青枯病預(yù)防劑和青枯病的預(yù)防方法
【專利摘要】提供能夠預(yù)防不同的各種青枯病菌株引起的青枯病的發(fā)病、即不同的各種植物品種的青枯病的發(fā)病的青枯病預(yù)防劑以及利用該青枯病預(yù)防劑的青枯病的預(yù)防方法。青枯病預(yù)防劑的特征是，以型線狀噬菌體和／或型線狀噬菌體感染的青枯病菌(Ralstonia?solanacearum)作為有效成分。青枯病的預(yù)防方法的特征在于，包括將該青枯病預(yù)防劑接種于植物的工序。該植物優(yōu)選是番茄、土豆、甜椒、茄子、煙草、辣椒、紫蘇、蘿卜、草莓、香蕉、雛菊、菊花或向日葵的任一種。
【專利說(shuō)明】青枯病預(yù)防劑和青枯病的預(yù)防方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用細(xì)菌曬菌體感染的青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的青枯病預(yù)防劑、以及使用該青枯病預(yù)防劑的青枯病的預(yù)防方法。
【背景技術(shù)】
[0002]青枯病(立枯病)是感染以茄子科植物為首的200種以上的植物并使其枯死的、在農(nóng)業(yè)上帶來(lái)嚴(yán)重災(zāi)害的病害。據(jù)說(shuō)在病情發(fā)展迅速的情況下有時(shí)還殘留綠色就枯萎了，故被冠以該名。特征是，將患青枯病的植物的近地面部的莖切斷，將莖浸水的話，產(chǎn)出乳白色的粘液(細(xì)菌粘塊)。
[0003]作為應(yīng)對(duì)青枯病的主要農(nóng)藥，提出有氯化苦或溴甲烷。但是，均為劇毒藥。關(guān)于溴甲烷，由于還是破壞臭氧層的物質(zhì)，在平成17年被中止使用。一般來(lái)說(shuō)，青枯病在比較溫暖的地區(qū)發(fā)生，但由于地球溫暖化傾向加速，青枯病菌的蔓延和農(nóng)作物生產(chǎn)降低，已經(jīng)在全世界產(chǎn)生年9.5兆日元左右的損失。
[0004]如上所述，青枯病發(fā)生在比較溫暖的地區(qū)。但是，在美國(guó)，適應(yīng)了低溫的race3biovar2phylotype II青枯病菌株引起的土豆青枯已經(jīng)成為很大的威脅,入侵日本也只是時(shí)間問(wèn)題。因此，不僅在日本，在全世界范圍都在研究開(kāi)發(fā)用于有效預(yù)防或根治青枯病囷的替代手段。
[0005]例如，專利文獻(xiàn)I中記載了茄子科植物的土壤病害根治方法。具體地，記載了以下方法:將青枯假單胞菌(Pseudomonas solanacearum、現(xiàn)在的學(xué)名是Ralstoniasolanacearum,與青枯病菌同義)菌株M4S的活菌、以及該菌與病原性的青枯假單胞菌兩者溶菌的細(xì)菌噬菌體固定化，將得到的固定化物施用于土壤的方法。另外，專利文獻(xiàn)2中記載了將對(duì)青枯病菌顯示 溶菌性的細(xì)菌噬菌體自身散布于植物或土壤的、青枯病菌的根治方法。進(jìn)而，還記載了將該細(xì)菌噬菌體添加于土壤的土壤改良方法。
[0006]另一方面，專利文獻(xiàn)3、以及非專利文獻(xiàn)I至非專利文獻(xiàn)3中詳細(xì)記載了特異性感染青枯病菌的細(xì)菌噬菌體。例如，記載了具有對(duì)青枯病菌不溶菌的特性的(pRSMl型線狀噬菌體、cpRSM3型線狀噬菌體以及(pRSSl型線狀噬菌體的詳細(xì)情況。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)昭63-22005號(hào)公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2005-278513號(hào)公報(bào)
[0011]專利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)2011-041527號(hào)公報(bào)
[0012]非專利文獻(xiàn)
[0013]非專利文獻(xiàn)1:Takashi Yamada, Takeru Kawasaki, Shoko Nagata, AkikoFujiwara,Shoj i Usami and Makoto Fujie,2007,New bacteriophages that infect thephytopathogen Ralstonia solanacearum.，Microbologyl53，2630—2639
[0014]非專利文獻(xiàn)2:Takeru Kawasaki, Shoko Nagata, Akiko Fujiwara,Hideki Satsuma， Makoto Fujie， Shoji Usami, and Takashi Yamada,2007, GenomicCharacterization ofFilamentous Integrative Bacteriophages, (pRSSl and cpRSMl，That Infect Ralstonia solanacearum.，J.Bacteriol189，5792—5802
[0015]非專利文獻(xiàn)3 ；Askora A.，Kwasaki T.，Usami S.，F(xiàn)ujie M.，and Yamada T.，2009， Host recognition and integration of filamentous phage (pRSM in thephytopathogen, Ralstonia solanacearum.，Virology384,69-76

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]發(fā)明要解決的課題
