前列腺癌細(xì)胞系、遺傳標(biāo)志及其用途
【專利摘要】本公開內(nèi)容涉及包含原代哺乳動物上皮細(xì)胞中的至少一種或一組的哺乳動物前列腺癌細(xì)胞系，所述細(xì)胞已感染攜帶癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述癌基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合，并且在所述細(xì)胞中表達(dá)所述基因。前列腺細(xì)胞系包括前列腺癌的免疫感受態(tài)動物模型的應(yīng)用、用于永生化原代哺乳動物上皮細(xì)胞的體外生產(chǎn)的方法、測定具有前列腺癌的人受試者是否患有轉(zhuǎn)移或處于發(fā)展轉(zhuǎn)移的危險中的方法、在處于發(fā)展癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移的危險中的受試者中預(yù)防癌癥或抑制對治療敏感的癌癥轉(zhuǎn)移的方法、和鑒定選擇性干擾癌細(xì)胞的增殖或活力的候選化合物的方法，所述癌細(xì)胞具有升高水平的CCR5。
【專利說明】前列腺癌細(xì)胞系、遺傳標(biāo)志及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]提供了用于診斷和治療癌癥包括前列腺癌的方法和組合物。本發(fā)明的具體方面涉及對于前列腺癌診斷、研究、治療分層和治療有用的方法和組合物。本發(fā)明中還提供的是可在這些方法中使用的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因非人動物。
[0002]關(guān)于聯(lián)邦贊助研究開發(fā)的聲明
[0003]本發(fā)明在由美國國立衛(wèi)生研究院(Nat1nal Institutes of Health,NIH)授予的授權(quán)號 R01CA70896、R01CA75503、R01CA86072、P30CA56036 和 R01CA132115-02 下由政府支持進(jìn)行。政府在本發(fā)明中擁有一定權(quán)利。

【背景技術(shù)】
[0004]癌癥是遍及全世界的重大健康問題。盡管在癌癥檢測和治療中已取得進(jìn)展，但目前無法獲得用于預(yù)防和/或治療的疫苗或其他普遍成功的方法。一般基于化學(xué)療法或手術(shù)和放射的組合的目前療法在許多患者中繼續(xù)證明是不足夠的。
[0005]例如，前列腺癌是對于在美國和遍及全世界的男性的重大健康問題。盡管在該疾病檢測和治療中已取得進(jìn)展，但前列腺癌仍是男性中的癌癥相關(guān)死亡的重要原因，每年影響美國超過221，000名男性。對于北美的男性，獲得前列腺癌的壽命優(yōu)勢目前是19.6%，具有4.6%的死亡風(fēng)險。前列腺癌是2009年全世界約250，000例死亡的原因。
[0006]目前無法獲得用于預(yù)防或治療前列腺癌的疫苗或其他普遍成功的方法。該疾病的管理目前依賴早期診斷(通過常規(guī)前列腺特異性抗原(“PSA”)測試)和侵入性治療的組合，所述侵入性治療可包括多種治療例如手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法和激素療法中的一種或多種。關(guān)于特定前列腺癌的治療過程通?；诙喾N前列腺參數(shù)包括組織學(xué)分析和疾病傳播加以選擇。然而，目前作為篩選標(biāo)準(zhǔn)的PSA的使用導(dǎo)致較不優(yōu)化的治療決策，因?yàn)镻SA測試具有高假陽性和假陰性率。2009年在美國進(jìn)行約45，000, 000次PSA，具有約27%的特異性?；谏叩腜SA，去年在美國采取約I百萬次前列腺活組織檢查，從其中鑒定250，000例腫瘤。在前列腺癌患者中觀察到的高死亡率指出在該疾病的治療、診斷和預(yù)防中需要改善。
[0007]關(guān)于PSA測試使用的另一復(fù)雜因素是醫(yī)生關(guān)于PSA篩選的建議不同。一些人鼓勵超過50歲的男性每年篩選，并且一些人建議處于前列腺癌的更高危險中的男性在40或45歲時開始篩選。另外其他人警告常規(guī)篩選。一般來講，4.0ng/mL以下的PSA水平視為正常的。然而，考慮到兩個報道，即Thompson IM等人的一個(“Prevalence of prostate canceramong men with a prostate-specific antigen level<or=4.0ng per milliliter,，，NewEngland Journal of Medicine2004, 350 (22)，2239-2246)和 Smith DS 等人的另一個(“The early detect1n of prostate carcinoma with prostate specific antigen:TheWashington University experience, ” Cancer 1997，80 (9), 1853-1856),參考的 PSA 水平看起來是任意且無用的。根據(jù)Thompson IM等人,在具有等于或小于4.0ng/mL的PSA水平的15.2百分比的男性中診斷出前列腺癌。那些男性中的百分之十五或總共約2.3百分比男性具有高分級的癌癥。根據(jù)Smith DS等人，發(fā)現(xiàn)具有4.1-9.9ng/mL的PSA水平和經(jīng)歷前列腺活組織檢查的25 - 35百分比的男性具有前列腺癌，而65-75百分比的剩余男性不具有前列腺癌。因此，不存在特定的正?；虍惓SA水平。
