包含絲氨酸蛋白酶變體的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供絲氨酸蛋白酶變體，更具體而言為由其產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶變體。具體而言，本發(fā)明提供與參考絲氨酸蛋白酶相比具有一個或多個置換的絲氨酸蛋白酶變體，更具體而言為枯草桿菌蛋白酶變體。另外，本發(fā)明提供包含這些絲氨酸蛋白酶變體，更具體而言枯草桿菌蛋白酶變體的組合物。在一些實施例中，本發(fā)明提供包含這些絲氨酸蛋白酶變體、更具體而言枯草桿菌蛋白酶變體中的至少一者的清潔組合物。
【專利說明】包含絲氨酸蛋白酶變體的組合物和方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明提供絲氨酸蛋白酶變體。具體而言，本發(fā)明提供與參考絲氨酸蛋白酶相比具有一個或多個置換的絲氨酸蛋白酶變體。此外，本發(fā)明提供包含這些絲氨酸蛋白酶變體的組合物。在一些實施例中，本發(fā)明提供包含這些絲氨酸蛋白酶變體(更具體而言是枯草桿菌蛋白酶變體)中的至少一者的清潔組合物。
[0002]發(fā)明背景
[0003]盡管絲氨酸蛋白酶在工業(yè)酶領域中已久為人所知，但對于適于特定條件和用途的工程蛋白酶仍存在需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]在一些實施例中，本發(fā)明包括分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自列表1-19的位置，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
[0005]在一些實施例中，本發(fā)明包括遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體與SEQID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換選自列表1-19，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
[0006]在一些實施例中，本發(fā)明包括編碼分離的枯草桿菌蛋白酶變體的核酸，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自列表1-19的位置，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。在一些實施例中，本發(fā)明為用于產(chǎn)生上述變體任一者的表達載體、宿主細胞或方法。
[0007]在一些實施例中，本發(fā)明包括編碼遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的核酸，其中所述遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體與SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換選自列表1-19，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。在一些實施例中，本發(fā)明為用于產(chǎn)生上述變體任一者的表達載體、宿主細胞或方法。[0008]在上文所列的每個實施例中，與具有SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的GG36蛋白酶相比，所述變體可具有改善的清潔性。
[0009]在一些實施例中，本發(fā)明包括上述變體或編碼所述變體的核酸中的任一者，其中所述變體的總凈電荷相對于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶的總凈電荷為O、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4 或-5。
[0010]在一些實施例中，本發(fā)明包括具有上文所列變體中的至少一者的組合物，其中所述組合物不是織物和家庭護理產(chǎn)品。在一些實施例中，本發(fā)明為使用上述組合物的清潔方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1提供了包括BPN’ (SEQ ID NO:1)和GG36 (SEQ ID NO:2)在內(nèi)的成熟參考蛋白酶的比對。每種蛋白酶變體(更具體而言,本文所述的枯草桿菌蛋白酶變體,包括每種冷水蛋白酶變體)的每個氨基酸位置均根據(jù)如圖1中所顯示的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’ (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號，如通過將所述蛋白酶變體氨基酸序列與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列進行比對所確定的。因而，除非本文另外指明，否則置換位置是以與BPN’的關(guān)系給出。
【具體實施方式】
[0012]本發(fā)明提供絲氨酸蛋白酶變體，更具體而言枯草桿菌蛋白酶變體。具體而言，本發(fā)明提供與參考絲氨酸蛋白酶 相比具有一個或多個置換的絲氨酸蛋白酶變體，更具體而言枯草桿菌蛋白酶變體。另外，本發(fā)明提供包含這些絲氨酸蛋白酶變體(更具體而言，枯草桿菌蛋白酶變體)的組合物。在一些實施例中，本發(fā)明提供包含這些絲氨酸蛋白酶變體(更具體而言是枯草桿菌蛋白酶變體)中的至少一者的清潔組合物。
[0013]定義
[0014]除非另外指明，否則本發(fā)明的實施涉及處于本領域技術(shù)范圍內(nèi)的常用于分子生物學、蛋白質(zhì)工程改造、微生物學和重組DNA的常規(guī)技術(shù)。這類技術(shù)是本領域技術(shù)人員已知的并描述于本領域技術(shù)人員眾所周知的許多文章和參考著作中。將本文提及的所有專利、專利申請、文章和出版物，包括上文中和下文中的，都特此明確地以引用的方式并入本文。
[0015]除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領域普通技術(shù)人員所一般理解的含義相同的含義。許多技術(shù)詞典是本領域技術(shù)人員已知的。盡管與本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本發(fā)明的實施，但還是在本文中描述了一些合適的方法和材料。相應地，通過整體參考本說明書來更完整地描述接下來定義的術(shù)語。另外，如本文所用，除非上下文明確指明，否則單數(shù)術(shù)語“一”、“一個”和“所述”包括復數(shù)含義。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)值。除非另外指明，否則分別地，核酸從左至右以5'至3'取向?qū)懗?；氨基酸序列從左至右以氨基至羧基取向?qū)懗觥斃斫?，本發(fā)明不限于所描述的具體方法學、方案和試劑，因為這些方面可根據(jù)本領域技術(shù)人員使用它們的背景而有所變化。
[0016]除非另外指明，否則本發(fā)明的實施可采用蛋白質(zhì)純化、分子生物學、微生物學、重組DNA技術(shù)以及蛋白質(zhì)測序的常規(guī)技術(shù)，所有這些均在本領域技術(shù)人員的技能之內(nèi)。[0017]此外，本文提供的標題并是對本發(fā)明的各個方面或?qū)嵤├南拗?，這些方面或?qū)嵤├伎梢酝ㄟ^整體參考說明書而獲取。因此，通過整體參考本說明書可更完全地限定下文定義的術(shù)語。盡管如此，為了便于理解本發(fā)明，將多個術(shù)語定義如下。
[0018]如本文所用，術(shù)語“蛋白酶”和“朊酶”是指具有分解其他蛋白質(zhì)的能力的酶蛋白。蛋白酶具有進行“蛋白水解”的能力，其通過水解在形成該蛋白質(zhì)的肽或多肽鏈中將氨基酸連接在一起的肽鍵而開始蛋白質(zhì)分解代謝。蛋白酶作為蛋白質(zhì)消化酶的這種活性稱為“蛋白水解活性”。存在許多眾所周知的用于測量蛋白水解活性的方法(參見例如，Kalisz, “Microbial Proteinases (微生物蛋白酶)”，載于:Fiechter (編輯)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology (《生物化學工程 / 生物技術(shù)進展》)(1988))。例如，蛋白水解活性可通過可分析各蛋白酶水解商業(yè)底物的能力的比較測定法來確定?？捎糜诘鞍酌富虻鞍姿饣钚缘姆治龅氖纠缘孜锇ǖ幌抻?二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛膠原(Sigma C-9879)、牛彈性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN BiomediCal902111)。利用這些底物的比色測定法為本領域所熟知的(參見例如W099/34011和美國專利N0.6，376，450，將這二者以引用的方式并入本文)。pNA測定法(參見例如Del Mar等人，Anal.Biochem.(《分析生物化學》)99:316-320 [1979])也可以用于測定在梯度洗脫期間收集的級分的活性酶濃度。該測定法測量當該酶水解可溶性的合成底物即琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)時對硝基苯胺釋放的速率。用分光光度計在410nm處測量從該水解反應產(chǎn)生黃色的速率，其與活性酶濃度成比例。此外，280納米(nm)處的吸光度測量值可用于測定總蛋白質(zhì)濃度?；钚悦?總蛋白質(zhì)比率給出了酶純度。
[0019]如本文中所用，術(shù)語“枯草桿菌蛋白酶”是指如在MEROPS-肽酶數(shù)據(jù)庫(MEROPS-The Peptidase Data base)中所述的S8絲氨酸蛋白酶家族的任何成員(參見Rawlings 等人，MEROPS:the peptidase database (MER0PS:妝酶數(shù)據(jù)庫)，Nucl AcidsRes(《核酸研究》)，34Database issue (數(shù)據(jù)庫期)，D270-272 [2006])。如其中所述，肽酶家族S8含有絲氨酸內(nèi)肽酶枯草桿菌蛋白酶及其同源物(Rawlings和Barrett, BiochemJ.(《(生物化學雜志》)，290:205-218, [1993])。S8家族也稱為枯草桿菌酶(subtilase)家族，是絲氨酸肽酶的第二大家族?，F(xiàn)在已經(jīng)測定了 S8家族若干成員的三級結(jié)構(gòu)。典型的S8蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由三個層組成，其中一個七股β片層夾在兩層螺旋之間?？莶輻U菌蛋白酶(S08.001)是異種集團(clan)SB(SB)的典型結(jié)構(gòu)。盡管結(jié)構(gòu)不同，但枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(S01.001)的活性位點可疊合，這表明該相似性是趨同進化而不是趨異進化的結(jié)果。
[0020]本文所用的術(shù)語“蛋白酶變體”、“變體蛋白酶”、“變體絲氨酸蛋白酶”、“絲氨酸蛋白酶變體”、“枯草桿菌蛋白酶變體”、“突變蛋白酶”用于指與參考蛋白酶(可以為野生型枯草桿菌蛋白酶)相似的蛋白酶(尤其是在其功能上)，但在其氨基酸序列中有使得它們在序列上與衍生該變體蛋白酶的野生型蛋白酶或任何起始參考蛋白酶(即“親本”蛋白酶)不同的突變。在一些實施例中，本發(fā)明提供了 “GG36變體”(或“GG36枯草桿菌蛋白酶變體”)，其中在SEQ ID NO:2所示的成熟GG36序列中存在突變。然而，并不旨在使參考蛋白酶局限于任何特定的氨基酸序列。此外，該術(shù)語旨在涵蓋親本蛋白酶的變體，其中所述親本蛋白酶的序列與SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性。
[0021]如本文所以，術(shù)語“冷水蛋白酶變體”意指親本蛋白酶的蛋白酶變體(更具體而言，枯草桿菌蛋白酶變體)，其中所述遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQID NO:2的氨基酸序列，其中所述蛋白酶變體(更具體而言，枯草桿菌蛋白酶變體)具有如下特性中的一者或多者:a)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至約10、1.1至約8或甚至1.1至約5的測試方法2性能指數(shù)；b)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至約10、1.1至約8或甚至1.1至約5的測試方法3性能指數(shù)；c)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至約10、1.0至約8或甚至1.0至約5的測試方法4性能指數(shù)；和/或d)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至約10、1.0至約8或甚至1.0至約5的測試方法6性能指數(shù)；和/或e)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至約15、1.1至約10或甚至1.1至約7的測試方法7性能指數(shù)。在下文實例I中標題為“測試方法”的部分中明確描述了測試方法2、測試方法3、測試方法4、測試方法6和測試方法7。此外，該術(shù)語旨在涵蓋親本蛋白酶的變體，其中所述親本蛋白酶的序列與SEQ IDNO: 2的氨基酸序列具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98%、至少99%或100%的同一性。
[0022]在本發(fā)明的一些實施例中，所述親本蛋白酶(即“參考”或“起始”蛋白酶)為可商購獲得的蛋白酶，包括但不限于:以如下商標名銷售的蛋白酶:SAVINASE?、POLARZYME?、KANNASE?、LIQUINASE?、
LIQUINASE ULTRA?、SAVINASE ULTRA?、OVOZYME? (諾維信公司(Novozymes A/S)銷售)；MAXACAL?、PROPERASE?、PURAFECT? >FN3?、FN4?和 PURAFECT 0XP?、PURAFAST?、PURAFECT? PR頂E、PURAMAX? (由
美國丹尼斯克杰能科分公司(Danisco US, Genencor Division)銷售的蛋白酶；以及可得自漢高/凱米拉公司(Henkel/Kemira)的那些，即BLAP (US5，352，604的圖29中所示的氨基酸序列，具有如下突變S99D+S101R+S103A+V104I+G159S，下文中稱為BLAP)和BLAP X(具有S3T+V4I+V205I 的 BLAP)。
[0023]本文所用的術(shù)語“變體多肽”是指包含與親本或參考多肽(包括但不限于野生型多肽)的氨基酸序列相差至少一個氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽。
[0024]如本文中所用，芽孢桿菌屬(Bacillus)包括本領域技術(shù)人員已知的芽孢桿菌屬內(nèi)的所有種，包括但不限于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophiIus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans) 、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.1autus)和蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)。已經(jīng)認識到，芽孢桿菌屬還在繼續(xù)進行分類學整理。因此，該屬旨在包括已經(jīng)重新分類的種，包括(但不限于)諸如現(xiàn)在命名為“嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus) ”的嗜熱脂肪芽孢桿菌之類的生物體。在存在氧氣的情況下產(chǎn)生抗性內(nèi)生孢子被視為芽孢桿菌屬的定義性特征，但該特性還適用于最近命名的脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、雙芽孢桿菌屬(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、線芽抱桿菌屬(Filobacillus)、薄壁芽抱桿菌屬(Gracilibacillus)、嗜鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、鹽芽孢桿菌屬(Salibacillus)、熱芽抱桿菌屬(Thermobacillus)、服芽抱桿菌屬(Ureibacillus)和枝芽抱桿菌屬(Virgibacillus)。
