 965,提出了通過逐漸消失(evanescence)誘導的突光來檢測擴增子。相似地，Alexandre 等“Identification and Quantification of aPlurality of Biological (Micro) Organisms or Their Components (多種(微)生物體或其成分的鑒定和定量)"US 7，829，313，提出了在陣列上檢測擴增子。在另一個示例中，通過檢測擴增生成的探針片段來檢測靶標多核苷酸，所述檢測例如通過結合電極，然后電化學檢測。見例如 Aivazachvilli 等，“Detection of Nucleic Acid Amplification (核酸擴增的檢測)，，US 2007/0099211 ;Aivazachvilli 等，“Systems and Methods for DetectingNucleic Acids (檢測核酸的系統(tǒng)和方法)” US 2008/0193940，和 Scaboo 等，“Methods AndSystems for Detecting Nucleic Acids (檢測核酸的方法和系統(tǒng))” US 2008/0241838。
[0009]所有這些方法的缺陷在于限制其用于多重靶標核酸檢測的現(xiàn)實限制性。例如Kleiber (US 6270, 965)依靠逐漸消失(evanescence)誘導的突光以在陣列表面檢測擴增子的熒光，并且需要復雜和昂貴的光學器和陣列。Alexandre (7，829，313)提出在陣列上檢測擴增子；如Kleiber所述，這顯著增加了陣列成本，因為必需設置設計各陣列以檢測各擴增子。如Alexandre所述，實踐中，在陣列上對不同的擴增子難于實現(xiàn)相似的雜交動力學，特別是當擴增子相對較大時。另外，本領域?qū)﹃嚵?在陣列上有也包含高水平信號背景的伴隨溶液相)或者在通過原位熱循環(huán)保持穩(wěn)定的陣列上如何檢測信號幾乎沒有提供引導。
[0010]本發(fā)明克服了本領域中這些問題和其他問題。通過完整閱讀以下內(nèi)容可以更完整地理解本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明提供了能高度多重`檢測感興趣核酸的方法及相關裝置、系統(tǒng)和耗材，所述檢測例如檢測病毒、細菌、瘧原蟲(Plasmodium)屬、真菌或生物樣品中的其他病原體。所述耗材包含在其腔室內(nèi)表面有高效熱穩(wěn)定核酸檢測陣列的信號優(yōu)化腔室。所述陣列設置成檢測多至約100種或更多種不同通用標記的探針。所述方法在感興趣核酸部分擴增中生成標記的通用探針(如“探針片段”)，所述擴增反應在腔室中進行。所述通用探針在一些擴增循環(huán)后與陣列雜交，并且然后選擇擴增循環(huán)，使得在樣品中實時檢測和擴增一種或多種感興趣核酸。因此，在第一個方面，提供了檢測靶標核酸的方法。這包含了提供在腔室的至少一個表面上有至少一種高效核酸檢測陣列的檢測腔室。所述高效陣列通常包含非速率限制(non-rate limiting)數(shù)量的捕獲核酸,使得增加了腔室中反應生成的可檢測探針片段的捕獲速率，并且所述捕獲核酸設置成捕獲相對小的探針核酸，這也增加了陣列效率。探針與陣列的結合檢測優(yōu)選在選擇或設置降低所述陣列附近的背景信號水平(如沒有結合的游離探針)的條件下進行。例如，在某些實施方式中，設置腔室本身以把信號背景降低成接近陣列背景，例如通過定型腔室以降低背景(如通過將腔室制成與接近陣列的相對薄的腔室，所述腔室通常是陣列上約500 μ m或更薄)。較薄的腔室也有較少的熱質(zhì)量，并且相較較厚的腔室，其溫度循環(huán)更快和更有效。下面詳細討論了把所述系統(tǒng)和方法設置成降低背景信號水平的其他方式。
[0012]有一個或多個拷貝要檢測的靶標核酸的樣品加載到所述檢測腔室中。所述擴增引物和標記探針與一個或多個靶標核酸拷貝雜交。在擴增引物依賴的擴增反應中擴增至少一個或多個靶標核酸拷貝的一部分。所述擴增反應造成剪切標記探針，例如由于擴增酶的核酸酶活性。這造成標記探針片段的釋放，其可以由所述陣列檢測。所述標記的探針片段與高效陣列雜交(通常在進行一些擴增循環(huán)以擴增腔室中釋放的探針片段數(shù)量之后)。然后檢測標記探針片段和陣列結合生成的標記信號，從而檢測所述靶標核酸。
[0013]能改變所述檢測腔室的精確設置。選擇所述設置以把腔室中的信號背景降低到接近陣列的程度。通常，腔室中至少1%并且經(jīng)常約5%或更高的信號在陣列區(qū)域中的陣列中濃縮(如約6%、8%或甚至10%或更多)。盡管經(jīng)常需要更低水平，總體信號99%或更少的背景能通過系統(tǒng)標準化。在本文所述常見實施方式中，通過把腔室優(yōu)化設置成接近陣列的程度以達到95%或更小的背景水平。例如通過保持腔室厚度高于陣列最小值來實現(xiàn)這種設置優(yōu)化。在典型實施方式中，所述腔室的厚度或其他接近陣列的尺寸小于約1_，更常見在至少一個接近陣列的尺寸上是約500 μ m或更小,優(yōu)選約250 μ m或更小,例如約10 μ m_約200 μ m之間，并且在一些實施方式中，所述腔室接近陣列的尺寸是約150 μ m。在本文一個實施例中，所述腔室的厚度高于所述陣列約142μπι。在本文另一個實施例中，所述腔室厚度約100 μ m。相關腔室尺寸取決于檢測系統(tǒng)中信號檢測路徑，例如當光通過陣列以生成所述信號時，其中一些光從陣列溢出并且進入陣列上的液體中，所述相關尺寸是陣列上腔室的厚度。除了降低要檢測的背景信號的水平，降低腔室厚度也有降低背景噪音成分影響的優(yōu)勢，例如反應流體的陣列點信號和背景信號的特異性檢測無關的檢測器反應。特別地，一個主要的噪音來源是使用的檢測器的散射噪音，其通常隨著要檢測的總信號量平方根而增加，所述平方根然后與所述反應器腔室的厚度相稱。因而，通過降低反應腔室的厚度，降低背景噪音，并且隨后增加整體系統(tǒng)的信號與背噪之比(signal to backgound noise ratio)(SNR)。其他可能的噪音來源包含檢測過量的光，如未過濾的激發(fā)光、非預期的環(huán)境光、散射熒光、系統(tǒng)組分的自發(fā)熒光等。很多這種噪音來源可以通過傳統(tǒng)方法減輕，例如通過使用合適的光學過濾器(如消除或降低過 量激發(fā)光)、在檢測器上降低或防止環(huán)境光的封閉的光學系統(tǒng)、和通過設置陣列點的大小和位置以降低或消除檢測器上的信號交互作用。在特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明所述測試方法和系統(tǒng)的SNR通常是2.5或更大，優(yōu)選大于3、大于4、大于
5、大I于O,并且在一些不例中大于20或更大。
[0014]也能在與本發(fā)明裝置和方法聯(lián)用中使用設置本發(fā)明系統(tǒng)和方法以降低背景信號的替代或其他方法。例如，可以使用全內(nèi)反射熒光顯微術(“TIRF”)設置本發(fā)明裝置和系統(tǒng)以向捕獲陣列提供激發(fā)光照，其中激發(fā)光定位到捕獲陣列下面的基材上，從而其全部內(nèi)發(fā)射(見 M.Tokunaga 等，Biochem.and Biophys.Res.Comm.235, 47 (1997)和 P.Ambrose, Cytometry, 36，244(1999))。盡管如此，在陣列的基材一液體界面生成漸消波，所述漸消波離開表面后指數(shù)衰減，造成臨近表面如IOOnm厚度的有效光照，在剩余溶液中沒有激發(fā)的熒光團。
[0015]在另一個替代或其他方案中，設置本發(fā)明分析方法中使用的反應物以降低相對于實際探針/陣列結合信號的背景信號。例如，可以通過在捕獲陣列探針和標記探針片段上使用協(xié)同熒光團(如FRET構建物)以降低背景信號。尤其是，有第一激發(fā)光譜和第一發(fā)射光譜的供體熒光團可以與捕獲探針或標記的探針片段之一偶聯(lián)。有與供體發(fā)射光譜重疊的激發(fā)光譜、并且不同于供體激發(fā)光譜的受體熒光團與其他探針偶聯(lián)。當捕獲探針和標記探針片段雜交時，所述供體和受體引入足夠近的能量轉(zhuǎn)移距離以生成響應受體熒光團發(fā)射光譜的不同的熒光信號。通過設置光學系統(tǒng)以僅在供體激發(fā)光譜中激發(fā)和過濾供體的發(fā)射光譜，能選擇性檢測雜交后從受體能量轉(zhuǎn)移信號生成的信號。預先描述了各種FRET標記對(見例如Waggoner的美國專利號6，008，373和Lee等的7，449，298)。應理解，本發(fā)明中可以使用很多方法以降低相對于結合背景探針片段檢測信號、反應溶液中未結合的完整標記探針信號或背景信號的影響，例如包含設置反應腔室以濃縮檢測器焦平面內(nèi)的信號，使用當與陣列結合對比溶液中未結合探針時有與不同發(fā)射光譜的交互式標記技術，或者當在相同完整探針中存在對比剪切探針片段中分離時有熒光降低的自體淬滅探針。
[0016]如所述，陣列通常包含非速率限制數(shù)量的與標記探針片段雜交的捕獲探針。這意味著所述擴增反應在擴增中生成大量探針片段，造成了反應混合物中探針片段濃度不能滿足陣列上可用于結合探針片段的位點數(shù)量(如可用的互補捕獲核酸)。再次聲明，陣列上結合位點的數(shù)目保持過量，并且優(yōu)選過量很多，可以在擴增反應中生成的探針片段濃度中飽和。因為陣列上位點的數(shù)目是非速率限制性的，優(yōu)化了陣列上探針片段與溶液中背景探針片段的比率。典型陣列密度是約350fmol/cm2或更大，如約2，000fmol/cm2或更大、
2,500fmol/cm2 或更大、3，OOOfmol/cm2 或更大、4，OOOfmol/cm2 或更大、4，500 f mo I/ cm2 或更大、或者5，OOOfmoVcm2或更大。在一些實施方式中，結合陣列上探針的位點數(shù)目是可以在擴增生成的探針片段濃度中飽和的位點數(shù)目的至少IX，并且可選5X、10X、50X或更多。所述比率可以隨著擴增循環(huán)數(shù)目和生成的探針量而變化。所述陣列效率也是要捕獲的探針片段長度的函數(shù)。盡管所述探針必需足夠長以在雜交給定Tm下結合，更短片段通常顯示更有效的雜交。通常陣列要捕獲的探針片段長度是約50個核苷酸或更短；所述陣列包含對應互補捕獲核酸序列的位點(所述捕獲核酸也能可選包含其他序列，如表面上間隔互補位點，如降低表面影響的序列)。更典型地，所述探針和捕獲序列長度是約40個核苷酸或更短，如長度約30、約20或約15個核苷 酸或更短。
[0017]在一些示例中，選擇用于給定分析的所述捕獲陣列探針和互補標記探針片段，從而提供了超過陣列所有數(shù)目的窄范圍Tm。特別地，為了確保與捕獲陣列的最優(yōu)和穩(wěn)定的雜交，給定陣列中所述捕獲探針各自Tm是所述陣列其他成員的約10°C內(nèi)，并且優(yōu)選所述陣列的各自其他探針的約7°C、5°C或:TC內(nèi)。這樣窄的Tm范圍使得穩(wěn)定雜交，并且所得信號生成涵蓋陣列的所有成員。
[0018]在典型實施方式中，所述雜交溫度小于擴增反應的溫度，所以所述捕獲核酸的探針片段Tm能小于探針的分子內(nèi)Tm (如當探針包含淬滅劑以降低背景時)，和/或低于靶標核酸探針的Tm。在典型熱循環(huán)實施方式中，這是在高于雜交步驟的溫度下進行的擴增反應；因此所述靶標核酸探針通常有比陣列探針片段更高的Tm。所述標記探針通常包含與所述靶標核酸不互補的第一正交折翼；所述折翼從所述標記探針上剪切下以生成標記探針片段。所述標記探針可選包含如偶聯(lián)到淬滅劑部分的第二正交折翼，所述第二正交折翼至少與第一折翼部分互補(如提供第一折翼上標記的鄰近淬滅)。當?shù)诙垡斫Y合第一折翼的Tm高于所述第一折翼結合陣列的Tm時，背景降低。在這種設置中，所述延伸反應在第一溫度發(fā)生，即低于所述靶標核酸的完整探針的Tm，但是高于完整探針的分子內(nèi)Tm和陣列上捕獲探針的探針片段的Tm)。延伸后，隨著反應溫度降低，其低于探針的分子內(nèi)Tm，使得形成所述探針的二級結構，并且造成熒光團的淬滅。再冷卻到低于捕獲探針的探針片段Tm，使得探針片段與陣列雜交，并且檢測其相關的熒光團。因為所述完整探針先形成其二級結構，其較不可能結合到捕獲探針或淬滅，因而降低了完整探針的非預期的捕獲和溶液中完整探針上存在的熒光團的背景信號(或其可以結合到捕獲探針陣列上)。盡管在某些方面，在本發(fā)明完整探針上使用淬滅劑，在某些實施方式中，令人驚訝地測定了所述探針上不需要淬滅劑，因為甚至當探針沒有淬滅劑背景增加時，最優(yōu)腔室設計和高效陣列能區(qū)分陣列信號和背景。
[0019]在其他實施方式中，設計或選擇Tni高于延伸反應溫度(如高10度或更多)的標記探針片段和其互補捕獲核酸。因此，當例如在55° -60°C下進行延伸實驗時，所述標記探針片段和捕獲核酸的Tm通常是例如71°C。這種示例中，標記探針片段與陣列上捕獲核酸的雜交在延伸反應相同溫度下進行，避免了進一步降低溫度以雜交所述陣列和檢測所得信號的需要。結果，可以使用兩步溫度法而不是三步法。
[0020]在完整標記探針背景下，正交標記探針片段相對于結合靶標序列探針部分的方向是可以變化的。特別地，釋放的標記探針片段可以與陣列上的捕獲探針雜交，在所述雜交方向中從所述探針的靶標特異部分剪切的末端在捕獲探針偶聯(lián)到陣列表面位點的近端或遠端。在一些示例中，例如通過確保任意完整探針僅結合到捕獲探針上(所述結合方向使探針的靶標特異性部分朝向陣列表面)，然后可以利用與所述結合的潛在表面干擾以進一步降低所述陣列的完整探針不需要捕獲的可能。這種方法在陣列上固體表面示例中特別有用，例如二氧化硅基材等。
[0021]根據(jù)耗材的精確設置，樣品能以任意多種機制載入到腔室中。在一個方便應用中，通過與腔室可操作連通的至少一個艙門或流體通道來加載樣品。例如，能在耗材頂表面制成艙門，所述艙門朝向所述腔室。這提供了例如通過移液管或其他液體遞送裝置的簡化的加載。或者，流體或微流體通道、毛細管等能用于樣品遞送。