[0017]但是，如上所述，青枯病的問(wèn)題近年變得嚴(yán)重。因此，可以預(yù)防以及根治race (分離宿主以及宿主范圍)、biovar(生理型、酸的生產(chǎn)能力不同)以及phylotype (菌群)不同的各種青枯病菌株引起的青枯病的發(fā)病等的、多種疫苗的物質(zhì)(通過(guò)事先注入弱病原體而制造抗體，使得之后不易患由同樣的病原體引起的感染癥的物質(zhì))是必要的。
[0018]本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的，目的是提供青枯病預(yù)防劑、以及利用該青枯病預(yù)防劑的青枯病的預(yù)防方法，該青枯病預(yù)防劑可以預(yù)防不同的由各種青枯病菌株引起的青枯病的發(fā)病、即可以預(yù)防在不同的各種植物品種上的青枯病的發(fā)病。
[0019]解決課題的手段
[0020]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):(pRSMl型線狀噬菌體(Ralstonia phage RSM1、DDBJ 的接收編號(hào) AB259123)(以下記為 CpRSMl 噬菌體)、或CpRSM3型線狀噬菌體(Ralstonia phage RSM3、DDBJ的接收編號(hào)AB434711)(以下記為
(PRSM3噬菌體)感染后 的青枯病菌失去其病原性，即使接種于番茄等植物也不發(fā)生青枯病。另外，如果將感染了這些噬菌體的青枯病菌預(yù)先接種于番茄等植物，則之后即使接種具有強(qiáng)病原性的青枯病菌，也顯示強(qiáng)的抵抗性，至少2個(gè)月以上不發(fā)生青枯病。這里，cpRSMl噬菌體是:以噬菌體感染了青枯病菌的狀態(tài)，于2011年4月19日申請(qǐng)保藏于獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(〒292-0818日本國(guó)千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8)，作為微生物的識(shí)別顯示:CpRSMl /M4S,保藏編號(hào):NITE P-1085而被保藏，之后進(jìn)行了向基于布達(dá)佩斯條約的保藏的移交請(qǐng)求，作為保藏編號(hào):NITE BP-1085而被保藏的噬菌體。CPRSM3噬菌體也是:以噬菌體感染了青枯病菌的狀態(tài)，于2011年4月19日申請(qǐng)保藏于獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(〒292-0818日本國(guó)千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8)，作為微生物的識(shí)別顯示:(pRSM3 / 1?)6603、保藏編號(hào):ΝΙΤΕ Ρ-1086而被保藏，之后進(jìn)行了向基于布達(dá)佩斯條約的保藏的移交請(qǐng)求，作為保藏編號(hào):ΝΙΤΕ BP-1086而被保藏的噬菌體。
[0021]進(jìn)而，(pRSMl嗤菌體以及(pRSM3噬菌體的青枯病菌株的宿主特異性彼此大不相同。因此發(fā)現(xiàn):通過(guò)使用這2種曬菌體,能夠預(yù)防race、biovar以及phylotype不同的共計(jì)15菌株的青枯病菌株引起的青枯病的發(fā)病。也就是發(fā)現(xiàn)了:自然界中的各種青枯病菌株預(yù)計(jì)感染CpRSMl嗤菌體或cpRSM3l噬菌體的任一噬菌體的可能性高。圖1是表示本發(fā)明的cpRSM型線狀噬菌體的宿主特異性的圖。圖1之中，+表示對(duì)各菌株的感受性，-表示非感受性。(pRSSl噬菌體(Ralstonia phageRSSl、DDBJ的接收編號(hào)AB259124)是比較對(duì)照。cpRSSl噬菌體，與cpRSMl嗤菌體以及q>RSM3噬菌體同樣地以青枯病菌為宿主，但具有不溶菌的特性(參照非專利文獻(xiàn)2)。如圖1所示，(pRSSl噬菌體，如cpRSMl噬菌體和cpRSM3噬菌體的感受性的組合那樣，均沒(méi)能感染多數(shù)的青枯病菌株。圖2是顯示各種青枯病菌株的特性的圖。關(guān)于圖2所示的詳情，可以參照“堀田光生?土屋健一，2002，微生物遺傳資源利用手冊(cè)(12)-青枯病菌Ralstonia solanacearum-,農(nóng)業(yè)生物資源研究所”。
[0022]因此，本發(fā)明的第I方面的青枯病預(yù)防劑的特征在于以cpRSMl型線狀噬菌體和/或tpRSM3型線狀曬菌體感染的青枯病菌(Ralstonia solanacearum)作為有效成分。
[0023]優(yōu)選地，其特征在于:前述cpRSMl型線狀噬菌體感染的青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)的菌株是 M4S、Ps29、Ps65 或 Ps74 的任一種。
[0024]更優(yōu)選地，其特征在于:前述tpRSM3型線狀曬菌體感染的青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)的菌株是 C319、Ps72 或 Ps74 的任一種。 [0025]本發(fā)明的第2方面的青枯病的預(yù)防方法的特征在于包括將第I方面涉及的青枯病預(yù)防劑接種于植物的工序。
[0026]優(yōu)選地，其特征在于:前述植物是番茄、土豆、甜椒、茄子、煙草、辣椒、紫蘇、蘿卜、草莓、香蕉、雛菊、菊花或向日葵的任一種。
[0027]更優(yōu)選地，其特征在于:前述植物是番茄、土豆、甜椒、茄子或煙草的任一種。
[0028]另外，優(yōu)選地，前述青枯病的預(yù)防方法的特征在于:每植物個(gè)體重量接種前述青枯病菌(Ralstonia solanacearum) IO5 ~IO8Cells / g。
[0029]更優(yōu)選地，前述青枯病的預(yù)防方法的特征在于:每植物個(gè)體重量接種前述青枯病菌(Ralstonia solanacearum)IO6~IO7Cells / g。
