用于識(shí)別個(gè)體對(duì)免疫球蛋白療法的響應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種確定患病個(gè)體對(duì)免疫球蛋白療法的響應(yīng)可能性的方法，所述方法包括以下步驟：提供該個(gè)體的含B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、不變T細(xì)胞和單核細(xì)胞的樣品；對(duì)ADAMTS9-內(nèi)含子的多核苷酸；KLHDC8A-內(nèi)含子的多核苷酸或CD14基因的側(cè)翼區(qū)的多核苷酸中的至少一個(gè)進(jìn)行基因分型；以及對(duì)純合單核苷酸多態(tài)性組合賦予值1，表明該血液樣品來(lái)源于將對(duì)免疫球蛋白治療不響應(yīng)的人，而對(duì)不符合該標(biāo)準(zhǔn)的SNP賦予值0，表明該血液樣品來(lái)源于將對(duì)免疫球蛋白治療作出響應(yīng)的人。
【專利說(shuō)明】用于識(shí)別個(gè)體對(duì)免疫球蛋白療法的響應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)和方法
[0001 ] 本發(fā)明涉及用于確定個(gè)體對(duì)免疫球蛋白療法的響應(yīng)性的方法。
[0002]當(dāng)B細(xì)胞表面上的抗體(B細(xì)胞受體)結(jié)合至特異性外源抗原時(shí)，B細(xì)胞即識(shí)別病原體。作為響應(yīng)，B細(xì)胞分裂并分化成漿細(xì)胞，而漿細(xì)胞分泌出成千上萬(wàn)的識(shí)別激活抗原的抗體拷貝?？贵w(也稱免疫球蛋白)識(shí)別各種靶標(biāo)，包括許多不同的化合物、結(jié)構(gòu)體以及作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的一部分的那些物質(zhì)，并且中和它們的生物學(xué)效果。免疫復(fù)合物被快速清除，導(dǎo)致“靶標(biāo)”分子被去除，因此，識(shí)別、結(jié)合和去除功能無(wú)疑是具有必可或缺的重要性，缺乏免疫球蛋白水平或免疫球蛋白水平減少的患者易于患嚴(yán)重且反復(fù)的感染，這顯得免疫球蛋白的功能更加重要。除了針對(duì)侵入物的這種保護(hù)功能之外，免疫球蛋白在平衡和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面承擔(dān)著重要的調(diào)節(jié)功能。免疫球蛋白產(chǎn)物通常來(lái)源于混合的血液或血漿捐獻(xiàn)，并且根據(jù)專業(yè)人員孰知的方法制備，它們用于治療IMID (免疫介導(dǎo)炎性疾病)以及所謂的AID(自身免疫疾病)，而這些定義可能表達(dá)出一種疾病的相同或重疊特征。免疫球蛋白G(IgG)濃縮物通經(jīng)常靜脈內(nèi)(IVIG)或皮下(SCIG)施用，但也可經(jīng)肌肉內(nèi)、吸入、眼內(nèi)、口服或局部施用。當(dāng)B細(xì)胞攻擊性地與自身反應(yīng)時(shí)，則病理學(xué)潛能達(dá)到極限。因此，在患有自身免疫疾病或免疫介導(dǎo)炎性疾病(IMID)的患者中，B細(xì)胞清除被視為一種吸引人的療法不令人驚訝。
[0003]自然殺傷(NK)細(xì)胞是大顆粒淋巴細(xì)胞，屬于先天免疫系統(tǒng)，因?yàn)椴煌谶m應(yīng)性或抗原特異性免疫系統(tǒng)中的T淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞不會(huì)對(duì)T細(xì)胞受體或免疫球蛋白基因的種系構(gòu)造進(jìn)行重排。NK細(xì)胞是淋巴細(xì)胞譜系，具有細(xì)胞毒性功能和生成細(xì)胞因子的效應(yīng)分子功能。NK細(xì)胞基于對(duì)NK細(xì)胞譜系相對(duì)特異性的激活受體和抑制性受體完成對(duì)細(xì)胞的選擇性裂解。激活受體，例如NKG2D，識(shí)別表達(dá)在轉(zhuǎn)化的或受感染的細(xì)胞上的天然應(yīng)力信號(hào)配體(natural stress signal ligand)或病原體來(lái)源的配體。相反,Q)94_NKG2A復(fù)合體的抑制性受體，KIR家族(殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體)，自體結(jié)合而不結(jié)合至同種異體MHC I (主要組織相容性復(fù)合物I)。KIR受體是高度多態(tài)性的，在NK細(xì)胞中不均勻地表達(dá)，并且在NK細(xì)胞自身耐受性方面具有重要作用。在許可(licensing)過(guò)程中，NK細(xì)胞在進(jìn)行了生長(zhǎng)期間抑制性受體和自身MHC之間的生產(chǎn)性相互作用之后獲得了功能。被許可的NK細(xì)胞表達(dá)幾種可能的抑制性受體等位基因中的至少一個(gè)。因此，NK細(xì)胞中的MHC識(shí)別是多樣化的，因而至少一種NK細(xì)胞亞群將響應(yīng)任何單個(gè)MHC I類分子的下調(diào)。當(dāng)激活NK細(xì)胞效應(yīng)分子功能就緒時(shí)，會(huì)分泌IFN- Y，并且增強(qiáng)粒酶和穿孔素釋放。NK細(xì)胞還表達(dá)Fe Y受體，其識(shí)別幾個(gè)IgG子類，以介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性。這些受體以及它們?cè)贜K細(xì)胞監(jiān)測(cè)和細(xì)胞溶解中的作用已被充分研究，并且與NK細(xì)胞的身份緊密相連。在流式細(xì)胞儀上，所謂的⑶56?和^56?可被區(qū)分出來(lái)哪個(gè)表達(dá)或不表達(dá)Fe Y RIII (⑶16)。本領(lǐng)域技術(shù)人員孰知基于“設(shè)門(gating) ”的流式細(xì)胞儀結(jié)果的解釋。
[0004]因此 ，可識(shí)別出4中主要的亞群，它們是:
CD 16+ / CD56m
CD16+ / CD56?