[0022]所述方法能用于檢測樣品中感興趣核酸和/或如實時定量核酸。因此，一方面，在檢測信號前多種擴增循環(huán)中可選擴增`所述靶標核酸，信號檢測后即標記附加探針拷貝存在時再擴增靶標核酸部分。所得的釋放標記探針片段然后與陣列雜交并且檢測，檢測的信號強度與樣品中存在的靶標核酸的存在和/或數(shù)量相關聯(lián)。通常，所述樣品在起始檢測前擴增多于I輪循環(huán)，以通過增加擴增釋放的探針片段數(shù)量來增加信號水平。例如，陣列中檢測信號前，所述靶標核酸能可選擴增至少如2、3、4、5輪或更多輪擴增循環(huán)。
[0023]所述標記探針通常包含熒光或發(fā)光標記，盡管也能使用其他標記例如量子點。在一個優(yōu)選實施方式中，所述標記是熒光染料。所述探針片段生成的信號通常是光學信號。所述標記探針可選包含標記和標記淬滅劑；標記探針被切斷造成所述標記和淬滅劑的分離，因而不淬滅所述標記。然而，如上述，在實踐本發(fā)明中不需要淬滅劑。
[0024]信號通常通過檢測對應探針或探針片段上光學標記的一種或多種光學信號波長來檢測。因為陣列上探針片段的結合位點能用于區(qū)分不同探針，不需要在不同探針上使用不同標記以區(qū)分多重擴增反應中的探針(如果樣品中存在多于一個靶標時，設計擴增多個靶標核酸的擴增反應)。然而，多個探針標記能用于增強多重能力。當使用多個探針時，檢測信號檢測能包含檢測從多種不同標記生成的多種信號的多種光學信號波長(如不同探針上的不同熒光染料部分)。[0025]盡管通常與結合陣列的探針片段相連接的標記組(如標記探針片段)來描述，應理解可以使用不需要使用預先標記的探針的其他檢測方案。例如，在一些實施方式中，可以使用插入染料。插入染料通常一旦整合到或插入到雙鏈核酸上后提供檢測信號事件。在本發(fā)明中，陣列上所述剪切探針片段與互補探針的雜交生成了陣列表面的雙鏈體，所述雙鏈體可以整合到插入染料上，并且提供指示雜交的獨特信號。插入染料為本領域熟知，并且包含描述于如 Gudnason 等，Nucleic Acids Research, (2007),第 35 卷，第 19, el27 中的那些，其通過引用納入本文以用于所有目的。相似地，盡管特別優(yōu)選光學信號檢測方法，所述探針設計和測試方法也可以通常使用非光學標記和/或檢測方法進行，例如使用電化學檢測方法，如ChemFETS、ISFETS等，可選與電化學標記基團聯(lián)用，如有大帶電基團以擴增探針片段與陣列探針在檢測器表面或其附近雜交的檢測。
[0026]能就陣列的一個或多個區(qū)域檢測局部背景，信號強度測量值通過所述背景校正來標準化。通常，所述標準化的信號強度小于總體信號的10%，如總體信號的約1-約10%。在實施方式的一類示例中，所述標準化的信號強度是總體信號的約4-約7%。通常，當約1%或更多信號定位到陣列時，如當約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多信號定位到陣列上腔室區(qū)域，可以從背景中區(qū)分陣列信號?？赡軈^(qū)分更低水平信號和背景，但是通常不優(yōu)選這樣。所述方法也能包含通過對陣列上捕獲核酸點樣差異(如通過校正點大小和/或點密度)、或?qū)﹃嚵胁煌瑓^(qū)域的視野不等進行校正，來標準化信號強度。
[0027]本發(fā)明的優(yōu)選方面是在樣品中能同時檢測多個靶標核酸。所述樣品可以有一個或多個靶標核酸，所述陣列包含能在每個樣品中檢測多于一個靶標的多種捕獲核酸類型。所述捕獲核酸類型在陣列上空間分隔，不需要使用多個標記(盡管如上述能使用多個標記)。在多重方案中，各自對不同核酸靶標特異的多種擴增探針與樣品一起孵育，所述樣品能包含一個或多個靶標核酸。例如，能是約5-約100種或更多種捕獲核酸類型。要檢測的各潛在靶標也會使用不同的探針，如在擴增反應中可選約5-約100種或更多種標記探針類型，各自對潛在的感興趣靶標特異。所述陣列包含對應的捕獲核酸，如約5-100種或更多種捕獲核酸類型。這使得由陣列檢測和處理對應的大量信號。例如，探針片段和陣列雜交后，能根據(jù)陣列上信號位點檢測約5-約100種或更多種不同的信號。應理解，通常在單個反應體積內(nèi)多重的不同擴增反應的數(shù)目能 指示陣列上捕獲探針類型的數(shù)目。然而，有較大數(shù)量不同捕獲探針(如大于100、大于1000、10，000種或更多種捕獲探針類型)的捕獲陣列也能在一些情況中使用，例如當通過陣列調(diào)查等收集擴增反應。
[0028]本發(fā)明的優(yōu)勢是一種捕獲陣列設置可以用于多種不同的靶標核酸序列組。特別地，第一組的探針組會包含探針，所述探針有對組中靶標特異的第一靶標特異性位點，和與捕獲陣列上單個探針互補的第二捕獲部分。第二個不同組的探針組(部分重疊或完全不同)會包含所述組的靶標特異性部分，而所述捕獲部分與第一組探針組相同。再次聲明，對任意靶標組而言，所述探針組包含用于所述組探針的半固定部分，所述部分總是與所述捕獲陣列成員互補。所述探針也包含就靶標核酸特異組選擇的可變部分。例如，在分析過程中，當?shù)谝唤M中各探針有對應捕獲探針陣列上不同捕獲探針的第一固定部分時，使用第一組探針。各探針也包含與第一組中給定靶標序列互補的靶標特異部分。就第二組而言，當所述組中各探針包含相同第一固定部分但是有對組中靶標特異的第二靶標特異部分時，使用第二組探針。[0029]參照圖1A，標記探針的部分A對應可變部分，而部分B可以對應與陣列上探針互補的固定部分。使用通用的或常見的捕獲陣列和捕獲探針組使得生產(chǎn)本發(fā)明使用的耗材更有效并且成本更低。
[0030]因此，在一個樣品包含多個靶標核酸的實施方式中，所述方法包含將各自對不同靶標核酸特異的多種標記探針與靶標核酸孵育。在擴增引物依賴的擴增反應中擴增至少一部分靶標核酸剪切多種靶標探針類型和釋放多種標記探針片段類型。多種探針片段類型與陣列雜交。不同的探針片段類型各自分別與不同空間位置的捕獲核酸類型雜交。檢測標記信號包含檢測來自多個不同空間區(qū)域的多種標記信號，所述多個不同區(qū)域分別對應陣列上不同空間位置的多種捕獲核酸?？蛇x地，在數(shù)個優(yōu)選實施方式中，所述標記探針類型包含相同標記部分，但是其他多重和/或使用不同對照或?qū)?registration)探針能包含使用多種不同的標記部分。通常，所述多種標記探針類型能包含一種或多種不同的標記部分，不同標記部分的數(shù)目小于標記探針類型的數(shù)目。
[0031]進行所述方法的裝置和系統(tǒng)是本發(fā)明的特性。所述裝置和系統(tǒng)能包含在所述腔室的至少一個表面上包含至少一種高效核酸檢測陣列的檢測腔室。如方法所述，所述腔室的構造降低相對于陣列信號的背景信號。所述裝置和系統(tǒng)通常包含操作性連接到檢測腔室的熱調(diào)節(jié)模塊，其在裝置運行中調(diào)節(jié)腔室內(nèi)溫度。光學系統(tǒng)檢測所述裝置運行中陣列生成的信號。
[0032]對所述裝置可選應用參照方法所述的腔室降低背景的所有三維特性。例如，所述裝置在至少一個緯度上靠近所述陣列且該緯度的厚度小于約500 μ m,如至少一個緯度上靠近所述陣列的厚度約IOym-約200μπι。所述陣列形成的腔室表面能由任意合適材料組成，例如陶瓷、玻璃、石英或聚合物。在如使用落射熒光的數(shù)個實施方式中，所述表面至少部分透明。
[0033]如方法所述，通常在裝置操作中捕獲核酸在陣列上以非速率限制性的密度存在。所述陣列可選包含多種捕獲核酸類型，如定位在陣列不同空間區(qū)域上。例如，所述陣列上能存在5種或更多種不同捕獲核酸類型，如多至約100種或更多種不同類型。所述捕獲核酸可選偶聯(lián)到腔室表面的熱穩(wěn)定涂層上，以幫助陣列的熱循環(huán)。示例性涂層能可選包含:化學反應基團、未電基團、NHS酷、四氣苯基酷或五氣苯基酷、單硝基苯基酷或二硝基苯基酷、硫酷、異氰酸酯、異硫氰酸酯、?；B氮、環(huán)氧、氮雜環(huán)丙烷、醛、α，β_不飽和酮或包含乙烯酮或馬來酰亞胺的酰胺、?；u化物、磺酰鹵、亞酰胺、環(huán)酸酐、環(huán)加成反應中的活性基團、烯烴、二烯、炔烴、疊氮化物或其組合。
[0034]所述熱調(diào)節(jié)模塊可選包含幫助熱循環(huán)的結構(feature),例如熱電模塊、Peltier裝置、冷卻風扇、散熱器、設置成與所述腔室外表面部分配對的金屬墊片。通常，所述熱調(diào)節(jié)模塊有反饋控制系統(tǒng)，所述系統(tǒng)操作性連接到計算機上，所述計算機控制模塊或是模塊的一部分。
[0035]所述光學系統(tǒng)能包含或操作性連接到落射熒光檢測系統(tǒng)上。通常光學系統(tǒng)包含任意下列組件:激發(fā)光源、弧光燈、汞弧光燈、LED、透鏡、光學過濾器、棱鏡、相機、光檢測器、CMOS相機、和/或CCD陣列。所述裝置也能包含或偶聯(lián)到陣列讀數(shù)模塊上，所述模塊使陣列上信號與要檢測的核酸相關聯(lián)。
[0036]所述裝置或系統(tǒng)包含或操作性連接到如在計算機或計算機可讀介質(zhì)中實施的系統(tǒng)指令。所述指令能控制所述裝置和系統(tǒng)的任意方面，如信號強度的一種或多種測量與熱調(diào)節(jié)模塊進行的很多擴增循環(huán)相關聯(lián)，以測定所述裝置檢測的靶標核酸的濃度。
[0037]系統(tǒng)能包含如操作性連接到計算機的所述裝置。所述計算機包含控制熱調(diào)劑模塊進行的熱循環(huán)并指明光學系統(tǒng)何時成像何時讀圖的指令，和/或把圖片信息轉(zhuǎn)化成時間函數(shù)的信號強度曲線，測定由所述裝置分析的靶標核酸的濃度的指令等等。所述計算機能包含用背景信號強度標準化的指令，如就陣列的一個或多個區(qū)域檢測局部背景，以及通過較正所述背景來標準化陣列信號強度測量值。相似地，所述計算機能包含通過對陣列上捕獲核酸點樣差異、或?qū)﹃嚵胁煌瑓^(qū)域的視野不等進行校正，來標準化信號強度的指令。
[0038]所述發(fā)明一方面包含如與本發(fā)明裝置和系統(tǒng)使用的核酸檢測耗材，以用于實踐本發(fā)明方法。所述耗材能包含例如小于約500 μ m厚度的薄腔室，其中所述腔室包含光學透明窗，所述窗在窗內(nèi)表面設置有高效捕獲核酸陣列。所述耗材也能包含與所述腔室流體相通的至少一個試劑遞送端口。通常，所述耗材的構造使所述腔室中的流體熱循環(huán)。
[0039]關于上述本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法背景中陣列和腔室的所有特性也使用于耗材(并且反之亦然)。例如，所述核酸陣列能包含多種不同捕獲核酸類型，所述類型位于陣列的不同空間區(qū)域上。捕獲核酸的密度能是約例如2，000fmol/cm2或更大、2，500fmol/cm2或更大、3，OOOfmol/cm2 或更大、4，OOOfmol/cm2 或更大、4，500fmol/cm2 或更大、或者 5，OOOfmol/cm2或更大。
[0040]相似地，所述腔室能包含含有試劑遞送端口的第一上表面，和含有所述窗的底部透明表面，例如其中所述頂表面和底表面通過壓敏粘合材料形成的側(cè)壁結合。也能使用結合頂表面和底表面以形成腔室的其他結構。例如，所述頂表面和底表面能通過上表面和/或下表面上的襯墊或特形結構結合。所述襯墊或結構可選融合或附著到上表面和/或下表面上的相應區(qū)域。在一些實施方式中，所述襯墊或結構指導UV可固化粘合劑的流動，所述粘合劑在上表面和下表面之間流動，并且接受UV光，因而使所述上表面和下表面彼此結合。在其他實施方式中，所述 上表面和下表面能超聲融合在一起，所述襯墊或結構劃定融合區(qū)域的界限。在另一個實施例中，所述結構是上表面或下表面上的透明區(qū)域，和關聯(lián)的上表面或下表面上的對應陰影區(qū)域。在這個實施方式中，所述上表面或下表面能通過指導激光通過透明區(qū)域并且到陰影區(qū)域的激光焊接在一起。
[0041]所述捕獲核酸陣列通常偶聯(lián)到窗口的熱穩(wěn)定涂層上。例如，所述涂層能可選包含:化學反應基團、親電基團、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、單硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、?；B氮、環(huán)氧、氮雜環(huán)丙烷、醛、α，β-不飽和酮或包含乙烯酮或馬來酰亞胺的酰胺、?；u化物、磺酰鹵、亞酰胺、環(huán)酸酐、環(huán)加成反應中的活性基團、烯烴、二烯、炔烴、疊氮化物或其組合。所述窗本身能包含例如玻璃、石英、陶瓷、聚合物或其他透明材料。
[0042]關于上述方法、系統(tǒng)和裝置的所有特性能應用于設置耗材中所述腔室。例如，所述腔室厚度能是約10 μ m -約200 μ m,如厚度約140 μ m。所述腔室的其他尺寸更寬得多，如平均直徑約Imm-約50mm。在一個特定實施方式中，所述腔室的平均直徑約IOmm-約20mm。
[0043]本發(fā)明包含試劑盒，所述試劑盒如包含本發(fā)明的耗材。所述試劑盒也能包含包裝材料、實施所述方法的說明書、對照試劑(如結合到耗材陣列的對照位點上的如對照模板、探針或引物)。[0044]所述方法、系統(tǒng)、裝置、耗材和試劑盒也可以組合使用以實施本發(fā)明的方法，如所述試劑盒提供了在本發(fā)明系統(tǒng)或裝置中使用的耗材。除非另有表述，本發(fā)明步驟可選有所述系統(tǒng)、裝置、耗材或試劑盒中相應的結構特性，并且反之亦然。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1A和IB是本發(fā)明PCR探針的示意圖。