[0025]術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，指在鏈中共價鍵合的核苷酸單體的任何長度的聚合物。DNA (脫氧核糖核酸)(包含脫氧核糖核苷酸的多核苷酸)和RNA (核糖核酸)(核糖核苷酸的聚合物)是具有獨特生物學功能的多核苷酸或核酸的例子。多核苷酸或核酸包括(但不限于):單鏈、雙鏈或三鏈DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜交體，或包含嘌呤和嘧啶堿基的聚合物，或其他天然的、經(jīng)化學修飾的、經(jīng)生物化學修飾的、非天然的或衍生化的核苷酸堿基。如下是多核苷酸的非限制性例子:基因、基因片段、染色體片段、表達序列標簽(EST)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、核酶、互補DNA(cDNA)、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。在一些實施例中，多核苷酸包括經(jīng)修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物、尿嘧啶基(uracyl)、其他糖和連接基如氟代核糖和硫代酸酯(thioate)，以及核苷酸支鏈。在具體實施例中，核苷酸的序列夾雜有非核苷酸組分。
[0026]本文所用的術(shù)語“突變”是指在起始氨基酸或核酸序列中作出的變化。該術(shù)語旨在涵蓋置換、插入和缺失。
[0027]如本文所用，術(shù)語“載體”指用于將核酸或多核苷酸引入或轉(zhuǎn)移進靶細胞或組織中的核酸構(gòu)建體或多核苷酸構(gòu)建體。載體通常用于將外來DNA引入另一細胞或組織中。載體通常包含作為轉(zhuǎn)基因的DNA序列和充當該載體“骨架”的較大的多核苷酸序列。載體通常起到轉(zhuǎn)移遺傳信息(如插入的轉(zhuǎn)基因)至靶細胞或組織的作用，以便在該靶細胞或組織中分離、增殖或表達該插入物。載體包括質(zhì)粒、克隆載體、噬菌體、病毒(如病毒載體)、粘粒、表達載體、穿梭載體、盒(cassette)等等。載體通常包含復制起點、多克隆位點和選擇性標記。將載體插入靶細胞的過程通常稱為轉(zhuǎn)染。使用病毒載體進行的細胞轉(zhuǎn)染通常稱為轉(zhuǎn)導。在一些實施例中，本發(fā)明包括載體，該載體包含編碼變體蛋白酶(如前體或成熟變體蛋白酶)的DNA序列，該DNA序列與能夠?qū)崿F(xiàn)其在合適宿主中表達的合適前序列(如分泌序列、信號肽序列等)有效連接。
[0028]本文所用的術(shù)語“表達盒”、“表達質(zhì)?！被颉氨磉_載體”是指以重組方式或以合成方式產(chǎn)生的、用于所關(guān)注的核酸(如外來核酸或轉(zhuǎn)基因)在靶細胞中表達的核酸構(gòu)建體或載體。所關(guān)注的核酸通常表達所關(guān)注的蛋白質(zhì)。表達載體或表達盒通常包含驅(qū)動或促進外來核酸的表達的啟動子核苷酸序列。表達載體或表達盒還通常包含允許特定核酸在祀細胞中的轉(zhuǎn)錄的任何其他規(guī)定的核酸元件。重組表達盒可摻入質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段中。某些表達載體具有使異源DNA片段插入宿主細胞中以及使其在宿主細胞中表達的能力。許多原核和真核表達載體是可商購獲得的。適宜的表達載體的選擇在本領域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。用于從摻入表達載體中的核酸序列表達蛋白質(zhì)的適當表達載體的選擇在本領域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
[0029]DNA構(gòu)建體是可被引入靶細胞或組織中的人工構(gòu)建的核酸區(qū)段。DNA構(gòu)建體通常包含已被亞克隆進載體中的DNA插入物，該DNA插入物包含編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。載體可含有用于在細菌中生長的細菌抗性基因和用于所關(guān)注的蛋白質(zhì)在生物體中的表達的啟動子。DNA可通過PCR或本領域技術(shù)人員已知的任何其他合適的技術(shù)體外產(chǎn)生。在一些實施例中，DNA構(gòu)建體包含所關(guān)注的核酸序列。在一些實施例中，該序列與另外的元件例如控制元件(如啟動子等)有效連接。DNA構(gòu)建體可還包含選擇性標記并且可還包含側(cè)接有同源盒(homology box)的輸入序列(incoming sequence)。構(gòu)建體可包含添加至末端的其他非同源序列(如填充序列(stuffer sequence)或旁側(cè)序列(flank))。在一些實施例中，序列的末端是閉合的，使得DNA構(gòu)建體形成閉環(huán)。用本領域熟知的技術(shù)摻入DNA構(gòu)建體中的所關(guān)注的核酸序列可以是野生型的、突變型的或經(jīng)修飾的核酸。在一些實施例中，DNA構(gòu)建體包含一條或多條與宿主細胞染色體同源的核酸序列。在其他實施例中，DNA構(gòu)建體包含一條或多條非同源核苷酸序列。一旦體外裝配了 DNA構(gòu)建體，則可將其用于例如:1)將異源序列插入宿主細胞的所需靶序列中；和/或2)誘變宿主細胞染色體的區(qū)域(即用異源序列置換內(nèi)源序列)；3)使靶基因缺失；和/或4)將復制型質(zhì)粒引入宿主中。在本文中“DNA構(gòu)建體”可與“表達盒”互換使用。
[0030]如本文所用，“質(zhì)粒”指染色體外DNA分子，其能夠獨立于染色體DNA進行復制。質(zhì)粒是雙鏈的(ds)并且可以是環(huán)狀的，通常用作克隆載體。
[0031]如本文在將核酸序列引入細胞的語境中所用，術(shù)語“引入”指任何適于將核酸序列轉(zhuǎn)移進細胞中的方法。這類引入方法包括但不限于:原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合和轉(zhuǎn)導(參見例 如Ferrari等人“Genetics” ( “遺傳學”)，載于Hardwood等人(編
) Bacillus (《芽孢桿菌》)，普萊南出版公司(Plenum Publishing Corp.),第57-72頁[1989])。
[0032]轉(zhuǎn)化是指因遺傳物質(zhì)(如DNA)的吸收、基因組摻入和表達所致的細胞的遺傳變更。
[0033]如本文所用，當核酸被置于與另一核酸序列的功能性關(guān)系中時，該核酸與另一核酸序列“有效連接”。例如，如果啟動子影響核苷酸編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子或增強子與該編碼序列有效連接。如果核糖體結(jié)合位點被設置成使得有利于編碼序列的翻譯，則該核糖體位點可與該編碼序列有效連接。通常，“有效連接的”DNA序列是連續(xù)的。然而，增強子不必是連續(xù)的。連接是通過在便利的限制位點處的連接來實現(xiàn)。如果這類位點不存在，則可根據(jù)常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸接頭或連接物。
[0034]如本文所用，術(shù)語“基因”是指多核苷酸(例如，DNA片段)，其編碼多肽并且包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域以及各個編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。
[0035]如本文所用，在用于指細胞時“重組的”通常指該細胞已通過引入異源核酸序列而進行了修飾或指該細胞衍自經(jīng)過如此修飾的細胞。例如，重組細胞可包含這樣的基因，其不以相同的形式存在于天然(非重組)形式的該細胞內(nèi)，或者重組細胞可包含(存在于天然形式的細胞中的)天然基因，但該基因已經(jīng)過修飾并被再次引入該細胞中。重組細胞可包含對該細胞而言是內(nèi)源性的核酸，該核酸在未將其從該細胞移除的情況下進行了修飾；這種修飾包括通過基因置換、定點突變以及本領域一般技術(shù)人員已知的相關(guān)技術(shù)獲得的那些修飾。重組DNA技術(shù)包括用于在體外產(chǎn)生重組DNA和將重組DNA轉(zhuǎn)移進細胞的技術(shù)，重組DNA在細胞中可以表達或增殖，從而產(chǎn)生重組的多肽。多核苷酸或核酸的“重組”和“重組的”一般是指兩條或更多條核酸或多核苷酸鏈或片段的組裝或組合，以產(chǎn)生新的多核苷酸或核酸。重組多核苷酸或核酸有時稱為嵌合體。當核酸或多肽為人工的或工程化改造的，或衍生自人工的或工程化改造的蛋白質(zhì)或核酸時，該核酸或多肽是“重組的”。
[0036]如本文所用，術(shù)語核酸或基因“擴增”是指這樣的一種過程，通過該過程特定DNA序列以不成比例的方式復制，使得被擴增的核酸或基因以高于基因組中最初存在的拷貝數(shù)的拷貝數(shù)存在。在一些實施例中，通過在藥物(例如，可抑制的酶的抑制劑)的存在下培養(yǎng)而進行的細胞的選擇，導致編碼在所述藥物的存在下生長所需的基因產(chǎn)物的內(nèi)源性基因的擴增，或編碼該核酸或基因產(chǎn)物的外源(即，輸入)序列的擴增或二者皆有。
[0037]“擴增”是涉及模板特異性的核酸復制的特定情形。與其形成對照的是非特異性模板復制(即，復制是模板依賴的，但不依賴于特異性模板)。模板特異性在這里區(qū)別于復制的保真性(即，正確的多核苷酸序列的合成)和(核糖或脫氧核糖)核苷酸特異性。模板特異性在很多情況下以“靶”特異性描述。靶序列是此種意義的“靶”，也就是可設法將它們從其他核酸挑選出來。已經(jīng)設計出主要用于該挑選的擴增技術(shù)。
[0038]如本文所用，術(shù)語“引物”是指寡核苷酸(核苷酸殘基的聚合物)，無論是天然產(chǎn)生的(如在純化的限制性消化產(chǎn)物中)還是合成產(chǎn)生的，其能夠在被置于與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成在其中被誘發(fā)的條件下時(即，在核苷酸和誘發(fā)劑如DNA聚合酶的存在下并且在適合的溫度和PH下)，作為合成起始的點起作用。為了使擴增效率最高，引物優(yōu)選為單鏈的，但作為另一種選擇其也可以是雙鏈的。如果是雙鏈，則首先對引物進行處理以分離其鏈，然后再用于制備延伸產(chǎn)物。在一些實施例中，引物為寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長以在誘導劑的存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度取決于多種因素，包括溫度、引物來源以及使用的方法。
[0039]如本文所用，術(shù)語“探針”指這樣的寡核苷酸，無論是如在純化的限制酶切消化物中的天然存在的還是以合成 方式、重組方式或通過PCR擴增產(chǎn)生的，其通常能夠與所關(guān)注的另一寡核苷酸雜交。探針可以是單鏈的或雙鏈的。探針可用于特定基因序列的檢測、鑒別和分離。設想到，本發(fā)明中所用的任何探針將用任何“報告分子”進行標記，從而其可在任何檢測系統(tǒng)中檢測，所述檢測系統(tǒng)包括但不限于酶系統(tǒng)(如ELISA，以及基于酶的組織化學測定法)、熒光系統(tǒng)、放射性系統(tǒng)和發(fā)光系統(tǒng)。無意于將本發(fā)明局限于任何具體的檢測系統(tǒng)或標記。
[0040]如本文所用，當用于討論聚合酶鏈反應時，術(shù)語“靶”是指用于聚合酶鏈反應的引物結(jié)合的核酸區(qū)域。因此，可設法將“靶”從其他核酸序列中挑選出來。核苷酸“片段”是在靶核酸序列內(nèi)的核酸區(qū)域。
[0041]如本文所用，術(shù)語“聚合酶鏈反應”(PCR)是指美國專利N0.4，683，195、N0.4，683，202和N0.4，965，188的方法(特此將該專利以引用方式并入)，其包括在不進行克隆或純化的情況下增加靶序列的某個片段在基因組DNA的混合物中的濃度的方法。擴增靶序列的這種方法是本領域眾所周知的。
[0042]如本文所用，術(shù)語“擴增試劑”指擴增所需的除引物、核酸模板以及擴增酶以外的那些試劑(如脫氧核糖核苷三磷酸、緩沖劑等)。通常，將擴增試劑連同其他反應組分放置于和裝于反應容器(試管、微孔等)中。
[0043]如本文所用，術(shù)語“限制性內(nèi)切酶”或“限制酶”指能夠在稱為限制位點的特定核苷酸序列處或附近切開雙鏈或單鏈DNA的酶(如細菌酶)。包含限制位點的核苷酸序列為給定的限制性內(nèi)切酶或限制酶所識別和切割并且常常是插入DNA片段的位點?？蓪⑾拗莆稽c工程引入進表達載體或DNA構(gòu)建體中。
[0044]“同源重組”是指兩個DNA分子或成對染色體之間的DNA片段在相同或幾乎相同的核苷酸序列位點處的交換。在一些實施例中，染色體整合是同源重組。
[0045]如果核酸或多核苷酸在天然狀態(tài)下或通過本領域的技術(shù)人員已知的方法操縱時，可轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)生多肽或其片段，則稱該核酸或多核苷酸“編碼”多肽。也稱此類核酸的反義鏈編碼該序列。
[0046]如本領域已知的，DNA序列可被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生RNA序列，但RNA序列可被逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生DNA序列。
[0047]“宿主菌株”或“宿主細胞”指適合于包含所關(guān)注的DNA序列的表達載體的宿主。所關(guān)注的DNA序列可在宿主菌株或宿主細胞中表達所關(guān)注的蛋白質(zhì)。
[0048]“蛋白質(zhì)”或“多肽”包含氨基酸殘基的多聚序列。在本文中，術(shù)語“蛋白質(zhì)”與“多肽”可互換使用。遵照國際 純化學及應用化學聯(lián)合會-國際生物化學聯(lián)合會的生物化學命名委員會(IUPAC-1UB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, JCBN)所定義的氨基酸的單字母和三字母代碼在整個本公開中使用。單字母X指二十種氨基酸中的任一種。還應理解，由于遺傳密碼的簡并性，多肽可由不止一種核苷酸序列編碼。突變按以下方式命名:親本氨基酸的單字母代碼，后跟三位數(shù)或兩位數(shù)的位置編號，然后是變體氨基酸的單字母代碼。例如，使位置87的甘氨酸(G)突變?yōu)榻z氨酸(S)表示為“G087S”或“G87S”。多重突變通過在各突變之間插入表示。在位置87和90的突變表示為“G087S-A090Y”或“G87S-A90Y”或“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。對于缺失，使用單字母代碼“Z”。對于相對于親本序列的插入，單字母代碼“Z”位于該位置號碼的左側(cè)。對于缺失，單字母代碼“Z”位于該位置號碼的右側(cè)。對于插入，位置號碼是在插入的氨基酸的前面的位置號碼，每個氨基酸加0.01。例如，在位置87和88之間插入三個氨基酸即丙氨酸(A)、絲氨酸(S)和酪氨酸(Y)顯示為“Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y”。因而，將上面所有的突變加上位置100處的缺失組合在一起為:“G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”。
[0049]“前序列”或“前肽序列”是指蛋白酶分泌所必要的處于信號肽序列和成熟蛋白酶序列之間的氨基酸序列。前序列或前肽序列的切除會得到成熟的活性蛋白酶。
[0050]術(shù)語“信號序列”或“信號肽”指可參與成熟或前體形式的蛋白質(zhì)的分泌或直接轉(zhuǎn)運的氨基酸殘基序列。信號序列通常位于前體或成熟蛋白質(zhì)序列的N端。信號序列可以是內(nèi)源性的或外源性的。一種示例性的外源性信號序列包含來自枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的信號序列的前七個氨基酸殘基和與之融合的來自遲緩芽孢桿菌(ATCC 21536)枯草桿菌蛋白酶的信號序列的其余部分。通常成熟蛋白質(zhì)缺少信號序列。在轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)后通常由信號肽酶從該蛋白質(zhì)切除信號序列。
[0051]術(shù)語“雜合信號序列”指與待表達的基因的信號序列融合的信號序列，其中該序列的一部分從表達宿主獲得。在一些實施例中，利用合成序列。[0052]術(shù)語蛋白質(zhì)、多肽或肽的“成熟”形式指無信號肽序列和前肽序列的該蛋白質(zhì)、多肽或肽功能形式。
[0053]術(shù)語蛋白質(zhì)或肽的“前體”形式指具有與該蛋白質(zhì)的氨基或羰基末端有效連接的前序列的該蛋白質(zhì)成熟形式。前體還可具有與前序列的氨基末端有效連接的“信號”序列。前體還可以具有涉及翻譯后活性的另外的多核苷酸(例如，從前體切除會留下蛋白質(zhì)或肽的成熟形式的多核苷酸)。