[0008]此外，促成前列腺癌復(fù)發(fā)和治療抗性的分子機(jī)制知之甚少。雄激素剝奪療法導(dǎo)致60%-80%初始應(yīng)答率(參見Scher, H.1.和Sawyers, C.L.，J Clin0ncol2005, 23，8253-8261)。然而，經(jīng)歷雄激素拮抗劑療法的大多數(shù)患者隨后復(fù)發(fā)。早期診斷可提供治愈手術(shù)的機(jī)會，然而，接受根治性前列腺切除術(shù)的~30%男性復(fù)發(fā)，促成微轉(zhuǎn)移疾病。因此，存在可在該疾病的早期階段時檢測和/或阻止轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的分子驅(qū)動物的醫(yī)學(xué)干預(yù)的需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]在一個方面，本發(fā)明提供了哺乳動物前列腺癌細(xì)胞系，其包含一組原代哺乳動物上皮細(xì)胞中的至少一種或多種，所述細(xì)胞已感染攜帶癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在某些實(shí)施例中，癌基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合，并且在所述細(xì)胞中表達(dá)所述癌基因或基因組合。哺乳動物前列腺癌細(xì)胞系可包括任何合適的哺乳動物細(xì)胞，包括原代鼠上皮細(xì)胞。原代哺乳動物上皮細(xì)胞可源自任何免疫感受態(tài)哺乳動物，包括免疫感受態(tài)嚙齒類動物，包括大鼠和小鼠。
[0010]在另一方面，本發(fā)明提供了癌癥動物模型，包括植入癌細(xì)胞系的免疫感受態(tài)哺乳動物，所述癌細(xì)胞系用選自C-Myc、Ha-Ras、NeuT、C-SrC及其組合的一組癌基因中的一種或多種轉(zhuǎn)化。
[0011]在一個實(shí)施例中，基于選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合的一組癌基因中的一種或多種的表達(dá)水平，使用本發(fā)明的哺乳動物前列腺癌細(xì)胞系產(chǎn)生的免疫活性轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)展能夠產(chǎn)生可檢測的分子遺傳標(biāo)志的前列腺腫瘤。
[0012]在又一方面，本發(fā)明提供了用于體外生產(chǎn)永生化原代哺乳動物上皮細(xì)胞的方法，該方法包括用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染原代哺乳動物上皮細(xì)胞，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合的癌基因，以提供受感染細(xì)胞，其中所述原代哺乳動物上皮細(xì)胞能夠被所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和在這樣的條件下感染，由此在所述受感染細(xì)胞中表達(dá) c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c~Src 及其組合。
[0013]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用于診斷前列腺癌的方法，該方法包括:(a)提供來自受試者的生物學(xué)測試樣品，所述受試者患有前列腺癌或懷疑具有前列腺癌或處于發(fā)展前列腺癌的危險中；(b)基于測試樣品中的一組基因中的一種或多種的基因表達(dá)模式或活性，測定至少一種生物標(biāo)記或分子遺傳標(biāo)志的水平，其中一組或多組基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c_Src及其組合；(c)比較所述測試樣品中的所述至少一種生物標(biāo)記或所述分子遺傳標(biāo)志的水平與對照樣品中的生物標(biāo)記的水平或分子遺傳標(biāo)志的水平，其中相對于所述對照樣品中的生物標(biāo)記或分子遺傳標(biāo)志的水平，所述測試樣品中的生物標(biāo)記或分子遺傳標(biāo)志的水平升高是所述受試者中的前列腺癌存在的診斷指示物。
[0014]在又一方面，本發(fā)明提供了分類癌癥腫瘤包括前列腺腫瘤的方法，該方法包括:(a)提供癌癥腫瘤或前列腺腫瘤樣品；(b)檢測源自樣品中的一組基因中的一種或多種的基因表達(dá)模式或活性的分子遺傳標(biāo)志，其中所述基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合；和(c)基于檢測步驟(b)的結(jié)果，將前列腺腫瘤分類為屬于腫瘤亞類。
[0015]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了將具有癌癥腫瘤包括前列腺腫瘤的受試者分層用于臨床試驗(yàn)的方法，該方法包括:(a)提供源自具有癌癥腫瘤或前列腺腫瘤的受試者的樣品；(b)檢測源自樣品中的一組基因中的一種或多種的基因表達(dá)模式或活性的分子遺傳標(biāo)志，其中所述基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src、ErbB2及其組合；和(c)基于檢測步驟的結(jié)果，將受試者分層用于臨床試驗(yàn)。
[0016]在另一方面，本發(fā)明提供了選擇用于具有前列腺腫瘤的受試者的治療的方法，該方法包括:(a)提供源自具有前列腺腫瘤的受試者的樣品；(b)檢測源自樣品中的一組基因中的一種或多種的基因表達(dá)模式或活性的分子遺傳標(biāo)志，其中所述基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合；和(c)基于檢測步驟的結(jié)果選擇治療。