[0046]圖2是本發(fā)明PCR腔室的示意圖。
[0047]圖3顯示了三步擴增反應的拷貝數(shù)目滴定的基于陣列的實時PCR曲線。
[0048]圖4顯示了溶液等分試樣生成的基于溶液的實時PCR曲線。[0049]圖5顯示了未淬滅探針生成的基于陣列的實時PCR曲線。
[0050]圖6顯示了多重擴增的實時PCR曲線。
[0051]圖7顯示了沒有靶標加入的10重反應的基于陣列的實時PCR曲線。
[0052]圖8顯示了在各自IO4個拷貝上存在的10重的組和3個靶標的基于陣列的實時PCR曲線。
[0053]圖9顯示了 5’折翼模擬雜交的實時動力學。
[0054]圖10是方法示意圖。
[0055]圖11是系統(tǒng)示意圖。
[0056]圖12顯示了兩步擴增反應的拷貝數(shù)目滴定的基于陣列的實時PCR曲線。
[0057]圖13顯示了反應腔室厚度跟信號一背景比的關系。
[0058]圖14顯示了本發(fā)明的移動基材實施方式的整體檢測系統(tǒng)。
[0059]發(fā)明詳述
[0060]進行靶標核酸擴增、檢測和實時定量的方法是本發(fā)明的特性。在所述方法中，靶標核酸的擴增釋放與陣列雜交的靶標特異性標記的探針片段；當發(fā)生擴增時，所述陣列在腔室中分布。從所述陣列檢測信號，提供了靶標核酸的檢測和實時定量。
[0061]本發(fā)明也提供了反應腔室，通常的形式是腔室中包含核酸檢測陣列的耗材，以及與所述耗材相互作用的裝置和系統(tǒng)。
[0062]方法
[0063]本發(fā)明提供了在樣品中實時檢測和定量一個或多個靶標核酸的方法。所述方法高度適合多重技術，相較使用可用的溶液實時核酸檢測方法所獲得，所述方法使得用一個腔室反應和檢測而特異性檢測和定量更大量的不同靶標核酸。這是因為本發(fā)明使用基于陣列來檢測分析物(所述陣列與所述分析物接觸)，而不是溶液相光譜檢測。相較于區(qū)分如溶液中的不同染料標記，通過陣列位點區(qū)分的核酸檢測陣列溶解分析物的能力顯著更強。通過比較，可能構建同時檢測數(shù)千種不同分析物的陣列，而通常不可能檢測溶液中多于約5種不同標記的熒光團。
[0064]圖10提供了所述方法的部分概述。如所示，引物與模板、標記探針一起雜交。所述探針包含與所述模板(“折翼”)不互補的、偶聯(lián)到標記部分的正交序列。所述探針在擴增反應中被剪切(如PCR擴增循環(huán))。在一個便利方法中，聚合酶的天然核酸酶活性用于剪切所述折翼一在這個方法中，通過聚合酶的引物延伸造成由于聚合酶的核酸酶活性而剪切折翼，因為其遇到了折翼和模板之間的連接。這釋放折翼作為標記探針片段，其然后再與陣列雜交，如通過把溫度調(diào)整到適合特異性雜交的條件。陣列上標記的檢測提供了對模板的實時檢測和定量。
[0065]通常，對要測試一個或多個靶標核酸是否存在的樣品進行擴增反應。所述反應能易于用多重技術以在單個反應腔室中擴增、檢測和定量約10-約100種或更多種不同核酸。例如，單個擴增/檢測腔室中能檢測約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、或約100種或更多種核酸。本文下面顯示了在反應/檢測腔室中同時擴增、檢測和定量10種不同靶標核酸的工作實例。這個實施例和本方法的容量超過傳統(tǒng)空間限制的、基于溶液多重檢測的容量。
[0066]在這個方法中，要檢測的各靶標核酸使用至少一種、并且通常兩種擴增引物來特異性擴增(與單個引物相比，使用兩種引物增加反應的特異性，并且加速產(chǎn)物形成速率)。所述引物通常在樣品中與靶標核酸特異性雜交，并且使用聚合酶如在標準聚合酶鏈反應(PCR)中延伸。按照已知方法來設計和構建能用于擴增感興趣靶標核酸的擴增引物。關于PCR 引物設計的細節(jié)，見例如 Anton Yuryev (編者)(2007) PCR Primer Design (Methods inMolecular Biology) [PCR引物設計(分子生物學方法)][精裝書]Humana出版公司?’第I版，ISBN-10:158829725X, ISBN-13:978-1588297259,以及下面引用的參考文獻。
[0067]在靶標核酸上使用引物的PCR擴增能使用合適的反應條件進行，所述條件包含使用標準的擴增緩沖液、酶、溫度和循環(huán)次數(shù)。對PCR技術的綜述，包含雜交條件、緩沖液、試劑、反應循環(huán)次數(shù)等，見例如Yuryev (如上)，van Pelt-Verkuil等，(2010)Principlesand Technical Aspects of PCR Amplif ication (PCR 擴增的原理和技術方面)Springer出版社；第 I 版，ISBN-10:9048175798, ISBN-13:978-9048175796 ;Bustin (編)(2009) ThePCR Revolution:Basic Technologies and Applications (PCR 革命:基本技術和引用)，劍橋大學出版社(Cambridge University Press);第 I 版，ISBN_10:0521882311, ISBN-13:978-0521882316;Viljoen 等，(2005)Molecular Diagnostic PCR Handbook (分子診斷PCR 手冊)，Springer 出版社，IS`BN1402034032; Kaufman 等，(2003) Handbook of Molecularand Cellular Methods in Biology and Medicine (生物學和醫(yī)學中分子和細胞方法手冊)第 2 版，Ceske (編)CRC 出版社(Kaufman) ; The Nucleic Acid Protocols Handbook(核酸方法手冊)Ralph Rapley(編)(2000)冷泉港實驗室出版社，Humana出版社公司(Rapley) ; Chen 等(編)PCR Cloning Protocols (PCR 克隆方案)，第 2 版(Methods inMolecular Biology(分子生物學方法)，第 192 卷)Humana 出版社；PCR Protocols A Guideto Methods and Applications (PCR方案:方法和應用手冊)(Innis等編)，加利福尼亞州圣地亞哥市學術出版社公司(1990) (Innis)?？捎糜趯崟rPCR方法的擴增條件、引物設計和其他細節(jié)描述于例如 Logan 等(編者)(2OO9) Real-Time PCR:Current Technology andApplications (實時PCR:現(xiàn)有技術和應用)，Caister學術出版社，第I版，ISBN-10:1904455395，ISBN-13:978-1904455394,和 MTevf ikDorak (編者)(2006) Real-time PCR (AdvancedMethods)(實時 PCR (高級方法))TF 公司(Taylor&Francis)，第 I 版，ISBN-10:041537734XISBN-13:978-0415377348。
[0068]樣品中對各靶標核酸特異的標記探針與擴增引物和靶標核酸一起雜交。所述擴增反應剪切模板-雜交標記探針以釋放標記探針片段。這種標記片段然后在反應腔室中與陣列雜交，如圖10所示。[0069]圖1A顯示用于本發(fā)明方法的探針。所述探針包含與靶標核酸互補的區(qū)域A。所述探針也包含與所述IE標核酸不互補的“折翼”B。標記E連接到折翼B上。在末端顯示標記E,但是所述標記實際上能在折翼B的任何位點上存在(format)。例如,任意各種核苷酸能被標記，并且用于標準或稍微改良的核酸合成方法中以提供探針任意所需位點上的標記。
[0070]圖1A中，包含標記淬滅劑D的可選區(qū)域C與折翼B的部分互補。在合適的溶液條件下，區(qū)域C與折翼B堿基配對，把標記E引入到淬滅劑D附近，因而淬滅標記E。這降低了反應/檢測腔室中的溶液相的信號背景，但是探針淬滅對本發(fā)明實踐不是必需的。本發(fā)明一個令人驚訝的方面是能特異性檢測結合到陣列的探針片段，甚至當接近陣列的溶液有未淬滅的探針時。本文描述了這個實施方式的一個工作實施例。通常，反應/檢測腔室中使用設置降低溶液相背景的高效陣列使得在本發(fā)明的方法、耗材、裝置和系統(tǒng)的溶液中區(qū)分陣列信號和信號背景。
[0071]根據(jù)實驗設置，各種不同標記基團能用于標記標記探針。如上述，這種標記通常包含熒光標記基團，所述熒光標記基團可以包含單個熒光團或相互作用的染料對或組,如FRET對，以及供體/淬滅劑對。合適于標記核酸探針的不同突光標記基團的范圍描述于Molecular Probes Handbook (分子探針手冊)，第11版(生命技術公司(LifeTechnologies, Inc.))。
[0072]盡管本文很多討論是關于PCR擴增，但是能應用到其他擴增。例如，能使用涉及與擴增反應偶聯(lián)的剪切反應的多酶系統(tǒng)，例如包含易剪切切斷的鍵(參見例如 US 5, Oil, 769;US 5, 660, 988;US 5, 403, 711 ;US 6, 251, 600)和叉狀核酸結構(US
7,361, 467;US 5, 422, 253;US 7, 122, 364;US 6，692，917)的那些。也能使用與 TaqMan 樣剪切偶聯(lián)的解旋酶依賴性擴增(Tong，Y等，2008BioTechniques45:543-557)。能使用核酸序列擴增(NASBA)或連接酶鏈反應(LCR)。在NASBA方法中，所述探針能與PCR中的模板、擴增引物一起雜交。所述探針能通過逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸酶活性或加入的內(nèi)切核酸酶剪切，以與PCR中聚合酶釋放相似的 方式釋放探針片段。NASBA的一個潛在優(yōu)勢是不需要熱循環(huán)。這簡化了整體裝置和系統(tǒng)需要。對NASBA的描述見例如Compton (1991)，" Nucleicacid sequence-based amplification(基于核酸序列的擴增)"Nature350 (6313): 91 - 2。對使用NASBA檢測例如致病性核酸，參見例如Keightley等，(2005) “Real-time NASBAdetection of SARS-associated coronavirus and comparison with real-time reversetranscription-PCR (實時NASBA檢測SARS相關的冠狀病毒及與實時逆轉(zhuǎn)錄PCR的比較)”Journal of Medical Virology77 (4): 602 - 8。當使用LCR類型反應時,探針能使用內(nèi)切核酸酶剪切，而不是依賴于擴增酶核酸酶活性的剪切。
[0073]本文所述方法中，提供了在所述腔室的至少一個內(nèi)表面上有至少一種高效核酸檢測陣列的檢測腔室。所述高效陣列通常以非速率限制數(shù)量捕獲核酸，這使得在腔室中擴增反應生成的有效捕獲探針片段。設置所述捕獲核酸以捕獲相對小的探針核酸，這也增加了陣列效率。設置所述腔室以把信號背景降低到接近所述陣列，如通過使所述腔室成形以降低背景。例如，通過使得腔室薄(淺)到靠近所述陣列(如上面或下面)來降低背景；如所述腔室通常在所述陣列上面或下面約500 μ m或更薄，盡管也能使用腔室中深至Imm或更深的檢測。關于所述方法使用的耗材，下面描述了反應腔室和陣列的其他細節(jié)。
[0074]檢測陣列捕獲的信號，并且測量信號強度。信號強度與樣品中的靶標核酸的存在和/或數(shù)量相關聯(lián)。通常，所述樣品在起始檢測前擴增多于I輪循環(huán)，以通過增加擴增釋放的探針片段數(shù)量來增加信號水平。例如，陣列中檢測信號前，所述靶標核酸能可選擴增至少如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多輪擴增循環(huán)。
[0075]在一個典型實施方式中，擴增反應中，在選定的時間、溫度和擴增循環(huán)間隔從陣列捕獲熒光或其他光學圖像。分析這些圖像以測定靶標核酸是否在樣品中存在，并且提供樣品中起始靶標核酸濃度的定量。結合使用平均灰度強度測量值、背景校正和基線調(diào)整來分析圖像。在所述陣列中對各個點局部測量背景。通過測量感興趣陣列區(qū)域(如陣列點)周圍溶液的同心環(huán)的圖像強度來計算背景。然后校正各個區(qū)域的信號以計算所述區(qū)域的局部背景。還能標準化各個區(qū)域的校正信號以計算點以及視野的不均勻光照中的變化。從第一組循環(huán)(通常5-15輪循環(huán))中獲得的校正強度測量值的平均用于調(diào)整基線和標準化各個區(qū)域的測量。
[0076]關于基于擴增后信號強度測量值定量核酸方法的其他細節(jié)可以在如上面部分所述的參考文獻和 Jang B.Rampal (編者)(2010)Microarrays(微陣列):第 2卷,Applicationsand Data Analysis (應用和數(shù)據(jù)分析)(Methods in Molecular Biology (分子生物學方法))Humana 出版社；第 2 版，ISBN-10:1617378526, ISBN-13:978-1617378522; StephenA.Bustin (編者)(2004) A-Z of Quantitative PCR (定量 PCR 大全)(IUL Biotechnology(IUL 生物技術)，第 5 卷)(IUL 生物技術系列)International University Line;第 I 版，ISBN-10:0963681788, ISBN-13:978-0963681782 ；和 Kamberova 和 Shah (2002)DNA ArrayImage Analysis:Nuts&Bolts (DNA 陣列圖像分析:螺母和螺栓)(Nuts&Bolts series (螺母和螺栓系列))DNA 出版社?’第 2 版，ISBN-10:0966402758, ISBN-13:978-0966402759 中找到。