[0030]另外，優(yōu)選地，其特征在于:前述青枯病預(yù)防劑接種于前述植物的莖。
[0031]更優(yōu)選地,其特征在于:前述青枯病預(yù)防劑接種于前述植物的莖的地上部I~4cm的位置。
[0032]進(jìn)一步優(yōu)選地，其特征在于:前述青枯病預(yù)防劑在前述植物發(fā)芽后2~4周的時(shí)期接種。
[0033]發(fā)明的效果
[0034]根據(jù)本發(fā)明，提供了青枯病預(yù)防劑、以及利用該青枯病預(yù)防劑的青枯病的預(yù)防方法，該青枯病預(yù)防劑可以預(yù)防不同的由各種青枯病菌株引起的青枯病的發(fā)病、即在不同的各種植物品種上的青枯病的發(fā)病。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035][圖1]表示本發(fā)明的CpRSM型線狀噬菌體的宿主特異性的圖。
[0036][圖2]表示各種青枯病菌株的特性的圖。
[0037][圖3]表示CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的在CPG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的樣態(tài)的圖。[0038][圖4]表示'(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的菌落的形態(tài)的圖。
[0039][圖5]表示(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603以及未感染青枯病菌株MAFF106603的詳細(xì)的特性的圖。
[0040][圖6]表示實(shí)施例1的(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的病原性的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。在發(fā)芽I~6周后的番茄苗的地上2-3片葉間接種了 IO6~IO7ceIls的情況下，ipRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603不影響接種番茄的生長(zhǎng)(左)。但是，噬菌體未感染青枯病菌株MAFF106603，在4日~I周后接種上部完全枯死(右)。對(duì)于各自5例有100%的重現(xiàn)性。
[0041][圖7]表示實(shí)施例2-1的CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603處理中的、I日后的對(duì)青枯病菌株MAFF106603的2次接種的抵抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。在發(fā)芽10日后的番茄苗第I片葉下，I次接種(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603或作為對(duì)照的大腸菌106~107cells ；1日后，在距接種部5mm的上部2次接種IO6~IO7Cells的青枯病菌株MAFF106603，在此情況下，CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的I次接種的番茄健康生長(zhǎng)(左)。但是，對(duì)照的大腸菌I次接種的番茄在4日~I周后完全枯死(右)。對(duì)于各自3例有100%的重現(xiàn)性。
[0042][圖8]表示實(shí)施例2-2的CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603處理中的、2周后的對(duì)青枯病菌株MAFF106603的2次接種的抵抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。對(duì)于與實(shí)驗(yàn)例2_1同樣地進(jìn)行了 I次處理后的番茄苗，2周后2次接種IO6~IO7ceIls的青枯病菌株MAFF106603的情況下，(PRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的I次接種的番茄健康生長(zhǎng)(左)。但是，對(duì)照的大腸菌I次接種的番茄在4日~I周后完全枯死(右)。對(duì)于各自3例有100%的重現(xiàn)性。
[0043][圖9]表示實(shí)施例2-3的CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603處理中的、2個(gè)月后的對(duì)青枯病菌株MAFF106603的2次接種的抵抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。對(duì)于與實(shí)驗(yàn)例2-1同樣地進(jìn)行了 I次處理后的番茄苗,2個(gè)月后2次接種IO6~IO7Cells的青枯病菌株MAFF106603的情況下，CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的I次接種番茄健康生長(zhǎng)(左)。但是，對(duì)照的大腸菌I次接種番茄在4日~I周后，接種部位的上部的葉青枯(右)。對(duì)于各自5例有100%的重現(xiàn)性。
具體實(shí)施方案
[0044]以下、詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。其中，本說(shuō)明書(shū)中，“具有”、“包括”或“含有”的表達(dá)也包括“包含”或“由......構(gòu)成”的意思。
[0045](青枯病預(yù)防劑)