[0054]關(guān)于氨基酸序列或核酸序列的術(shù)語“野生型”指所述氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。本文所用的術(shù)語“天然存在的”指自然界中存在的(即還未借助重組方法進行過操縱的)任何東西(如蛋白質(zhì)、氨基酸或核酸序列)。
[0055]本文所用的術(shù)語“非天然存在的”是指自然界中不存在的任何東西(如實驗室中產(chǎn)生的重組核酸)。
[0056]如本文所用，對于氨基酸殘基位置，“與相對應”或“對應于”或“對應”是指在蛋白質(zhì)或肽的列舉位置處的氨基酸殘基，或與蛋白質(zhì)或肽中列舉的殘基類似、同源或等同的氨基酸殘基。如本文所用，“對應區(qū)域”一般是指沿相關(guān)蛋白質(zhì)或參考蛋白質(zhì)的類似位置。
[0057]術(shù)語“衍生自”和“得自”不僅指通過所考慮的生物菌株產(chǎn)生或可產(chǎn)生的蛋白酶，還指從此類菌株分離的DNA序列編碼的以及在包含此類DNA序列的宿主生物中產(chǎn)生的蛋白酶。另外，該術(shù)語指由合成的和/或cDNA起源的DNA序列編碼的，并且具有所考慮的蛋白酶的鑒別特性的蛋白酶。例如，“衍生自芽孢桿菌屬的蛋白酶”是指那些由芽孢桿菌天然產(chǎn)生的具有蛋白水解活性的酶，以及指與由芽孢桿菌來源產(chǎn)生的那些蛋白酶類似的絲氨酸蛋白酶，但這些絲氨酸蛋白酶是通過使用基因工程技術(shù)由轉(zhuǎn)化有編碼絲氨酸蛋白酶的核酸的非芽孢桿菌生物體產(chǎn)生的。
[0058]在兩條核酸或多肽序列的語境中，術(shù)語“相同”是指當比對以達到最大匹配程度時兩條序列中相同的殘基，如使用如下序列比較或分析算法中的一種所測定的。
[0059]如本文所用，“同源基因”是指來自不同但通常相關(guān)的物種的一對基因，這對基因彼此對應并且彼此相同或非常類似。該術(shù)語涵蓋了因物種形成(即新物種的發(fā)展)而分化的基因(如直向同源基因)，以及因基因復制而分化的基因(如平行同源基因)。
[0060]如本文所用，“同源性”是指序列相似性或同一性，其中同一性是優(yōu)選的。同源性可用本領域已知的標準技術(shù)確定(參見例如Smith和Waterman, Adv.App1.Math.(《應用數(shù)學進展》)，2:482[1981] ;Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.(《分子生物學雜志》)，48:443 [1970] ;Pearson 和 Lipman，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國科學院院刊》)，85:2444[1988];軟件程序，如威斯康辛遺傳軟件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遺傳計算小組公司(Genetics Computer Group),威斯康辛州麥迪遜(Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ;以及 Devereux 等人，Nucl.Acid Res.(《核酸研究》)，12:387-395 [1984])。可用的算法的一個例子是PILEUP。PILEUP利用漸進性雙序列比對從一組相關(guān)序列產(chǎn)生多序列比對。其還可以畫出樹狀圖，該圖示出用于產(chǎn)生該比對的聚類關(guān)系。PILEUP使用Feng和Doolittle的漸進比對方法(參見Feng和Doolittle, J.Mol.Evol.(《分子進化雜志》)，35:351-360[1987])的簡化方法。該方法與Higgins和Sharp描述的方法(參見 Higgins 和 Sharp，CAB10S5: 151-153 [1989])類似?？捎玫?PILEUP 參數(shù)包括:默認空位權(quán)重=3.00，默認空位長度權(quán)重=0.10，以及加權(quán)的末端空位?？捎玫乃惴ǖ牧硪粋€例子是BLAST算法,該算法由Altschul等人進行了描述(參見Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物學雜志》)，215:403-410[1990];以及 Karlin 和 Altschul，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國科學院院刊》)，90:5873-5787[1993])。尤其可用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(參見Altschul等人,Meth.Enzymol.(《酶學方法》)，266:460-480 [1996])。WU-BLAST-2使用數(shù)種搜索參數(shù)，大部分參數(shù)設定為默認值?？烧{(diào)參數(shù)設定為如下值:重疊跨度(overlap span) = I,重疊分數(shù)(overlap fraction) = 0.125,字串閾值(word threshold) (T) = 11。HSP S和HSP S2參數(shù)是動態(tài)值，由程序自身根據(jù)特定序列的組成和被用來搜索所關(guān)注的序列的特定數(shù)據(jù)庫的組成來確定。然而，可以調(diào)整所述值來增加靈敏度。
[0061]參考序列和所關(guān)注的測試序列之間的序列同一性百分數(shù)可由本領域技術(shù)人員容易地測定。多核苷酸或多肽序列共有的同一性百分數(shù)通過分子之間序列信息的直接比較測定，所述比較通過序列比對并使用本領域已知的方法確定同一性來進行。適用于確定序列相似性的算法的例子是BLAST算法(參見Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物學雜志》)，215:403-410[1990])。用于進行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。該算法涉及首先通過在查詢序列中確定長度為W的短字串來確定高打分序列對(high scoring sequence pair,HSP)，該短字串當與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串比對時匹配或滿足某取正值的閾值分數(shù)T0這些最初的鄰近命中字串充當起點來尋找含有它們的更長的HSP。使命中字串沿進行比較的兩條序列的每一條朝兩個方向擴展至累積比對分數(shù)不能增加為止。命中字串的延伸在如下情況會停止:累積比對分數(shù)從最大獲得值下降達數(shù)量X ;累積分數(shù)達到零或零以下；或者到達任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定該算法的靈敏度和速度。BLAST程序使用如下默認值:字串長度(W)為11、BL0SUM62打分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sc1. USA(《美國科學院院刊》)，89:10915 [1992])，比對數(shù)(B)為 50，期望值(E)為10，M’ 5，N’ -4，以及兩條鏈的比較。
[0062]BLAST算法然后對兩條序列之間的相似性進行統(tǒng)計分析(例如參見Karlin和Altschul,出處同上)。BLAST算法提供的一種相似性量度是最小合計概率(smallest sumprobability, P (N))，其指示兩條核苷酸或氨基酸序列之間的匹配會偶然發(fā)生的概率。例如，如果在測試核酸與絲氨酸蛋白酶核酸的比較中最小合計概率低于約0.1，更優(yōu)選低于約0.01，最優(yōu)選低于0.001，則該核酸可視為與本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶核酸相似。在測試核酸編碼絲氨酸蛋白酶多肽的情況中，如果比較得到低于約0.5，更優(yōu)選低于約0.2的最小合計概率，則其視為與指定的絲氨酸蛋白酶核酸相似。
[0063]在兩條或更多條核酸或多肽序列的語境中，“相同”或“同一性”百分數(shù)是指，當比較和比對以達到最大相似性時，兩條或更多條序列是相同的或分別具有指定百分比的相同核酸殘基或氨基酸殘基，如使用序列比較算法或通過目測所確定的。主題氨基酸序列與參考(即查詢)氨基酸序列的“序列同一性百分數(shù)”或“同一性或“序列同一性或“氨基酸序列同一性％ ”意指當將序列進行最佳比對時，在比較長度上主題氨基酸序列與查詢氨基酸序列相同(即以氨基酸比氨基酸計)達指定的百分數(shù)。因此，就兩條氨基酸序列而言，80%氨基酸序列同一性或80%同一性意指兩條最佳比對的氨基酸序列中80%氨基酸殘基是相同的。[0064]主題核酸序列與參考(即查詢)核酸序列的“序列同一性百分數(shù)”或“同一性
或“序列同一性％ ”或“核苷酸序列同一性％ ”意指當將序列進行最佳比對時，在比較長度上主題核酸序列與查詢序列相同(即以多核苷酸序列的核苷酸比核苷酸計)達指定的百分數(shù)。因此，就兩條核酸序列而言，80%核苷酸序列同一性或80%同一性意指兩條最佳比對的核酸序列中80 %核苷酸殘基是相同的。
[0065]在一些實施例中，主題序列與查詢序列的“序列同一性百分數(shù)”或“序列同一性
或“同一性％ ”可通過將兩條序列進行最佳比對并在比較長度上比較兩條最佳比對的序列來計算。確定在最佳比對中相同的殘基出現(xiàn)在兩條序列中的位置數(shù)目，從而提供匹配位置的數(shù)目，然后將匹配位置的數(shù)目除以比較長度(除非另外指明，否則其為查詢序列的長度)的位置總數(shù)。所得的數(shù)目乘以100而得到主題序列與查詢序列的序列同一性百分數(shù)。
[0066]“最佳比對”或“最佳比對的”指兩條(或更多條)序列的給出最高同一性百分比分數(shù)的比對。例如，可通過將兩條蛋白質(zhì)序列進行手動比對使得每條序列中最大數(shù)目的相同氨基酸殘基被一起比對，或通過使用本文描述的或本領域已知的軟件程序或方法，來實現(xiàn)所述序列的最佳比對?？赏ㄟ^將兩條核酸序列進行手動比對使得每條序列中最大數(shù)目的相同核苷酸殘基被一起比對，或通過使用本文描述的或本領域已知的軟件程序或方法，來實現(xiàn)所述序列的最佳比對。
[0067]在一些實施例中，當用限定的參數(shù)，例如限定的氨基酸置換矩陣、空位存在罰分(也稱為空位開放罰分)和空位延伸罰分來比對兩條多肽序列，以實現(xiàn)該對序列可能的最高相似性分數(shù)時，這兩條多肽序列被認為是“最佳比對的”。在多肽序列比對算法(如BLASTP)中，BL0SUM62打分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，出處同上)通常用作默認的打分置換矩陣。施加空位存在罰分以在被比對的序列之一者中引入單個氨基酸空位，并為該空位中的每一個殘基位置施加空位延伸罰分。所采用的示例性比對參數(shù)是:BL0SUM62打分矩陣，空位存在罰分=11，空位延伸罰分=I。比對分數(shù)由每條序列的該對比開始和結(jié)束的氨基酸位置(如比對窗口)，以及任選由一條或兩條序列中一個空位或多個空位的插入來限定，以實現(xiàn)可能的最高相似性分數(shù)。
[0068]兩條或更多條序列之間的最佳比對可通過目測手動來確定，或通過使用計算機，例如但不限于如BLASTP程序(用于氨基酸序列)和BLASTN程序(用于核酸序列)(參見例如 Altschul 等人,Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)，25 (17):3389-3402 (1997);還可參見美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站)來確定。
[0069]如果所關(guān)注的多肽包含與參考多肽的氨基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80 %、至少約85 %、至少約90%、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %、至少約99 %或至少約99.5 %的序列同一性的氨基酸序列，則可稱所關(guān)注的多肽與參考多肽“實質(zhì)上相同”。兩條這類多肽之間的同一性百分數(shù)可通過觀察兩條經(jīng)最佳比對的多肽序列來手動確定，或通過使用軟件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用標準參數(shù)來確定。兩個多肽實質(zhì)上相同的一個指示是第一多肽與第二多肽是免疫交叉反應性的。通常，差別在于保守氨基酸置換的多肽是免疫交叉反應性的。因而，例如在某條多肽與第二多肽僅因保守氨基酸置換或一個或多個保守氨基酸置換而不同的情況中，這兩條多肽是實質(zhì)上相同的。
[0070]如果所關(guān)注的核酸包含與參考核酸的核苷酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80 %、至少約85 %、至少約90%、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %、至少約99 %或至少約99.5 %的序列同一性的核苷酸序列，則可稱所關(guān)注的核酸與參考核酸“實質(zhì)上相同”。兩條這類核酸之間的同一性百分數(shù)可通過觀察兩條經(jīng)最佳比對的核酸序列來手動確定，或通過使用軟件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用標準參數(shù)來確定。兩條核酸序列實質(zhì)上相同的一個指示是這兩條核酸分子在嚴格條件(例如，在中等嚴格性至高嚴格性的范圍內(nèi))下彼此雜交。
[0071]當核酸或多核苷酸從其他組分(包括但不限于例如其他蛋白質(zhì)、核酸、細胞等)部分地或完全地分離時，該核酸或多核苷酸是“分離的”。相似地，當多肽、蛋白質(zhì)或肽從其他組分(包括但不限于例如其他蛋白質(zhì)、核酸、細胞等)部分地或完全地分離時，該多肽、蛋白質(zhì)或肽是“分離的”。以摩爾濃度計，在組合物中，分離的物質(zhì)的豐度比其他物質(zhì)更高。例如，分離的物質(zhì)可以占所有存在的大分子物質(zhì)的至少約50%、約70%、約80%、約85%、約90 %、約 91 %、約 92 %、約 93 %、約 94 %、約 95 %、約 96 %、約 97 %、約 98 %、約 99 % 或約100% (以摩爾濃度計)。優(yōu)選地，所關(guān)注的物質(zhì)純化為基本上均質(zhì)的(即通過常規(guī)檢測方法在組合物中檢測不到污染物)。純度和均一性可以使用本領域熟知的多種技術(shù)測定，例如對蛋白質(zhì)或核酸樣品進行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后在染色后進行目測觀察。如果需要，可采用高分辨率技術(shù)，如高效液相色譜法(HPLC)或類似的方法來純化材料。
[0072]應用于核酸或多肽的術(shù)語“純化的” 一般表示核酸或多肽基本上不合其他組分，如通過本領域熟知的分析技術(shù)所測定的(如，純化的多肽或多核苷酸在電泳凝膠、色譜洗脫物和/或經(jīng)密度梯度離心的 介質(zhì)中形成離散的條帶)。例如，在電泳凝膠中產(chǎn)生基本上一個條帶的核酸或多肽是“純化的”。純化的核酸或多肽的純度為至少約50%，通常純度為至少約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約97%、約98%、約99%、約99.5%、約99.6%、約99.7%、約99.8%或更大(例如以摩爾濃度計的重量％ )。在相關(guān)的意義上，本發(fā)明提供對組合物富集一種或多種本發(fā)明的分子，例如一種或多種本發(fā)明的多肽或多核苷酸的方法。在應用純化或富集技術(shù)后某分子的濃度有實質(zhì)性增加時，則對組合物富集了該分子。實質(zhì)上純的本發(fā)明的多肽或多核苷酸(如，分別為實質(zhì)上純的本發(fā)明變體蛋白酶或編碼本發(fā)明變體蛋白酶的多核苷酸)通常將占特定組合物中的所有大分子物質(zhì)重量(以摩爾濃度計)的至少約55%、約60%、約70%、約80%、約85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98、約 99%、約99.5%或更高。
[0073]在相關(guān)的意義上，本發(fā)明提供針對一種或多種本發(fā)明的分子，例如一種或多種本發(fā)明的多肽(如一種或多種本發(fā)明的變體蛋白酶)或一種或多種本發(fā)明的核酸(如編碼一種或多種本發(fā)明變體蛋白酶的一種或多種核酸)對組合物進行富集的方法。在應用純化或富集技術(shù)后某分子的濃度有實質(zhì)性增加時，則對組合物富集了該分子?；旧霞兊亩嚯幕蚨嗪塑账嵬ǔ⒄继囟ńM合物中的所有大分子物質(zhì)重量(以摩爾濃度計)的至少約55%、約 60%、約 70%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約96%、約97%、約98、約99%、約99.5%或更高。