CD 16- / CD56mCD16- / CD56?。
[0005]NK細(xì)胞是宿主防御的重要部分。但是，如果被異常調(diào)節(jié)，例如由于疾病導(dǎo)致或在疾病過(guò)程中被異常調(diào)節(jié)，它們可引導(dǎo)自身攻擊“自身結(jié)構(gòu)體”，導(dǎo)致嚴(yán)重的病理學(xué)結(jié)果，像攻擊器官結(jié)構(gòu)體和外周系統(tǒng)和腦中的寡樹(shù)突膠質(zhì)細(xì)胞。雖然導(dǎo)致這種自身攻擊的機(jī)制尚未完全明白，但需要重新獲得對(duì)這些細(xì)胞的控制并將它們的殺傷功能降低至生理上合理的水平。因?yàn)闅逝c效應(yīng)分子的脫顆粒和釋放緊密相關(guān)，因此一個(gè)目的就是控制這種脫顆粒作用以降低損害。
[0006]靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)在自身免疫疾病中的效果最先在1950年代被描述，隨后在1980年代被描述，當(dāng)時(shí)它被用來(lái)治療患特發(fā)性血小板減少性紫癜的病人。同時(shí)，許多臨床研究證實(shí)了 IVIG在自身免疫性疾病中的有益效果。在這些研究中，IVIG療法被證明在格林-巴利綜合癥(GBS)、川崎綜合癥、慢性炎癥性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病、重癥肌無(wú)力和皮質(zhì)類固醇耐藥性皮肌炎中有效(Ephrem et al., 2005; Kazatchkine and Kaveri,2001; Boros et al.，2005)。臨床研究也證實(shí)了 IVIG在疾病進(jìn)展復(fù)發(fā)率和多發(fā)性硬化(MS)中的 MRI 增強(qiáng)病變有積極效果(Sorensen PS, 2003; Sorensen et al., 2002)。已建立的評(píng)價(jià)疾病狀態(tài)的方法是EDSS擴(kuò)展的功能障礙狀況量表(EDSS)。
[0007]IVIG作用的完全機(jī)制仍不清楚，但顯得涉及調(diào)節(jié)Fe Y受體的表達(dá)和功能、干擾補(bǔ)體激活、調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞活化、分化因子及效應(yīng)分子功能(Ephrem et al.，2005;Kazatchkine and Kaveri, 2001; Boros et al., 2005)。
[0008]雖然免疫球蛋白預(yù)防和治療成功地應(yīng)用于很多患者，但其中也有許多患者對(duì)免疫球蛋白應(yīng)用響應(yīng)得很差，甚至不響應(yīng)。近來(lái)的方法建議定性或定量確定血細(xì)胞或細(xì)胞來(lái)源因子(單獨(dú)或組合)以便于個(gè)性化地預(yù)測(cè)對(duì)免疫球蛋白療法的響應(yīng)參數(shù)。
[0009]Asphalter 等在 Clin Exp Tmmunol 2000, 121, 506-514 中報(bào)道了體內(nèi) IVIG 替換療法和高劑量IVIG(2g/kg體重)對(duì)NK細(xì)胞亞群的影響。他們描述了一種實(shí)驗(yàn)，其中在IVIG療法(每3周200-400mg/kg)之前和之后測(cè)定NK細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)IFN- Y。Ruiz.等在Journal of Reproductive Immunology, 31 (1996), 125-141 中描述了當(dāng) IVIG 被添加至NK細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(以外周血淋巴細(xì)胞作為靶標(biāo))中時(shí)IVIG抑制NK體外活性的免疫學(xué)機(jī)制。但是，在這兩個(gè)報(bào)道中，這些發(fā)現(xiàn)與IVIG療法在個(gè)體患者中的療效無(wú)關(guān)。
[0010]Tha-1n Thanyalak等在BLOOD, Vol 110，No 9，9.Nov.2007 中報(bào)道了熟化 18小時(shí)的樹(shù)突細(xì)胞(DC’s)在存在IVIG的條件下對(duì)自然殺傷(NK)細(xì)胞的影響。這些細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞表型的影響通過(guò)在5天后測(cè)定Fe- Y RIII的表達(dá)來(lái)檢查。還分析了與IVIG-DC’ s共培養(yǎng)48小時(shí)的共培養(yǎng)物中的NK細(xì)胞的INF-y產(chǎn)生和脫顆粒，表明干擾素Y的表達(dá)增加。但是，以IVIG處理但無(wú)DC’ s的NK細(xì)胞僅顯示出輕微的活化。因此，Tha-1n總結(jié)，僅IVIG-DC's能適當(dāng)?shù)丶せ頝K細(xì)胞脫顆粒。
[0011]Kwak Joanne Y.H.等在 EARLY PREGNANCY, Vol IV, pp 154-164 研究了 IVIG 治療(伴隨接收額外的治療)在NK細(xì)胞水平升高的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的臨床效果。NK細(xì)胞毒性和⑶16的表達(dá)在IVIG灌注后5-7天被顯著抑制。該文章無(wú)意使用這些發(fā)現(xiàn)去預(yù)測(cè)對(duì)IVIG療法的個(gè)體響應(yīng)。
[0012]EP-A-1 801 234涉及一種診斷方法，通過(guò)使用重組核苷酸構(gòu)建體來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)象是否易于患疾病或發(fā)展成自身免疫疾病。本申請(qǐng)未使用這種構(gòu)建體。[0013]Park-Min Kyung-Hyun 等在 IMMUNITY, vol.26, n0.1, January 2007, pp67-78中描述了幾項(xiàng)有關(guān)IVIG在細(xì)胞對(duì)干擾素Y的響應(yīng)方面的影響的研究。這些研究主要基于在紫藤單核細(xì)胞增生菌(Wisteria monocytogenes)以及巨曬細(xì)胞上觀察得到,而非NK細(xì)胞。
[0014]Meuer等描述了一種預(yù)測(cè)對(duì)免疫球蛋白療法的個(gè)體響應(yīng)的方法，其關(guān)注于NK細(xì)胞相關(guān)且來(lái)源于NK細(xì)胞的因子，例如細(xì)胞因子和酶，以及脫顆粒相關(guān)的參數(shù)(W02009/087219)。
[0015]除了幾種生物化學(xué)參數(shù)之外，Meuer等報(bào)道了在用免疫球蛋白治療患MID的患者后，CD56-明CD3-陰性的NK細(xì)胞的量會(huì)減少。但是，沒(méi)有評(píng)價(jià)對(duì)免疫球蛋白療法的響應(yīng)的預(yù)測(cè)值。該發(fā)明沒(méi)有闡明B細(xì)胞、功能化免疫因子和遺傳因子的重要性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)免疫球蛋白療法、特別是對(duì)免疫球蛋白G療法的個(gè)體響應(yīng)性的可靠方法。 [0017]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種預(yù)測(cè)對(duì)免疫球蛋白療法、特別是對(duì)免疫球蛋白G療法的個(gè)體響應(yīng)性的方法，該方法比已知方法更快。
[0018]本發(fā)明所針對(duì)的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下方法來(lái)解決，該方法用于確定患病個(gè)體對(duì)免疫球蛋白療法的相應(yīng)可能性，包括以下步驟:
提供該個(gè)體的包含B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、不變T細(xì)胞(invariantT-cells)和單核細(xì)胞的樣品；
對(duì)ADAMTS9-內(nèi)含子的多核苷酸；KLHDC8A-內(nèi)含子的多核苷酸或CD14基因的側(cè)翼區(qū)的多核苷酸中的至少一個(gè)進(jìn)行基因分型；以及
對(duì)純合SNP(單核苷酸多態(tài)性)組合賦予值1，表明該血液樣品來(lái)源于將對(duì)免疫球蛋白(IG)治療不響應(yīng)的人，但是
對(duì)不符合該標(biāo)準(zhǔn)的SNP賦予值0，表明該血液樣品來(lái)源于將對(duì)免疫球蛋白治療作出響應(yīng)的人。
[0019]本發(fā)明避免了長(zhǎng)時(shí)間的檢驗(yàn)，例如Tha-1n公開(kāi)的使用不同于本發(fā)明的細(xì)胞(本發(fā)明未使用IVIG-DC’s)進(jìn)行的檢驗(yàn)(48小時(shí)和5天)。而且，Tha-1n未發(fā)現(xiàn)任何跡象使用那些發(fā)現(xiàn)來(lái)確定對(duì)IVIG療法的個(gè)體響應(yīng)性。另外，Tha-1n中公開(kāi)的僅有的一個(gè)可比較的實(shí)驗(yàn)(以IVIG處理NK細(xì)胞)顯示出與本發(fā)明相矛盾的結(jié)果，不幸的是，沒(méi)有公布具體的條件，因而不可能進(jìn)行實(shí)質(zhì)性比較(第3257頁(yè)，左欄，第3-7行)。
[0020]術(shù)語(yǔ)“基因分型”的使用與本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的一樣。特別地，該術(shù)語(yǔ)是指通過(guò)利用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢查個(gè)體DNA序列來(lái)確定該個(gè)體的基因型的過(guò)程。更準(zhǔn)確地說(shuō)，基因分型是利用分子工具使用DNA序列來(lái)確定生物種群。目前基因分型的方法包括PCR、DNA測(cè)序、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針和雜交至DNA微陣列或小珠。應(yīng)當(dāng)理解的是，基因分型是對(duì)個(gè)體的樣品進(jìn)行的，即間接體內(nèi)(ex vivo)進(jìn)行。
[0021]本發(fā)明中純合子標(biāo)記為AA或BB，而雜合子標(biāo)記為AB或BA。
[0022]術(shù)語(yǔ)“ADAMTS9-內(nèi)含子”、“KLHDC8A-內(nèi)含子”和“⑶14基因的側(cè)翼區(qū)”指在個(gè)體的所提及的基因組片段中的特異多態(tài)性。[0023]“線性判別分析” (LDA)是一種在統(tǒng)計(jì)學(xué)、模式識(shí)別和機(jī)器學(xué)習(xí)中的方法，用于找出特征化或分離兩類或更多類的物體或事件的特征的線性組合。軟件可購(gòu)得，商品名為IBMsSPSS? Statistics。[0024]特別地，本發(fā)明的方法包括以下步驟:
提供個(gè)體的包含B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、不變T細(xì)胞(invariantT-cells)和單核細(xì)胞的樣品；
在 Chr.3pl4.1 和物理位置 64560013-64595571-64602006-64605119-64612402-64614313-64617371-64620883對(duì)ADAMTS9-內(nèi)含子進(jìn)行基因分型，這些物理位置以相同順序由 dbSNP RS ID 的 rs9820942、rs6780659、rs6445415、rsll721258、rsll707584、rs7652817、rsl3079218、rs9819183 代表，這些 ID 可由 NCBI 的 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP/ 獲得，和 / 或在 Chr.1q32.1 和物理位置 205312280-205318524-205318854-205318983對(duì)KLHDC8A-內(nèi)含子進(jìn)行基因分型，這些物理位置以相同順序由dbSNP RS ID的rs7549293、rsl0751436、rs913723、rs913722 代表，和 / 或在 Chr.5q31.3 和物理位置 140007011-140011315-140014909-140015208對(duì)CD14側(cè)翼區(qū)行基因分型，這些物理位置以相同順序由 dbSNP RS ID 的rs778588、rs2563298、rs5744448、rs2569192 代表，為 ADAMTS9-內(nèi)含子的純合SNP (單核苷酸多態(tài)性)組合BB-AA-AA-BB-AA-BB-BB-AA賦予值1，其表現(xiàn)為純合SNP 組合 G(dbSNP RS ID rs9820942_ 物理位置 64560013)-C(dbSNP RS ID rs6780659_ 物理位置 64595571)- A(dbSNP RS ID rs6445415_ 物理位置 64602006)-T(dbSNPRS ID rsl 1721258-物理位置 64605119)-A(dbSNP RS ID rsl 1707584-物理位置 64612402)-G (dbSNP RS ID rs7652817 -物理位置 64614313)-T (dbSNP RS IDrsl3079218-物理位置 64617371)-A(dbSNP RS ID rs9819183 -物理位置 64620883)，為KLHDC8A-內(nèi)含子的純合SNP組合AA-BB-AA-BB賦予值I，其表現(xiàn)為純合SNP組合C(dbSNP RS ID rs7549293_ 物理位置 205312280)-T (dbSNP RS ID rsl0751436_ 物理位置 205318524)-A (dbSNP RS ID rs913723_ 物理位置 205318854)-T (dbSNP RS IDrs913722-物理位置205318983)，以及為⑶14側(cè)翼區(qū)在所述物理位置的純合SNP組合AA-BB-BB-AA賦予值1，其表現(xiàn)為純合SNP組合A(dbSNP RS ID rs778588_物理位置 140007011)-C(dbSNP RS ID rs2563298-物理位置 140011315)-C (dbSNP RS IDrs5744448-物理位置 140014909)-C(dbSNP RS ID rs2569192_物理位置 140015208)，表明該血液樣品來(lái)源于將對(duì)IG治療不響應(yīng)的人，但對(duì)不符合該標(biāo)準(zhǔn)的SNP賦予值0，表明該血液樣品來(lái)源于將對(duì)IG治療作出響應(yīng)的人。
[0025]用于根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行基因分型的多核苷酸來(lái)源于http://www.affymetrix.com/analysis/netaffx/index, affx。
[0026]有關(guān)所述SNP的更詳細(xì)信息如表1所示，并且可從NCBI的SNP-數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP/)獲取。