[0046]本發(fā)明的實(shí)施方式I涉及以(pRSMl噬菌體和/或(pRSM3噬菌體感染的青枯病菌作為有效成分的青枯病預(yù)防劑。這里，cpRSMl嗤菌體和q>RSM3噬菌體，具有90%以上的DNA堿基序列同源性，其大的不同點(diǎn)在于宿主識(shí)別蛋白質(zhì)pill的結(jié)構(gòu)。在前述的DDBJ或 NCBI (National Center for Biotechnology Information)等基因組數(shù)據(jù)庫(kù)上，檢測(cè)出顯示與這些噬菌體((pRSMl嗤菌體以及tpRSM3噬菌體)高同源性的噬菌體以及原噬菌體(prophage)。所以，對(duì)于顯示與這些噬菌體在基因組序列上90%以上的同源性的噬菌體，啟示是具有同一系統(tǒng)的特性的噬菌體。另外，對(duì)于(pRSMl噬菌體以及(PRSM3I噬菌體的其他詳細(xì)特性，如上所述，可以參照專利文獻(xiàn)3以及非專利文獻(xiàn)I至非專利文獻(xiàn)3。
[0047]本說(shuō)明書(shū)之中，所謂“青枯病(立枯病)”，如上所述，是指感染以茄子科植物或豆科植物等為首的200種以上的植物而使其枯死的、在農(nóng)業(yè)上帶來(lái)嚴(yán)重災(zāi)害的病害。所以，本說(shuō)明書(shū)中，所謂“青枯病預(yù)防劑”，是指可以預(yù)防、防止這樣的青枯病的病癥以及病害等、或延遲發(fā)病的物質(zhì)，只要是青枯病的疫苗的組合物則任何物質(zhì)都可以。另外，本實(shí)施方式I的青枯病預(yù)防劑，除了作為有效成分的感染了噬菌體的青枯病菌以外，也可以含有一般在藥學(xué)、植物學(xué)上容許的其他物質(zhì).組合物等。[0048]φΚ^Μ1噬菌體*iipR^M；3噬菌體感染青枯病菌的感染方法可以使用本領(lǐng)域技
術(shù)人員公知的任意方法。例如可以使用以下的方法:在用CPG液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的青枯病菌的培養(yǎng)液中，將從溶原型的各噬菌體感染的青枯病菌株分離、純化進(jìn)而使其繁殖后的cpRSMl噬菌體或cpRSM3噬菌體，參照?qǐng)D1以及圖2，添加到適當(dāng)?shù)那嗫莶【曛?，進(jìn)行培養(yǎng)使其増殖的方法(參考非專利文獻(xiàn)I至非專利文獻(xiàn)3)。例如，(pRSMl噬菌體的溶原型可以舉出青枯病菌株MAFF211270、Ps29或Ps74等，CpRSM3噬菌體的溶原型可以舉出MAFF106611、MAFF211272 或 MAFF730139 等。
[0049]對(duì)于本實(shí)施方式I中的“以cpRSMl噬菌體或cpRSM3噬菌體(的任一者)感染的青枯病菌作為有效成分的青枯病預(yù)防劑”，進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。青枯病預(yù)防劑的有效成分是cpRSMl噬菌體感染的青枯病菌時(shí)，該青枯病菌株只要是(pRSMl噬菌體能感染的青枯病菌株，則可以是任何菌株。另外，青枯病預(yù)防劑的有效成分是q>RSM3噬菌體感染的青枯病菌時(shí)，該青枯病菌株只要是q>RSM3噬菌體能感染的青枯病菌株，則也可以是任何菌株。各個(gè)噬菌體能感染的青枯病菌株可以參照?qǐng)D1、以及“堀田光生?土屋健一，2002，微生物遺傳資源利用手冊(cè)(12)-青枯病菌Ralstonia solanacearum-,農(nóng)業(yè)生物資源研究所”。
[0050]具體地，例如，作為使cpRSMl噬菌體感染的青枯病菌株，可以舉出M4S、Ps29、Ps65、Ps74、MAFF211270或MAFF730138等。另一方面，例如，作為使CpRSM3噬菌體感染的青枯病菌株，可以舉出 C319、Ps72、Ps74、MAFF106603、MAFF106611、MAFF211270、MAFF211271、MAFF211272、MAFF301556、MAFF301558 或 MAFF730139 等。
[0051]由圖1可知,通過(guò)使用這2個(gè)曬菌體,可以感染race、biovar以及phylotype的各自不同的共計(jì)15菌株的青枯病菌株。這里，race、biovar以及phylotype不同的各種青枯病菌株，對(duì)不同的各種植物品種，使青枯病發(fā)病。即，如果將使用了這2個(gè)噬菌體的本實(shí)施方式I的青枯病預(yù)防劑(噬菌體疫苗)適當(dāng)組合而使用的話，則預(yù)防不同的各種青枯病菌株引起的青枯病的發(fā)病、即不同的各種植物品種中的青枯病的發(fā)病就成為可能。
[0052]關(guān)于本實(shí)施方式I中的“以cpRSMl噬菌體以及(pRSM3噬菌體(任一者均)感染的青枯病菌作為有效成分的青枯病預(yù)防劑”，是因?yàn)?，例如，?duì)于圖1中所示的MAFF211270，由于對(duì)于任意噬菌體均具有宿主特異性，因此以(pRSMl噬菌體和(pRSM3噬菌體的任一噬菌體感染的青枯病菌作為有效成分的青枯病預(yù)防劑都是可能的。另外，是因?yàn)橐远喾N青枯病菌株作為有效成分的、青枯病預(yù)防劑都是可以的。[0053]這里，對(duì)于噬菌體感染青枯病菌株和噬菌體未感染青枯病菌株的差異，舉出具體例來(lái)詳細(xì)敘述。圖3是顯示cpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603在CPG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的樣態(tài)的圖。圖3之中，左邊(未感染的細(xì)胞)是cpRSM3噬菌體未感染青枯病菌株MAFF106603培養(yǎng)液，中央(CpRSM3 -感染的細(xì)胞)是cpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603培養(yǎng)液。均在后期對(duì)數(shù)増殖期用CPG液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)后，顯示經(jīng)過(guò)2小時(shí)后的狀態(tài)。右邊(CPG)顯示不含青枯病菌的僅CPG液體培養(yǎng)基的樣態(tài)。如圖3所示，(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603培養(yǎng)液容易沉淀，但(pRSM3噬菌體未感染青枯病菌株MAFF106603培養(yǎng)液仍是懸浮狀態(tài)。