[0074]本文所用的術(shù)語“組合誘變”或“組合”是指產(chǎn)生參考核酸序列的核酸變體的文庫的方法。在這些文庫中，變體含有選自一組預定突變的一個或數(shù)個突變。這類方法還提供了引入隨機突變的手段，這些隨機突變不是該預定突變組的成員。一些此類方法包括在美國專利N0.6，582，914中示出的那些方法，特此將該專利以引用的方式。一些此類組合誘變方法包括和/或涵蓋在市售試劑盒(例如QUIKCHANGE?多定點誘變試劑盒(Stratagene公司)，PCR融合/延伸PCR)中體現(xiàn)的方法。
[0075]如本文所用，結(jié)合變體蛋白酶使用的“具有改善的特性’’是指相對于對應的參考蛋白酶(如野生型或天然存在的蛋白酶)，變體蛋白酶具有改善的或增強的洗滌或清潔性能，和/或改善的或增強的穩(wěn)定性，任選保持了洗滌或清潔性能。變體蛋白酶的改善特性可以包括改善的洗滌或清潔性能和/或改善的穩(wěn)定性。在一些實施例中，本發(fā)明提供表現(xiàn)出如下特性中的一者或多者的本發(fā)明變體蛋白酶:相對于參考蛋白酶(如，野生型蛋白酶，例如野生型枯草桿菌蛋白酶)的改善的手動洗滌性能、改善的手動或手工盛具洗滌性能、改善的自動盛具洗滌性能、改善的衣物洗滌性能和/或改善的穩(wěn)定性。
[0076]如本文所用，術(shù)語“功能測定法”指提供蛋白質(zhì)活性的指示的測定法。在一些實施例中，該術(shù)語是指其中針對蛋白質(zhì)以其慣常的本領發(fā)揮作用的能力對該蛋白質(zhì)進行分析的測定系統(tǒng)。例如，就酶而言，功能測定法涉及測定該酶催化反應的效力。
[0077]如本文所用，術(shù)語“靶性質(zhì)”是指待變更的起始基因的性質(zhì)。無意于將本發(fā)明局限于任何特定的靶性質(zhì)。然而，在一些實施例中，靶性質(zhì)是基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性(如，對變性、蛋白水解或其他降解因素的耐受性)，而在其他實施例中，生產(chǎn)宿主的生產(chǎn)水平發(fā)生改變。
[0078]如本文所用，在核酸的語境中，術(shù)語“性質(zhì)”或其語法等同形式是指可選擇或檢測的核酸的任何特性或?qū)傩?。這些性質(zhì)包括但不限于影響與多肽的結(jié)合的性質(zhì)、賦予包含特定核酸的細胞的性質(zhì)、影響基因轉(zhuǎn)錄的性質(zhì)(如，啟動子強度、啟動子識別、啟動子調(diào)控、增強子功能)、影響RNA加工的性質(zhì)(如，RNA剪接、RNA穩(wěn)定性、RNA構(gòu)象和轉(zhuǎn)錄后修飾)、影響翻譯的性質(zhì)(如mRNA的水平 、調(diào)控、與核糖體蛋白的結(jié)合、翻譯后修飾)。例如，可以改變核酸的轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、調(diào)節(jié)因子等的結(jié)合位點以產(chǎn)生所需的特性或鑒別不期望的特性。
[0079]如本文所用，在多肽(包括蛋白質(zhì))的語境中，術(shù)語“性質(zhì)”或其語法等同形式是指可選擇或檢測的多肽的任何特性或?qū)傩浴＿@些性質(zhì)包括但不限于氧化穩(wěn)定性、底物特異性、催化活性、酶活性、熱穩(wěn)定性、堿穩(wěn)定性、pH活性分布、對蛋白降解的耐受性、KM、kcat> kcat/kM比率、蛋白質(zhì)折疊、誘導免疫應答、與配體結(jié)合的能力、與受體結(jié)合的能力、被分泌的能力、在細胞表面上展示的能力、低聚化的能力、信號傳導的能力、刺激細胞增殖的能力、抑制細胞增殖的能力、誘導細胞凋亡的能力、被磷酸化或糖基化作用修飾的能力和/或治療疾病的能力等。
[0080]如本文所用，術(shù)語“篩選”在本領域中具有其通常含義。在一個示例性篩選方法中，提供了突變體核酸或由其編碼的變體多肽，并且分別評估或測定突變體核酸或變體多肽的性質(zhì)。突變體核酸或變體多肽的測定性質(zhì)可以分別與對應的前體(親本)核酸的性質(zhì)或與對應的親本多肽的性質(zhì)比較。
[0081]對技術(shù)人員而言將顯而易見的是，獲得具有改變的性質(zhì)的核酸或蛋白質(zhì)的篩選方法取決于原料性質(zhì)，突變體核酸的產(chǎn)生旨在促進原料性質(zhì)的變更。因此，技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明不限于要篩選的任何具體性質(zhì)，并且如下性質(zhì)描述僅列出了示例性的例子。篩選任何特定性質(zhì)的方法通常在本領域中有所描述。例如，可在突變之前和之后測量結(jié)合性、pH、特異性等，其中變化表明發(fā)生了變更。優(yōu)選地，篩選以高通量方式進行，包括同時篩選多個樣品，包括但不限于利用芯片、噬菌體展示和多底物和/或指示劑的測定法。
[0082]如本文所用，在一些實施例中，篩選方法包括一個或多個選擇步驟，在這些步驟中將所關(guān)注的變體從一群變體中富集。這些實施例的例子包括對賦予宿主生物生長優(yōu)勢的變體的選擇，以及噬菌體展示或任何其他展示方法，其中可根據(jù)變體的結(jié)合或催化性質(zhì)從一群變體捕集該變體。在一些實施例中，將變體文庫暴露于脅迫(如熱、變性等)，隨后對仍然完整的變體在篩選中進行鑒定或通過選擇進行富集。該術(shù)語旨在涵蓋任何合適的選擇方式。實際上，無意于將本發(fā)明局限于任何特定的篩選方法。
[0083]術(shù)語“經(jīng)修飾的核酸序列”和“經(jīng)修飾的基因”在本文中可互換使用，是指天然存在的(即野生型)核酸序列的包含缺失、插入或中斷的核酸序列。在一些實施例中，經(jīng)修飾的核酸序列的表達產(chǎn)物是截短的蛋白質(zhì)(例如，如果修飾為序列的缺失或中斷的話)。在一些實施例中，截短的蛋白質(zhì)保留生物活性。在備選的實施例中，經(jīng)修飾的核酸序列的表達產(chǎn)物是延長的蛋白質(zhì)(例如，修飾包括核酸序列中的插入)。在一些實施例中，核苷酸插入核酸序列會導致截短的蛋白質(zhì)(例如，當插入導致形成終止密碼子時)。因此，插入可以導致截短的蛋白質(zhì)或延長的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物。
[0084]“突變體”核酸序列通常指這樣的核酸序列，其在宿主細胞的野生型序列中存在的至少一個密碼子中具有變更，使得該突變型核酸序列的表達產(chǎn)物是相對于野生型蛋白質(zhì)而言具有變更的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。表達產(chǎn)物可具有變更的功能能力(例如增強的酶活性)。
[0085]如本文所用，短語“底物特異性的變更”是指酶的底物特異性的變化。在一些實施例中，底物特異性的變化定義為由于酶的突變或反應條件的改變而導致的特定底物的kMt和/或Km的變化。通過比較酶表現(xiàn)出的對不同底物的催化效率，來確定酶的底物特異性。這些測定尤其可用于評估突變酶的效率，因為通常期望產(chǎn)生的變體酶對所關(guān)注的底物表現(xiàn)出更大kMt/Km比率。然而，無意于將本發(fā)明局限于任何特定的底物組合物或底物特異性。
[0086]如本文所用，“表 面性質(zhì)”用于指靜電荷，以及蛋白質(zhì)表面所展現(xiàn)的諸如疏水性和親水性之類的性質(zhì)。
[0087]本文所用的術(shù)語“凈電荷”定義為分子中存在的所有電荷的總和?？蓪τH本蛋白質(zhì)分子作出“凈電荷改變”，以提供具有與該親本分子的凈電荷不同的凈電荷的變體(即該變體具有的凈電荷與親本分子的凈電荷不相同)。例如，用帶負電的氨基酸置換中性氨基酸或用中性氨基酸置換帶正電的氨基酸，會導致相對于親本分子而言凈電荷為-1。用帶負電的氨基酸置換帶正電的氨基酸，會導致相對于親本而言凈電荷為_2。用帶正電的氨基酸置換中性氨基酸或用中性氨基酸置換帶負電的氨基酸，會導致相對于親本而言凈電荷為+1。用帶正電的氨基酸置換帶負電的氨基酸，會導致相對于親本而言凈電荷為+2。親本蛋白質(zhì)的凈電荷還可通過缺失和/或插入帶電的氨基酸來變更。
[0088]術(shù)語“熱穩(wěn)定的”和“熱穩(wěn)定”和“熱穩(wěn)定性”是指蛋白酶在本發(fā)明的蛋白水解、水解、清潔或其他處理期間的主要條件下(同時暴露于改變的溫度)，暴露于指定的溫度達給定時間段后仍保持指定量的酶活性?！案淖兊臏囟取焙w增加的或降低的溫度。在一些實施例中，蛋白酶在暴露于改變的溫度指定時間段(例如至少約60分鐘、約120分鐘、約180分鐘、約240分鐘、約300分鐘等)后保持至少約50 %、約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、約85%、約90%、約92%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的蛋白水解活性。[0089]在氧化、螯合劑、熱和/或pH穩(wěn)定蛋白酶的語境中，術(shù)語“增強的穩(wěn)定性”是指與其他蛋白酶(例如枯草桿菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，隨時間推移保留較高的蛋白水解活性。
[0090]在氧化、螯合劑、熱和/或pH穩(wěn)定蛋白酶的語境中，術(shù)語“降低的穩(wěn)定性”是指與其他蛋白酶(例如枯草桿菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，隨時間推移保留較低的蛋白水解活性。
[0091]術(shù)語“清潔活性”是指在本發(fā)明的蛋白水解、水解、清潔或其他過程期間的主要條件下，變體蛋白酶或參考蛋白酶實現(xiàn)的清潔性能。在一些實施例中，變體蛋白酶或參考蛋白酶的清潔性能可以使用用于清潔物品或表面上的一種或多種不同的酶敏感性污潰(例如來自食物、草、血、墨、奶、油和/或卵蛋白的污潰)的各種測定法來測定。變體或參考蛋白酶的清潔性能可通過使物品或表面上的污潰經(jīng)受標準洗滌條件，并且使用各種色譜方法、分光光度方法或其他定量方法評估污潰被移除的程度來測定。示例性的清潔測定法和方法是本領域已知的，包括但不限于W099/34011和美國專利6，605, 458 (這二個專利均以引用方式并入本文)中描述的那些方法以及下文提供的實例中包括的那些清潔測定法和方法。
[0092]術(shù)語變體蛋白酶或參考蛋白酶的“清潔有效量”是指在特定清潔組合物中實現(xiàn)所需水平的酶活性的蛋白酶的量。這種有效量可由本領域一般技術(shù)人員容易地確定并且基于多種因素，如所用的特定蛋白酶、清潔應用、清潔組合物的具體組成，以及是需要液體組合物還是干燥(例如顆粒狀、片狀、條棒狀)組合物等等。
[0093]術(shù)語“清潔輔助材料”是指清潔組合物中包含的除本發(fā)明變體蛋白酶之外的任何液體、固體或氣體材料。在一些實施例中，本發(fā)明的清潔組合物包括一種或多種清潔輔助材料。每種清潔輔助材 料通常根據(jù)清潔組合物的具體類型和形式(例如液體、顆粒、粉末、條棒、糊、噴霧、片劑、凝膠、泡沫或其他組合物)來選擇。優(yōu)選地，每種清潔輔助材料與組合物中所用的蛋白酶相容。
[0094]在清潔活性的語境中術(shù)語“增強的性能”是指酶對某些酶敏感性污潰如蛋、奶、草、墨、油和/或血的增加的或更高的清潔活性，這種活性是在標準的洗滌循環(huán)和/或多個洗滌循環(huán)后通過常用的評價法來測定的。
[0095]在清潔活性的語境中術(shù)語“減低的性能”是指酶對某些酶敏感性污潰如蛋、奶、草或血的降低的或較小的清潔活性，這種活性是在標準的洗滌循環(huán)后通過常用的評價法來測定的。
[0096]在本發(fā)明變體蛋白酶的清潔活性語境中，術(shù)語“相當?shù)男阅堋笔侵钢辽偌s60%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91 %、至少約92 %、至少約93 %、至少約94%、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%的比較或參考蛋白酶(如市售蛋白酶)的清潔活性，所述比較或參考蛋白酶包括但不限于0PTIMASE?蛋白酶(杰能科公司)、I3URAFECTtm蛋白酶產(chǎn)品(杰能科公司)、SAVINASE?蛋白酶(諾維信公司)、BPN’ -變體(參見例如美國專利 N0.Re34, 606)、RELASE?、DURAZYME?、EVERLASE?、KANNASE? 蛋白酶(諾維信公司)、MAXACAL?、MAXAPEM?、PROPERASE?蛋白酶(杰能科公司；還可參見美國專利N0.Re34, 606和美國專利 N0.5，700，676、N0.5，955，340、N0.6，312，936 以及 N0.6，482，628)和遲緩芽孢桿菌變體蛋白酶產(chǎn)品(例如W092/21760、W095/23221和/或W097/07770中描述的那些)?？扇缦聹y定清潔性能:在涉及酶敏感性污潰(例如草、血、墨、油和/或奶)的各種清潔測定法中，將本發(fā)明變體蛋白酶與參考枯草桿菌蛋白酶進行比較，如在標準洗滌循環(huán)條件后通過常用的分光光度測定或分析法來測定。
[0097]本文所用的術(shù)語“消費品”意指織物和家庭護理產(chǎn)品。如本文所以，術(shù)語“織物和家庭護理產(chǎn)品”或“織物和家居護理產(chǎn)品”包括通常旨在以它們所銷售的形式使用或消費的且用以處理織物、硬質(zhì)表面和任何其他表面的產(chǎn)品；和用于無生命表面的護理和清潔的清潔系統(tǒng)整體；以及織物調(diào)理劑產(chǎn)品和特定設計用于織物的護理和維護的其他產(chǎn)品；和空氣護理產(chǎn)品，包括:空氣護理(包括空氣清新劑和香味遞送系統(tǒng))；汽車護理產(chǎn)品、寵物護理產(chǎn)品、家畜護理產(chǎn)品、個人護理產(chǎn)品、珠寶護理產(chǎn)品；盛具洗滌產(chǎn)品、織物調(diào)理產(chǎn)品(包括軟化和/或鮮化)、衣物洗滌產(chǎn)品、洗衣和漂洗添加劑和/或護理產(chǎn)品、預處理清潔組合物、硬質(zhì)表面清潔和/或處理產(chǎn)品(包括地板和抽水馬桶清潔劑、玻璃清潔劑和/或處理劑、瓷磚清潔劑和/或處理劑、陶瓷清潔劑和/或處理劑)以及用于消費者或公共場所使用的其他清潔產(chǎn)品。在一些實施例中，織物和家庭護理產(chǎn)品適用于傷口和/或皮膚。“織物和家庭護理產(chǎn)品”包括消費者和公共場所用產(chǎn)品。
[0098]本文所用的術(shù)語“非織物和家庭護理產(chǎn)品”是指這樣的組合物，其被添加至其他組合物中以產(chǎn)生可以為織物和家庭護理產(chǎn)品的最終產(chǎn)品。
[0099]如本文所用，術(shù)語“公共場所用清潔組合物”是指適用于公共場所(包括但不限于學校、醫(yī)院、工廠、商場、公司、建筑物、餐館、辦公樓和商廈、加工和/或制造車間、獸醫(yī)院、工廠化農(nóng)場、工廠化牧場等)的產(chǎn)品。
[0100]本文所用的術(shù)語“清潔和/或處理組合物”是指織物和家庭護理產(chǎn)品的這樣的子集，除非另外指明，該子 集包括適用于清潔和/或處理物品的組合物。這類產(chǎn)品包括(但不限于)用于處理織物、硬質(zhì)表面及織物和家庭護理領域中的任何其他表面的產(chǎn)品，包括:空氣護理產(chǎn)品(包括空氣清新劑和香味遞送系統(tǒng))；汽車護理產(chǎn)品、盛具洗滌產(chǎn)品；織物調(diào)理產(chǎn)品(包括軟化和/或鮮化)；衣物洗滌產(chǎn)品、洗衣和漂洗添加劑和/或護理產(chǎn)品、硬質(zhì)表面清潔和/或處理產(chǎn)品(包括地板和抽水馬桶清潔劑)；顆?；蚍勰┬问降亩喙δ苄突颉爸毓感汀毕礈靹绕涫乔鍧嵪礈靹?；液體、凝膠或糊形式的多功能型洗滌劑，尤其是所謂的重垢液體型；液體精細織物洗滌劑；手動盛具洗滌劑或輕垢型盛具洗滌劑，尤其是高泡類型的那些；機洗用盛具洗滌劑，包括家居和公共場所使用的各種片劑型、顆粒型、液體型和漂洗助劑型:汽車或地毯清洗劑、浴室清潔劑(包括抽水馬桶清潔劑)；以及清潔輔劑，例如漂白添加劑和“去污棒”或預處理類型、底物裝載型產(chǎn)品(substrate-laden)如加干燥劑的片材。
[0101 ] 實際上，如本文所用，本發(fā)明的“清潔組合物”或“清潔制劑”是指可用于從待清潔的物體、物品或表面移除或除去化合物(如不需要的化合物)的任何本發(fā)明組合物，所述待清潔的物體、物品或表面包括但不限于，例如織物、織物物品、盛具物品、餐具物品、玻璃器具物品、接觸鏡、其他固體基材、毛發(fā)(洗發(fā)劑)(包括人或動物毛發(fā))、皮膚(肥皂或/和霜劑)、牙齒(漱口水、牙膏)、物品或物體的表面(如硬質(zhì)表面，例如桌子、桌面、墻壁、家具物品、地板、天花板、非盤碟物品、非盛具物品等的硬質(zhì)表面)、過濾器、膜(如過濾膜，包括但不限于超濾膜)等。該術(shù)語涵蓋為所需清潔組合物的特定類型和產(chǎn)品的形式(如液體、凝膠、顆粒、噴霧或其他組合物)選擇的任何材料和/或添加的化合物，只要該組合物與用于組合物的蛋白酶和其他酶相容即可。易于通過考慮待清潔的表面、物體、物品或織物以及針對在使用期間清潔條件所需的組合物形式來具體選擇清潔組合物材料。
