病毒樣顆粒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了由重組番木瓜花葉病毒外殼蛋白和ssRNA制備病毒樣顆粒(VLP)的體外方法，其允許以高產(chǎn)率大規(guī)模生產(chǎn)VLP。還提供了通過(guò)所述體外方法制備的包含ssRNA的VLP。所述VLP可用作佐劑，并且當(dāng)與抗原融合時(shí)用作疫苗。還提供了所述VLP用于刺激先天免疫應(yīng)答的用途。
【專利說(shuō)明】病毒樣顆粒及其制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑的領(lǐng)域，并且特別地涉及病毒樣顆粒(Virus-likeparticle, VLP)及制備VLP的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]以下專利和專利申請(qǐng)描述了番木瓜花葉病毒(papaya mosaic virus,PapMV)病毒樣顆粒(VLP)增強(qiáng)抗原的免疫原性的能力。
[0003]美國(guó)專利N0.7,641, 896、加拿大專利申請(qǐng)N0.2，434，000和國(guó)際專利申請(qǐng)N0.PCT/CA03/00985 (W02004/004761)描述了 PapMV或來(lái)源于PapMV外殼蛋白的VLP用于在動(dòng)物中加強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的用途?？乖膳cPapMV或VLP連接或者它們可與PapMV或VLP組合施用。
[0004]國(guó)際專利申請(qǐng)N0.PCT/CA2007/002069 (W02008/058396)描述了基于 PapMV 和PapMV VLP的流感疫苗。疫苗包含PapMV或PapMV VLP和一種或更多種流感抗原，所述抗原可與PapMV或VLP連接或者可與PapMV或VLP組合施用。
[0005]國(guó)際專利申請(qǐng)N0.PCT/CA2007/001904(W02008/058369)描述了基于 PapMV 的免疫原性親和綴合抗原系統(tǒng)。該申請(qǐng)描述了 PapMV外殼蛋白與能夠結(jié)合目的抗原的多種親和肽的融合體。
[0006]國(guó)際專利申請(qǐng)N0.PCT/CA2008/000154(W02008/089569)描述了基于 PapMV 的對(duì)抗傷寒沙門氏菌(S.typhi)和其他腸道菌病原體的疫苗。所述疫苗包含PapMV或PapMV VLP和一種或更多種腸道菌抗原，所述抗原可與PapMV或VLP連接，或者可與PapMV或VLP組合施用。
[0007]國(guó)際專利申請(qǐng) N0.PCT/CA2009/00636 (W02010/012069)描述了包含 PapMV 成分和一種或更多種抗原的多價(jià)疫苗，及其提供對(duì)抗多種病原體株或?qū)苟嘤谝环N病原體的保護(hù)的用途。所述疫苗可任選地包含沙門氏菌屬(Salmonella spp.)孔蛋白成分。
[0008]已描述了由經(jīng)分離的PapMV外殼蛋白制備PapMV VLP。Erickson和Bancroft (1978，Virology, 90:36_46&1978，Virology, 90:47-53)首先描述了通過(guò)體外自組裝經(jīng)分離的PapMV外殼蛋白和PapMV RNA來(lái)制備PapMV VLP。用于這些實(shí)驗(yàn)的PapMV外殼蛋白制備物分離自PapMV并且以蛋白質(zhì)的聚合形式為主(在3S、14S和25S沉積)，其中的一種或更多種被認(rèn)為是對(duì)于引發(fā)VLP形成必不可少的。Sit等(1994, Virology, 199:238-242)的后續(xù)研究確立了引發(fā)組裝需要PapMV基因組的前38至47個(gè)核苷酸，并且提出了引發(fā)復(fù)合也需要14S聚合物種類(species)。
[0009]后來(lái)，證明了 PapMV VLP可由在大腸桿菌中表達(dá)的PapMV外殼蛋白的單體形式來(lái)制備。重組外殼蛋白在細(xì)菌細(xì)胞中自組裝，并且可通過(guò)使細(xì)胞破裂，然后進(jìn)行幾步純化步驟(包括去污劑處理)來(lái)分離VLP (參見(jiàn)Tremblay等? 2006，F(xiàn)EBS J.，273: 14-25 ;國(guó)際專利申請(qǐng) N0.PCT/CA2007/002069 (W02008/058396)、PCT/CA2007/001904 (W02008/058369) ,PCT/CA2008/000154(W02008/089569)和 PCT/CA2009/00636(W02010/012069))。[0010]提供該背景信息的目的是為了告知本 申請(qǐng)人:認(rèn)為的可與本發(fā)明相關(guān)的信息。既未必旨在承認(rèn)也不應(yīng)解釋為任何以上信息構(gòu)成針對(duì)本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供番木瓜花葉病毒樣顆粒及用于制備所述病毒樣顆粒的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于制備病毒樣顆粒(VLP)的體外方法，其包括以下步驟:a)在約6.0至約9.0的pH下和約2°C至約37°C的溫度下，將蛋白質(zhì):RNA比按重量計(jì)為約1:1至50:1的重組馬鈴薯X病毒(potexvirus)外殼蛋白與ssRNA組合足以允許VLP組裝的時(shí)間山)用核酸酶處理VLP以移除從顆粒中突出的任何RNA ；以及c)將VLP與其他處理成分分尚。
[0012]根據(jù)另一個(gè)方面，提供了通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的病毒樣顆粒(VLP)。
[0013]根據(jù)另一個(gè)方面，提供了包含通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的VLP的藥物組合物。