[0027]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)，這些參數(shù)通過(guò)測(cè)定由細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子的量或它們?cè)诩?xì)胞上的表達(dá)的基因的量中的至少一個(gè)而獲得，其中細(xì)胞因子選自干擾素Y (IFN- Y ),白細(xì)胞介素_8(CXCL8)、C-X-C模體趨化因子
10(CXCLlO)、趨化因子C-C模體配體8 (CCL8)、趨化因子C-C模體配體20 (CCL20)、白細(xì)胞介素-10 (IL-10)和干細(xì)胞因子(SCF)。[0028]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，基因分型被輔以參數(shù)，這些參數(shù)是通過(guò)測(cè)定至少一種以下釋放自細(xì)胞的蛋白質(zhì)的量和/或它們?cè)诩?xì)胞上的表達(dá)的基因的量來(lái)獲得的，所述蛋白質(zhì)為⑶32b、⑶16、IL-6R(白細(xì)胞介素_6受體)和ICAM-1 (細(xì)胞間粘附分子I)。
[0029]在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)的釋放以及它們基因的表達(dá)在樣品被以間接體內(nèi)方式暴露于免疫球蛋白(特別是IgG、IgM、IgA或它們的組合)后被測(cè)定。
[0030]特別地，基因分型、蛋白質(zhì)釋放和基因表達(dá)是在全血、血液成分、細(xì)胞碎片或細(xì)胞質(zhì)中測(cè)定的。
[0031]根據(jù)本發(fā)明，特別地，樣品在存在刺激物的情況培養(yǎng)，并且在至少一個(gè)實(shí)驗(yàn)中在存在免疫球蛋白的情況下培養(yǎng)，并在至少一個(gè)實(shí)驗(yàn)中在不存在免疫球蛋白的情況下培養(yǎng)以作為對(duì)照，其中刺激物選自脂多糖(LPS)、佛波醇-12-豆蘧酸-13乙酯(PMA)/離子霉素、結(jié)合至白細(xì)胞上的受體的單克隆抗體，或它們的組合。 [0032]特別地，使用在實(shí)驗(yàn)中的免疫球蛋白的量為約0.01至約100 mg/ml，特別是約I至約 50 mg/ml。
[0033]通常，本發(fā)明的方法可在用免疫球蛋白治療患者之前和/或期間進(jìn)行。
[0034]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”，LDA-分值(線性判別分析)通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-LDA-分值(2P5) = 12，6661481683* (ADAMTS9 基因型)-0，0018215212* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)-5，2193484355,
其中LDA-分值(2P5)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P5) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0035]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和蛋白質(zhì)的量的值[pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(2P4)= 5，1547784757*(ADAMTS9 基因型)+ 0，OOO66I3Ml*(IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)-2，5483009377,
其中LDA-分值(2P4)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P4) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0036]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-10釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和蛋白質(zhì)的量的值[pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(2P3)= 5，1710817023* (ADAMTS9 基因型)-0，0526409406* (IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-10 釋放)-2,5189275627，
其中LDA-分值(2P3)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P3) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0037]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN- Y Genex", LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μι]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(2Ρ2)= 5，1584234532* (ADAMTS9 基因型)+ 0，0009843151* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 2,5250980052，
其中LDA-分值(2P2) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P2) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0038]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，ADAMTS9的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)IFN- y Genex", LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(2Pl)= 5，173156752*(ADAMTS9 基因型)+ O, 0010883751*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 2,5111538246，
其中LDA-分值(2P1) ≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P1) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0039]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值以及轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(3P2)= 28，427707664*(ADAMTS9 基因型)-0，0(?6972337*(IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+ 0,0129144727* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)-12, 7163079623,其中LDA-分值(3P2)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(3P2) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0040]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”和“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN- Y Genex",并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值以及轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(4P1)= 31，5741470438*(ADAMTS9 基因分型)-0，0052245002*(IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放)+0，0166330872* (IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放e)-0，0109678784* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 13, 8885092449,
其中LDA-分值(4P1) ≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(4P1) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0041]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8釋放”和“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex”，并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值以及轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(5P1)= 107，2468831*(ADAMTS9 基因型)-0.038780771* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 0.017866668* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+0.044172208* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)+ 0.002477736* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8釋放)-47.9651381，
其中LDA-分值(5P1) ≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P1) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0042]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)SCF釋放”和“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex”，并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值以及轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(5P2)= 89.56250541*(ADAMTS9 基因型)-0.128146913*(IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 0.015495947* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+0.058499044* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)+ 0.008472595* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)SCF 釋放)-43.33685048，
其中LDA-分值(5P2)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P2) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0043]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CXCLlO釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-1O釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8釋放”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl Genex”、“IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex”和“ IG 誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8Genex”，并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值以及轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(9P)= 108，5705785*(ADAMTS9 基因型)-0.06566I8Il*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl Genex) - 0.14179279* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 0.00521369* (IG誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8 Genex) - 0.017983675* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+0.018722767* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)+ 0.001625748* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CXCLlO釋放)+ 0.425763386* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-10 釋放)+ 0.004389251*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8 釋放)-48.34366669，
其中LDA-分值(9P) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(9P) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0044]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放”，并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和蛋白質(zhì)的量的值[pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(2P6)= 5，6030684062*(KLHDC8A基因型)+ 0，5886M5M9*(IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R 釋放)-2，0540283735，