[0054]圖4是顯示CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的菌落的形態(tài)的圖。圖4之中，左上(未感染的細(xì)胞、CPG)是(pRSM3噬菌體未感染青枯病菌株MAFF106603的CPG平板上的菌落，右上((pRSM3 -感染的細(xì)胞、CPG)是cpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的CPG平板上的菌落，左下(未感染的細(xì)胞、MM)是CpRSM3噬菌體未感染青枯病菌株MAFF106603的MM(最小培養(yǎng)基)平板上的菌落，右下(q>RSM3-感染的細(xì)胞、MM)是(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的MM平板上的菌落。如圖4所示，(pRSM3噬菌體未感染青枯病菌株MAFF106603的CPG平板上的菌落的邊緣變粗，是不規(guī)則的形狀。但是，(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的CPG平板上的菌落比q>RSM3噬菌體未感染青枯病菌株MAFF106603的菌落更小，是圓形。在MM平板上，也同樣地，與(pRSM3噬菌體未感染青枯病菌株MAFF106603的菌落相比，CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的菌落變得相當(dāng)小。
[0055]如此，通過(guò)使(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603，青枯病菌株MAFF106603的形態(tài)以及特徴大大不同。圖5是顯示q>RSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603以及未感染青枯病菌株MAFF106603的詳細(xì)特性的圖。
[0056](青枯病的預(yù)防方法)
[0057]本發(fā)明的實(shí)施方式 2涉及將以cpRSMl型線狀噬菌體和/或cpRSM3型線狀噬菌體感染的青枯病菌(Ralstonia solanacearum)作為有效成分的青枯病預(yù)防劑接種于植物的、即將前述實(shí)施方式I的青枯病預(yù)防劑接種于植物的青枯病的預(yù)防方法。
[0058]本說(shuō)明書(shū)中，所謂“植物”，包括會(huì)患青枯病(立枯病)的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的所有的植物。例如，可以舉出番茄、土豆、甜椒、茄子、煙草、辣椒、紫蘇、蘿卜、草莓、香蕉、雛菊、菊花或向日葵等。其中，優(yōu)選番茄、土豆、甜椒、茄子或煙草的任一者。本說(shuō)明書(shū)中，所謂“接種”，是指用注射針注入植物的莖等、或使青枯病預(yù)防劑附著于牙簽的尖端部并刺入莖而注入等，與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的向植物體接種的意思相同。
[0059]其中，所謂“將青枯病預(yù)防劑接種于植物”，意思是將前述實(shí)施方式I的青枯病預(yù)防劑接種于適當(dāng)?shù)闹参锲贩N。即，意思是:將race (宿主范圍)等所適宜的噬菌體感染青枯病菌株作為有效成分的青枯病預(yù)防劑進(jìn)行接種。
[0060]關(guān)于接種青枯病預(yù)防劑的位置，優(yōu)選植物的莖，更優(yōu)選植物的莖的地上部(近地面部)I~4cm的位置，尤其優(yōu)選植物的莖的地上部2~3cm的位置。另外，關(guān)于青枯病預(yù)防劑的接種量，根據(jù)各植物的種類、品種來(lái)接種適當(dāng)?shù)牧考纯?。例如，可以調(diào)整青枯病預(yù)防劑的濃度，使得對(duì)每克(g)的植物個(gè)體重量接種IO5~108cells、優(yōu)選IO6~IO7Cells或尤其優(yōu)選IO6ceIls左右的、cpRSMl噬菌體或cpRSM3噬菌體感染青枯病菌。進(jìn)而，關(guān)于接種青枯病預(yù)防劑的時(shí)期，與各植物的成長(zhǎng)以及前述的接種位置相應(yīng)地，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)期接種即可。例如，可以舉出在植物發(fā)芽后I~5周、優(yōu)選發(fā)芽后2~4周左右的時(shí)期接種。
[0061]在這樣的方法之中，如果預(yù)先將前述的實(shí)施方式I的青枯病預(yù)防劑接種于植物，則針對(duì)青枯病菌，具有2個(gè)月以上的抵抗性。其對(duì)于菌株不同的強(qiáng)病原性的青枯病菌，也具有同樣的抵抗性(參照實(shí)施例2(2-1、2-2以及2-3))。
[0062]實(shí)施例[0063]以下，使用制備例以及實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于制備例以及實(shí)施例。需要說(shuō)明的是，關(guān)于以下的制備例以及實(shí)施例中的詳細(xì)條件等，基于“堀田光生.土屋健一，2002,微生物遺傳資源利用手冊(cè)(12)-青枯病菌Ralstonia solanacearum-,農(nóng)業(yè)生物資源研究所”中記載的方法實(shí)施。