[0077]在其他設置中，所述捕獲探針可選偶聯(lián)到移動基材(例如珠、樹脂、顆粒等(本文通常與“珠”互換))，而不是靜態(tài)基材。例如，如本文其它地方所述，平面基材可以用于提供陣列捕獲探針，所述陣列捕獲探針與擴增樣品材料中一個或多個靶標核酸系列生成的剪切探針片段雜交。通過檢測陣列上哪個捕獲探針位點與探針片段雜交來檢測給定靶標核酸系列的存在。因為各探針片段對特定靶標序列特異，如果所述探針片段存在，其指示所述靶標存在并且擴增。在移動相基材中，給定分析中各個不同類型的捕獲探針偶聯(lián)到也帶有單個標記的不同移動基材上。所述移動基材然后通過檢測通道以鑒定珠和隱含地鑒定捕獲探針，并且鑒定所述標記探針是否存在。如果在對應特定捕獲探針的給定珠上檢測所述標記探針，其指不了與探針片段(和互補捕獲探針)相關聯(lián)的祀標序列在樣品中存在并且擴增。本發(fā)明的這個方面可以在如完成整體擴增反應的終點檢測中使用，但是也可以在定量分析中使用，如一個或多個擴增循環(huán)后用虹吸管從擴增混合物中吸出珠部分，和從珠上測量標記探針片段信號強度。
[0078]給定珠上的捕獲標記探針片段的濃度提供了檢測通道中足夠高的信號一背景比，從而不需要把反應混合物與珠分離開。另外，有陣列基材時，在完整探針和/或可選淬滅基團中包含二級結構使得不論是在溶液中還是無意結合到移動基材上，更能區(qū)別探針片段和完整探針背景信號。在一些示例中，也期望完整探針二級結構的特性以在移動基材上結合捕獲探針時生成位阻，造成在一些示例中完整探針結合珠的可能性降低。
[0079]多種不同珠類型可以與本發(fā)明這個方面聯(lián)用。例如，可以使用聚苯乙烯、纖維素、丙烯酸、乙烯、二氧化硅、順磁或其他無機顆粒、或任意各種其他類型的珠。如所述，珠通常用獨特標記特征分別標記。再者，可以使用多種不同標記類型，包含有機熒光標記、無機熒光標記(如量子點)、發(fā)光標記、電化學標記等。大量的這種標記市售可得，并且設置成易于偶聯(lián)到合適的活性珠上。在熒光標記基團的示例中，可以通過不同結合2、3、4種或更多種不同空間熒光標記基團和不同水平的各種標記以提供大量的標記特征，從而提供不使用寬的激發(fā)輻射光譜就能提供寬范圍的單個標記特征，如多重激光。
[0080]所述方法通常使用裝置、系統(tǒng)、耗材和試劑盒來進行。能提供所述裝置、系統(tǒng)和耗材的所有特性以實踐本文所述方法，并且本文所述方法能與所述裝置、系統(tǒng)、耗材和試劑盒聯(lián)用。
[0081]耗材
[0082]設置本發(fā)明的單罐式反應腔室以降低信號背景。在所述腔室的至少一個內(nèi)表面上形成高效陣列。在所述方法的擴增和陣列雜交步驟中，所述陣列通常與擴增反應劑和產(chǎn)物接觸。這使得用戶進行一次或多次擴增反應循環(huán)，通過實時監(jiān)測陣列信號來檢測結果，并且然后進行一次或多次附加的擴增反應，再檢測。因此，陣列的信號強度可以用于實時檢測和定量感興趣核Ife。
[0083]本發(fā)明的耗材包含腔室和所述腔室內(nèi)表面上的高效陣列。所述腔室通常較薄(淺)，如厚度小于約1_。通常，腔室越薄，陣列上的溶液越少，這降低了溶液中標記探針或探針片段的信號背景。通常所需的腔室厚度的范圍是約I μ m -約500 μ m。就耗材生產(chǎn)的容易性而言，所述腔室在陣列上的厚度范圍通常是約IOym-約250 μ m，如厚度約IOOym-約150 μ m。所述腔室能包含有試劑遞送端口的表面，例如通過手工或自動移液器遞送樣品。
[0084]圖2提供了示例性耗材 的放大(blow-up)圖。在這個實施例中，底表面層I和上表面層2通過中間層3結合。在組裝層1、2和3后切口 4形成腔室。端口 5形成便利通道以把緩沖液和試劑遞送到組裝成的腔室中。能在所述區(qū)域的頂層或底層形成高效陣列，所述區(qū)域形成切口的頂表面或底表面。在一個便利實施方式中，當落射熒光檢測用于檢測結合到陣列的標記時，底表面上制成陣列，設置所述耗材以通過定位在本發(fā)明裝置和系統(tǒng)底表面下面的檢測光學器來觀察。通常，頂表面和/或底表面會包含窗口，通過窗口檢測光學器能觀察到陣列。
[0085]中層3能根據(jù)要使用方法組裝的耗材采用任意各種形式。在一個便利實施方式中，頂表面或底表面I和2通過壓敏粘合材料形成的層3來結合。壓敏的粘合層(如帶)熟知并且廣泛可用。參見例如Benedek和Feldstein (編者)(2008)Handbook of Pressure-Sensitive Adhesives and Products (壓敏粘合劑和產(chǎn)品手冊):卷 I !Fundamentals of Pressure Sensitivity (壓敏的基本原理)，卷 2 !Technologyof Pressure-Sensitive Adhesives and Products (壓敏粘合劑和產(chǎn)品技術)，卷 3:Applications of Pressure-Sensitive Products(壓敏產(chǎn)品的應用)，CRC 出版社；第 I 版,ISBN-10:1420059343，ISBN-13:978-1420059342。
[0086]也能使用結合上表面和底部表面以形成腔室的其他制造方法。例如，所述上表面和底部表面能通過上表面和/或下表面上的襯墊或特形結構結合。所述襯墊或結構可選融合或附著到上表面和/或下表面上的相應區(qū)域。硅和聚合物芯片制造方法能用于形成頂表面或底表面的結構。對結構制造(包含微結構制造)方法的介紹，參見例如Franssila (2010)Introduction to Microfabrication (微制造介紹)，Wiley 出版社；第 2 版，ISBN-10:0470749830，ISBN-13:978-0470749838 ;Shen 和 Lin (2009) “Analysis of mold insertfabrication for the processing of microfluidic chip(用于微流體芯片處理的模塑插入制造的分析)”聚合物工程和科學出版社，塑料工程協(xié)會公司(Polymer Engineering andScience Publisher: Society of Plastics Engineers, Inc.),卷 49,第 I 期,第 104 (11)頁；Abgrall (2009)Nanofluidics (納米流體)ISBN_10:159693350X, ISBN-13:978-1596933507;Kaajakari(2009)Practical MEMS:Design of microsystems, accelerometers, gyroscopes, RF MEMS, optical MEMS, and microf luidic systems (實踐 MEMS:設計微系統(tǒng)、加速度計、陀螺儀、RF MEMS、光學MEMS和微流體系統(tǒng))，小齒輪出版社(Small Gear Publishing),ISBN-10:0982299109, ISBN-13:978-0982299104;Saliterman(2006)Fundamentals ofBioMEMS and Medical Microdevices (BioMEMS 和醫(yī)學微型裝置的基本原理)，SPIE 出版社，ISBN-10:0819459771，ISBN-13:978-0819459770;Madou(2002)Fundamentals ofMicrofabrication:The Science of Miniaturization (微制造的基本原理:小型化的科學)，第 2 版，CRC 出版社；ISBN-10:0849308267, ISBN-13:978-0849308260。這些制造方法能用于基本形成頂表面或底表面所需的任意結構，而不需要中間層。例如，在所述頂表面和/或底表面形成降低，并且所述兩個層結合，因而形成所述腔室。
[0087]在一些實施方式中，所述襯墊或結構指導UV或可輻射固化的粘合劑的流動。這種粘合劑在上表面和下表面之間流動，并且接受UV光或輻射(如電子束或“EB”輻射)，因而使上表面和下表面彼此結合。可用的粘合劑(包含UV和可輻射固化的粘合劑)的描述，參見例如 Ebnesaj jad (2010) Handbook of Adhesives and Surface Preparation: Technology,Applications and Manufacturing (粘合劑和表面制備手冊:技術、應用和生產(chǎn)),威廉姆斯安德魯出版社(William Andrew);第 I 版，ISBN-10:1437744613, ISBN-13:978-1437744613;Drobny (2010) Radiation Technology for Polymers (聚合物的福射技術)，第 2 版，CRC 出版社，第 2 版，I SBN-10:1420094041, ISBN-13:978-1420094046。
[0088]在其他實施方式中，所述上表面和下表面能超聲融合在一起，所述襯墊或表面結構劃定耗材中融合和要生產(chǎn)腔室或其他構造結構的區(qū)域。用于融合材料的超聲焊接和相關技術在例如 Astashev` 和 Babitsky (2010)，Ultrasonic Processes andMachines: Dynamics,Control and Applications(Foundations of EngineeringMechanics)(超聲處理和機械:動力學、控制和應用(工程機械的基礎))，Springer出版社；第 I 版，ISBN-10:3642091245, ISBN-13:978-3642091247 ;和 Leaversuch (2002) “Howto use those fancy ultrasonic welding controls (怎樣使用那些奇特的超聲焊接控制)” Plastics Technology48 (10):70-76 中講述。
[0089]在另一個實施例中，所述結構是上表面或下表面上的透明區(qū)域，和關聯(lián)的上表面或下表面上的對應陰影區(qū)域。在這個實施方式中，所述上表面或下表面能通過指導激光通過透明區(qū)域并且到陰影區(qū)域的激光焊接在一起。激光焊接方法在例如Steen等，(2010)Laser Material Processing (激光材料處理)Springer 出版社；第 4 版,ISBN-10:1849960615, ISBN-13:978-1849960618 ；Kannatey-Asibu(2009)Principles of Laser MaterialsProcessing (Wiley Series on Processing of Engineering Materials)(激光材料處理原理(Wiley 工程材料處理系列))，Wiley 出版社，ISBN-10:0470177985, ISBN-13:978-0470177983 ;和 Duley (1998) Laser Welding (激光焊接)韋利科學公司，ISBN-10:0471246794，ISBN-13:978-0471246794 中講述。
[0090]所述捕獲核酸陣列通常偶聯(lián)到窗口的熱穩(wěn)定涂層上。所述窗本身能包含例如玻璃、石英、陶瓷、聚合物或其他透明材料?？捎眠m用于涂層所述窗的多種涂層。通常，基于以下因素選擇涂層:與陣列基材的相容性(如陣列連接的腔室表面是玻璃或者聚合物)，衍生或處理以包含合適連接陣列成員的活性基團的能力，和與處理條件的相容性(如熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性等)。例如，所述涂層能可選包含:化學反應基團、親電基團、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、單硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、?；B氮、環(huán)氧、氮雜環(huán)丙烷、醛、α，β-不飽和酮或包含乙烯酮或馬來酰亞胺的酰胺、酰基鹵化物、磺酰鹵、亞酰胺、環(huán)酸酐、環(huán)加成反應中的活性基團、烯烴、二烯、炔烴、疊氮化物或其組合。