其中LDA-分值(2P6) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P6) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0045]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl釋放”，并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和蛋白質(zhì)的量的值[pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(2P7)= 6，4011642693*(KLHDC8A基因型)+ O, 1385143298*(IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl 釋放)-2，870032934,
其中LDA-分值(2P7) ( -1.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P7) >-1.0表示非響應(yīng)者。
[0046]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)⑶32b Genex”，并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和轉(zhuǎn)錄數(shù)的值[轉(zhuǎn)錄體/μι]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(2Ρ8)= 5，7296431439*(KLHDC8A基因型)-0，3O5O588266*(IG誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) - 2, 8435304986,
其中LDA-分值(2P8) ( -1.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P8) >-1.0表示非響應(yīng)者。
[0047]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)⑶16 Genex”和“IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1釋放”，并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值以及轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(3P1)= 6，207662683*(KLHDC8A 基因型)-0.007323378*(IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD16 Genex) + 0.219033761* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1 釋放)-5.456170752,其中LDA-分值(3P1) ( -1.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(3P1) >-1.0表示非響應(yīng)者。
[0048]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放”和“IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1釋放”，并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值以及轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(4P2) = 7，0639539622* (KLHDC8A 基因型)-0，2539770554* (IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) + O, 4613873178* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R 釋放)+0，111066766* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl 釋放)-3,3328149764，
其中LDA-分值(4P2) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(4P2) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0049]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD16 Genex”、“IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex”、“IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1釋放”和“IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放”，并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值以及轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(5P3)= 11.44098342*(KLHDC8A 基因型)-0.045599133*(IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD16 Genex) - 0.535989358* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) +0.225465018* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1 釋放)+ 3.14495298* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放)-3.9398568，
其中LDA-分值(5P3) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P3) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0050]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAM_1 Genex ”、“ IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)⑶32b Genex”和“ IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放”，并且LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值以及轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定:
LDA-分值(δΡ4)= 9.476844721*(KLHDC8A 基因型)-0.361M4446* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) + 0.008332887* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1 Genex)-0.939416614* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) + 0，951418988* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R 釋放)- 4.232325519，
其中LDA-分值(5P4)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P4) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0051]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，響應(yīng)者或非響應(yīng)者的表示通過(guò)至少一種額外的方法確認(rèn)。
[0052]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，涉及到了任何適合體內(nèi)使用的免疫球蛋白產(chǎn)品，例如經(jīng)靜脈、皮下、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、囊內(nèi)、口腔、局部或吸入施用的那些免疫球蛋白產(chǎn)品。
[0053]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述疾病選自炎性介導(dǎo)免疫疾病、自身免疫疾病、過(guò)敏癥、移植物抗宿主反應(yīng)和預(yù)防移植排斥；任何種類的多發(fā)性硬化癥或任何其他脫髓鞘神經(jīng)系統(tǒng)疾病；或復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥。
[0054]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明被用來(lái)允許預(yù)測(cè)MS患者的復(fù)發(fā)可能性和/或疾病在患者的殘疾和/或機(jī)能方面(通過(guò)例如但不限于擴(kuò)展殘疾狀況評(píng)分量表(EDSS)的臨床評(píng)分量表來(lái)測(cè)定)的進(jìn)展比率，特別是紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或腸病(例如克羅恩病)、肌炎或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。
[0055]本發(fā)明的 主題還在于本發(fā)明的方法在幫助健康機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或推薦免疫球蛋白用于治療任何種類的多發(fā)性硬化癥或任何其他脫髓鞘疾病或紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或腸病(例如克羅恩病)、肌炎或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)方面的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0056]圖1至圖20以圖表形式顯示了 LDA-分值。
【具體實(shí)施方式】
[0057]本發(fā)明所針對(duì)的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)預(yù)測(cè)對(duì)免疫球蛋白療法的個(gè)體響應(yīng)性的方法來(lái)解決，在該方法中確定了 ADAMTS9-內(nèi)含子的特定區(qū)域(A解聯(lián)蛋白的內(nèi)含子和具有血小板反應(yīng)蛋白模體9的金屬蛋白酶；Chr.3p 14.1和物理位置64560013，64595571，64602006，64605119，64612402，64614313，64617371，64620883，分別以相同順序dbSNP RS ID rs9820942, rs6780659, rs6445415, rsll721258, rsll707584, rs7652817,rsl3079218, rs9819183)和KLHDC8A-內(nèi)含子特定區(qū)域(含8A的Kelch結(jié)構(gòu)域內(nèi)含子；Chr.1q32.1 和物理位置 205312280-205318524- 205318854-205318983，分別以相同順序 dbSNP RS ID rs7549293, rsl0751436, rs913723, rs913722SNP)或 CD14 側(cè)翼區(qū)的特定區(qū)域(Chr.5q31.3 (SNP 染色體 5，區(qū)段 q31.3，物理位置 140007011，140011315,140014909，140015208，分別以相同順序 dbSNP RS ID rs778588, rs2563298,rs5744448, rs2569192))的純合性，同時(shí)確定了從細(xì)胞中釋放的細(xì)胞因子的量或它們?cè)诩?xì)胞上表達(dá)的基因的量。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子應(yīng)被理解為包括其亞群趨化因子。細(xì)胞因子(它們的分別表達(dá)的基因)選自干擾素Y (IFN- Y )、白細(xì)胞介素-8 (IL-8或CXCL8)、C-X-C模體趨化因子10(CXCL10或干擾素Y誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)10 kDa (IP-10))、趨化因子C-C模體配體8(CCL8)、趨化因子C-C模體配體20 (CCL20)、白細(xì)胞介素-10 (IL-10)和干細(xì)胞因子(SCF)，這些細(xì)胞因子被用來(lái)單獨(dú)或與其他物質(zhì)組合地預(yù)測(cè)IgG響應(yīng)性。還感興趣的有⑶32b、⑶16(FcR- Y IIDXD 19、CD20、CD56、IL-6R (白細(xì)胞介素_6受體)和ICAM-1 (細(xì)胞間粘附分子I)的釋放和/或基因表達(dá)。
[0058]所述的細(xì)胞-生物化學(xué)參數(shù)在全血中研究，并通過(guò)分析和比較血液樣品而來(lái)源于患有復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥的患者的血漿和/或白細(xì)胞(在施用免疫球蛋白(常規(guī)施用量為0.4g IVIG/kg體重)之前和之后抽取)。該研究最初參與了 33人，其中6人隨后因表現(xiàn)出明顯的炎性活性而被排除或中途退出。剩余27人的分析結(jié)果為，根據(jù)研究設(shè)計(jì)，15人為響應(yīng)者，而12人為非響應(yīng)者，因此這些人用于確定相關(guān)參數(shù)。