[0064](制備例)
[0065]關(guān)于對(duì)青枯病菌以及兩噬菌體的制備例進(jìn)行簡(jiǎn)單地?cái)⑹?。各噬菌體感染前的各種青枯病菌株(均從獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所(日本)購(gòu)入)是用由含0.1 %的酪蛋白氨基酸、I %的蛋白胨以及0.5 %的葡萄糖的蒸餾水形成的CPG液體培養(yǎng)基，在28°C、200~300rpm條件下振蕩培養(yǎng)來(lái)制備的。關(guān)于噬菌體，cpRSM3噬菌體通過(guò)作為宿主菌的青枯病菌株MAFF106611繁殖，CpRSMl噬菌體通過(guò)作為宿主菌的青枯病菌株M4S繁殖。詳細(xì)來(lái)說(shuō)，如下進(jìn)行制備:向用CPG培養(yǎng)液増殖后的兩宿主菌(初期對(duì)數(shù)増殖期、OD600=0.1)中添加各噬菌體而達(dá)到MOI=0.01~0.05，培養(yǎng)16~18小時(shí)后，通過(guò)離心分離除去細(xì)菌細(xì)胞(8，000Xg)，使上清通過(guò)過(guò)濾膜(0.2μπι)，用0.5Μ的NaCl以及5%聚乙二醇6000進(jìn)行處理，對(duì)沉淀后的噬菌體粒子進(jìn)行離心分離(15，00Xg、30*#、4°C)。由此，可以以1012PFU / / ml的收益率回收CpRSMl噬菌體以及CpRSM3噬菌體。兩噬菌體能夠在低溫
(4°C )下穩(wěn)定保存。另外，詳細(xì)情況可以參照專利文獻(xiàn)3以及非專利文獻(xiàn)I至非專利文獻(xiàn)3。
[0066](實(shí)施例1)
[0067]本實(shí)施例1中，對(duì)于(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的病原性的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0068]使調(diào)整后的CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603 (MOI=IO)，在由含0.1%酪蛋白氨基酸、I %蛋白胨、0.5%葡萄糖以及1.7%瓊脂的蒸餾水形成的CPG瓊脂培養(yǎng)基(pH6.8~7.0)上選出感染單一菌落(通過(guò)限制性內(nèi)切酶處理來(lái)確認(rèn))。將該菌落用由含
0.1 %酪蛋白氨基酸、I %蛋白胨以及0.5 %的葡萄糖的蒸餾水形成的CPG液體培養(yǎng)基，在28°C振蕩培養(yǎng)至0D_=0.2。之后，用滅菌注射器將培養(yǎng)液5 μ I接種到發(fā)芽后I~6周的番茄(寸夕一 > (品種名))的第2片葉-第3片葉間。作為對(duì)照，將沒(méi)有感染tRSM3噬菌體的青枯病菌株MAFF106603也以同樣條件接種至番茄(寸夕一 >)。將進(jìn)行了這種接種處置后的番茄各5株栽培在人工氣象器(28°C、明16小時(shí)?暗8小時(shí))內(nèi)。
[0069]圖6是表示實(shí)施例1的CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的病原性的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。如圖6所示，接種了CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的番茄(左)沒(méi)有發(fā)生青枯病。進(jìn)行了同樣處置的其他4株番茄也全部表現(xiàn)出健康生長(zhǎng)，接種2個(gè)月后也完全沒(méi)有發(fā)現(xiàn)青枯病的病癥(無(wú)圖示)。另一方面，如圖6所示，作為對(duì)照而接種了(pRSM3噬菌體未感染青枯病菌株MAFF106603的番茄(右)，全部在接種后4日~I周間以內(nèi)表現(xiàn)出青枯病的病癥，接種部位上部的莖/葉枯死。由本實(shí)施例1的結(jié)果確認(rèn)了:感染了(pRSM3噬菌體的青枯病菌株MAFF106603對(duì)番茄不顯示病原性 。
[0070](實(shí)施例2)
[0071]本實(shí)施例2中，對(duì)于用CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603處理后的番茄中的、對(duì)青枯病菌株MAFF106603的抵抗性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0072]首先，與前述的實(shí)施例1同樣地，使調(diào)整后的(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603(M0I=i0)，在由含0.1 %酪蛋白氨基酸、I %蛋白胨、0.5%葡萄糖以及1.7%瓊脂的蒸餾水形成的CPG瓊脂培養(yǎng)基(pH6.8~7.0)上選出感染單一菌落(通過(guò)限制性內(nèi)切酶處理來(lái)確認(rèn))。接著，將該菌落用由含0.1 %酪蛋白氨基酸、I %蛋白胨以及0.5 %的葡萄糖的蒸餾水形成的CPG液體培養(yǎng)基在28°C振蕩培養(yǎng)至0D_=0.2。之后，用滅菌注射器將培養(yǎng)液5 μ I接種到發(fā)芽后1.5周的番茄(寸夕一 > )的莖(地上部2~3cm)。需要說(shuō)明的是，作為對(duì)照，將大腸菌JM109在相同條件下接種至番茄(*々一 > )。將進(jìn)行了這種接種處置后的番茄各3株栽培在人工氣象器(28°C、明16小時(shí)?暗8小時(shí))內(nèi)。
[0073](實(shí)施例2-1)