[0017]在又一方面，本發(fā)明提供了通過用一種或多種外源癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的非天然存在的細(xì)胞，允許所述細(xì)胞分裂至少一次，其中所述細(xì)胞是被含有一種或多種外源癌基因的載體轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，其中所述一種或多種外源癌基因選自c-Myc、Ha-Ras, NeuT,c-Src及其組合。
[0018]已發(fā)現(xiàn)前列腺上皮細(xì)胞的癌基因轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)與趨化因子受體5型(“CCR5”)及其配體(CCL5、CCL8、CCL7)的表達(dá)增加相關(guān)的轉(zhuǎn)移細(xì)胞。CCR5受體在功能上與骨轉(zhuǎn)移有關(guān)，如通過使用每日口服CCR5拮抗劑馬拉維若減少轉(zhuǎn)移證明的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1示出癌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的PEC系在軟瓊脂中形成集落；
[0020]圖2示出通過陣列CGH評估的在四個癌基因細(xì)胞系中的拷貝數(shù)異常；
[0021]圖3示出前列腺上皮細(xì)胞系在免疫感受態(tài)小鼠中生長；
[0022]圖4示出癌基因轉(zhuǎn)化的前列腺上皮細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)移至肺；
[0023]圖5示出微陣列基因表達(dá)的層次聚類；
[0024]圖6示出前列腺腫瘤中的c-Myc和Ha-Ras特異性癌基因標(biāo)志在其他組織中是保守的；
[0025]圖7示出癌基因轉(zhuǎn)化的前列腺癌細(xì)胞系與無復(fù)發(fā)存活的基因表達(dá)關(guān)聯(lián)；和
[0026]圖8示出癌基因轉(zhuǎn)化的前列腺癌細(xì)胞系與無復(fù)發(fā)存活的基因表達(dá)關(guān)聯(lián)。
[0027]圖9示出分化不良的前列腺腺癌的組織學(xué)特征；
[0028]圖10示出同基因前列腺癌細(xì)胞系的3D基質(zhì)膠侵入的Src增強(qiáng)，其中:
[0029]圖1OA示出細(xì)胞遷移的劃痕測定顯示劃痕，
[0030]圖1OB示出關(guān)于N=3次分開實(shí)驗(yàn)的關(guān)閉定量，
[0031]圖1OC示出在基質(zhì)膠中使用前列腺癌細(xì)胞系的3-D侵入測定，和
[0032]圖1OD示出來自對于PEC系(PEC-NeuT、PEC-Ras和PEC-Src)的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均侵入距離土 SEM ；
[0033]圖11示出同基因前列腺癌細(xì)胞系腫瘤是血管的，其中:
[0034]圖1lA示出使用標(biāo)準(zhǔn)化的光子通量來定量腫瘤體積，對于3個系各自在IxlO5細(xì)胞的皮下接種后經(jīng)過3周定量的，在NCR裸鼠中的皮下腫瘤生長，
[0035]圖1lB示出關(guān)于血管性血友病因子(von Willebrand factor, WF)的免疫組織化學(xué)染色，顯示具有Ras系的增強(qiáng)VWF染色的該系血管分布；
[0036]圖12示出前列腺癌系發(fā)展轉(zhuǎn)移。如下呈現(xiàn)來自實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中將用表達(dá)Luc2-番茄紅融合蛋白的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PEC系注射到FVB小鼠的心室內(nèi)，并且每周定量體內(nèi)生物發(fā)光信號:
[0037]圖12A示出在前列腺上皮細(xì)胞的心內(nèi)注射后兩周時的代表性全身生物發(fā)光圖像，
[0038]圖12B示出在同基因前列腺癌系的心內(nèi)注射后，在小鼠中的腦轉(zhuǎn)移的代表性圖像，
[0039]圖12C示出顯示為具有腫瘤的小鼠比例的生物發(fā)光成像(BLI)的定量(平均值±SEM, n=6)，
[0040]圖12D示出對于同基因系各自作為轉(zhuǎn)移性腦腫瘤負(fù)荷的量度的平均總質(zhì)子通量，
[0041]圖12E示出在PEC-Src和PEC-NeuT心內(nèi)注射與細(xì)胞角蛋白14( “CK14”)染色2周后形成的腦轉(zhuǎn)移的蘇木精伊紅(“H&E”)染色，確證在腦內(nèi)前列腺上皮細(xì)胞的存在；
[0042]圖13示出前列腺腫瘤細(xì)胞系的肝轉(zhuǎn)移。如下呈現(xiàn)來自實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中將表達(dá)Luc2-番茄紅融合蛋白的PEC系注射到FVB小鼠的心室內(nèi)，并且定量體內(nèi)生物發(fā)光信號:
[0043]圖13A示出具有肝腫瘤的小鼠百分比，
[0044]圖13B示出通過光子通量測定的腫瘤大小，
[0045]圖13C示出顯示肝轉(zhuǎn)移的代表性小鼠圖像，
[0046]圖13D示出具有腎腫瘤的小鼠百分比，
[0047]圖13E示出通過光子通量的腎腫瘤大小，和
[0048]圖13F示出腎轉(zhuǎn)移的代表性圖像；
[0049]圖14示出同基因前列腺癌細(xì)胞系發(fā)展溶骨性骨轉(zhuǎn)移:
[0050]圖14A示出FVB小鼠的代表性體內(nèi)圖像，所述FVB小鼠經(jīng)歷表達(dá)Luc2_番茄紅融合蛋白的PEC系的心內(nèi)注射，并且定量體內(nèi)生物發(fā)光信號，
[0051]圖14B示出作為具有腫瘤的小鼠比例的生物發(fā)光成像(BLI)的定量(平均值±SEM, n=6)，和