[0102]清潔組合物和清潔制劑包括適于對任何物體、物品和/或表面進行清潔、漂白、消毒和/或滅菌的任何組合物。這種組合物和制劑包括但不限于例如:液體和/或固體組合物，包括清潔或洗滌劑組合物(例如液體、片狀、凝膠、條棒狀、顆粒和/或固體衣物清潔組合物或洗滌劑組合物以及精細織物洗滌劑組合物；硬質(zhì)表面清潔組合物和制劑，如用于玻璃、木材、陶瓷和金屬臺面和窗；地毯清潔劑；烘箱清潔劑；織物清新劑；織物軟化劑；以及紡織物、衣物助洗劑清潔組合物或洗滌劑組合物、洗衣添加劑清潔組合物和衣物預洗劑清潔組合物；盛具洗滌組合物，包括手動或手工盛具洗滌組合物(如“手動”或“手工”盛具洗滌劑)和自動盛具洗滌用組合物(如“自動盛具洗滌用洗滌劑”)。
[0103]除非另外指明，否則如本文所用，清潔組合物或清潔制劑包括顆粒狀或粉末形式的多功能型洗滌劑或重垢型洗滌劑，尤其是清潔洗滌劑；液體、顆粒、凝膠、固體、片或糊形式的多功能型洗滌劑，尤其是所謂的重垢液體(HDL)洗滌劑或重垢粉末洗滌劑(HDD)類型；液體精細織物洗滌劑；手動或手工盛具洗滌劑，包括高泡類型的那些；手動或手工盛具洗滌劑、自動盛具洗滌用洗滌劑或盛具或餐具洗滌劑，包括家居和公共場所使用的各種片、粉末、固體、顆粒、液體、凝膠和漂洗助劑類型；液體清潔和消毒劑，包括抗菌手洗類型、清潔條棒、漱口水、假牙清潔劑、汽車清洗劑、地毯清洗劑、浴室清潔劑；人和其他動物的洗發(fā)劑和/或毛發(fā)清洗劑；沐浴凝膠和泡沫浴和金屬洗滌劑；以及清潔輔劑，例如漂白添加劑和“去污棒”或預處理類型。在一些實施例中，顆粒狀組合物為“緊湊”形式；在一些實施例中，液體組合物為“濃縮”形式。
[0104]如本文所用，“織物清潔組合物”包括手洗和機洗衣物洗滌劑組合物，包括洗衣添加劑組合物和適用于染污織物(如衣物、亞麻布和其他紡織材料)的浸洗和/或預處理的組合物在內(nèi)。
[0105]如本文所用，“非織物清潔組合物”包括非紡織物(即非織物)表面清潔組合物，包括但不限于例如手動或人工或自動盛具洗滌劑組合物、口腔清潔組合物、假牙清潔組合物和個人清潔組合物。
[0106]如本文所以，術(shù)語“織物和/或硬質(zhì)表面清潔和/或處理組合物”是清潔和處理組合物的這樣的子集，除非另外指明，該子集包括顆粒或粉末形式的多用途型或“重垢型”洗滌劑，尤其是清潔洗滌劑；液體、凝膠或糊形式的多功能型洗滌劑，尤其是所謂的重垢液體型；液體精細織物洗滌劑；手動盛具洗滌劑或輕垢型盛具洗滌劑，尤其是高泡類型的那些；機洗用盛具洗滌劑，包括家居和公共場所使用的各種片劑型、顆粒型、液體型和漂洗助劑型；液體清潔和消毒劑，汽車或地毯清洗劑、浴室清潔劑(包括抽水馬桶清潔劑)；織物調(diào)理產(chǎn)品，包括可以液體、固體和/或干衣紙形式使用的軟化產(chǎn)品和/或鮮化產(chǎn)品；以及清潔輔劑，例如漂白添加劑和“去污棒”或預處理類型、底物裝載型產(chǎn)品如加干燥劑的片材。所有此類適用的產(chǎn)品可以是標準、濃縮或甚至高濃縮形式，甚至濃縮到使此類產(chǎn)品在某些方面為非水性的程度。 [0107]如本文所用，術(shù)語“洗滌劑組合物”或“洗滌劑制劑”用于指旨在用于洗滌介質(zhì)中用來清潔染污的或臟的物體(包括特定的織物和/或非織物物體或物品)的組合物。本發(fā)明的這類組合物不限于任何特定的洗滌劑組合物或制劑。實際上，在一些實施例中，本發(fā)明的洗滌劑包含至少一種本發(fā)明的變體蛋白酶，此外還包含一種或多種表面活性劑、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶、助洗劑(例如助洗劑鹽)、漂白劑、漂白活化劑、上藍劑、熒光染料、結(jié)塊抑制劑、掩蔽劑、酶激活劑、抗氧化劑和/或增溶劑。在某些情況下，助洗劑鹽為硅酸鹽和磷酸鹽的混合物，優(yōu)選硅酸鹽(如偏硅酸鈉)比磷酸鹽(如三聚磷酸鈉)多。一些本發(fā)明的組合物(例如但不限于清潔組合物或洗滌劑組合物)不含有任何磷酸鹽(如磷酸鹽或磷酸鹽助洗劑)。
[0108]如本文所用，術(shù)語“漂白”是指以足夠的時長和/或在合適的pH和/或溫度條件下處理材料(如織物、衣物、紙漿等)或表面以實現(xiàn)該材料的增亮(增白)和/或清潔。適用于漂白的化學品的例子包括但不限于例如C102、H202、過酸、NO2等。
[0109]如本文所用，蛋白酶(如本發(fā)明的變體蛋白酶)的“洗滌性能”是指變體蛋白酶對洗滌的貢獻，與未向組合物中添加該變體蛋白酶的洗滌劑相比其為洗滌劑提供額外的清潔性能。洗滌性能是在相關(guān)的洗滌條件下進行比較。在一些測試系統(tǒng)中，其他相關(guān)因素(如洗滌劑組成、泡沫濃度、水硬度、洗滌力學、時間、PH和/或溫度)可以以使得某些細分市場中的家居應用(手動或手用盛具洗滌、自動盛具洗滌、盛具清潔、餐具清潔、織物清潔等)的典型條件得以模擬的方式進行控制。
[0110]術(shù)語“相關(guān)洗滌條件”在本文中用于指在手動盛具洗滌、自動盛具洗滌或衣物洗滌劑細分市場中在家庭中實際上使用的條件，特別是洗滌溫度、時間、洗滌力學、泡沫濃度、洗滌劑類型和水硬度。
[0111]術(shù)語“改善的洗滌性能”用于指在相關(guān)洗滌條件下在去污方面獲得更好的最終結(jié)果，或以重量計，相對于相應的野生型或起始親本蛋白酶，需要較少的變體蛋白酶來獲得相同的最終結(jié)果。
[0112]如本文所用，術(shù)語“消毒”是指從表面除去污染物，以及抑制或殺死物品表面上的微生物。無意于將本發(fā)明受限于任何特定表面、物品或待移除的污染物或微生物。
[0113]本文的清潔組合物的“緊湊”形式最好由密度反映，就組成來說，由無機填料鹽的量反映。無機填料鹽是呈粉末形式的洗滌劑組合物的常規(guī)成分。在常規(guī)洗滌劑組合物中，填料鹽是大量存在，通常占總組合物的約17重量％至約35重量％。相比之下，在緊湊型組合物中，填料鹽以不超過總組合物的約15 %的量存在。在一些實施例中，填料鹽以不超過所述組合物的約10重量％，或更優(yōu)選不超過約5重量％的量存在。在一些實施例中，無機填料鹽選自堿金屬和堿土金屬硫酸鹽和氯化物。在一些實施例中，填料鹽為硫酸鈉。
[0114]在本文中，給定氨基酸序列中的氨基酸殘基的位置通常利用SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的對應氨基酸殘基的位置的編號方式進行編號。SEQ ID NO:1的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’氨基酸序列因而充當參考序列?？衫帽疚乃龅谋葘λ惴▽⒔o定氨基酸序列(例如本文描述的變體蛋白酶氨基酸序列)與BPN’序列(SEQ ID NO: I)比對，該給定氨基酸序列中與BPN’序列中的氨基酸殘基比對(優(yōu)選最佳比對)的氨基酸殘基可通過參考該枯草桿菌蛋白酶BPN’序列中的對應氨基酸殘基便利地進行編號?；蛘?，如果枯草桿菌蛋白酶變體蛋白酶序列的氨基酸殘基位置利用GG36氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的氨基酸殘基位置的實際編號方式進行編號，并且在比對時不參考BPN’序列中的對應氨基酸位置，則枯草桿菌蛋白酶變體蛋白酶可描述為SEQ ID N0:2所示的GG36蛋白酶的變體蛋白酶。[0115]—般來講，本文所用的命名以及下文描述的細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、分子生物學、核酸化學和蛋白質(zhì)化學中的實驗室方法中的許多方法是眾所周知的，并常常為本領域一般技術(shù)人員所采用。重組核酸的產(chǎn)生和操縱的方法、核酸合成的方法、細胞培養(yǎng)方法以及轉(zhuǎn)基因摻入(如轉(zhuǎn)染、電穿孔)是本領域技術(shù)人員已知的并在許多標準文獻中有描述。寡核苷酸合成和純化步驟通常根據(jù)說明書來進行。技術(shù)和程序通常根據(jù)本領域眾所周知的常規(guī)方法以及本文通篇中提供的各種一般文獻來進行。本文的程序據(jù)信是本領域普通技術(shù)人員所熟知的，并為了閱讀者的便利而提供。
[0116]本發(fā)明的多肽
[0117]本發(fā)明提供新型多肽，它們可統(tǒng)稱為“本發(fā)明的多肽”。本發(fā)明的多肽包括分離的、重組的、實質(zhì)上純的或非天然存在的變體蛋白酶多肽，包括例如具有酶活性(如蛋白水解活性)的枯草桿菌蛋白酶變體多肽。在一些實施例中，本發(fā)明的多肽(例如枯草桿菌蛋白酶變體或具有SEQ ID NO:2的序列的GG36的變體)，與親本如具有SEQ ID NO:2的序列的GG36蛋白酶相比，具有改善的清潔性能。在一些實施例中，本發(fā)明的多肽可用于清潔應用，并且可摻入可在清潔需要進行清潔的物品或表面(如物品的表面)的方法中使用的清潔組合物中。
[0118]在一些實施例中，本發(fā)明的變體蛋白酶包括“變體枯草桿菌蛋白酶”。在一些實施例中，本發(fā)明提供“芽孢桿菌變體蛋白酶”。在一些實施例中，本發(fā)明提供“芽孢桿菌變體枯草桿菌蛋白酶”。在一些實施例中，本發(fā)明提供分離的枯草桿菌蛋白酶變體。在一些實施例中，本發(fā)明提供遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
[0119]在上述實施例任一者中，本發(fā)明包括分離的、重組的、基本上純的或非天然存在的具有蛋白水解活性的變體蛋白酶，該多肽包含的多肽序列與編碼本文提供的變體蛋白酶的氨基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或100%的序列同一性。
[0120]如上所述，本發(fā)明的變體蛋白酶多肽具有酶活性(如蛋白水解活性)并因而可用于清潔應用，包括但不限于用于清潔盤碟物品、餐具物品、織物和具有硬質(zhì)表面的物品(如桌子、桌面、墻壁、家具物品、地板、天花板等的硬質(zhì)表面)的方法。包含一種或多種本發(fā)明的變體蛋白酶多肽的示例性清潔組合物在下文中進行描述。本發(fā)明的變體蛋白酶多肽的酶活性(如蛋白酶活性)可使用本領域普通技術(shù)人員熟知的程序容易地測定。下文提供的實例描述了用于評價酶活性、清潔性能和/或洗滌性能的方法。本發(fā)明的變體蛋白酶在移除污潰(例如蛋白質(zhì)性污潰)、清潔硬質(zhì)表面或清潔衣物、盛具或餐具物品方面的性能可用本領域所熟知的程序和/或通過使用實例部分中示出的程序容易地測定。
[0121]可對本發(fā)明的多肽進行多種改變，如一個或多個氨基酸的插入、缺失和/或置換(保守的或非保守的置換)，包括其中這類改變不會實質(zhì)上改變該多肽的酶活性的情況。類似地，也可對本發(fā)明的核酸進行多種改變，如在一個或多個密碼子中對一個或多個核酸進行一個或多個置換使得特定的密碼子編碼相同或不同的氨基酸，從而導致沉默變異(如，核苷酸序列中的突變可導致氨基酸序列中的沉默突變，例如當所編碼的氨基酸未因該核酸突變而變更時)或非沉默變異；序列中一個或多個核酸(或密碼子)的一種或多種缺失；序列中一個或多個核酸(密碼子)的一種或多種添加或插入；和/或序列中一個或多個核酸(密碼子)的切除或序列中一個或多個核酸(密碼子)的一種或多種截短。與初始核酸序列編碼的變體蛋白酶相比，核酸序列中的許多此類改變可能不會實質(zhì)上改變所得的編碼的變體蛋白酶的酶活性。還可對本發(fā)明的核酸進行修飾以包括一個或多個使得能在表達系統(tǒng)(如細菌表達系統(tǒng))中進行最優(yōu)表達的密碼子，同時如果需要，所述一個或多個密碼子仍編碼相同氨基酸。
[0122]在一些實施例中，本發(fā)明提供這樣一類多肽，其包括具有所需酶活性(如蛋白酶活性或清潔性能活性)的變體蛋白酶多肽，所述變體蛋白酶多肽包含具有本文所述的氨基酸置換的序列并且還包含一個或多個另外的氨基酸置換，例如保守和非保守置換，其中多肽表現(xiàn)出、維持或大致維持所需的酶活性(如蛋白酶活性或枯草桿菌蛋白酶活性，如該變體蛋白酶的清潔活性或性能所反映的)。根據(jù)本發(fā)明的氨基酸置換可包括但不限于一個或多個非保守置換和/或一個或多個保守氨基酸置換。保守氨基酸殘基置換通常涉及將一功能類別的氨基酸殘基中的成員替換為屬于同一功能類別的殘基(在計算功能同源性百分數(shù)時相同氨基酸殘基被視為在功能上是同源的或保守的)。保守氨基酸置換通常涉及用功能相似的氨基酸置換氨基酸序列中的氨基酸。例如，丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸是功能相似的，因而可充當彼此的保守氨基酸置換。天冬氨酸和谷氨酸可充當彼此的保守置換。天冬酰胺和谷氨酰胺可充當彼此的保守置換。精氨酸、賴氨酸和組氨酸可充當彼此的保守置換。異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸可充當彼此的保守置換。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可充當彼此的保守置換。
[0123]可以設想其他的保守氨基酸置換組。例如，可通過相似的功能或化學結(jié)構(gòu)或組成對氨基酸進行分組(如酸性、堿性、脂族、芳族、含硫)。例如，脂族組可包括:甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)。含有可視為彼此保守置換的氨基酸的其他組包括:芳族組:苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫組:甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);堿性組:精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H);酸性組:天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);非極性不帶電荷的殘基的組:半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)和脯氨酸(P);親水性不帶電荷的殘基的組:絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分組是本領域技術(shù)人員所熟知的并在各種標準教科書中有描述。本文的多肽序列的列表，結(jié)合上文的置換組，提供了所有經(jīng)保守置換的多肽序列的明確列表。
[0124]在上文描述的氨基酸殘基類別中存在更保守的置換，其也可以是合適的或者其作為另一種選擇可以是合適的。用于更保守的置換的保守組包括:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。因此，例如在一些實施例中，本發(fā)明提供具有蛋白水解活性的分離或重組的變體蛋白酶多肽(如變體枯草桿菌蛋白酶)，所述變體蛋白酶多肽包含與SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少約90 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %或約99.5 %序列同一性的氨基酸序列。本發(fā)明的變體蛋白酶中一個氨基酸保守置換另一個氨基酸預計不會顯著改變該變體蛋白酶的酶活性或清潔性能活性。所得的蛋白酶的酶活性或清潔性能活性可容易地用標準測定法和本文所述的測定法進行測定。
[0125]本發(fā)明的多肽序列 (例如本發(fā)明的變體蛋白酶)的保守置換變異包括用同一保守置換組的保守選擇的氨基酸來置換該多肽序列的少部分的，有時低于約25%、約20%、約15%、約14%、約13%、約12%、約11%、約10%、約9%、約8%、約7%或約6%的氨基酸，或該多肽序列的低于約5%、約4%、約3%、約2%或約I %的氨基酸。
[0126]如本文其他地方更詳細描述的以及本文提供的實例中描述的，本發(fā)明的多肽可具有可與已知蛋白酶(包括已知枯草桿菌蛋白酶)相當?shù)那鍧嵞芰?。示例性的已知枯草桿菌蛋白酶包括但不限于例如遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36、解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’、解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’ -Y217L和克勞氏芽孢桿菌PB92。成熟遲緩芽抱桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白的氣基酸序列為:
[0127]AQSVPffGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVS SIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO:2)
[0128]成熟解淀粉芽抱桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’蛋白的氣基酸序列為:
[0129]AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO:1)