對表面涂層和其用于生物分子和表面連接的描述，參見例如Plackett (編者)(2011)Biopolymers:New Materials for Sustainable Films and Coatings (生物聚合物:可持續(xù)膜和涂層的新材料)，Wiley 出版社，ISBN-1O:0470683414，ISBN-13:978-0470683415 ；Niemeyer (編者)(2010)，Bioconjugation Protocols: Strategies and Methods (Methodsin Molecular Biology)(生物偶聯(lián)方案:策略和方法(分子生物學方法))，Humana出版社；第 I 版，ISBN-10:1617373540, ISBN-13:978-1617373541 ；Lahann(編者)(2009)，ClickChemistry for Biotechnology and Materials Science (生物技術和材料科學的點擊化學)，Wiley 出版社，ISBN-1O:0470699701, ISBN-13:978-0470699706 ；Hermanson(2008),Bioconjugate Techniques (生物偶聯(lián)技術),第2版,學術出版社；第2版,ISBN-10:0123705010，ISBN-13:978-0123705013 ;Wuts 和 Greene (2006)Greene' s Protective Groupsin Organic Synthesis (有機合成中的保護基團)，韋利科學公司(Wiley-1nterscience);第 4 版，ISBN-10:0471697540，#ISBN-13:978-0471697541 ；ffittmann(編者)(2006)，Immobilisation of DNA on Chips II (Topics in Current Chemistry)(芯片上DNA 的固定II (現(xiàn)代化學專題)),Springer 出版社，第 I 版，ISBN-10:3540284362, ISBN-13:978-3540284369 ；Licari (2003),Coating Materials for Electronic Applications:Polymers, Processing, Reliability, Testing(Materials and Processes for Electronic Applications)(電子應用的涂層材料:聚合物、處理、可靠性、測試(電子應用的材料和處理))，威廉姆斯安德魯出版社，ISBN-10:0815514921, ISBN-13:978-0815514923 ；Conk(2002), FabricationTechniques for Micro-Optical Device Arrays Storming Media(微型光學陣列基質(zhì)的制造技術)，ISBN-10:1423509641, ISBN-13:978-1423509646,以及石油和顏色化學協(xié)會(Oiland Colour Chemists ' Association) (1993), Surface Coatings-Raw materials andtheir usage (表面涂層-原材料及其應用),第3版,Springer出版社；第3版，ISBN-10:0412552108，ISBN-13:978-0412552106。
[0091]生成核酸陣列的方法可用，并且能通過形成內(nèi)腔室表面來適應本發(fā)明。能用于在內(nèi)腔室表面形成陣列的核酸微陣列形成技術描述在，例如Rampal (編者)，Microarrays: Volume 1: Synthesis Methods (Methods in Molecular Biology)(微陣列:卷1:合成方法(分子生物學方法))，Humana出版社；第2版，ISBN-10:1617376639, ISBN-13:978-1617376634 ;Miiller 和 Nicolau (編者)(2010), Microarray Technology and ItsApplications (Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering)(微陣列技術及其應用(生物和醫(yī)學物理、生物醫(yī)學工程))，Springer出版社?’第1版，ISBN-1O:3642061826，ISBN13:978-3642061820 ；Xing 和 Cheng (編者)(2010) Biochips: Technology andApplications (Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering)(生物芯片:技術和應用(生物和醫(yī)學物理、生物醫(yī)學工程))，Springer出版社?’第I版，ISBN-10:3642055850, ISBN-13:978-3642055850 ;Dill 等(編者)(2010)Microarrays:Preparation, Microfluidics, Detection Methods, and Biological Applications (Integrated AnalyticalSystems)(微陣列:制備、微流體、檢測方法和生物應用(集成分析系統(tǒng)))，Springer出版社，ISBN-10:1441924906，ISBN-13:978-1441924902 ；Whittmann (2010)Immobilisationof DNA on Chips II (Topics in Current Chemistry)(芯片上 DNA 的固定 II (現(xiàn)代化學專題))，Springer 出版社；第 I 版，ISBN-10:3642066666, ISBN-13:978-3642066665 ；Rampal(2010), DNA Arrays:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(DNA陣列:方法和方案(分子生物學方法))，Humana出版社；第I版，ISBN-10:1617372048，ISBN-13:978-1617372049 ；Schena (作者，編者)(2007)，DNA Microarrays (MethodsExpress) (DNA 微陣列(方法快報))，Scion 出版社；第 I 版，ISBN-10:1904842151, ISBN-13:978-1904842156 ;Appasani (編者)(2007) ,Bioarrays = From Basics to Diagnostics (生物陣列:從基礎到診斷)，Humana 出版社?’第 I 版，ISBN-10:1588294765, ISBN-13:978-1588294760 JPUlrike Nuber (編者)(2007), DNA Microarrays (Advanced Methods) (DNA 微陣列(高級方法))TF 公司(Taylor&Francis), ISBN-10:0415358663, ISBN-13:978-0415358668。把DNA連接到表面以形成陣列的技術能包含任意各種點樣方法、使用化學反應表面或涂層、光導向的合成、DNA印刷技術、和很多本領域可用的其他方法。
[0092]定量陣列密度的方法在上面引用的參考文獻以及Gong等，(2006) “Mult1-technique Comparisons of Immobilized and HybridizedOligonucleotide Surface Density on Commercial Amine-Reactive Microarray Slides(商業(yè)胺反應性微陣列載玻片上固定和雜交寡核苷酸表面密度的多技術比較)”Anal.Chem.78:2342-2351 中描述。
[0093]所述耗材能在容器中包裝，或包裝材料以形成試劑盒。所述試劑盒也能包含用于使用所述耗材的組分，所述耗材例如對照試劑(如對照模板、對照探針、對照引物等)、緩沖液等。
[0094]裝置和系統(tǒng)
[0095]使用所述耗材和/或?qū)嵺`本發(fā)明方法的裝置和系統(tǒng)也是本發(fā)明的特性。所述裝置和系統(tǒng)能包含所述耗材的特性，例如反應腔室和陣列(以耗材形式或者裝置的專用部件)。最典型的，所述裝置通常有接收器如安置上述耗材平臺(stage)，以及監(jiān)測陣列的監(jiān)測光學器，熱循環(huán)腔室的模塊，和有控制熱循環(huán)、監(jiān)測和信號后處理的系統(tǒng)指令的計算機。
[0096]系統(tǒng)的示意圖示于圖11。如所示，耗材10安置在平臺20上。環(huán)境控制模塊(ECM) 30 (如包含Peltier裝置，冷卻風扇等)提供環(huán)境控制(如溫度的熱循環(huán))。通過光源40 (如燈、電弧燈、LED、激光等)提供照明光。光學系統(tǒng)50把光從光源40導向耗材10。耗材10的信號通過光學系統(tǒng)監(jiān)測，并且信號信息傳遞給計算機60。計算機60也可選控制ECM30。信號信息能通過計算機60來處理，并且輸出給用戶可見的顯示器70和/或打印機。ECM30能安置在耗材10的上面或下面，并且能包含其他可見光學器80 (位于平臺20的上面或下面)。
[0097]設置所述平臺/接收器以安置用于熱循環(huán)和分析的耗材。所述平臺能包含與對應的耗材特性件緊密配合的對準(registration)和比對結構,例如比對臂、扳手、孔、栓等。所述平臺能包含接收和定向所述耗材的盒，使其置于與其他裝置元件的可操作連接中，盡管其在很多實施方式中不是必需的，如當所述耗材直接安置在平臺上時。設置裝置元件以操作耗材，并且裝置元件包含遞送緩沖液和試劑到耗材的流體遞送系統(tǒng)、熱循環(huán)或其他溫度控制或環(huán)境控制模塊、檢測光學器等。在所述腔室置于裝置而不是整合到耗材的實施方式中，通常設置所述裝置元件以在腔室上或接近腔室處操作。
[0098]流體遞送到耗材能通過所述裝置或系統(tǒng)來完成，或能在把耗材加載到所述裝置或系統(tǒng)前來進行。流體處理元件能整合到所述裝置或系統(tǒng)上，或能配置(format)成從所述裝置或系統(tǒng)分開的單獨處理器。流體處理元件能包含把試劑或緩沖液遞送(手工或自動)到耗材中端口的移液器，或能包含毛細管、微制造的裝置通道等。能用于加載所述耗材的手工和自動移液器和移液器系統(tǒng)從各種來源廣泛可用，包含賽默科技公司(ThermoScientific)(美國)、Eppendorf公司(德國)、Labtronics公司(加拿大)等。一般說，可用各種流體處理系統(tǒng)，并且能整合到本發(fā)明的裝置和系統(tǒng)中。參見例如Kirby (2010)，Micro-and Nanoscale Fluid Mechanics: Transport in Microfluidic Devices (微米級和納米級流體力學:微流體裝置中的運輸)，ISBN-10:0521119030, ISBN-13:978-0521119030 ；Bruus (2007), Theoretical Microfluidics(Oxford Master Series in Physics)(理論微流體(牛津物理大師叢書)，美國牛津大學出版社，ISBN-10:0199235090, ISBN-13:978-0199235094 ；Nguyen(2006), Fundamentals And Applications of Microfluidics (微流體的基礎和應用)，第2版，(Integrated Microsystems (整合的微系統(tǒng)))，ISBN-10:1580539726，ISBN-13:978-1580539722 ;Wells(2003)，High Throughput Bioanalytical SamplePreparation:Methods and Automation Strategies(Progress in Pharmaceutical andBiomedical Analysis)(高通量生物分析樣品制備:方法和自動策略(藥學和生物醫(yī)藥分析中的進展))，埃爾斯威爾科學公司；第 I 版，ISBN-10:044451029X, ISBN-13:978-0444510297。所述耗材可選包含設置成與所述遞送系統(tǒng)緊密配合的端口，如通過移液器或毛細管遞送裝置加載的合適尺寸的端口。
[0099]所述ECM或熱調(diào)節(jié)模塊能包含幫助熱循環(huán)的結構，例如熱電模塊、Peltier裝置、冷卻風扇、散熱器、設置成與所述腔室的外表面部分配對的金屬墊片、流體浴等。很多這種熱調(diào)節(jié)組件可用于整合到本發(fā)明的所述裝置和系統(tǒng)中。參見例如Kennedy和Oswald (編者)(2011), PCR Troubleshooting and Optimization:The Essential Guide (PCR 問題解決和優(yōu)化:基本手冊)，Caister 學術出版社，ISBN-10:1904455727; ISBN-13:978-1904455721 ；Bustin (2009), The PCR Revolution:Basic Technologies and Applications (PCR 革命:基本技術和應用)，劍橋大學出版社；第I版，ISBN-10:0521882311, ISBN-13:978-0521882316 ;Wittwer 等(編者)(2004), Rapid Cycle Real-Time PCR-Methods and Applications(快速循環(huán)實時PCR方法和應用)，Springer出版社；第I版，ISBN-10:3540206299，ISBN-13:978-3540206293;Goldsmid(2009)Introduction to Thermoelectricity(Springer Seriesin Materials Science)(熱電性介紹(Springer材料科學系列))，Springer出版社；第I版，ISBN-10:3642007155, ISBN-13:978-3642007156 ;Rowe (編者)(2005) ThermoelectricsHandbook:Macro to Nano (熱電手冊:宏觀到納米)，CRC 出版社；第 I 版，ISBN-1O:0849322642，ISBN-13:978-0849322648。所述熱調(diào)節(jié)模塊能例如制成接收耗材的盒的形式，或能安置在與耗材可操作臨近的平臺上。