[0052]圖14C示出在光子通量上的腫瘤團(tuán)塊大?。?br> [0053]圖15示出溶骨性前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的Src增強(qiáng)。如下呈現(xiàn)來自實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中在PEC-Src心內(nèi)注射后2周，F(xiàn)VB小鼠發(fā)展溶骨性骨病灶:
[0054]圖15A示出與PEC-Ras和PEC-NeuT相比較，骨中的腫瘤面積在PEC-Src組中顯著增加，
[0055]圖15B示出在細(xì)胞的心內(nèi)注射前(t0)和后14天(tl4)的代表性X射線，
[0056]圖15C示出耐酒石酸鹽酸性磷酸酶(“TRAP”)染色，確證骨-腫瘤界面中成骨細(xì)胞(箭頭)的存在，
[0057]圖15D示出骨轉(zhuǎn)移形成后的H&E染色，
[0058]圖15E示出CK14染色，和圖15F示出CK8染色，并且兩者均確證在骨內(nèi)上皮細(xì)胞的存在；
[0059]圖16示出溶骨性前列腺癌細(xì)胞系表達(dá)功能CCL5和骨橋蛋白(“0ΡΝ”)受體:
[0060]圖16A — 16D示出在PEC系上的CCR5表達(dá)的熒光激活細(xì)胞分選器(“FACS”)分析，
[0061] 圖16E和16F示出使用OPN作為CD44配體和CCL5作為CCR5配體進(jìn)行的PEC-Src系的基質(zhì)膠侵入測定，和
[0062]圖16G示出定量為平均值+SEM的PEC-Src系的基質(zhì)膠侵入，和
[0063]圖16F示出在組織培養(yǎng)中的前列腺腫瘤細(xì)胞系的趨化因子受體和配體基因表達(dá)，和
[0064]圖16G示出與組織培養(yǎng)中的表達(dá)相比較，在皮下植入后的細(xì)胞因子配體和受體的相對豐度；
[0065]圖17示出CCR5拮抗劑阻斷脊柱溶骨性前列腺癌轉(zhuǎn)移。來自實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖16A-16D中，其中將用表達(dá)Luc2-番茄紅融合蛋白的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PEC系注射到FVB小鼠的心室內(nèi)，并且在2周后定量體內(nèi)生物發(fā)光信號:
[0066]圖17A示出顯示來自每組小鼠的代表性例子(用口服馬拉維若(8mg/kg)或?qū)φ仗幚硇∈?，
[0067]圖17B不出作為總腫瘤團(tuán)塊的體積分析的光子通量，
[0068]圖17C示出小鼠中的下肢骨質(zhì)量(數(shù)據(jù)是關(guān)于每個組中的N=S只分離小鼠的平均值+SEM, Ρ〈0.05);和
[0069]圖17D顯示小鼠中的下肢骨質(zhì)量的代表性X射線圖像。
[0070]圖18Α-18Η示出與X射線分析關(guān)聯(lián)的氟_18，氟化鈉(“F_18_NaF”)成像證實(shí)脊柱轉(zhuǎn)移的存在；
[0071]圖19A和19B顯示用馬拉維若每日口服處理使脊柱轉(zhuǎn)移減少>90% ;和
[0072]圖20示出來自tPEC細(xì)胞系微陣列的數(shù)據(jù)。

【具體實(shí)施方式】
[0073]本發(fā)明主題目前將在下文參考附圖和其中顯示了代表性實(shí)施例的實(shí)例更全面地描述。然而，本發(fā)明主題可以不同形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)解釋為限制于本文闡述的實(shí)施例。相反，這些實(shí)施例提供用于描述且賦予本領(lǐng)域技術(shù)人員方法。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與主題所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。本文提及的所有公開物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)全文以引用的方式并入。
[0074]1.動物模型和細(xì)胞系:
[0075]用于疾病例如癌癥且特別是前列腺癌的新治療需要在動物中的新測試方案。這些測試方案已受限于可植入免疫感受態(tài)(或“免疫活性”)動物中的前列腺癌細(xì)胞系的缺乏。這是重要的，因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)在人前列腺癌的發(fā)作和進(jìn)展中起重要作用。為了篩選對于治療具有前列腺癌的患者有用的新藥，必須開發(fā)可在免疫感受態(tài)動物中研究的前列腺癌細(xì)胞系，所述免疫感受態(tài)動物通過組織學(xué)反映人疾病，并且在體內(nèi)經(jīng)歷相同類型的行為，包括如在人疾病中發(fā)生的對肺和骨的轉(zhuǎn)移。
[0076]相應(yīng)地，本發(fā)明的方面提供了可植入免疫感受態(tài)或免疫活性動物中的癌細(xì)胞系，所述動物包括人和非人動物，包括哺乳動物。示例性非人哺乳動物包括例如嚙齒類動物例如大鼠、豚鼠和小鼠，和農(nóng)場動物例如豬、綿羊、山羊、馬和牛。
[0077]因?yàn)樵隗w內(nèi)的任何類型的細(xì)胞均可以是癌癥的來源，所以任何合適類型的癌細(xì)胞系均可在本發(fā)明中使用。合適的癌癥類型包括癌(上皮細(xì)胞的癌癥)、肉瘤(骨、肌肉或其他結(jié)締組織的癌癥)、淋巴瘤(淋巴系統(tǒng)的癌癥)、白血病(血細(xì)胞或血前體細(xì)胞的癌癥)和黑素瘤(色素提供細(xì)胞的癌癥)。