[0059]雖然每個(gè)所述的參數(shù)揭示出其自身在ROC-分析(受試者操作特征)后的一定預(yù)測(cè)值，但是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，基于細(xì)胞因子(IFN-Y，CXCL8, CXCL10, IL-10和SCF)釋放和/或基因表達(dá)以及ADAMTS9-內(nèi)含子基因分型的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的組合，或者基于CD16，⑶32b，IL-6R和ICAM-1的釋放和/或基因表達(dá)以及KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的組合更具有預(yù)測(cè)性，因?yàn)樵趯?duì)免疫球蛋白治療的響應(yīng)者和有關(guān)預(yù)防復(fù)發(fā)或延長(zhǎng)緩解期的所述參數(shù)之間具有更強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。也可以將其中一個(gè)基因分型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與一個(gè)或兩個(gè)其他基因分型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果結(jié)合，從而識(shí)別出可能的假陽(yáng)性/假陰性結(jié)果，或者用來(lái)確認(rèn)響應(yīng)者/非響應(yīng)者的評(píng)估。經(jīng)KLHDC8A-內(nèi)含子基因分型確定的響應(yīng)者通過(guò)ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型來(lái)確認(rèn)可被視為這種組合的一個(gè)非限制性的例子。使用內(nèi)含子KLHDC8A和CD14的基因分型結(jié)果，或ADAMTS9和CD14的基因分型結(jié)果，甚至是KLHDC8A和ADAMTS9和CD14的基因分型結(jié)果，可能是有用的。
[0060]而且，這些參數(shù)可進(jìn)一步與其他增加免疫球蛋白療法響應(yīng)的預(yù)測(cè)性的參數(shù)結(jié)合，例如，NK細(xì)胞脫顆粒參數(shù)(顆粒酶B、穿孔素或CD107a)以及功能性NK細(xì)胞殺傷活性或它們的組合。所有這些參數(shù)(細(xì)胞因子釋放、細(xì)胞因子基因表達(dá)、NK細(xì)胞脫顆粒參數(shù)和功能性NK細(xì)胞殺傷活性)都在暴露于免疫球蛋白的全血樣品或血漿的短期間接體內(nèi)培養(yǎng)物(有或無(wú)LPS (脂多糖)刺激)中生成。
[0061]試劑和實(shí)齡
試劑、實(shí)驗(yàn)和結(jié)果評(píng)價(jià)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。Jacobi等在ClinicalImmunology (2009) 133，393 - 401中詳細(xì)地描述了許多實(shí)驗(yàn)。
[0062]全血培養(yǎng)物的常規(guī)制備是通過(guò)將肝素化的靜脈全血與相同體積的含有在培養(yǎng)基(RPM1- 1640，10% FCS, L-谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素，50 μ M β-巰基乙醇)中的20mg/ml IgG的儲(chǔ)備溶液混合而進(jìn)行的。當(dāng)要進(jìn)行qRT-PCR、FACS和NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)時(shí)，在37°C培養(yǎng)該混合物3小時(shí)，而在要進(jìn)行ELISA時(shí)，在37°C培養(yǎng)該混合物24小時(shí)。這樣的實(shí)驗(yàn)在本申請(qǐng)中被稱為“IG誘導(dǎo)的”。某些實(shí)驗(yàn)是以在全血、IgG和培養(yǎng)基的混合物中的100ng/ml的終濃度的脂多糖(LPS,購(gòu)自Sigma, St.Luis, USA)以實(shí)現(xiàn)刺激來(lái)進(jìn)行的。這種實(shí)驗(yàn)在本申請(qǐng)中被稱為“IG/LPS誘導(dǎo)的”。相同的實(shí)驗(yàn)也以10mg/ml終濃度的麥芽糖代替IgG來(lái)進(jìn)行，以與IgG培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較。IG或IG/LPS培養(yǎng)的無(wú)麥芽糖(minus maltose)或麥芽糖/LPS(IG缺失，對(duì)照樣品)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的差值在本申請(qǐng)中稱作“(凈值)”。
[0063]基因分型是利用全血在Affymetrix 公司的 GeneChip? Human Mapping 6.0Array上根據(jù)制造商手冊(cè)進(jìn)行的。在相關(guān)位置的純合SNP(單核苷酸多態(tài)性)組合在數(shù)據(jù)分析中被賦予值1，而不符合該標(biāo)準(zhǔn)的SNP被賦予值O。特別地，CD14側(cè)翼區(qū)的AA-BB-BB-AA 純合序列(CHR.5q31.3)(由純合 SNP 組合 A (dbSNP RS ID rs778588 -物理位置 140007011)-C (dbSNP RS ID rs2563298 -物理位置 140011315)-C (dbSNP RS IDrs5744448 -物理位置 140014909)-C (dbSNP RS ID rs2569192 -物理位置 140015208)所代表)、KLHDC8A-內(nèi)含子的AA-BB-AA-BB純合序列(Chr.1q32.1)(由純合SNP組合 C(dbSNP RS ID rs7549293 -物理位置 205312280)-T(dbSNP RS ID rsl0751436-物理位置 205318524)-A(dbSNP RS ID rs913723 -物理位置 205318854)-T(dbSNPRS ID rs913722 -物理位置205318983)所代表)、以及ADAMTS9-內(nèi)含子在Chr.3pl4.1 的 BB-AA-AA-BB-AA-BB-BB-AA 純合序列(由純合 SNP 組合 G(dbSNP RS IDrs9820942 - physical position 64560013)-C (dbSNP RS ID rs6780659 -物理位置64595571)-A(dbSNP RS ID rs6445415 -物理位置64602006)-T(dbSNP RS ID rsl 1721258-物理位置 64605119)-A(dbSNP RS ID rsll707584 -物理位置 64612402)-G(dbSNPRS ID rs7652817 -物理位置 64614313)-T(dbSNP RS ID rsl3079218 -物理位置64617371)-A(dbSNP RS ID rs9819183 -物理位置 64620883)所代表)被賦予值 I,而其他所有序列被賦予值O。
[0064]基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)以全血通過(guò)qRT-PCR來(lái)進(jìn)行。在紅細(xì)胞裂解后，將細(xì)胞重懸于400μ lMagNApure Lysis 緩沖液(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)中，裂解產(chǎn)物被存儲(chǔ)在_80°C直至進(jìn)行分析。使用自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)(MagNA-Pure，Roche AppliedScience, Mannheim, Germany),根據(jù)制造商手冊(cè)進(jìn)行mRNA分離。洗脫體積設(shè)定至50 μ I。使用第一鏈cDNA合成試劑盒(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)并用寡-(dT)作為引物，在熱循環(huán)儀中根據(jù)制造商手冊(cè)對(duì)8.2 μ I RNA的等分試樣進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA合成終止后，將反應(yīng)混合稀釋至500 μ I的終體積，并存儲(chǔ)在_20°C直至聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析。被優(yōu)化用于 LightCycler (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)的參數(shù)特異性引物對(duì)由SEARCH-LC GmbH (Heidelberg, Germany)開(kāi)發(fā)并從其購(gòu)買。根據(jù)參數(shù)特異性試劑盒中提供的手冊(cè)使用LightCycler FastStart DNA Sybr Green I試劑盒(RocheApplied Science, Mannheim, Germany)進(jìn)行PCR。使用兩種管家基因β-肌動(dòng)蛋白和親環(huán)蛋白B的平均表達(dá)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化RNA投入。使用調(diào)整的每μ I cDNA轉(zhuǎn)錄數(shù)作為數(shù)據(jù)。
[0065]使用可商購(gòu)的試劑盒(Diaclone, Pelikine and Lumine),根據(jù)制造商手冊(cè),在全血培養(yǎng)物的上清液中通過(guò)ELISA進(jìn)行所釋放的蛋白質(zhì)的分析。在于37°C培養(yǎng)24h后，離心使全血培養(yǎng)物沉淀，上清液被保持在_80°C直至分析。使用pg/ml蛋白質(zhì)濃度作為數(shù)據(jù)。
[0066]與脫顆粒有關(guān)的任何其他細(xì)胞標(biāo)記物的改變均可用來(lái)檢測(cè)和定量由于暴露于IgG而誘導(dǎo)的脫顆粒效率和狀態(tài)。這些NK細(xì)胞顆粒(裂解性溶酶體)復(fù)合物的例子為穿孔蛋白和顆粒酶(后一種蛋白酶更具體地為顆粒酶B)，它們可通過(guò)例如抗原檢測(cè)系統(tǒng)(像ELISA)或直接酶測(cè)試(用于酶和蛋白酶)來(lái)定量。CD107a的表達(dá)增加是NK脫顆粒的典型指標(biāo)。在全血實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中使用脂多糖(來(lái)源于細(xì)菌)，從而模擬病理-生理環(huán)境，IFN-Y和CXCLlO的mRNA轉(zhuǎn)錄(數(shù)量)和蛋白質(zhì)(釋放)水平都有上調(diào)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在存在添加的免疫球蛋白(在用LPS刺激后)的情況下，與未添加免疫球蛋白的對(duì)照相比，CXCLlO的增加量由于免疫球蛋白而減少，但沒(méi)有觀察到IFN-Y具有相關(guān)的減少。
[0067]通常，通過(guò)專業(yè)人員所知的方法來(lái)測(cè)定所監(jiān)控的信號(hào)，例如通過(guò)在流式細(xì)胞儀中使用標(biāo)記的抗體、片段或親和配合進(jìn)行特定檢測(cè)(如FACS，熒光激活細(xì)胞分類術(shù))。
[0068]而且，這些參數(shù)可與單核苷酸多態(tài)性(SNP)(如白細(xì)胞介素-2受體(IL-2R)、白細(xì)胞介素-7受體(IL-7R)和CD58)的實(shí)驗(yàn)結(jié)合，或與表明患者不同遺傳背景的基因分型實(shí)驗(yàn)結(jié)合。
[0069]所有這些分析結(jié)果被與研究成果以及相應(yīng)IgG-治療的患者(“響應(yīng)者”)和不響應(yīng)患者(“非響應(yīng)者”)的區(qū)分相關(guān)聯(lián)，并且被進(jìn)行線性判別分析(LDA)以確定預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)IgG治療敏感性的最相關(guān)參數(shù)。在鑒別出有用的參數(shù)后，如以下實(shí)施例所示，具有高預(yù)測(cè)值的幾個(gè)LDA分值被確立出來(lái)。
[0070]如在關(guān)于實(shí)驗(yàn)的一般性描述中所指明的，分析結(jié)果被引入到各個(gè)等式中以計(jì)算LDA分值的值和范圍(dimensions)。通過(guò)幾乎相同規(guī)模的響應(yīng)者和非響應(yīng)者(在圖中以“學(xué)習(xí)組”表示)的隨機(jī)亞組建立了許多實(shí)施例，使用已建立的等式測(cè)試補(bǔ)充亞組(“驗(yàn)證亞組”)。兩個(gè)亞組也具有相似的規(guī)模。
[0071]以下為實(shí)施例中使用的縮寫的一般性描述，與已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)的一般性描述中所討論的相同:
“ IG”表示使用免疫球蛋白的探針培養(yǎng)
“IG/LPS”表示使用免疫球蛋白和LPS刺激的探針培養(yǎng)
“X Genex”表示X的基因表達(dá)
“Y釋放”表示蛋白質(zhì)Y的釋放/脫顆粒
“(凈值)”，當(dāng)與“Genex”結(jié)合使用時(shí)表示培養(yǎng)3h，當(dāng)與“釋放”結(jié)合使用時(shí)表示分別培養(yǎng)24h，并且從免疫球蛋白培養(yǎng)的樣品(IG或IG/LPS)中減去對(duì)照樣品(麥芽糖或麥芽糖/LPS)的分析值。
[0072]實(shí)施例1-LDA-分倌(9個(gè)參數(shù)):LDA-分值(9P)= 108，5705785*(ADAMTS9 基因型)-0.06566I8Il*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl Genex) - 0.14179279* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 0.00521369* (IG誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8 Genex) - 0.017983675* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+0.018722767* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)+ 0.001625748* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CXCLlO釋放)+ 0.425763386* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-10 釋放)+ 0.004389251*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8 釋放)-48.34366669。
[0073]如圖1所示，LDA-分值(9P) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(9P) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0074]實(shí)施例2-LDA-分倌(5P1):
LDA-分值(5P1)= 107，2468831*(ADAMTS9 基因型)-0.038780771* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 0.017866668* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+0.044172208* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)+ 0.002477736* (誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8 釋放)-47.96513813。