[0100]通常，所述ECM或熱調(diào)節(jié)模塊有反饋控制系統(tǒng)，所述系統(tǒng)操作性連接到計算機，所述計算機控制模塊或是模塊的一部分。計算機反饋控制是可用于儀器控制的方法。參見例如 Tooley (2005), PC Based Instrumentation and Control (基于 PC 的儀器和控制)，第 3 版，ISBN-10:0750647167, ISBN-13:978-0750647168 ；Dix 等(2003)，Human-ComputerInteraction (人機互動)(第 3 版)，Prentice Hall 出版社，第 3 版，ISBN-10:013046109I，ISBN-13:978-0130461094。通常，通過計算機進行系統(tǒng)控制，所述計算機能使用例如腳本文件作為輸入以生成靶標溫度和循環(huán)時間期限，以及當通過檢測光學器觀察或拍攝圖像時的特異化。圖像通常在反應中不同時間點拍攝，并且通過計算機分析以生成作為時間函數(shù)的強度曲線，并且因而得到靶標濃度。
[0101]所述光學系統(tǒng)能包含任意典型光學系統(tǒng)組件，或能操作性連接到這種組件上。所述光學系統(tǒng)把光導向耗材，例如集中到耗材陣列或陣列區(qū)域上。所述光學系統(tǒng)也能指導從陣列發(fā)射的光(如突光或發(fā)光信號)?？蛇x光學組件的描述參見例如Kasap等(2009),Cambridge Illustrated Handbook of Optoelectronics and Photonics (劍橋光電子和光子圖示手冊)，劍橋大學出版社?’第I版，ISBN-10:0521815967, ISBN-13:978-0521815963 ;Bass 等(2009), Handbook of Optics (光學手冊),第 3 版,卷 I !Geometrical andPhysical Optics, Polarized Light, Components and Instruments (set)(幾何和物理光學，偏振光、組件和儀器(組))，MHP 公司(McGraw-Hill Professional);第 3 版，ISBN_10:0071498893，ISBN-13:978-0071498890 ；Bass 等(2009), Handbook of Optics (光學手冊)，第3 版，卷 I1:Design, Fabrication and Testing, Sources and Detectors, Radiometry andPhotometry(設計、制造和測試，來源和檢測器，輻射測量和光度測定法)，MHP公司；第3版，ISBN-10:0071498907，ISBN-13:978-0071498906 ;Bass 等(2009)，Handbook of Optics (光學手冊)，第3版,卷II1: V ision and Vision Optics (視覺和視覺光學),MHP公司，ISBN-10:0071498915，ISBN-13:978-0071498913 ;Bass 等(2009) Handbook of Optics(光學手冊)，第 3 版，卷 IV:0ptical Properties of Materials, Nonlinear Optics, Quantum Optics(材料的光學屬性，非線性光學、量子光學)，MHP公司(McGraw-Hill Professional),第3版，ISBN-10:0071498923，ISBN-13:978-0071498920 ;Bass 等(2009)，Handbook of Optics(光學手冊)，第 3 版，卷 V:Atmospheric Optics, Modulators, Fiber Optics, X-Ray andNeutron Optics (大氣光學、調(diào)節(jié)劑、光纖、X-射線和中子光學)，MHP公司；第3版，ISBN-10:0071633138, ISBN-13:978-0071633130 ;以及 Gupta 和 Ballato (2006) The Handbook ofPhotonics (光子手冊)，第 2 版，CRC 出版社，第 2 版，ISBN-10:0849330955, ISBN-13:978-0849330957。通常光學系統(tǒng)包含任意下列組件:激發(fā)光源、弧光燈、汞弧光燈、LED、透鏡、光學過濾器、棱鏡、相機、光檢測器、CMOS相機、和/或CCD陣列。在一個所需實施方式中，使用落射熒光檢測系統(tǒng)。所述裝置也能包含或偶聯(lián)到陣列讀數(shù)模塊上，所述模塊使陣列上信號與要檢測的核酸相關聯(lián)。
[0102]在本發(fā)明的移動基材實施方式中，在某些方面，所述反應容器可以直接偶聯(lián)到檢測通道，如在整合的微流體通道系統(tǒng)內(nèi)，或通過控制混合物和檢測通道之間的合適的流體界面。或者，例如傳統(tǒng)流式細胞儀中的流體界面，可以在檢測通道上存在以取樣擴增反應混合物。所述檢測通道通常設置成在給定時間基本上僅使單個珠穿過所述通道的尺寸。所述檢測通道通常包含檢測窗，所述檢測窗能激發(fā)珠，并且收集從所述珠發(fā)出的熒光。在很多示例中，融合的二氧化硅或玻璃毛細管或其他透明微流體通道用作檢測通道。
[0103]本發(fā)明的光學檢測系統(tǒng)通常包含能在一種或多種激發(fā)波長遞送激發(fā)光的一種或多種激發(fā)光源。也包含了設置光學系統(tǒng)，以收集從檢測通道發(fā)出的光和過濾來自熒光信號的激發(fā)光。所述光學系統(tǒng)也通常包含其他分離元件，所述分離元件轉(zhuǎn)化熒光信號、或者把所述珠發(fā)出的熒光信號成分與捕獲的探針片段發(fā)出的信號成分分開。
[0104]圖14提供了整體檢測系統(tǒng)1400的示意圖。如所示，所述系統(tǒng)包含第一和第二激發(fā)光光源，例如激光1402和1404，各提供不同波長的激發(fā)光?；蛘?，單個寬光譜光源或多個窄光譜光源可以用于在一個或多個合適波長范圍內(nèi)遞送激發(fā)光以激發(fā)樣品中的檢測標記，如與所述珠相關聯(lián)的那些和與所述標記探針片段相關聯(lián)的那些。
[0105]實線箭頭所示的來自各激光的激發(fā)光束指向檢測通道1408，如通過使用定向光學器，如分色鏡1406。在檢測通道1408中的珠1410發(fā)出的光，通過收集光學器如物鏡1412收集。所述收集的光然后通過過濾器1414，所述過濾器設置成通過虛線箭頭所示的發(fā)出的熒光，而排除收集的激發(fā)輻射。所述收集熒光包含在第一發(fā)射光譜的捕獲探針片段上的標記發(fā)出的熒光，以及根據(jù)珠中使用的很多標記，在一種或多種不同發(fā)射光譜上的珠標記特征的熒光信號。所述收集的熒光然后通過分色鏡1416，所述分色鏡把來自捕獲特征片段的熒光發(fā)射到第一檢測器1420。來自所述珠的剩余熒光特征然后再用于通過第二分色鏡1418的信號來分離(其把第一珠信號組分反射到第二檢測器1422)，并且通過第二珠信號組分到第三檢測器1424。所述檢測器通常偶聯(lián)到合適的處理器或計算機上以存儲和檢測與珠相關聯(lián)的信號數(shù)據(jù)，并分析信號數(shù)據(jù)以測定珠與捕獲特征和相關靶標核酸序列的一致性。再者，所述處理器或計算機可以包含定量信號數(shù)據(jù)的程序和引起(originate)靶標序列拷貝數(shù)目，其中進行時程實驗，如在整體擴增反應中一輪或多輪擴增循環(huán)后對珠取樣。
`[0106]所述裝置和系統(tǒng)包含或操作性連接到如在計算機或計算機可讀介質(zhì)中實施的系統(tǒng)指令上。所述指令能控制所述裝置和系統(tǒng)的任意方面，如信號強度的一種或多種測量與熱調(diào)節(jié)模塊進行的很多控制循環(huán)相關聯(lián)，以測定所述裝置檢測的靶標核酸的濃度。
[0107]系統(tǒng)能包含操作性連接到其他裝置組分的計算機，如通過合適的配線或通過無線連接。所述計算機能包含如通過熱調(diào)節(jié)模塊控制熱循環(huán)的指令，如使用上述反饋控制，和/或當光學系統(tǒng)拍攝或觀察圖片時發(fā)生特異性。所述計算機能接收或轉(zhuǎn)化圖像信息成數(shù)據(jù)信息和/或作為時間函數(shù)的信號強度曲線，測定由所述裝置分析的靶標函數(shù)的濃度等等。所述計算機能包含標準化信號強度以作為(account for)背景，如就陣列的一個或多個區(qū)域檢測局部背景，以及通過校正所述背景來標準化陣列信號強度測量值。相似地，所述計算機能包含通過對陣列上捕獲核酸點樣差異、或?qū)﹃嚵胁煌瑓^(qū)域的視野不等進行校正，來標準化信號強度的指令。
[0108]其他定義在進一步詳細描述本發(fā)明之前，應理解，本發(fā)明不限于本文所述的特定裝置或生物系統(tǒng)，因為它們當然可能變化。還應當理解本文所使用的術語僅為了描述特定的實施方式而不是限制性的。在本說明書和權利要求書中所用的單數(shù)形式“一個”，“一種”和“該”包括多個指示物，除非上下文中有明顯的表示。因此，例如關于"一個表面"，如本文所討論的耗材腔室，可選包含兩個或多個表面的結合，等等。
[0109]除非另有限定，在此使用的所有技術和科學術語均與本發(fā)明所屬領域技術人員的通常理解一致。雖然也可采用與本文所述相似或等同的任何方法和材料實施或測試本發(fā)明，但下面描述了優(yōu)選的方法和材料。在說明和要求保護本發(fā)明的過程中，將依據(jù)以下定義使用以下術語。
[0110]“擴增引物”是在模板依賴性擴增反應中延伸的部分(如分子)。最典型地，所述引物會包含或是在擴增條件下結合到模板的核酸。通常，所述引物會包含通過聚合酶(如通過聚合酶鏈反應中的熱穩(wěn)定聚合酶)或通過(如連接酶鏈反應中的)連接酶延伸的末端。
[0111]“檢測腔室”是部分或全部封閉的結構，其中分析樣品或檢測靶標核酸。所述腔室能全部封閉，或能包含流體偶聯(lián)到所述腔室的端口或通道，例如用于遞送試劑或反應劑。所述腔室的形狀能根據(jù)本發(fā)明和可用的系統(tǒng)設備而變化。當其設置尺寸形狀以降低信號背景[如通過包含接近陣列的較窄尺寸(如腔室厚度)(因而降低靠近所述陣列溶液生成的信號數(shù)量)]時，或者當設置所述腔室以降低背景[如通過使用涂層(如光學涂層)或結構(如擋板或靠近所述陣列的其他形狀結構)]時，腔室“設置成降低到靠近所述陣列的背景信號”。通常，設置所述腔室以靠近所述陣列的尺寸(如厚度)，從而溶液中的信號足夠低以使得檢測到陣列上的信號差異。例如，在一個實施方式中，所述腔室小于陣列上厚度約Imm ；需要的是所述腔室厚度小于約500 μ m。通常，所述腔室厚度小于陣列上約400 μ m，小于約300 μ m，小于約200 μ m，或小于約150 μ m。在本文提供的一個實施例中，所述腔室厚度約142 μ m0
[0112]“高效核酸陣列”是在雜交條件下與探針或探針片段有效雜交的捕獲核酸陣列。在典型實施方式中，所述陣列設置成反應/檢測腔室的內(nèi)表面。所述陣列能通過在表面上從點樣到化學或光化學合成的任意傳統(tǒng)陣列技術形成。通過控制捕獲探針區(qū)域長度(相較更長的探針，更短的探針雜交更有效，小到雜交條件的最小雜交長度)、和通過控制各陣列區(qū)域上捕獲核酸數(shù)目來實現(xiàn)高效 。能通過包含捕獲位點和表面之間的連接序列或結構生成對雜交更有效/更可用的捕獲位點(因而在表面的選擇距離上形成捕獲位點格式，其能降低表面對雜交的影響)。例如，能使用核酸序列和/或聚乙二醇接頭。各陣列區(qū)域上分布捕獲核酸的數(shù)目，從而對通?？刂品磻傻慕o定探針或片段而言，不限定可用于雜交的位點數(shù)目。如上所述，這意味著用于在擴增反應中生成的結合標記探針片段的位點數(shù)目是過量的，并且優(yōu)選位點數(shù)目顯著(substantially)過量,所述位點數(shù)目在擴增反應后在反應混合物中可以由探針片段濃度飽和?！皹擞浱结槨笔欠肿踊蚧衔铮龇肿踊蚧衔镌陔s交條件下與靶標核酸特異雜交的，并且包含可檢測部分或能制成可檢測的部分。最常見地，標記探針是包含光學標記的核酸，所述光學標記例如熒光團、染料、發(fā)光團、量子點等。所述標記能直接檢測，或能在淬滅狀態(tài)，如其中所述探針包含淬滅劑部分。在本文很多實施方式中，在靶標核酸擴增中剪切靶標探針以釋放包含可檢測標記的探針片段。例如，所述標記探針能包含熒光團和淬滅劑，如其中擴增反應造成探針剪切以釋放標記探針片段。最典型地，所述探針包含“折翼”區(qū)域。這種折翼區(qū)域在雜交中不與靶標堿基配對，并且通過核酸酶(如聚合酶的核酸酶活性)從探針的其余部分剪切下，因而形成探針片段。
實施例[0113]提供以下實施例用于說明而非限制本發(fā)明的權利要求。應理解，本文所述的實施例和實施方式僅用于說明目的，本領域技術人員應了解據(jù)此作出的各種修飾或改變，且它們包括在本申請的主旨和權益以及所附權利要求書的范圍內(nèi)。
[0114]示例性檢測系統(tǒng)
[0115]這個實施例的檢測系統(tǒng)使得對單個腔室、多重、靶標核酸的實時PCR檢測。所述系統(tǒng)擴大了實時PCR的多重性能，所述擴大是通過除去其他光譜差異到陣列空間差異以生成對要擴增的各靶標特異的實時信息。
[0116]傳統(tǒng)上，通過使用對各擴增子特異和用不同波長熒光團標記的PCR探針例如TAQMAN?探針來實現(xiàn)單孔多重。由于染料釋放光譜和光譜窗的限制，這種方法把單個反應多重性能限制在最多約5個靶標。
[0117]這個實施例中描述的方法使用標記的PCR探針，所述PCR探針擴增子作為代替以在方法中把關于擴增進展的信息轉(zhuǎn)移到陣列結合的表面上。保留了關于擴增的動力學信息，這使得根據(jù)循環(huán)數(shù)目閥值方法來獲得檢測和定量信息。