[0078]在一個實(shí)施例中，提供了前列腺癌細(xì)胞系，其中所述前列腺細(xì)胞系包含一組原代哺乳動物上皮細(xì)胞中的至少一種或多種，其已感染攜帶癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述癌基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合，并且在所述細(xì)胞中表達(dá)所述癌基因或基因組合。
[0079]在一個實(shí)施例中，提供了小鼠前列腺癌細(xì)胞系，其中鼠前列腺細(xì)胞用選自c-Myc、Ha-Ras,NeuT,c-Src及其組合的癌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。合適的小鼠前列腺細(xì)胞系可通過用攜帶癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在這樣的條件下感染原代鼠上皮細(xì)胞而獲得，所述條件允許癌基因在原代鼠上皮細(xì)胞中表達(dá)。
[0080]例如，人癌癥的轉(zhuǎn)基因免疫活性小鼠模型具有比異種移植物模型更多反映人癌癥的潛力，因?yàn)橛绕涫寝D(zhuǎn)基因小鼠形成原位腫瘤(即在更類似于人腫瘤的環(huán)境中和在正常免疫系統(tǒng)的設(shè)置中)。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，將免疫活性非人哺乳動物改造為表達(dá)本文描述的癌基因中的一種或多種，包括c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src或其組合，且發(fā)展癌癥。
[0081]存在在研究中使用人癌癥的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的幾個優(yōu)點(diǎn)。例如，小動物X射線計算機(jī)體層攝影術(shù)(微型CT)可用于相對廉價地監(jiān)控腫瘤的進(jìn)展，并且作為用于臨床前顯現(xiàn)血管和血管生成的高度定量的三維方法。使用此類方法能夠在活小鼠中在臨床前治療試驗(yàn)過程中實(shí)現(xiàn)血管分布的快速和準(zhǔn)確評估。用微型CT的腫瘤評估允許數(shù)據(jù)的快速定量視覺繪制以及腫瘤血容量、血管密度、血管管徑、支化度和使用分段分析的彎曲度的定量分析。
[0082]適合于在本發(fā)明中使用的免疫活性小鼠的例子包括(隨機(jī)配種的⑶1，圣康斯坦的查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(Charles River Laboratories, St.Constant, PQ) > C57BI/6J (B6) >C57BI/6X129/J Fl (Fl，緬因州巴爾港的杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Jackson Laboratories, BarHarbor, ME) )、FVB/N、C57BV6、BALB/c 和 ND4。
[0083]在優(yōu)選實(shí)施例中，F(xiàn)VB/N小鼠依照本發(fā)明用于改造轉(zhuǎn)基因小鼠模型。FVB/N小鼠適合于本文考慮和/或描述的大多數(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)和遺傳分析。近交FVB/N品系的特征在于強(qiáng)生殖能力和一致的大窩，并且FVB/N受精卵含有大和突出的原核，其促進(jìn)DNA的顯微注射。
[0084]基于選自c-Myc、Ha-Ras> NeuT、c_Src及其組合的一組癌基因中的一種或多種的表達(dá)水平，使用本發(fā)明的哺乳動物前列腺癌細(xì)胞系產(chǎn)生的免疫活性轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)展能夠產(chǎn)生可檢測的分子遺傳標(biāo)志的前列腺腫瘤。
[0085]轉(zhuǎn)移是癌癥患者中的死亡主因。目前的化學(xué)療法抗癌治療使用旨在減少患者體內(nèi)癌細(xì)胞數(shù)目的細(xì)胞毒性、激素或免疫調(diào)節(jié)劑藥物。然而，漸增的大量證據(jù)顯示大多數(shù)轉(zhuǎn)移細(xì)胞對抗癌藥物有抵抗力，并且因此目前可用的藥物無法有效停止癌細(xì)胞散布到其他組織或器官。目前，不存在用于治療大多數(shù)轉(zhuǎn)移性腫瘤的有效方法，盡管有癌癥治療領(lǐng)域中的眾多和不同的治療革新。
[0086]“載體”或“構(gòu)建體”指包含在體外或體內(nèi)遞送給宿主細(xì)胞的多核苷酸的大分子或分子復(fù)合物。待遞送的多核苷酸可包含目的序列用于基因療法。載體包括例如轉(zhuǎn)座子和其他位點(diǎn)特異性可動元件，病毒載體例如腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、痘病毒、乳頭狀瘤病毒、慢病毒、皰疹病毒、泡沫病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并且包括假型病毒、脂質(zhì)體和其他含脂質(zhì)復(fù)合物，及其他能夠介導(dǎo)多核苷酸遞送至宿主細(xì)胞的大分子復(fù)合物，例如DNA包被的金顆粒、聚合物-DNA復(fù)合物、脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物、脂質(zhì)體-聚合物-DNA復(fù)合物、病毒-聚合物-DNA復(fù)合物例如腺病毒-聚賴氨酸-DNA復(fù)合物、和抗體-DNA復(fù)合物。載體還可包含其他組分或功能性，其還調(diào)芐基因遞送和/或基因表達(dá)，或另外對載體將引入其內(nèi)的細(xì)胞提供有利性質(zhì)。