[0075]如圖2所示，LDA-分值(5P1) < 0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5Ρ1)>(λΟ表示非
響應(yīng)者。 [0076]實(shí)施例3-LDA-分倌(5Ρ2):
LDA-分值(5Ρ2)= 89.56250541*(ADAMTS9 基因型)-0.128146913* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 0.015495947* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+0.058499044*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)+ 0.008472595*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)SCF 釋放)-43.33685048。
[0077]如圖3所示，LDA-分值(5P2) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P2) >0.0表示非
響應(yīng)者。
[0078]實(shí)施例4-LDA-分倌(5P3):
LDA-分值(5P3)= 11.44098342*(KLHDC8A 基因型)-0.045599133*(IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CDl6 Genex) - 0.535989358* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) +
0.225465018* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)I CAM-1 釋放)+ 3.14495298* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放)-3.9398568。
[0079]如圖4所示，LDA-分值(5P3) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P3) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0080]實(shí)施例5-LDA-分倌(5P4):
LDA-分值(5P4)= 9.476844721*(KLHDC8A 基因型)-0.361M4446*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) + 0.008332887* (IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1 Genex) - 0.939416614* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) + 0，951418988* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R 釋放)-
4.232325519。
[0081]如圖5所示，LDA-分值(5P4)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P4) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0082]實(shí)施例6-LDA-分倌(3P1):
LDA-分值(3P1)= 6，207662683*(KLHDC8A 基因型)-0.007323378*(IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD16 Genex) + 0.219033761* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1 釋放)-5.456170752。[0083]如圖6所示，LDA-分值(3P1) <-1.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(3Ρ1)> -1.0表示非響應(yīng)者。
[0084]實(shí)施例7-LDA-分倌(3P2):
LDA-分值(3P2)= 28，427707664*(ADAMTS9 基因型)-0，0(?6972337*(IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+ 0,0129144727* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)-12,7163079623。
[0085]如圖7所示，LDA-分值(3P2)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(3P2) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0086]實(shí)施例8-CD14-某閔型:
如圖 8 所示，CD14 側(cè)翼區(qū)在 CHR.5q31.3 的 SNP rs7549293, rsl0751436,rs913723, rs913722的純合序列AA-BB-BB-AA被賦予值1，，其由純合SNP組合A(dbSNPRS ID rs778588 -物理位置 140007011)-C(dbSNP RS ID rs2563298 -物理位置140011315)-C (dbSNP RS ID rs5744448 -物理位置 140014909)-C (dbSNP RS ID rs2569192-物理位置140015208)所代表，并表明主要是非響應(yīng)者，而任何其他序列被賦予值0，并表明主要是響應(yīng)者。
[0087]實(shí)施例9- ADAMTS9-某閔型:
如圖 9 所示，ADAMTS9-內(nèi)含子在 Chr.3pl4.1 的 SNP rs9820942, rs6780659,rs6445415, rsll721258, rsll707584, rs7652817, rsl3079218, rs9819183 的純合序列 BB-AA-AA-BB-AA-BB-BB-AA 被賦予值 1，其由純合 SNP 組合 G (dbSNP RS ID rs9820942-物理位置 64560013)-C(dbSNP RS ID rs6780659 -物理位置 64595571)-A(dbSNPRS ID rs6445415 -物理位置 64602006)-T(dbSNP RS ID rsll721258 -物理位置64605119)-A(dbSNP RS ID rsll707584 -物理位置64612402)-G(dbSNP RS ID rs7652817-物理位置 64614313)-T (dbSNP RS ID rsl3079218 -物理位置 64617371)-A (dbSNP RS IDrs9819183 -物理位置64620883)所代表，并表明主要是非響應(yīng)者(包括I個(gè)假陰性結(jié)果)，而任何其他序列被賦予值0，并表明主要是響應(yīng)者。
[0088]實(shí)施例10- KLHDC8A-某閔型:
如圖 10 所示，KLHDC8A-內(nèi)含子在 Chr.1q32.1 的 SNP rs778588, rs2563298,rs5744448, rs2569192的純合序列AA-BB-AA-BB被賦予值1，其由純合SNP組合C(dbSNPRS ID rs7549293 -物理位置 205312280)-T(dbSNP RS ID rsl0751436 -物理位置205318524)-A (dbSNP RS ID rs913723 -物理位置 205318854)-T (dbSNP RS ID rs913722-物理位置205318983)所代表，并表明是非響應(yīng)者，而任何其他序列被賦予值0，并主要表明是響應(yīng)者(包括I個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果)。
[0089]實(shí)施例1l-LDA-分倌(2P1):
LDA-分值(2Pl)= 5，173156752*(ADAMTS9 基因型)+ 0，0010883751*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 2,5111538246。
[0090]如圖11所示，LDA-分值(2P1) ^ 0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2Ρ1)>0.0主要表示非響應(yīng)者(包括I個(gè)假陰性結(jié)果)。
[0091]實(shí)施例12-LDA-分倌(2Ρ2):
LDA-分值(2Ρ2)= 5，1584234532*(ADAMTS9基因型)+ 0，0009843151*(IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 2,5250980052。[0092]如圖12所示，LDA-分值(2P2) ^ 0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P2) >0.0主要表示非響應(yīng)者(包括I個(gè)假陰性結(jié)果)。
[0093]實(shí)施例13-LDA-分倌(2P3):
LDA-分值(2P3)= 5，1710817023*(ADAMTS9 基因型)-0，0526409406*(IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-10 釋放)-2,5189275627。
[0094]如圖13所示，LDA-分值(2P3)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P3) >0.0主要表示非響應(yīng)者(包括I個(gè)假陰性結(jié)果)。
[0095]實(shí)施例14-LDA-分倌(2P4):
LDA-分值(2P4)= 5，1547784757*(ADAMTS9 基因型)+ 0，OOO66I3Ml*(IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)-2,5483009377。
[0096]如圖14所示，LDA-分值(2P4)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P4) >0.0主要表示非響應(yīng)者(包括I個(gè)假陰性結(jié)果)。
[0097]實(shí)施例15-LDA-分倌(2P5):
LDA-分值(2P5)= 12，6661481683*(ADAMTS9 基因型)-0，0018215212*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)-5，21934別355。
[0098]如圖15所示，LDA-分值(2P5) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P5) >0.0表示
非響應(yīng)者。
[0099]實(shí)施例16-LDA-分倌(2P6):
LDA-分值(2P6)= 5，6030684062*(KLHDC8A基因型)+ 0，5886M5M9*(IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R 釋放)-2，0540283735。
[0100]如圖16所示，LDA-分值(2P6)≤0.0主要表示響應(yīng)者(包括I個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果)，而LDA-分值(2P6) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0101]實(shí)施例17-LDA-分倌(2P7):
LDA-分值(2P7)= 6，4011642693*(KLHDC8A基因型)+ O, 1385143298*(IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl 釋放)-2,870032934。
[0102]如圖17所示，LDA-分值(2P7)≤-1.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P7)>_1.0表
示非響應(yīng)者。
[0103]實(shí)施例18-LDA-分倌(2P8):
LDA-分值(2P8)= 5，7296431439*(KLHDC8A基因型)-0，3O5O588266*(IG誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) - 2,8435304986。
[0104]如圖18所示，LDA-分值(2P8)≤-1.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2Ρ8)>_1.0表
示非響應(yīng)者。
[0105]實(shí)施例19-LDA-分倌(4Ρ1):
LDA-分值(4Ρ1)= 31，5741470438*(ADAMTS9 基因型)-0，0052245002*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+ 0，0166330872* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)-0，0109678784* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-y Genex) - 13, 8885092449ο
[0106]如圖19所示，LDA-分值(4Ρ1)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(4Ρ1) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0107]實(shí)施例20-LDA-分倌(4Ρ2):LDA-分值(4P2) = 7，0639539622* (KLHDC8A 基因型)-0，2539770554* (IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) + O, 4613873178* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R 釋放)+0，111066766* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl 釋放)-3,3328149764。
[0108]如圖20所示，LDA-分值(4P2)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(4P2) >0.0表示非響應(yīng)者。
[0109]該方法使得可以識(shí)別出個(gè)體對(duì)適于體內(nèi)使用而治療原則上能夠通過(guò)免疫球蛋白治療的疾病的任何免疫球蛋白產(chǎn)品的響應(yīng)性/非響應(yīng)性，所述免疫球蛋白產(chǎn)品例如是經(jīng)靜脈、皮下、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、囊內(nèi)、口腔、局部或吸入施用的那些免疫球蛋白產(chǎn)品，所述疾病例如是免疫介導(dǎo)炎性疾病、自身免疫疾病、過(guò)敏癥、移植物抗宿主反應(yīng)和預(yù)防移植排斥；任何種類的多發(fā)性硬化癥或任何其他脫髓鞘神經(jīng)系統(tǒng)疾??；或復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥。