[0014]根據(jù)另一個(gè)方面，提供了通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的VLP，其用作佐劑。
[0015]根據(jù)另一個(gè)方面，提供了通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的VLP，其用于在對(duì)象中刺激先天免疫應(yīng)答并從而預(yù)防對(duì)象中的微生物感染或降低其嚴(yán)重程度。
[0016]根據(jù)另一個(gè)方面，提供了通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的VLP，其與一種或更多種抗原組合用作疫苗。
[0017]根據(jù)另一個(gè)方面，提供了通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的VLP，其用于制備藥物。
[0018]根據(jù)另一個(gè)方面，提供了一種在對(duì)象中增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括向?qū)ο笫┯冒ㄟ^(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的VLP的佐劑。
`[0019]根據(jù)另一個(gè)方面，提供了一種在對(duì)象中刺激先天免疫應(yīng)答并從而預(yù)防對(duì)象中的微生物感染或降低其嚴(yán)重程度的方法，其包括向?qū)ο笫┯猛ㄟ^(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的VLP。
[0020]根據(jù)另一個(gè)方面，提供了一種在對(duì)象中刺激免疫應(yīng)答的方法，其包括向?qū)ο笫┯门c一種或更多種抗原組合的通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的VLP。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含重組PapMV外殼蛋白和ssRNA的番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸并且其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)的藥物組合物，所述VLP包含重組PapMV外殼蛋白和ssRNA，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸并且其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含重組PapMV外殼蛋白和ssRNA的番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸并且其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段，所述VLP用作佐劑。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含重組PapMV外殼蛋白和ssRNA的番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸并且其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:5或6所示核酸序列的序列或其片段，所述VLP用于在對(duì)象中刺激先天免疫應(yīng)答并從而預(yù)防對(duì)象中的微生物感染或降低其嚴(yán)重程度。[0025]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含重組PapMV外殼蛋白和ssRNA的番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸并且其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:5或6所示核酸序列的序列或其片段，所述VLP與一種或更多種抗原組合用作疫苗。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含重組PapMV外殼蛋白和ssRNA的番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸并且其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:5或6所示核酸序列的序列或其片段，所述VLP用于制備藥物。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種在對(duì)象中增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括向?qū)ο笫┯冒竟匣ㄈ~病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)的佐劑，所述VLP包含重組PapMV外殼蛋白和ssRNA，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸并且其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種在對(duì)象中刺激先天免疫應(yīng)答并從而預(yù)防對(duì)象中的微生物感染或降低其嚴(yán)重程度的方法,其包括向?qū)ο笫┯冒亟MPapMV外殼蛋白和ssRNA的番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸并且其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種在對(duì)象中刺激免疫應(yīng)答的方法，其包括向?qū)ο笫┯门c一種或更多種抗原組合的包含重組PapMV外殼蛋白和ssRNA的番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸并且其包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于制備番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)的體外方法，其包括以下步驟:a)在pH為約6.5至約8.5的緩沖溶液中和約22°C至約37°C的溫度下，將蛋白質(zhì):RNA比按重量計(jì)為約5:1至40:1的重組PapMV外殼蛋白與ssRNA組合足以允許VLP組裝的時(shí)間，其中所述重組PapMV主要為以小于20-mer的低分子量種類(10w molecular weight species)的形式；b)用核酸酶處理VLP以移除從顆粒中突出的任何RNA ；以及c)將VLP與其他處理成分分離。