此類其他組分包括例如影響與細(xì)胞的結(jié)合或?qū)?xì)胞的靶向的組分(包括介導(dǎo)細(xì)胞型或組織特異性結(jié)合的組分)；影響載體核酸由細(xì)胞攝取的組分；影響多核苷酸在攝取后在細(xì)胞內(nèi)的定位的組分(例如介導(dǎo)核定位的試劑)；和影響多核苷酸表達(dá)的組分。此類組分還可包括標(biāo)記，例如可檢測和/或可選標(biāo)記，其可用于檢測或選擇已吸收且表達(dá)由載體遞送的核酸的細(xì)胞。此類組分可提供作為載體的天然特征(例如某些病毒載體的使用，所述病毒載體具有介導(dǎo)結(jié)合和攝取的組分或功能性)，或載體可進(jìn)行修飾以提供此類功能性。大量多樣的此類載體是本領(lǐng)域已知的，并且是一般可獲得的。當(dāng)載體維持在宿主細(xì)胞中時，載體可作為自主結(jié)構(gòu)在有絲分裂過程中由細(xì)胞穩(wěn)定地復(fù)制，摻入宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，或維持在宿主細(xì)胞的核或細(xì)胞質(zhì)中。
[0087]人前列腺癌已嵌入反映癌基因信號傳導(dǎo)的基因構(gòu)成和標(biāo)志內(nèi)。本發(fā)明的細(xì)胞系有利地反映這些癌基因信號傳導(dǎo)途徑中的一種或多種， 從而有利于例如癌基因特異性化合物或基于核酸的療法的測試。特別地，如本文提供的前列腺癌細(xì)胞系對于癌基因特異性化合物或基于核酸的療法的測試和/或篩選是有用的。
[0088]合適的癌基因特異性抑制劑的例子包括對于c-Myc、Ha-Ras, c-Src和ErbB2癌基因的抑制劑。在臨床使用或開發(fā)中的靶向ErbB的幾種合適的抗癌劑，包括屬于針對ErbB家族的嵌合或人源化單克隆抗體種類的那些和小分子ErbB酪氨酸激酶抑制劑。嵌合或人源化單克隆包括阻止配體結(jié)合和配體依賴性受體激活的抗體(例如靶向ErbBl的配體結(jié)合亞結(jié)構(gòu)域III的西妥昔單抗)、干擾配體依賴性受體激活的抗體(例如靶向ErbB2的亞結(jié)構(gòu)域IV的曲妥珠單抗)、和阻止受體異二聚化的抗體(例如靶向ErbB2的亞結(jié)構(gòu)域II中的二聚環(huán)周圍區(qū)域的抗ErbB2抗體帕妥珠單抗)。示例性小分子ErbB酪氨酸激酶抑制劑包括兩種ErbBl特異性酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼/易瑞沙和厄洛替尼，其已批準(zhǔn)用于治療非小細(xì)胞肺癌，和雙重ErbBl/ErbB2抑制劑拉帕替尼，其作為TYKERB?上市并且指出與卡培他濱組合用于治療具有晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者；并且與來曲唑組合用于治療具有過表達(dá)HER2的激素受體陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的絕經(jīng)后女性。
[0089]其他ErbB2受體抑制劑包括GW-282974 (葛蘭素威康公司(Glaxo WellcomePLC)),以及單克隆抗體AR-209 (美國德克薩斯州林地市的Aronex制藥有限公司(AronexPharmaceuticals Inc.0f The Woodlands, Tex., USA))和 2B-1 (Chiron)。不例性 ErbB2 抑制劑還包括在W01998/02434 (1998年I月22日公開)、TO1999/35146 (1999年7月15日公開)、W01999/35132 (1999 年 7 月 15 日公開)、W01998/02437 (1998 年 I 月 22 日公開)、W01997/13760 (1997 年 4 月 17 日公開)、W01995/19970 (1995 年 7 月 27 日公開)、美國專利號5，587，458 (1996年12月24日頒布)和美國專利號5，877，305 (1999年3月2日頒布)中描述的那些，所述專利各自全文以引用的方式并入本文。在本發(fā)明中有用的ErbB2受體抑制劑也在1999年I月27日提交的美國臨時申請?zhí)?0/117，341和1999年I月27日提交的美國臨時申請?zhí)?0/117，346中描述，所述申請全文以引用的方式并入本文。
[0090]在本發(fā)明中有用的c-Src蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑的例子包括但不限于一般和具體公開于 W01996/10028、W01997/28161、W01997/32879 和 W01997/49706 中的化合物，包括屬于下述結(jié)構(gòu)種類的化合物:吡咯并嘧啶尤其是吡咯并[2，3-d]嘧啶、嘌呤、吡唑并嘧啶尤其是吡唑并[3，4-d]嘧啶、吡唑并嘧啶尤其是吡唑并[3，4-d]嘧啶和吡啶并嘧啶尤其是吡啶并[2，3-d]嘧啶。示例性化合物包括下式1-1V的化合物。
[0091]

【權(quán)利要求】
1.一種包含原代哺乳動物上皮細(xì)胞中的至少一種或一組的哺乳動物前列腺癌細(xì)胞系，所述細(xì)胞已感染攜帶癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述癌基因選自c-Myc、Ha-Ras, NeuT,c-Src及其組合，并且在所述細(xì)胞中表達(dá)所述基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動物前列腺癌細(xì)胞系，其中所述原代哺乳動物上皮細(xì)胞包括原代鼠上皮細(xì)胞。
3.根據(jù) 權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)所述的哺乳動物前列腺癌細(xì)胞系，其中所述原代哺乳動物上皮細(xì)胞源自一個免疫感受態(tài)小鼠或多個免疫感受態(tài)小鼠。