[0074]本實(shí)施例2-1中，對(duì)以下情況進(jìn)行說(shuō)明:對(duì)于進(jìn)行了前述的接種處置的各3株番茄(寸夕一> )，在接種I日后，將未感染(pRSM3噬菌體的強(qiáng)病原性的青枯病菌株MAFF106603通過(guò)與前述同樣的方法進(jìn)行接種(地上部3~4cm)的情況。
[0075]圖7是表示實(shí)施例2-1的用q>RSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的處理中的、對(duì)I日后的青枯病菌株MAFF106603的2次接種的抵抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。如圖7所示，即使向接種了<pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的番茄接種青枯病菌株MAFF106603(2次接種)，也沒(méi)有發(fā)生青枯病(左)。另外，該結(jié)果對(duì)于接種了任一(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的番茄株都是同樣的，之后也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)發(fā)病。另一方面，如圖7所示，作為比較對(duì)照的接種了大腸菌JM109的番茄全部在2次接種后2~3日時(shí)表現(xiàn)出青枯病的病癥，在4日~I周后枯死(右)。由本實(shí)施例2-1的結(jié)果確認(rèn)了:接種了cpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的番茄顯示出對(duì)青枯病菌株MAFF106603的2次接種(I日后)的抵抗性。
[0076](實(shí)施例2-2)
[0077]本實(shí)施例2-2中，對(duì)以下情況進(jìn)行說(shuō)明:對(duì)于進(jìn)行了前述的接種處置的各3株番茄，在接種2周后，以與前述同樣的方法接種青枯病菌株MAFF106603(地上部4~5em)的情況。
[0078]圖8是表示實(shí)施例2-2的用cPrsm3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的處理
中的、對(duì)2周后的青枯病菌株MAFF106603的2次接種的抵抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。如圖8所示，即使向接種了cpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的番茄進(jìn)行2次接種，任意株都是健康的，之后也沒(méi)有發(fā)病(左)。另一方面，如圖8所示，作為比較對(duì)照的接種了大腸菌JM109的番茄全部在2次接種后2~3日時(shí)表現(xiàn)出青枯病的病癥，在4日~I周后枯死(右)。由本實(shí)施例2-2的結(jié)果確認(rèn)了:接種了CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的番茄顯示出對(duì)青枯病菌株MAFF106603的2次接種(2周后)的抵抗性。
[0079](實(shí)施例2-3)
[0080]本實(shí)施例2-3中，對(duì)以下情況進(jìn)行說(shuō)明:對(duì)于進(jìn)行了前述的接種處置的各5株番茄，在接種2個(gè)月后，以與前述同樣的方法接種青枯病菌株MAFF106603(地上部8~IOcm)的情況。
[0081]圖9是表示實(shí)施例2-3的用CpRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的處理中的、對(duì)2個(gè)月后的青枯病菌株MAFF106603的2次接種的抵抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。如圖9所示，即使向接種了ipRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的番茄進(jìn)行2次接種，任意株都是健康的，之后也沒(méi)有發(fā)病(左)。另一方面，如圖9所示，作為對(duì)照的接種了大腸菌JM109的番茄全部在2次接種后4日~I周時(shí)表現(xiàn)出青枯病的病癥(右)。由本實(shí)施例2-3的結(jié)果確認(rèn)了:接種了(pRSM3噬菌體感染青枯病菌株MAFF106603的番茄顯示出對(duì)青枯病菌株MAFF106603的2次接種(2個(gè)月后)的抵抗性。
[0082]進(jìn)而，利用與前述的實(shí)施例2 (2-1、2-2以及2_3)同樣的方法、條件，對(duì)于用
(pRSMl噬菌體感染青枯病菌株MAFF211270以及.CpRSMl嗤菌體感染青枯病菌株
MAFF106611進(jìn)行了處理的番茄，用青枯病菌株MAFF106603進(jìn)行2次接種時(shí)，確認(rèn)了完全相同的抵抗性結(jié)果(無(wú)圖示)。這表明:即使在接種不同組合的噬菌體感染青枯病菌株的情況下，對(duì)2次接種的抵抗性的效果也不變。即，啟示了:通過(guò)將感染了(pRSM型線狀噬菌體的青枯病各株接種到各適當(dāng)?shù)霓r(nóng)作物或園藝用植物等，可以長(zhǎng)期(至少2個(gè)月以上)預(yù)防青枯病菌引起的感染。
[0083]另外，本發(fā) 明人發(fā)現(xiàn):將(pRSMl噬菌體的宿主識(shí)別蛋白質(zhì)重組為cpRSM3噬菌體型后的RSM噬菌體也顯示出與菌體同樣的宿主特異性。g卩，啟示了:將具有cpRSMl噬菌體型的宿主識(shí)別蛋白質(zhì)的RSM噬菌體、和/或、具有cpRSM3噬菌體型的宿主辨識(shí)蛋白質(zhì)的RSM噬菌體感染的青枯病菌作為有效成分時(shí)，成為對(duì)各適當(dāng)?shù)霓r(nóng)作物或園藝用植物等的青枯病預(yù)防劑。另外，對(duì)于cpRSMl噬菌體以及cpRSM3噬菌體的宿主識(shí)別蛋白質(zhì)的詳細(xì)情況，可以參照非專利文獻(xiàn)3。