[0130]本發(fā)明提供分離 的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自如下的位置:T022R+V104I+Q245R、G020R+S024R+S101A、T022R+S103A+V1041、T022R+V104I+A232V, T022R+S103A+Q245R、T022R+A232V+Q245R、T022R+S103A+A232V,T022R+S103A+V104I+A232V、T022R+V104I+A232V+Q245R, T022R+S103A+V104I+Q245R,T022R+S103A+A232V+Q245R、T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V, T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R,T0 2 2A + N0 7 6D + S10 3A + A2 3 2V + Q245R、TO 22Α + Ν076D + SI O 3A + VI O4 I+ Q245R、T022A+N076D+V104I+Q245R, T022A+N076D+A232V+Q245R, T022A+N076D+V104I+A232V,T022A+N076D+S103A+Q245R, T022A+N076D+S103A+A232V, T022A+N076D+S103A+V1041、T022A+N076D+S103A、T022A+N076D+V104I, T022A+N076D+A232V, T022A+N076D+Q245R,G020R+S101A+T213A、G020R+R045T+S101A、G020R+S101A+G21 IQ、S024R+S101A+T213A、G020R+T022W+S101A、S024R+S101A+G21 IQ、N043R+S101A+T213A、N043R+R045T+S101A、S024R+N043R+S101A、S024R+R045T+S101A、S101A+G211Q+T213A、G020R+N043R+S101A、R045T+S101A+T213A、T022W+S024R+S101A、T022R+S101G+V1041、T022W+S101A+T213A、T022R + S101G + Q245R、T0 2 2W + S101A + G2I IQ, GO 2 O R + S O 24R + Q245R,T022R + S101G + V104I+Q245R、TO22R + SI O IG + A232V、TO22R + SI O IG + SI O 3A、T022R+S101G+S103A+V1041、T022R+S101G+S103A+Q245R、T022R+S101G+A232V+Q245R、T022R+S101G+V104I+A232V、G020R+S024R+S101A+T213A, G020R+S024R+T213AS101N+V104I+A232V、 S101N+S103A+V1041、 S101N+S103A+A232V、 S101N+S103A+V104I+A232V,G020R + S103A + A232V、GO2OR + VI O4 I+A232V、GO2OR + SI O3A + VI O4 I+A232V、G020R+S103A+V1041、N018R+N076D+N116A、N018R+N076D+T213A、N018R+N076D+S101A、N018R+N076D+A215F或N018R+N076D+G211Q(列表1)，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
[0131]本發(fā)明還提供分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于位置T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R(列表2)，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
[0132]本發(fā)明還提供分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自如下的位置:T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A + N076D + S103A + V104I+A232V、TO22Α + Ν076D + VI O4 I+A232V + Q245R、T022A+N076D+S103A+A232V+Q245R 或 T022A+N076D+S103A+V104I+Q245R(列表 3)，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
[0133]本發(fā)明還提供分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自如下的位置:T022R+S103A+V104I+A232V、T022R+V104I+A232V+Q245R、T022R+S103A+V104I+Q245R、T022R+S103A+A232V+Q245R、T022A+N076D+V104I+Q245R,T022A+N076D+A232V+Q245R、T022A+N076D+V104I+A232V, T022A+N076D+S103A+Q245R,T022A+N076D+S103A+A232V、 T022A+N076D+S103A+V1041、 T022R+S101G+V104I+Q245R、T022R+S101G+S103 A+V1041、T022R+S101G+S103A+Q245R、T022R+S101G+A232V+Q245R、T022R+S101G+V104I+A232V、G020R+S024R+S101A+T213A、S101N+S103A+V104I+A232V 或G020R+S103A+V104I+A232V(列表4)，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
[0134]本發(fā)明還提供分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自如下的位置:T022R+V104I+Q245R、G020R+S024R+S101A、T022R+S103A+V1041、T022R+V104I+A232V, T022R+S103A+Q245R、T022R+A232V+Q245R、T022R+S103A+A232V,T022A+N076D+S103A、T022A+N076D+V104I, T022A+N076D+A232V, T022A+N076D+Q245R,G020R+S101A+T213A、G020R+R045T+S101A、G020R+S101A+G21 IQ、S024R+S101A+T213A、G020R+T022W+S101A、S024R+S101A+G21 IQ、N043R+S101A+T213A、N043R+R045T+S101A、S024R+N043R+S101A、S024R+R045T+S101A、S101A+G211Q+T213A、G020R+N043R+S101A、R045T+S101A+T213A、T022W+S024R+S101A、T022R+S101G+V1041、T022W+S101A+T213A、T022R+S101G+Q245R、T022W+S101A+G21 IQ、G020R+S024R+Q245R、T022R+S101G+A232V、T022R+S101G+S103A、 G020R+S024R+T213A、 S101N+V104I+A232V、 S101N+S103A+V1041、S101N+S103A+A232V、G020R+S103A+A232V、G020R+V104I+A232V、G020R+S103A+V1041、N018R+N076D+N116A、N018R+N076D+T213A、N018R+N076D+S101A、N018R+N076D+A215F 或N018R+N076D+G211Q(列表5)，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
[0135]本發(fā)明還提供分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自如下的位置:S101N+V104I+A232V、S101N+S103A+V1041、S101N+S103A+A232V 或S101N+S103A+V104I+A232V (列表6)，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
[0136]本發(fā)明還提供分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于位置S101N+S103A+V104I+A232V(列表7)，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID N0:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
[0137]本發(fā)明還提供分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自如下的位置:S101N+V104I+A232V、S101N+S103A+V104I 或 S101N+S103A+A232V (列表8)，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID N0:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
[0138]本發(fā)明還提供分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自如下的位置:S103A+V104I+S188D、S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+Q245R、V104I + S188D + Q245R、S I O 3A + VI O4 I+ S I 88D + Q245R、TO22A + SI O 3A + SI 88D、T022A + V104I + S188D、TO22A + SI O 3A + VI O4 I+ S I 88D、G I 59D + SI 88D + Q245R、S103A+S188D+A232V、S103A+G159D+S188D、V104I+S188D+A232V、V104I+G159D+S188D、S103A+V104I+S188D+A232V、 S103A+V104I+G159D+S188D、 S103A+S188D+N248D、V104I + S188D + N248D、S I O 3A + VI O4 I+ S I 88D + N248D、G I59D + SI88D + N248D、S188D+A232V+Q245R、S103A+S188D+A232V+Q245R、V104I + S188D+A232V+Q245R、S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R、T022A+S188D+Q245R、T022A+S103A+S188D+Q245R、T022A + V104I + S188D + Q245R、S I O 3A + SI 88D + E27 IF、V I 04 I+ S I 88D + E27 IF、T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R、 S103A+V104I+S188D+E271F, T022A+S188D+N248D、T022A+S103A+S188D+N248D、T022A+V104I+S188D+N248D、S103A+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+V104I+S188D+N248D、V104I+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D、T022A+S188D+A232V, T022A+S103A+S188D+A232V、T022A+V104I+S188D+A232V、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V, S188D+A232V+N248D、S188D + Q245R + E271F、TO22A + SI 88D + E27 IF、TO22A + SI 88D + Q245R + N248D、S103A+S188D+A232V+N248D、 S103A+S188D+Q245R+E271F、 S188D+N248D+E271F、V104I+S188D+A232V+N248D、V104I+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+E271F、T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+N248D+E27 1F、
【權(quán)利要求】
1.一種分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自如下的位置:T022R+V104I+Q245R、G020R+S024R+S101A、T022R+S103A+V1041、T022R+V104I+A232V, T022R+S103A+Q245R、T022R+A232V+Q245R、T022R+S103A+A232V,T022R+S103A+V104I+A232V、T022R+V104I+A232V+Q245R, T022R+S103A+V104I+Q245R,T022R+S103A+A232V+Q245R、T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V, T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R,T0 2 2A + N0 7 6D + S10 3A + A2 3 2V + Q245R、TO 22A + NO76D + SI O 3A + VI O4 I+ Q245R、T022A+N076D+V104I+Q245R, T022A+N076D+A232V+Q245R, T022A+N076D+V104I+A232V,T022A+N076D+S103A+Q245R, T022A+N076D+S103A+A232V, T022A+N076D+S103A+V1041、T022A+N076D+S103A、T022A+N076D+V104I, T022A+N076D+A232V, T022A+N076D+Q245R,G020R+S101A+T213A、G020R+R045T+S101A、G020R+S101A+G21 IQ、S024R+S101A+T213A、G020R+T022W+S101A、S024R+S101A+G21 IQ、N043R+S101A+T213A、N043R+R045T+S101A、S024R+N043R+S101A、S024R+R045T+S101A、S101A+G211Q+T213A、G020R+N043R+S101A、R045T+S101A+T213A、T022W+S024R+S101A、T022R+S101G+V1041、T022W+S101A+T213A、T022R + S101G + Q245R、T0 2 2W + S101A + G2I IQ, GO 2 O R + S O 24R + Q245R,T022R + S101G + V104I+Q245R、TO22R + SI O IG + A232V、TO22R + SI O IG + SI O 3A、T022R+S101G+S103A+V1041、T022R+S101G+S103A+Q245R、T022R+S101G+A232V+Q245R、T022R+S101G+V104I+A232V、G020R+S024R+S101A+T213A, G020R+S024R+T213AS101N+V104I+A232V、 S101N+S103A+V1041、 S101N+S103A+A232V、 S101N+S103A+V104I+A232V,G020R + S103A + A232V、GO2OR + VI O4 I+A232V、GO2OR + SI O3A + VI O4 I+A232V、G020R+S103A+V1041、N018R+N076D+N116A、N018R+N076D+T213A、N018R+N076D+S101A、N018R+N076D+A215F或N018R+N076D+G211Q，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置所對應的編號方式進行編號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述位置為T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R,并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述位置選自 T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R、 T022A+N076D+S103A+V104I+A232V、T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R、 T0 22A+N076D+S103A+A23 2V+Q245R 