4.一種人前列腺癌的動物模型，所述動物模型包括植入根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的哺乳動物前列腺癌細(xì)胞系的免疫感受態(tài)非人哺乳動物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的動物模型，其中所述非人哺乳動物選自嚙齒類動物例如大鼠、豚鼠和小鼠；和農(nóng)場動物例如豬、綿羊、山羊、馬和牛。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的動物模型，其中所述非人哺乳動物是嚙齒類動物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4和5中任一項(xiàng)所述的動物模型，其中所述非人哺乳動物是小鼠。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的動物模型，其中所述非人哺乳動物是FVB/N小鼠。
9.一種發(fā)展前列腺腫瘤的免疫感受態(tài)轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述前列腺腫瘤產(chǎn)生一組癌基因中的一種或多種特有的分子遺傳標(biāo)志，所述癌基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合。
10.一種用于體外生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的永生化原代哺乳動物上皮細(xì)胞的方法，所述方法包括用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染原代哺乳動物上皮細(xì)胞，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT> c_Src及其組合的癌基因，以提供受感染細(xì)胞，其中所述原代哺乳動物上皮細(xì)胞能夠被所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和在這樣的條件下感染，由此在所述受感染細(xì)胞中表達(dá)c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c_Src及其組合。
11.一種用于診斷受試者中的前列腺癌的方法，所述受試者患有前列腺癌或懷疑具有前列腺癌或處于發(fā)展前列腺癌的危險中，所述方法包括: (a)提供來自受試者的生物學(xué)測試樣品，所述受試者患有前列腺癌或懷疑具有前列腺癌或處于發(fā)展前列腺癌的危險中； (b)基于得自所述受試者的生物學(xué)測試樣品中的基因表達(dá)模式，測定至少一種生物標(biāo)記的水平，其中所述基因表達(dá)模式與選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合的一種或多種癌基因的組相關(guān)； (C)比較所述生物學(xué)測試樣品中的所述至少一種生物標(biāo)記的水平與對照樣品中的所述生物標(biāo)記的水平， 其中相對于所述對照樣品中的所述生物標(biāo)記的水平，所述測試樣品中的所述生物標(biāo)記的水平升高是所述受試者中的前列腺癌存在的診斷指示物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于診斷前列腺癌的方法，其中遺傳材料源自所述前列腺癌或與前列腺有關(guān)的生物流體，包括前列腺、尿和血液。
13.一種將前列腺癌/腫瘤分類成不同前列腺癌亞類的方法，所述前列腺癌亞類具有選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合的一種或多種癌基因的組特有的基因表達(dá)模式，所述方法包括: (a)提供前列腺癌/腫瘤樣品；(b)檢測源自所述樣品中的所述一種或多種癌基因的組的基因表達(dá)模式或活性的分子遺傳標(biāo)記；和 (C)基于所述檢測步驟(b)的結(jié)果，將所述前列腺腫瘤分類為屬于癌癥/腫瘤亞類。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分類前列腺癌/腫瘤的方法，其中所述步驟(c)的分類步驟包括使所述樣品中的分子遺傳標(biāo)記與所述前列腺癌的組織病理學(xué)分級關(guān)聯(lián)。
15.根據(jù)權(quán)利要求 13所述的分類前列腺癌/腫瘤的方法，其中所述前列腺癌亞類具有所述c-Myc癌基因特有的基因表達(dá)模式。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分類前列腺癌/腫瘤的方法，其中所述前列腺癌亞類具有所述Ha-Ras癌基因特有的基因表達(dá)模式。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分類前列腺癌/腫瘤的方法，其中所述前列腺癌亞類具有所述NeuT癌基因特有的基因表達(dá)模式。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分類前列腺癌/腫瘤的方法，其中所述前列腺癌亞類具有所述c-Src癌基因特有的基因表達(dá)模式。
19.一種將具有前列腺腫瘤的受試者分層用于臨床試驗(yàn)的方法，所述方法包括: (a)提供源自具有前列腺腫瘤的受試者的樣品； (b)檢測源自所述樣品中的一組基因中的一種或多種的基因表達(dá)模式或活性的分子遺傳標(biāo)志，其中所述基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合；和 (C)基于所述檢測步驟(b)的結(jié)果，將所述受試者分層用于臨床試驗(yàn)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述(c)中的分層步驟在比較所述(b)中的檢測步驟的結(jié)果與得自對照樣品的結(jié)果后進(jìn)行。