[0118]PCR循環(huán)的延伸步驟中，Taq聚合酶的5’ _3’核酸酶活性剪切PCR探針以釋放折翼核酸，然后所述折翼核酸能優(yōu)選與陣列表面的捕獲探針雜交。各個折翼和對應的捕獲探針對測試組中的潛在靶標是獨特的。
[0119]反應腔室厚度
[0120]進行實驗以評價給定陣列中腔室厚度與信號與背噪之比的關系。用不同厚度腔室的機器來設計基材，并且用官能化的聚合物涂層。測量腔室的實際厚度。所述基材然后用捕獲探針點樣，并且使用UV固化環(huán)氧樹脂組裝成封閉的反應腔室。包含45nM與陣列上各包含探針互補的標記探針片段的合成模擬和255nM對應完整探針(對模擬15%剪切)用移液器轉(zhuǎn)移到各封閉反應腔室中，并`且30C下3min雜交后測量所述信號對比背景信號。一個試驗的結構示于圖13。如所示，反應腔室從厚度600微米降低到小于200微米顯示了信號與背噪之比的顯著增加，最優(yōu)比率小于300微米，并且優(yōu)選小于200微米厚度。
[0121]PCR腔室和陣列
[0122]大部分實驗中使用的PCR腔室示于圖2。如所示，所述腔室由包含與PCR探針折翼序列互補的陣列捕獲寡核苷酸的底表面組成。所述捕獲探針通過整合DNA技術公司(Integrated DNA Technologies Inc)(愛荷華州克拉威爾)合成,并且有共價連接到形成PCR腔室底部的基材的5’末端氨基基團，以及連接化學和寡核苷酸序列之間的聚乙二醇接頭。序列長度與對應的PCR探針折翼相同。用市售可得的載玻片形成PCR腔室的底部。這種載玻片與包含捕獲探針后續(xù)連接的活性NHS酯的聚合物涂層一起獲得。載玻片包含用聚合物涂層的玻璃和塑料基材。兩種類型的載玻片生成相似的實驗數(shù)據(jù)。根據(jù)標準方法，使用SP0TB0TTM(Arrayit技術公司(加利福尼亞州薩尼維爾))點樣捕獲探針。所述捕獲探針點通常是100 μ m直徑，點之間中心與中心的距離是200 μ m。
[0123]所述捕獲探針點樣和洗滌之后，使用壓敏粘合劑(PSA)和有如圖2所示的進端口和出端口的聚碳酸酯頂部部件組裝成PCR腔室。所述腔室有142 μ M的最終深度/厚度(或高度)和15mm的直徑。所述腔室的溶劑保持約45uL PCR試劑。
[0124]熱循環(huán)和光學線路板。
[0125]所述熱循環(huán)和光學檢測系統(tǒng)包含落射熒光、單通道系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含(I)激發(fā)光源(如汞弧光燈或LED)，(2)用于激發(fā)光和發(fā)射光的干擾光學過濾器，從而檢測特異性結合的熒光團，如Cy3、Cy5等，和(3)是CXD或CMOS照相機的光探測器。
[0126]所述系統(tǒng)也包含熱循環(huán)組件，例如一對熱電模塊、金屬板、散熱器和強力冷卻風扇，這些組件用于把封閉的耗材(如上述需要的陣列和腔室)快速熱循環(huán)到需要的溫度和需要的時間。通過使用反饋控制系統(tǒng)來控制所述熱電模塊到特定溫度、特定時間期，所述系統(tǒng)使用與耗材臨近的熱敏電阻器作為控制系統(tǒng)的反饋。通過計算機進行系統(tǒng)控制，所述計算機使用腳本文件作為輸入以生成靶標溫度和時間期，以及當通過光探測器拍攝圖像時產(chǎn)生特異性。所得圖像在熱反應中的不同時間點拍攝，并且通過計算機分析以生成作為時間函數(shù)的強度曲線，并且因而得到靶標濃度。
[0127]在熱反應過程中的不同時間和溫度下捕獲單通道熒光圖像。然后分析這些熒光圖像以生成起始靶標核酸濃度的定量。結合使用平均灰度強度測量值、背景校正和基線調(diào)整來分析熒光圖像。在所述陣列中對各個點局部測量背景。通過測量感興趣點的周圍溶液的同心環(huán)的熒光強度來計算背景。然后校正各個點的信號以計算局部背景。還能標準化各個點的校正信號以計算點以及視野的不均勻光照中的變化。從第一組循環(huán)(通常5-15輪循環(huán))中獲得的校正強度測量值的平均用于調(diào)整基線和標準化各個點的測量。
[0128]實施例1:三步擴增反應所述擴增試劑混合物包含標準PCR試劑，所述試劑包含對要擴增的各靶標特異的兩個PCR擴增引物，以及對要擴增的各靶標特異的PCR探針。典型探針的結構示于圖1A。如所示，圖1A探針區(qū)域(A)表示與靶標擴增子互補的探針核酸區(qū)域，使用如通常對傳統(tǒng)實時PCR探針(如在TAQMAN?探針中)相同的規(guī)定來設計。探針區(qū)域(B)表示與相應捕獲探針(下面討論)互補但是與靶標核酸不互補的正交核酸“折翼”序列。為了說明，在一個實施例中設計所述序列以有40° -46°C的Tm，盡管能用其他探針設計來取代。在一個實施例中，所述序列長度是約13或14個堿基。探針區(qū)域(C)表示有與核酸區(qū)域(B)序列部分互補的序列的核酸。設計這個序列以幫助形成全長探針的二級結構，如Tm是47-51°C。淬滅劑(D)表示可選淬滅劑分子。標記(E)表示熒光團或其他可選的檢測標記。所述熒光團Cy3用于 下面表示的數(shù)據(jù)。
[0129]對這個實施例中的數(shù)據(jù)而言，用下列試劑制劑進行PCR:200nM引物，IX FASTSTARTtdi PCR 緩沖液(可購自 Roche 公司)，2_6mM MgCl2,0.5mg/mL BSA, 0.2 單位 /uL FASTSTARTtdi Taq 聚合酶(Roche 公司)和 150nM PCR 探針。
[0130]使用上述制劑制備IOOuL PCR反應。用于這個實施例的所述PCR探針序列是:
[0131]
NNNNNNNNNNNNNCCTGTTGCCAATTTCAGAGTGTTTTGCTT AACNNN
NNNNNN' GAT (SEQ ID NO:1)。
[0132]所述5’和3’折翼以下劃線/雙下劃線顯示，并且傳統(tǒng)TaqMan序列示于黑體。雙下劃線序列顯示設計形成二級結構的同源區(qū)域。二級結構的預測融合溫度是51°C，如mFold(idtdna.com)使用PCR緩沖液條件所測定。所述PCR探針用5’Cy3熒光團和黑洞猝滅物(Black Hole Quencher) 2部分在3’末端標記。
[0133]所述連接到PCR腔室的底表面的捕獲探針序列是:NNN NNNNNNNNN N (SEQ IDNO: 2),使用PCR緩沖液條件的Tm是42°C。[0134]包含靶標序列的DNA質(zhì)粒以濃度106、IO4和IO2拷貝/uL加入到各PCR反應中。然后所述溶液通過加熱到95°C脫氣。脫氣后，加入聚合酶，并且所述反應使用移液器加載到PCR腔室中。剩余溶液加入應用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems) 7500用于平行分析。
[0135]對基于PCR的陣列的循環(huán)條件如下:
[0136]
【權利要求】
1.一種檢測靶標核酸的方法，所述方法包括如下步驟: 提供檢測腔室，所述檢測腔室在腔室的至少一個表面上有至少一種高效核酸檢測陣列； 把樣品加入到檢測腔室，所述樣品包含要檢測的一個或多個靶標核酸拷貝； 將擴增引物和探針與一個或多個拷貝雜交； 在擴增引物依賴性擴增反應中擴增一個或多個靶標核酸拷貝的至少一部分，其中所述擴增反應將所述探針切斷并釋放第一探針片段； 將所述第一探針片段與高效陣列雜交；和， 檢測所述第一探針片段與所述陣列結合生成的信號，由此檢測所述靶標核酸，其中在降低陣列附近背景信號的條件下進行所述檢測步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針包含標記探針，所述第一探針片段包含標記探針片段。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述標記探針片段包含在與所述陣列雜交后生成可檢測信號的標記。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測腔室的構造降低所述陣列附近的背景信號。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測腔室在至少一個緯度上靠近所述陣列且該緯度的尺寸小于500 μ mo
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測腔室在至少一個緯度上靠近所述陣列且該緯度的尺寸約10 μ m —約200 μ m。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述陣列包含與所述第一探針片段雜交的非速率限制數(shù)量的捕獲核酸。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探針片段與所述靶標核酸不互補。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，與陣列上捕獲核酸雜交的所述第一探針片段長度小于約30個核苷酸。
10.如權利要求7所述的方法，其特征在于，與陣列上捕獲核酸雜交的所述第一探針片段長度小于約20個核苷酸。
11.如權利要求7所述的方法，其特征在于，與陣列上捕獲核酸雜交的所述第一探針片段長度小于約15個核苷酸或更短。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過與腔室可操作連通的至少一個端口或流體通道來加載所述樣品。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶標核酸在檢測前至少擴增5輪循環(huán)。
14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶標核酸在檢測前進行多輪循環(huán)擴增，檢測后在附加探針拷貝存在下再擴增所述靶標核酸部分，由此釋放的第一探針片段與所述陣列雜交并被檢測，將測得的信號強度與樣品中靶標核酸的量相關聯(lián)。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述信號檢測是通過檢測一種或多種光學信號波長。
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述信號檢測包含檢測多種信號的多種光學信號波長。
17.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述雜交溫度低于所述擴增反應的溫度。
18.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探針包含與所述靶標核酸不互補的第一正交折翼，所述折翼從所述標記探針上切下而生成標記探針片段。
19.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述探針包含與所述第一折翼至少部分互補的第二正交折翼，所述第二折翼結合第一折翼的Tm高于所述第一折翼結合陣列的Tm。
20.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述標記探針包含熒光標記或發(fā)光標記。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述標記是熒光染料。
22.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針包含標記和標記淬滅劑，探針被切斷造成所述標記和淬滅劑的分離，因而不淬滅所述標記。
23.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針包含不淬滅的標記。
24.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述信號是光學信號。
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述被檢信號包含來自插入染料的信號，該信號指示所述第一探針片段與所述高效陣列雜交。
26.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包含檢測陣列一個或多個區(qū)域的局部背景，并且通過校正所述背景來標準化信號強度測量值。
27.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測步驟中被檢信號的信號與背噪之比大于2.5。
28.如權利要求1所述的 方法，其特征在于，所述檢測步驟中被檢信號的信號與背噪之比大于5。
29.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法包含通過對陣列上捕獲核酸點樣差異、或?qū)﹃嚵胁煌瑓^(qū)域的視野不等進行校正，從而標準化信號強度。
30.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品包含多種靶標核酸，和所述陣列包含多種捕獲核酸類型。
31.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述捕獲核酸類型在陣列上空間分隔。
32.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法把特異性針對不同核酸靶標的多種擴增探針與所述靶標核酸一起孵育。
33.如權利要求30所述的方法，其特征在于，在所述擴增反應中有約5-約100種捕獲核酸類型，和約5-約100種對應的標記探針類型，基于信號在所述陣列上的定位能檢測多達5-100種不同信號。
34.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述捕獲核酸的排布密度約350fmol/cm2 一約 5，OOOfmol/cm2 或更大。
35.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述捕獲核酸的排布密度大于2000fmol/2cm ο