或T022A+N076D+S103A+V104I+Q245R，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述位置選自T022R+S103A+V104I+A232V、T022R+V104I+A232V+Q245R, T022R+S103A+V104I+Q245R,T022R+S103A+A232V+Q245R、T022A+N076D+V104I+Q245R, T022A+N076D+A232V+Q245R,T022A+N076D+V104I+A232V, T022A+N076D+S103A+Q245R, T022A+N076D+S103A+A232V,T022A+N076D+S103A+V1041、T022R+S101G+V104I+Q245R、T022R+S101G+S103A+V1041、T022R+S101G+S103A+Q245R、T022R+S101G+A232V+Q245R、T022R+S101G+V104I+A232V、G020R+S024R+S101A+T213A、S101N+S103A+V104I+A232V 或 G020R+S103A+V104I+A232V，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述位置選自T022R+V104I+Q245R、G020R+S024R+S101A、T022R+S103A+V1041、T022R+V104I+A232V、T022R+S103A+Q245R、T022R+A232V+Q245R、T022R+S103A+A232V, T022A+N076D+S103A、T022A+N076D+V1041、T022A+N076D+A232V、T022A+N076D+Q245R、G020R+S101A+T213A、G020R+R045T+S101A、G020R+S101A+G21IQ、S024R+S101A+T213A、G020R+T022W+S101A、S024R+S101A+G211Q、N043R+S101A+T213A、N043R+R045T+S101A、S024R+N043R+S101A、S024R+R045T+S101A、S101A+G211Q+T213A、G020R+N043R+S101A、R045T+S101A+T213A、T022W+S024R+S101A、T022R+S101G+V1041、T022W+S101A+T213A、T022R+S101G+Q245R、T022W+S101A+G211Q, G020R+S024R+Q245R、T022R+S101G+A232V、T022R+S101G+S103A、G020R+S024R+T213A、 S101N+V104I+A232V、 S101N+S103A+V1041、 S101N+S103A+A232V、G020R+S103A+A232V、G020R+V104I+A232V, G020R+S103A+V1041、N018R+N076D+N116A、N018R+N076D+T213A、N018R+N076D+S101A、N018R+N076D+A215F 或 N018R+N076D+G211Q，并且其中所述枯草桿菌蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
6.一種分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換處于選自如下的位置:S103A+V104I+S188D、S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+Q245R、V104I + S188D + Q245R、S I O 3A + VI O4 I+ S I 88D + Q245R、TO22A + SI O 3A + SI 88D、T022A + V104I + S188D、TO22A + SI O 3A + VI O4 I+ S I 88D、G I 59D + SI 88D + Q245R、S103A+S188D+A232V、S103A+G159D+S188D、V104I+S188D+A232V、V104I+G159D+S188D、S103A+V104I+S188D+A232V、 S103A+V104I+G159D+S188D、 S103A+S188D+N248D、V104I + S188D + N248D、S I O 3A + VI O4 I+ S I 88D + N248D、G I59D + SI88D + N248D、S188D+A232V+Q245R、S103A+S188D+A232V+Q245R、V104I + S188D+A232V+Q245R、S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R、T022A+S188D+Q245R、T022A+S103A+S188D+Q245R、T022A + V104I + S188D + Q245R、S I O 3A + SI 88D + E27 IF、V I 04 I+ S I 88D + E27 IF、T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R、 S103A+V104I+S188D+E271F, T022A+S188D+N248D、T022A+S103A+S188D+N248D、T022A+V104I+S188D+N248D、S103A+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+V104I+S188D+N248D、V104I+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D、T022A+S188D+A232V, T022A+S103A+S188D+A232V、T022A+V104I+S188D+A232V、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V, S188D+A232V+N248D、S188D + Q245R + E271F、TO22A + SI 88D + E27 IF、TO22A + SI 88D + Q245R + N248D、S103A+S188D+A232V+N248D、 S103A+S188D+Q245R+E271F、 S188D+N248D+E271F、V104I+S188D+A232V+N24 8D、V104I+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+E271F、T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+N248D+E27 1F、T022A+V104I+S188D+E27 1F、T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D、 S103A + V104I + S188D + Q245R + E271F、S 1 03A + V 1 04 I+ S188D + A232V + N248D、 V104I+S188D+N248D+E271F、S188D+A232V+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+S188D+N248D+E271F, S103A+S188D+A232V+E271F、V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R、 T022A+S188D+Q245R+E271F、 T022A+S188D+N248D+E271F、 S103A+V104I+S18 8D+A232V+E271F、 T02 2A+S103A+S188D+A232V+Q245R、 S188D+A232V+Q245R+N248D、 S188D+Q245R+N248D+E271F、 T022A+S188D+A232V+N248D、 T022A+S103A+S188D+Q245R+E271F、 T022A+S103A+S188D+N248D+E271F、 T022A + V104I + S18 8D + A232V + Q2 4 5R、S 1 03A + S 1 88D + A232V + Q245R + N248D、 S103A + S188D + Q24 5R + N2 48D + E271F、T022A + S 1 03A + S188D + A232V + N248D、 T022A + V104I + S18 8D + N2 48D + E271F、T022A + V 1 04 I+ S188D + Q245R + E271F、 S188D+A232V+Q245R+E271F、 S188D+A232V+N248D+E271F、 T022A+S103A+V104I+S188D+ A232V+Q245R、V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+V104I+S188D+A232V+N248D、 V104I+S188D + Q245R + N248D + E271F、TO22A + S188D+A232V + E271F、T022A + S1 03A + V104I + S188D + Q245R + E2 71F, TO22A + S103A + V1041+ S188D + N248D + E271 F、T022A + S188D + Q245R + N248D + E271F, S 103A + S188D+A232V + Q245R + E271F, S103A+S188D+A232V+N248D+E271F、 S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+N248D, S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+ N248D、 T022A+S103A+S188D+A232V+E271F、 V104I+S188D+A232V+N248D+E271F、 V104I+S188D+A2 3 2V+Q245R+E2 71F、 T02 2A+S10 3A+S188D+Q245R+N248D+E2 7 IF、T0 22A+V104I+S188D+A2 32V + E2 71F, TO22A + S188D+A232V+N248D + E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D、 S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、 T022A+V10 4I+S188D+Q245R+N248D+E271F、 S103A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F, S103A+V 104I+S188D+A232V+Q245R+E271F、 T022A+S188D+A232V+Q245R+E271F、 T022A+S103A +V104I+S188D+A232V+E271F、 T022A+S103A+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S1 03A+S188D+A232V+Q245R+N248D、 S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、 T022A +V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D、 T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F, TO 22A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E27IF、 V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、 T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E27 IF、 G159D+S188D+Q245R+N248D、 T022A+G159D+S188D、 T022A+S103A+G159D+S188D、 T022A+V104I+G159D+S188D、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D、 S103A+G159D+S188D+Q245R、V104I+G159D+S188D+Q245R、 S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R、S103A+G159D+S188D+N248D、 V104I+G159D+S188D+N248D、S103A+V104I+G159D+S188D+N248D、 G159D + S188D+A232V, S103A+G159D + S188D+A232V, V104I+G159D + S188D+A232V, S103A+V104I+G159D+S188D+A232V, T022A+G159D+S188D+Q245R、G159D+S188D+E271F、 T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R、S103A+G159D+S188D+E27 1F、 T022A + V104I+G159D + S188D + Q245R、V 1 04 I+G159D + S188D + E271F、T022A +
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述位置選自T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D.T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R.T022A+S103A+V1
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述位置選自
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述位置選自S103A+V104I+S188D+Q245R、 T022A+S103A+V104I+S188D、 S103A+V104I+S188D+A232V、S103A+V104I+G159D+S188D、 S103A+V104I+S188D+N248D、 S103A+S188D+A232V+Q245R、V104I+S188D+A232V+Q245R、T022A+S103A+S188D+Q245R、T022A+V104I+S188D+Q245R、S103A+V104I+S188D+E271F、 T022A+S103A+S188D+N248D、 T022A+V104I+S188D+N248D、S103A+S188D+Q245R+N248D、V104I+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+S188D+A232V、T022A+V104I+S188D+A232V、 T022A+S188D+Q245R+N248D、 S103A+S188D+A232V+N248D、S103A+S188D+Q245R+E271F、V104I+S188D+A232V+N248D、V104I+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+E271F、 S103A+S188D+N248D+E271F、 T022A+V104I+S188D+E271F、V104I+S188D+N248D+E271F、S103A+S188D+A232V+E271F、V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R、 T022A+S188D+Q245R+E271F、 T022A+S188D+N248D+E271F、S188D+A232V+Q245R+N248D、 S188D+Q245R+N248D+E271F、 T022A+S188D+A232V+N248D、S188D+A232V+Q245R+E271F、 S188D+A232V+N248D+E271F、 T022A+S188D+A232V+E271F、
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述位置選自
11.一種分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換的組合選
12.—種分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換的組合選自
13.一種分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換的組合選自