21.一種選擇用于具有前列腺癌/腫瘤的受試者的治療的方法，所述方法包括: (a)提供源自具有前列腺癌/腫瘤的受試者的樣品； (b)檢測源自所述樣品中的一組基因中的一種或多種的基因表達(dá)模式或活性的分子遺傳標(biāo)志，其中所述基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其組合；和 (C)基于所述檢測步驟(b)的結(jié)果選擇治療。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述(c)中的選擇步驟在比較所述(b)中的檢測步驟的結(jié)果與得自對照樣品的結(jié)果后進(jìn)行。
23.一種通過用一種或多種外源癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的非天然存在的細(xì)胞，允許所述細(xì)胞分裂至少一次，其中所述細(xì)胞是被含有所述外源癌基因的載體轉(zhuǎn)化的人細(xì)胞，其中所述一種或多種外源癌基因選自c-Myc、Ha-Ras、NeuT> c_Src及其組合。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的非天然存在的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原代哺乳動物上皮細(xì)胞。
25.一種用于選擇用于具有癌癥的受試者的治療的方法，所述方法包括: (a)在得自需要治療癌癥的受試者的樣品中，測定編碼本文描述的基因標(biāo)志或其修飾物的核酸的表達(dá)水平；和 (b)基于所測定的基因標(biāo)志選擇用于所述受試者的治療，其中所述基因標(biāo)志源自選自c-Myc> Ras、ErbB2 和 Src 的癌基因。
26.一種測定具有前列腺癌的人受試者是否患有轉(zhuǎn)移或處于發(fā)展轉(zhuǎn)移的危險中的方法，所述方法包括:(a)從具有前列腺癌或處于發(fā)展前列腺癌的危險中的人受試者獲得生物樣品；和 (b)測定所述樣品中CCR5的表達(dá)水平和/或其配體(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一種的表達(dá)水平，其中所述樣品中的CCR5和/或其配體(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一種的表達(dá)水平如果高于對照表達(dá)水平，則指示所述人受試者可能患有轉(zhuǎn)移或處于發(fā)展轉(zhuǎn)移的危險中。
27.一種在處于發(fā)展癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移的危險中的受試者中預(yù)防癌癥或抑制對治療敏感的癌癥轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括給有此需要的所述受試者施用CCR5拮抗劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述CCR5拮抗劑是馬拉維若或維立韋羅。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述CCR5拮抗劑抑制選自下述的一種或多種器官中的腫瘤轉(zhuǎn)移:肝、腦、膀胱、肺、腎上腺、腎、骨及其組合。
30.一種鑒定選擇性干擾 癌細(xì)胞的增殖或活力的候選化合物的方法，所述癌細(xì)胞具有升高水平的CCR5和/或其配體(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一種，所述方法包括: 使候選化合物與具有升高水平的CCR5和/或其配體(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一種的癌細(xì)胞接觸，和 如果與不具有升高水平的CCR5和/或其配體(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一種的對照細(xì)胞相比較，具有升高水平的CCR5和/或其配體(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一種的所述癌細(xì)胞的增殖或活力降低，則 將所述候選化合物鑒定為干擾具有升高水平的CCR5和/或其配體(例如CCL5、CCL8、CCL7)中的至少一種的所述癌細(xì)胞增殖或活力的化合物。
31.一種用于下調(diào)一種或多種前列腺癌細(xì)胞系的組中的CCR5表達(dá)的體內(nèi)方法，所述前列腺癌細(xì)胞系源自在編碼選自NeuT、Ha-Ras、c-Src及其組合的至少一種癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒中的鼠上皮和前列腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述方法包括: (a)給根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的動物模型施用候選化合物； (b)和測量所述動物模型中的CCR5RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)水平，其中所述動物模型中的所述CCR5表達(dá)水平低于未用所述候選化合物處理的對照動物模型中的所述CCR5表達(dá)水平。
【文檔編號】C12N15/87GK104169425SQ201280020337
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月9日
【發(fā)明者】理查德·G·佩斯泰爾 申請人:理查德·G·佩斯泰爾