36.如權利要求32所述的方法，所述方法把特異性針對不同核酸靶標的多種標記探針與所述靶標核酸一起孵育，在所述擴增引物依賴性擴增反應中擴增至少部分靶標核酸造成多種標記探針類型切斷并且釋放多種標記探針片段類型，所述雜交包括這多種探針片段類型與所述陣列雜交，不同探針片段類型各自分別與不同空間位置的捕獲核酸類型雜交，檢測標記信號包含檢測來自多個不同空間區(qū)域的多種標記信號，所述多個不同區(qū)域分別對應陣列上不同空間位置的多種捕獲核酸。
37.如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述標記探針類型包含相同的標記部分。
38.如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述標記探針類型包含多種不同的標記部分。
39.如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述多種標記探針類型包含一種或多種不同的標記部分，不同標記部分的數(shù)目小于標記探針類型的數(shù)目。
40.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增步驟和將所述第一探針片段和高效陣列雜交的步驟在相同溫度下進行。
41.一種分析樣品多種靶標核酸序列的方法，所述方法包括如下步驟: 將所述樣品與第一標記探針群接觸，所述第一種標記探針各自包含分別與第一組靶標核酸序列內(nèi)不同感興趣靶標序列互補的第一部分和分別與高效探針陣列上的不同捕獲探針互補的第二部分，其中所述第二部分連有標記并且與感興趣靶標序列不互補； 在擴增引物依賴性擴增反應中從所述樣品中的第一組靶標核酸序列中擴增所有靶標序列，所述擴增反應將靶標序列雜交的標記探針切斷并釋放帶有標記的所述標記探針的第二部分； 將釋放的所述標記探針的第二部分與高效陣列雜交； 檢測所述標記探針的第二部分與高效陣列上捕獲探針的結合；和根據(jù)與所述高效陣列雜交的所述標記探針的第二部分來鑒定所述樣品中存在的靶標序列。
42.如權利要求41所述 的方法，其特征在于，所述方法還包括: 將樣品與第二標記探針群接觸，第二種標記探針各自包含所述第二部分和一個第三部分，所述第三部分分別與第二組靶標核酸序列中的不同感興趣靶標序列互補； 在擴增引物依賴性擴增反應中從所述樣品中的第二組靶標核酸序列中擴增所有靶標序列，所述擴增反應將靶標序列雜交的標記探針切斷并釋放帶有標記的所述標記探針的第二部分；和 重復所述雜交、檢測和鑒定步驟。
43.一種核酸檢測裝置，所述裝置包含: 檢測腔室，所述檢測腔室在至少一個腔室表面上包含至少一種高效核酸檢測陣列，所述腔室的構造降低相對于陣列信號的背景信號； 與檢測腔室操作性連接的熱調(diào)節(jié)模塊，所述模塊在裝置運行中調(diào)節(jié)腔室內(nèi)溫度；和 光學系統(tǒng)，所述光學系統(tǒng)在所述裝置運行中檢測陣列上生成的信號。
44.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述裝置在至少一個緯度上接近所述陣列且該緯度上厚度小于500 μ m。
45.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述裝置在至少一個緯度上接近所述陣列且該緯度上厚度約10 μ m —約200 μ m。
46.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述表面由陶瓷、玻璃、石英或聚合物構成。
47.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述裝置操作中，運行期間，捕獲核酸在所述陣列上以非速率限制性的密度存在。
48.如權利要求47所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述捕獲核酸結合于所述腔室表面的熱穩(wěn)定涂層。
49.如權利要求48所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述涂層包含下列一種或多種:化學反應基團、親電基團、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、單硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、?；B氮、環(huán)氧、氮雜環(huán)丙烷、醛、α，β-不飽和酮或包含乙烯酮或馬來酰亞胺的酰胺、?；u化物、磺酰鹵、亞酰胺、環(huán)酸酐、環(huán)加成反應中的活性基團、烯烴、二烯、炔烴、疊氮化物或其組合。
50.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述陣列包含多種捕獲核酸類型，不同類型定位在所述陣列上不同的空間區(qū)域。
51.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述陣列上存在多于5種不同的捕獲核酸類型。
52.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述陣列上存在約5—約100種不同的捕獲核酸類型。
53.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述捕獲核酸的排布密度大于2000fmol/cm2。
54.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述熱調(diào)節(jié)模塊包含下列一種或多種:熱電模塊、Peltier裝置、冷卻風扇、散熱器、設置成與所述腔室外表面部分配對的金屬墊片。
55.如權利要求54所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述熱調(diào)節(jié)模塊包含與計算機操作性連接的反饋控制系統(tǒng)。
56.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述光學系統(tǒng)包含或操作性連接落射熒光檢測系統(tǒng)。
57.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述光學系統(tǒng)包含下列一種或多種:激發(fā)光源、弧光燈、萊弧光燈、LED、透鏡、光學過濾器、棱鏡、相機、光檢測器、CMOS相機、或CXD陣列。
58.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述裝置包含陣列讀數(shù)模塊，所述讀數(shù)模塊將所述陣列上信號位點與要檢測的核酸相關聯(lián)。
59.如權利要求43所述的核酸檢測裝置，其特征在于，所述裝置包含或操作性連接包含于計算機或計算機可讀介質(zhì)中的系統(tǒng)指令，所述系統(tǒng)指令將一種或多種信號強度測量值與熱調(diào)節(jié)模塊進行的擴增循環(huán)數(shù)相關聯(lián)，以測定通過所述裝置檢測的靶標核酸的濃度。
60.一種包含如權利要求43所述裝置的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)操作性連接計算機，所述計算機包含控制熱調(diào)劑模塊進行的熱循環(huán)并指明光學系統(tǒng)何時成像何時讀圖的指令，所述計算機還包含把圖片信息轉(zhuǎn)化成時間函數(shù)的信號強度曲線并/或測定由所述裝置分析的靶標核酸的濃度的指令。
61.如權利要求60所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述計算機包含檢測陣列一個或多個區(qū)域的局部背景的指令，和通過校正所述背景來標準化信號強度測量值的指令。
62.如權利要求60所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述計算機包含通過對陣列上捕獲核酸點樣差異、或陣列不同區(qū)域視野不等進行校正來標準化信號強度的指令。
63.一種核酸檢測耗材，所述耗材包含:厚度小于約500 μ m的薄腔室，所述腔室包含光學透明窗，所述窗在窗內(nèi)表面設置有高效捕獲核酸陣列，所述腔室還包含與所述腔室流體相通的至少一個試劑遞送端口，其中耗材的構造允許所述腔室中的流體熱循環(huán)。
64.如權利要求63所述的耗材，其特征在于，所述核酸陣列包含多種不同的捕獲核酸類型，分別位于所述陣列的不同空間區(qū)域。
65.如權利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室包含含有試劑遞送端口的第一上表面，和含有所述窗的底部透明表面，所述上表面和底部表面通過包含壓敏粘合材料的側(cè)壁結合。
66.如權利要求63所述的耗材,所述腔室包含含有試劑遞送端口的第一上表面,和含有所述窗的底部透明表面，所述上表面和底部表面通過位于上表面和/或下表面上的襯墊或特形結構結合在一起，其中所述襯墊或結構融合或附著在上表面和/或下表面上的相應區(qū)域。
67.如權利要求66所述的耗材，其特征在于，所述上表面和下表面超聲融合在一起，所述襯墊或結構劃定融合區(qū)域的界限。
68.如權利要求66所述的耗材，其特征在于，所述結構是上表面或下表面上的透明區(qū)和相應上表面或下表面上的對應陰影區(qū)，所述上表面或下表面能通過引導激光透過透明區(qū)射到陰影區(qū)而激光焊接在一起。
69.如權利要求66所述的耗材，其特征在于，所述襯墊或結構引導UV可固化粘合劑的流動，所述粘合劑在上表面和下表面之間流動并接受UV光從而將所述上表面和下表面彼此結合。
70.如權利要求65所述的耗材,其特征在于,所述捕獲核酸陣列結合于所述窗的熱穩(wěn)定涂層上。
71.如權利要求70所述的耗材，其特征在于，所述涂層包含化學反應基團、親電基團、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、單硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、?；B氮、環(huán)氧、氮雜環(huán)丙烷、醛、α，不飽和酮或包含乙烯酮或馬來酰亞胺的酰胺、?；u化物、磺酰鹵、亞酰胺、環(huán)酸酐、環(huán)加成反應中的活性基團、烯烴、二烯、炔烴、疊氮化物或其組合。
72.如權利要求65所述的耗材，其特征在于，所述捕獲核酸陣列的排布密度大于2000fmol/cm2。
73.如權利要求65所述的耗材，其特征在于，所述捕獲核酸陣列的排布密度大于2500fmol/cm2。
74.如權利要求70所述的耗材，其特征在于，所述窗包含陶瓷、玻璃、石英或聚合物。
75.如權利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室厚度約10μ m —約200 μ m。
76.如權利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室厚度約140μ m或更薄。
77.如權利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室厚度約100μ m或更薄。
78.如權利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室平均直徑約Imm—約50mm。
79.如權利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室平均直徑約IOmm—約20mm。
80.一種試劑盒，包含包裝在包裝材料中的權利要求63所述耗材，所述試劑盒可選包含一種或多種對照試劑。
81.—種檢測樣品中靶標核酸存在的方法，所述方法包含: 在第一標記探針存在下，用有核酸酶活性的聚合酶對樣品進行擴增反應，所述第一標記探針包含與第一靶標核酸序列互補的第一部分和與第一靶標核酸序列不互補的帶標記的第二部分，由此，當擴增所述靶標核酸序列時，所述第二部分從第一部分上切下； 將所述帶標記的第二部分與包含與該第二部分互補的捕獲探針的基材雜交；和 檢測與基材上捕獲探針雜交的所述帶標記的第二部分。
82.如權利要求81所述的方法，其特征在于，所述基材包含平面基材。
83.如權利要求81所述的方法，其特征在于，所述基材包含珠。
84.如權利要求82所述的方法，其特征在于，所述方法還包含提供多種標記探針，所述多種標記探針分別具有與不同靶標核酸序列互補的第一部分和帶標記的第二部分，所述帶標記的第二部分包含各不相同且與不同靶標核酸序列都不互補序列，由此，當擴增不同靶標核酸序列時，所述帶標記的第二部分從第一部分上切下； 將擴增反應中切下的所述帶標記的第二部分與分別與之互補的不同捕獲探針雜交，不同捕獲探針各自置于平面基材的不同的已知位點上；和 根據(jù)所述基材上帶標記第二部分與捕獲探針雜交的位置鑒定樣品中存在的靶標核酸序列。
85.如權利要求83所述的方法，其特征在于，所述方法還包含提供多種標記探針，所述多種標記探針各有分別與不同靶標核酸序列互補的第一部分和帶標記的第二部分，所述帶標記的第二部分包含與不同靶標核酸序列都不互補的各不相同的序列，由此，當擴增不同靶標核酸序列時，所述第二標記部分從第一部分上切下； 將擴增反應中切下的所述帶標記第二部分與分別與之互補的多種不同捕獲探針雜交，其中不同捕獲探針各自置于各 有獨特標記的不同珠上；和
通過鑒定其結合的珠來檢測給定靶標核酸序列的存在。
【文檔編號】C12N15/11GK103502471SQ201280018955
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年2月17日 優(yōu)先權日:2011年2月18日
【發(fā)明者】K·斯卡布, P·馬丁, B·塔弗特 申請人:Nvs技術股份有限公司