[0110]該方法還允許預(yù)測(cè)MS患者的復(fù)發(fā)可能性和/或疾病在患者的殘疾和/或機(jī)能方面(通過(guò)例如但不限于擴(kuò)展殘疾狀況評(píng)分量表(EDSS)的臨床評(píng)分量表來(lái)測(cè)定)的進(jìn)展比率，特別是紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或腸病(例如克羅恩病)、肌炎或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。
[0111]該方法還可額外地用于幫助健康機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或推薦免疫球蛋白用于治療任何種類的多發(fā)性硬化癥或任何其他脫髓鞘疾病或紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或腸病(例如克羅恩病)、肌炎或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)方面的應(yīng)用。
[0112]
【權(quán)利要求】
1.一種確定患病個(gè)體對(duì)免疫球蛋白療法的響應(yīng)可能性的方法，所述方法包括以下步驟: 提供該個(gè)體的含B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、不變T細(xì)胞和單核細(xì)胞的樣品; 對(duì)ADAMTS9-內(nèi)含子的多核苷酸；KLHDC8A-內(nèi)含子的多核苷酸或CD14基因的側(cè)翼區(qū)的多核苷酸中的至少一個(gè)進(jìn)行基因分型；以及 對(duì)純合單核苷酸多態(tài)性組合賦予值1，表明該血液樣品來(lái)源于將對(duì)免疫球蛋白治療不響應(yīng)的人， 而對(duì)不符合該標(biāo)準(zhǔn)的SNP賦予值O，表明該血液樣品來(lái)源于將對(duì)免疫球蛋白治療作出響應(yīng)的人。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的確定患病個(gè)體對(duì)免疫球蛋白療法的響應(yīng)可能性的方法，所述方法包括以下步驟: 提供該個(gè)體的含B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、不變T細(xì)胞和單核細(xì)胞的樣品; 對(duì) ADAMTS9-內(nèi)含子在 Chr.3p 14.1 處以及 dbSNP RS ID rs9820942, rs6780659,rs6445415, rsll721258, rsll707584, rs7652817, rsl3079218, rs9819183 進(jìn)行基因分型，和/或?qū)LHDC8A-內(nèi)含子在Chr.1q32.1處以及dbSNP RS ID rs7549293,rsl0751436, rs913723, rs913722 進(jìn)行基因分型，和 / 或?qū)?CD14 側(cè)翼區(qū)在 Chr.5q31.3處以及 dbSNP RS ID rs778588, rs2563298, rs5744448, rs2569192 進(jìn)行基因分型，并對(duì)ADAMTS9-內(nèi)含子的純合SNP (單核苷酸多態(tài)性)組合BB-AA-AA-BB-AA-BB-BB-AA賦予值 1，其由純合 SNP 組合 G(dbSNP RS ID rs9820942 -物理位置 64560013)-C(dbSNPRS ID rs6780659 -物理位置 64595571)-A(dbSNP RS ID rs6445415 -物理位置.64602006)-T(dbSNP RS ID rsl 1721258-物理位置64605119)-A(dbSNP RS ID rsl 1707584-物理位置 64612402)-G (dbSNP RS ID rs7652817 -物理位置 64614313)-T (dbSNP RS IDrsl3079218 -物理位置 64617371)-A(dbSNP RS ID rs9819183 -物理位置 64620883)所代表，并對(duì)KLHDC8A-內(nèi)含子的純合SNP組合AA-BB-AA-BB賦予值I，其由純合SNP組合C(dbSNP RS ID rs7549293 -物理位置 205312280)-T(dbSNP RS ID rsl0751436 -物理位置 205318524)-A(dbSNP RS ID rs913723 -物理位置 205318854)-T(dbSNP RS IDrs913722 -物理位置205318983)所代表，以及對(duì)⑶14側(cè)翼區(qū)在所述物理位置的純合SNP組合AA-BB-BB-AA賦予值1，其由純合SNP組合A (dbSNP RS ID rs778588 -物理位置 140007011)-C(dbSNP RS ID rs2563298 -物理位置 140011315)_C(dbSNP RS IDrs5744448 -物理位置 140014909)-C (dbSNP RS ID rs2569192 -物理位置 140015208)所代表，其與在相關(guān)位置的包含核酸AA-CC-CC-CC的等位基因組合的順序相同，表明該血液樣品來(lái)源于將不對(duì)IG治療響應(yīng)的人，而對(duì)不符合該標(biāo)準(zhǔn)的SNP賦予值0，表明該血液樣品來(lái)源于將對(duì)IG治療作出響應(yīng)的人。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2所述的方法，其中基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)，所述參數(shù)是通過(guò)確定從細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子的量或細(xì)胞因子在細(xì)胞上的表達(dá)的基因的量中的至少一個(gè)而獲得，其中細(xì)胞因子選自干擾素Y (IFN-Y)、白細(xì)胞介素-8(CXCL8)、C-X-C模體趨化因子.10 (CXCLlO)、趨化因子C-C模體配體8 (CCL8)、趨化因子C-C模體配體20 (CCL20)、白細(xì)胞介素-10 (IL-1O)和干細(xì)胞因子(SCF)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的方法，其中基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)，所述參數(shù)通過(guò)確定釋放自細(xì)胞的蛋白質(zhì)⑶32b、⑶16、IL-6R (白細(xì)胞介素_6受體)和ICAM-1 (細(xì)胞間粘附分子I)中的至少一種的量和/或細(xì)胞上的這些蛋白質(zhì)的被表達(dá)的基因中的至少一種的量來(lái)獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求3至4的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)的釋放以及它們的基因的表達(dá)在樣品被間接體內(nèi)地暴露于免疫球蛋白之后確定，所述免疫球蛋白特別是IgG、IgM、IgA或它們的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)所述的方法，其中基因分型、蛋白質(zhì)釋放和基因表達(dá)是在全血、血液成分、細(xì)胞碎片或細(xì)胞質(zhì)中確定的。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6的任一項(xiàng)所述的方法，其中在至少一個(gè)存在免疫球蛋白的實(shí)驗(yàn)中在存在刺激物的情況下培養(yǎng)樣品，并且在至少Iv不存在免疫球蛋白的對(duì)照試驗(yàn)中在存在刺激物的情況下培養(yǎng)樣品，其中刺激物選自脂多糖(LPS)、佛波醇-12-豆蘧酸-13乙酯(PMA)/離子霉素、結(jié)合至白細(xì)胞上的受體的單克隆抗體，或它們的組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7的任一項(xiàng)所述的方法，其中用在使用中的免疫球蛋白的量為約0.01至約100 mg/ml,特別是約I至約50 mg/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法在用免疫球蛋白治療患者之前和/或期間進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”，LDA-分值(線性判別分析)通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和蛋白質(zhì)的量的值[pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA- LDA-分值(2P5)= 12，6661481683*(ADAMTS9基因型)-0，0018215212*(IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)-5，2193484355, 其中LDA-分值(2P5)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P5) >0.0表示非響應(yīng)者。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(2P4) = 5，1547784757* (ADAMTS9 基因型)+ 0，0006613541* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)-2,5483009377， 其中LDA-分值(2P4)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P4) >0.0表示非響應(yīng)者。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-10釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(2P3)= 5，1710817023* (ADAMTS9 基因型)-0，0526409406* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-10 釋放)-2,5189275627， 其中LDA-分值(2P3)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P3) >0.0表示非響應(yīng)者。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μι]代入下式而測(cè)定:LDA-分值(2P2)= 5，1584234532*(ADAMTS9基因型)+ O, 0009843151*(IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 2, 5250980052, 其中LDA-分值(2P2) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P2) >0.0表示非響應(yīng)者。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)IFN-y Genex”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μι]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(2Pl)= 5，173156752*(ADAMTS9 基因型)+ 0，0010883751*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 2,5111538246， 其中LDA-分值(2P1) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P1) >0.0表示非響應(yīng)者。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”和“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值、轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(3P2)= 28，427707664*(ADAMTS9 基因型)-0，0(?6972337*(IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+ 0,0129144727* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)-12, 7163079623, 其中LDA-分值(3P2) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(3P2) >0.0表示非響應(yīng)者。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”和“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex", LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值、轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(4P1)= 31，5741470438*(ADAMTS9 基因型)-0，0052245002*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+ 0，0166330872* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)-0，0109678784* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-y Genex) - 13, 8885092449, 其中LDA-分值(4P1) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(4P1) >0.0表示非響應(yīng)者。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8釋放”和“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN- y Genex", LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值、轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(5P1)= 107，2468831*(ADAMTS9 基因型)-0.038780771* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 0.017866668* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+0.044172208* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)+ 0.002477736* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8 釋放)-47.9651381，其中LDA-分值(5P1) < 0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P1) >0.0表示非響應(yīng)者。