[0084]本發(fā)明不限于上述發(fā)明的實(shí)施方式以及實(shí)施例的說(shuō)明。只要不脫離權(quán)利要求書(shū)的記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到的范圍內(nèi)的各種變形方式也包括在本發(fā)明中。
[0085]本說(shuō)明書(shū)中明示的論文及公開(kāi)專利公報(bào)等內(nèi)容的所有的內(nèi)容通過(guò)援引而引入本文。
[0086]本申請(qǐng)以2011年4月28日申請(qǐng)的日本國(guó)專利申請(qǐng)2011-102153號(hào)為基礎(chǔ)。本說(shuō)明書(shū)中，將日本國(guó)專利申請(qǐng)2011-102153號(hào)的說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求書(shū)、附圖整體作為參照而包括在內(nèi)。
[0087]工業(yè)上的可利用性
[0088]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了:感染了(pRSMl噬菌體或(pRSM3噬菌體的青枯病菌失去其病原性，即使接種于番茄等植物也不發(fā)生青枯病，如果將感染了這些噬菌體的青枯病菌接種于番茄等植物，則之后即使接種青枯病菌，也顯示出強(qiáng)的抵抗性，至少2個(gè)月以上不發(fā)生青枯病。進(jìn)而發(fā)現(xiàn):cpRSMl嗤菌體以及q>RSM3噬菌體由于宿主特異性彼此大不相同，通過(guò)使用這2個(gè)曬菌體，race、biovar以及phylotype的不同的共計(jì)15菌株的青枯病的預(yù)防疫苗的使用成為可能，預(yù)計(jì)自然界中的幾乎所有青枯病菌株都能由這2個(gè)噬菌體所感染。 [0089]因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了能夠預(yù)防不同的各種青枯病菌株引起的青枯病的發(fā)病、即不同的各種植物品種中的青枯病的發(fā)病的青枯病預(yù)防劑、以及利用該青枯病預(yù)防劑的青枯病的預(yù)防方法。具體地，通過(guò)用本發(fā)明的技術(shù)處理番茄、土豆、甜椒、茄子以及煙草等主要農(nóng)作物、以及各種園藝作物的苗(園地以及花壇等移動(dòng)前盆栽水平)，可以大幅預(yù)防移植后的青枯病的發(fā)病。該結(jié)果涉及避免如下問(wèn)題，即估計(jì)全世界每年9.5兆日元左右損失的青枯病災(zāi)害的預(yù)防、以及使用化學(xué)農(nóng)藥引起的環(huán)境綜合污染和農(nóng)藥殘留問(wèn)題等。
【權(quán)利要求】
1.一種青枯病預(yù)防劑，其特征在于，以CpRSivn型線狀噬菌體和/或(PRSM3型線狀噬菌體感染的青枯病菌(Ralstonia solanacearum)作為有效成分。
2.如權(quán)利要求1所述的青枯病預(yù)防劑，其特征在于，前述(pRSMl型線狀噬菌體感染的青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的菌株是 M4S、Ps29、Ps65 或 Ps74 的任一種。
3.如權(quán)利要求1或2所述的青枯病預(yù)防劑，其特征在于，前述cpRSM3:型線狀噬菌體感染的青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的菌株是C319、Ps72或Ps74的任一種。
4.青枯病的預(yù)防方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的青枯病預(yù)防劑接種于植物的工序。
5.如權(quán)利要求4所述的青枯病的預(yù)防方法，其特征在于，前述植物是番茄、土豆、甜椒、茄子、煙草、辣椒、紫蘇、蘿卜、草莓、香蕉、雛菊、菊花或向日葵的任一種。
6.如權(quán)利要求5所述的青枯病的預(yù)防方法，其特征在于，前述植物是番茄、土豆、甜椒、爺子或煙草的任一種。
7.如權(quán)利要求4~6的任一項(xiàng)所述的青枯病的預(yù)防方法，前述青枯病的預(yù)防方法的特征在于,每植物個(gè)體重量接種前述青枯病菌(Ralstonia solanacearum) IO5~IO8Cells /g°
8.如權(quán)利要求7所述的青枯病的預(yù)防方法，前述青枯病的預(yù)防方法的特征在于，每植物個(gè)體重量接種前述青枯病菌(Ralstonia solanacearum) IO6~107cells / g。
9.如權(quán)利要求4~8的任一項(xiàng)所述的青枯病的預(yù)防方法,其特征在于,前述青枯病預(yù)防劑接種于前述植物的莖。
10.如權(quán)利要求7所述 的青枯病的預(yù)防方法,其特征在于,前述青枯病預(yù)防劑接種于前述植物的莖的地上部I~4cm的位置。
11.如權(quán)利要求4~10的任一項(xiàng)所述的青枯病的預(yù)防方法,其特征在于,前述青枯病預(yù)防劑在前述植物發(fā)芽后2~4周的時(shí)期接種。
【文檔編號(hào)】C12N1/00GK103547669SQ201280020848
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月28日
【發(fā)明者】山田隆, 藤江誠(chéng), 川崎健 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人廣島大學(xué)