14.一種分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換的組合選白 G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-N204S-G211Q, T022W-S024R-S101A-P2101-T213A、G020R-S101A-G211Q、G020R-S024R-S101A-P2101-G211Q-T213A、G020R-S101A-P2101-T213A,T022ff-S024R-N043R-S101A-P210I,G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q、T022R-S101T-S103N-V104L-A232M-Q245R、G020R-T022A-S024R-R045T-S101A-T213A、T022R-S101G-S103N-V1041-A232M-Q245R、G020R-T022W-S024R-S101A-N116L-G211Q-T213A,G020R-T022ff-N043R-S101A-N116L-G211Q,G020R-T022ff-N043R-R045T-S101A,T022W-N043R-R045T-S101A-P2101-T213A, G020R-S024R-R045T-S101A-Q109R-P2101-G211Q-T213A、S024R-N043K-S101A-N204D-P2101、G020R-S024R-R045T-S101A-P2101、S024R-N043R-R045T-S101A-P2101-T213A、G020R-S024R-R045T-S101A-T213A、T022R-S101A-S103N-V1041-A232T-Q245R、GO2OR-TO22W-S024R-R045T-SI ` IA-N2O4S-P2IO 1-G211 Q、T022ff-N043R-S101A-P2101-G211Q,G020R-S024R-N043K-R045T-S101A-N116L-P210I,T022A-S101G-S103A-V1041-1107V-L217Q-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A、T022R-S101A-S103G-V1041-A232M-Q245R、T022R-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R、S024R-S078G-G118S-Q245R-N248D-H249R、S024R-N043R-S101A-P2101-T213A、T022K-S101N-S103A-V1041-A232T-Q245R、G020R-N043R-S101A-P2101-G211Q、T022R-S101T-S103A-V1041-A232M-Q245R、S024R-V026A-N043R-S101A-P2101-G211Q、T022A-S078N-S101G-S103A-V1041-S128A-L217Q-A232V-Q245R、T022K-S101T-S103G-V1041-A232L-Q245R、G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q、G020R-S024R-S078G-G118D-Q245R、T022A-S101N-S103A-V1041-S128A-P129S-A232V-Q245R、T022A-G097A-S101G-S103A-V1041-L217Q-A232V-Q245R、G020R-T022W-N043R-S101A-G211Q-T213A、N018K-G020R-S024R-R045T-S101A-P2101-G211Q-T213A、G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A、T022R-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R、G020R-S024R-S101A-T213A、T022R-S101N-S103G-V1041-A232V-Q245R、G020R-T022W-S024R-S101A-G211Q-T213A、T022A-S024G-S101G-S103A-V1041-S128A-L217Q-A232V-Q245R、S024R-S078G-G118D-P129E-Q245R-H249R、 T022R-S101T-S103A-V104L-A232L-Q245R,G020R-S024R-S101A-G211Q-T213A、T022A-S024G-S101G-S103A-V1041-L217Q-A232V-Q245R、G020R-T022W-N043R-V051A-S101A-P2101-G21 IQ, S024R-S078G-G118D-Q245R、N043R-S101A-P2 101、T022Y-S101G-S103N-V1041-A232L-Q245R、G020R-T022W-N043R-S101A-T213A、G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R、T022Y-S101N-S103N-V1041-A232T-Q245R、G020R-T022W-S024R-F050L-S101A-G211Q-T213A、N018S-T022W-S024R-N043R-S101A-G211Q、T022A-S101G-S103A-V1041-S128A-P129S-L217Q-A232V-Q245R、T022R-S101N-S103N-V1041-A232V-Q245R、T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V1041-L217Q-A232V-Q245R,S101A-P2101-G211Q-T213A.G020R-N043R-R045T-S101A-P
15.一種分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換的組合選自
16.一種分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體為具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置換的組合的氨基酸序列，所述氨基酸置換的組合選
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體是遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體與所述包含SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列的遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少90%的氨基酸同一性。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述變體的總凈電荷相對于所述遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶的總凈電荷為0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、~4 或-5。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述變體的總凈電荷相對于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶的總凈電荷為-1、0、+1、+2、+3、+4或+5。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述變體的總凈電荷相對于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶的總凈電荷為-1、0、+1、+2、+3或+4。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述變體的總凈電荷相對于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶的總凈電荷為+1、0、-1、-2、-3、-4或-5。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述變體的總凈電荷相對于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶GG36蛋白酶的總凈電荷為+1、0、-1、-2、-3或-4。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述總凈電荷通過一個或多個選自如下的置換獲得:A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E 或 R275H/S，并且其中所述蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述總凈電荷通過一個或多個選自如下的置換獲得:A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D0321、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/1、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K 或 E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V，并且其中所述蛋白酶變體的氨基酸位置是根據(jù)SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的對應氨基酸位置的編號方式進行編號。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-41中任一項所述的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體具有如下特性中的一者或多者:a)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至約10、1.1至約8或甚至1.1至約5的測試方法2性能指數(shù)；b)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少.1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至約10、1.1至約8或甚至1.1至約5的測試方法3性能指數(shù)；c)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至約10、1.0至約8或甚至1.0至約5的測試方法4性能指數(shù)；和/或d)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少.1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至約10、1.0至約8或甚至1.0至約5的測試方法6性能指數(shù)；和/或e)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至約15、1.1至約10或甚至1.1至約7的測試方法7性能指數(shù)。
27.一種分離的核酸，其包含編碼權(quán)利要求1-26中任一項提供的枯草桿菌蛋白酶變體的多核苷酸序列。
28.一種表達載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求27所述的核酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的表達載體，其中所述至少一種核酸與啟動子有效連接。
30.一種宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求28或29中任一項所述的表達載體。
31.一種用于產(chǎn)生芽孢桿菌屬(Bacillus)枯草桿菌蛋白酶的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體的方法，其包括: a)用包含編碼至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項所述的枯草桿菌蛋白酶變體的至少一種核酸的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細胞；以及 b)在適于產(chǎn)生至少一種枯草桿菌蛋白酶變體的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以產(chǎn)生至少一種枯草桿菌蛋白酶變體。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，還包括收獲所產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶變體。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-31中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞為芽孢桿菌屬物種。
34.根據(jù)權(quán) 利要求33所述的方法，其中所述芽孢桿菌屬物種為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
35.一種包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項所述的枯草桿菌蛋白酶變體的組合物，其中所述組合物不是織物和家庭護理產(chǎn)品。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述組合物為清潔組合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求35-36中任一項所述的組合物，其中所述清潔組合物為顆粒、粉末、固體、條棒、液體、片劑、凝膠或糊劑組合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求35-37中任一項所述的組合物，還包含至少一種漂白劑。
39.根據(jù)權(quán)利要求35-38中任一項所述的組合物，其中所述清潔組合物不含磷酸鹽。
40.根據(jù)權(quán)利要求35-39中任一項所述的組合物，其中所述清潔組合物含有磷酸鹽。
41.根據(jù)權(quán)利要求35-40中任一項所述的組合物，還包含至少一種另外的酶。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述至少一種另外的酶選自半纖維素酶、纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、果膠酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)酶、支鏈淀粉酶、鞋酸酶、戍聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的任何組合。
43.根據(jù)權(quán)利要求35-42中任一項所述的組合物，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體不是冷水蛋白酶變體。
44.一種清潔方法，包括使表面或物品與包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項所述的枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組合物接觸。
45.一種清潔方法，包括使表面或物品與權(quán)利要求35-43中任一項所示的清潔組合物接觸。
46.根據(jù)權(quán)利要求44-45中任一項所述的方法，還包括在使所述表面或物品分別與所述清潔組合物接觸后漂洗所述表面或物品。
47.根據(jù)權(quán)利要求44-46中任一項所述的方法，還包括在使所述表面或物品與所述清潔組合物接觸后漂洗所述表面或物品的步驟。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，還包括在所述表面或物品的所述漂洗后干燥所述表面或物品的步驟。
49.一種清潔表面或物品的方法，包括:提供根據(jù)權(quán)利要求35-43中任一項所述的清潔組合物和需要清潔的表面或物品；以及使所述清潔組合物與所述需要清潔的表面或物品在適于清潔所述表面或物品的所述表面的條件下接觸，以產(chǎn)生清潔的表面或物品。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，還包括漂洗所述清潔過的表面或物品以產(chǎn)生漂洗過的表面或物品的步驟。
51.根據(jù)權(quán)利要求49-50中任一項所述的方法，還包括干燥所述漂洗過的表面或物品的步驟。
52.根據(jù)權(quán)利要求44-51中的 任一項所述的方法，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體不是冷水蛋白酶變體。
【文檔編號】C12N9/54GK103764823SQ201280021911
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月5日
【發(fā)明者】N·S·阿明, K·奧古斯汀, J·R·巴斯勒, L·G·卡斯康-佩雷拉, K·D·科利爾, E·M·孔卡, D·A·埃斯特爾, J·T·小凱利斯, E·J·馬格尼斯, A·比薩奇科, A·J·保羅斯, P·F·蘇特, G·S·沃德, J·姚 申請人:丹尼斯科美國公司, 寶潔公司