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)SCF釋放”和“ IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN- y Genex", LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值、轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(5P2)= 89.56250541*(ADAMTS9 基因型)-0.128146913*(IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 0.015495947* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+，0.058499044*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)+ 0.008472595*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)SCF 釋放)-43.33685048， 其中LDA-分值(5P2) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P2) >0.0表示非響應(yīng)者。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中ADAMTS9-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL20釋放”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)CCL8釋放”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)CXCLlO釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-10釋放”、“ IG誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8釋放”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl Genex”、“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex”和“IG誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8 Genex”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值、轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(9P) =108，5705785*(ADAMTS9 基因型)-0.065661811*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl Genex) - 0.14179279* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IFN-Y Genex) - 0.00521369* (IG誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8 Genex) - 0.017983675* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL20 釋放)+0.018722767* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CCL8 釋放)+ 0.001625748* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)CXCLlO釋放)+ 0.425763386* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-10 釋放)+ 0.004389251*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)CXCL8 釋放)-48.34366669, 其中LDA-分值(9P) ^0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(9P) >0.0表示非響應(yīng)者。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(2P6)= 5，6030684062*(KLHDC8A基因型)+ 0，5886M5M9*(IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R 釋放)-2，0540283735， 其中LDA-分值(2P6) ^0. 0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P6) >0.0表示非響應(yīng)者。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(2P7)= 6，4011642693*(KLHDC8A基因型)+ O, 1385143298*(IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl 釋放)-2，870032934, 其中LDA-分值(2P7) ( -1.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P7) >-1.0表示非響應(yīng)者。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)⑶32b Genex", LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值和轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μι]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(2Ρ8)= 5，7296431439*(KLHDC8A基因型)-0，3O5O588266*(IG誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) - 2, 8435304986, 其中LDA-分值(2P8) ( -1.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(2P8) >-1.0表示非響應(yīng)者。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)CD16 Genex”和“IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值、轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(3P1)= 6，207662683*(KLHDC8A 基因型)-0.007323378*(IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD16 Genex) + 0.219033761* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1 釋放)-5.456170752,其中LDA-分值(3P1) ≤-1.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(3P1) >-1.0表示非響應(yīng)者。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放”和“IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值、轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(4P2)= 7，0639539622*(KLHDC8A 基因型)-0，2539770554*(IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) + O, 4613873178* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R 釋放)+.0，111066766* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl 釋放)-3,3328149764， 其中LDA-分值(4P2)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(4P2) >0.0表示非響應(yīng)者。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)CD16 Genex”、“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAM1釋放”和“IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值、轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(5P3)= 11.44098342*(KLHDC8A 基因型)-0.045599133*(IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD16 Genex) - 0.535989358* (IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) +.0.225465018* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1 釋放)+ 3.14495298* (IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放)-3.9398568， 其中LDA-分值(5P3) ≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P3) >0.0表示非響應(yīng)者。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的方法，其中KLHDC8A-內(nèi)含子的基因分型狀態(tài)被輔以參數(shù)“IG誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex”、“IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAMl Genex”、“IG/LPS誘導(dǎo)的(凈值)⑶32b Genex”和“ IG誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R釋放”，LDA-分值通過(guò)將基因分型狀態(tài)的值、轉(zhuǎn)錄體數(shù)量的值[轉(zhuǎn)錄體/μ?]和蛋白質(zhì)的量的值[Pg/ml]代入下式而測(cè)定: LDA-分值(5P4)= 9.476844721*(KLHDC8A 基因型)-0.361M4446*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) + 0.008332887* (IG誘導(dǎo)的(凈值)ICAM-1 Genex) - 0.939416614*(IG/LPS 誘導(dǎo)的(凈值)CD32b Genex) + 0，951418988*(IG 誘導(dǎo)的(凈值)IL-6R 釋放)-4.232325519， 其中LDA-分值(5P4)≤0.0表示響應(yīng)者，而LDA-分值(5P4) >0.0表示非響應(yīng)者。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至26所述的方法，其中響應(yīng)者或非響應(yīng)者的表示通過(guò)至少一種額外的但不同于權(quán)利要求1至26的方法來(lái)確認(rèn)。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至27任一項(xiàng)所述的方法，其中涉及任何適合體內(nèi)使用的免疫球蛋白產(chǎn)品，例如經(jīng)靜脈、皮下、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、囊內(nèi)、口腔、局部或吸入施用的那些免疫球蛋白產(chǎn)品O
29.根據(jù)權(quán)利要求1至28任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疾病選自炎性介導(dǎo)免疫疾病、自身免疫疾病、過(guò)敏癥、移植物抗宿主反應(yīng)和預(yù)防移植排斥；任何種類的多發(fā)性硬化癥或任何其他脫髓鞘神經(jīng)系統(tǒng)疾?。换驈?fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥。
30.根據(jù)權(quán)利要求1至29的任一項(xiàng)所述的方法，所述方法允許預(yù)測(cè)MS患者的復(fù)發(fā)可能性和/或疾病在患者的通過(guò)例如但不限于擴(kuò)展殘疾狀況評(píng)分量表(EDSS)的臨床評(píng)分量表所測(cè)定的殘疾和/或機(jī)能方面的進(jìn)展比率，特別是紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或例如克羅恩病的腸病、肌炎或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。
31.權(quán)利要求1至30的任一項(xiàng)所述的方法在幫助健康機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或推薦免疫球蛋白用于治療任何種類的多發(fā)性硬化癥或任何其他脫髓鞘疾病或紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或例如克羅恩病的腸病、肌炎或復(fù) 發(fā)性流產(chǎn)方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103597096SQ201280022134
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月7日
【發(fā)明者】斯蒂芬·繆爾, 托馬斯·杰賽, 克里斯蒂安·嘉科碧, 斯蒂芬·哈格, 約根·羅米申 申請(qǐng)人:歐克塔醫(yī)藥公司