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031]本發(fā)明的這些和其他特征將從參照附圖的以下詳述中變得更明顯。
[0032]圖1示出了(A)野生型PapMV外殼蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和⑶野生型PapMV外殼蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。
[0033]圖2示出了 (A)經(jīng)修飾PapMV外殼蛋白CPAN5的氨基酸序列(SEQ ID NO:3);和(B)經(jīng)修飾PapMV外殼蛋白PapMV CPsm的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
[0034]圖3示出了概括根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于制備包含ssRNA之體外組裝PapMV VLP的步驟的流程圖(rCP=重組PapMV VLP外殼蛋白；SRT=合成RNA模板；rVLP=重組 VLP)。
[0035]圖4示出了概括根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于制備包含ssRNA之體外組裝PapMV VLP的步驟的流程圖(縮寫(xiě)如圖3 ；prCP=編碼rCP的質(zhì)粒)。[0036]圖5示出了概括根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于制備包含ssRNA之體外組裝PapMV VLP的步驟的流程圖(縮寫(xiě)如圖4)。
[0037]圖6示出了概括根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于制備包含ssRNA之體外組裝PapMV VLP的步驟的流程圖(縮寫(xiě)如圖4 ;Ec.prCP=包含編碼rCP的質(zhì)粒的大腸桿菌；Ec.pSRT=包含編碼SRT的質(zhì)粒的大腸桿菌)。
[0038]圖7示出了(A)用于根據(jù)本發(fā)明之方法的一個(gè)實(shí)施方案的合成RNA模板(SRT)的序列[SEQ ID N0:5]，以及⑶用于根據(jù)本發(fā)明之方法的另一個(gè)實(shí)施方案的合成RNA模板(SRT)的序列[SEQ ID NO:6];所有的ATG密碼子已突變?yōu)門AA終止密碼子(粗體)，前16個(gè)核苷酸來(lái)自于位于pBluescript表達(dá)載體中的T7轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并且所述序列包含用于rVLP組裝的PapMV成核位點(diǎn)((A)中的框中)。
[0039]圖8示出了與ssRNA自組裝的PapMV VLP⑷和與聚1:C (dsRNA)自組裝的PapMVVLP(B)的電子顯微圖。
[0040]圖9示出了證明PapMV VLP誘導(dǎo)控制流感感染的抗病毒應(yīng)答的結(jié)果，⑷描繪用含ssRNA 的 PapMV VLP,60 u g 含聚 1:C 的 PapMV VLP,3 u gssRNA,3u g 聚 1:C 的 PapMV、60 u g的PapMV CP單體或?qū)φ站彌_液(Tris HCllOmM pH8)鼻內(nèi)處理并用200pfu的流感病毒株WSN/33攻擊的Balb/C小鼠(每組10只)的重量減輕；⑶示出在感染期間小鼠產(chǎn)生癥狀的總結(jié)(癥狀:0，無(wú)癥狀。1，輕微豎毛，輕微彎曲后背。2，豎毛，彎曲后背。3，豎毛，彎曲后背，移動(dòng)困難和輕度脫水。4，豎毛，彎曲后背，移動(dòng)困難，嚴(yán)重脫水，閉眼以及眼部分泌物)。
[0041]圖10 示出了表明用 PapMV VLP (60 U g), Pam3CSK4 (15 U g)或?qū)φ站彌_液(TrisHCllOmM pH8)鼻內(nèi)處理的Balb/C小鼠的支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage)中IP-1O(A)和IL-9⑶的存在的圖。每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于每只小鼠中檢測(cè)到的細(xì)胞因子的水平。還示出了存在于小鼠鼻咽灌洗(“LNP”)中的IP-10或IL-9的量。
`[0042]圖11示出了表明用PapMV VLP (60 U g)或用對(duì)照緩沖液(Tris HCllOmM pH8)鼻內(nèi)處理一次或兩次的Balb/C小鼠的支氣`管肺泡灌洗中(A)MIP-1 a、(B)MIP-1 P、(C)MIP_2、(D) KC, (E) TNF- a , (F) RANTES, (G) VEGF, (H)MCP-U (I)IP_10、(J)IL_17、(K)IL_13、(L)IL-12(p70)、(M) IL-9、(N)IL-6、(0) IL-1 a、(P) IL-1 ^ , (Q)GM-CSF 和(R)G-CSF 的存在的圖。每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于在每只小鼠中檢測(cè)到的細(xì)胞因子的水平。
[0043]圖12 示出了描繪 PapMV VLP ssRNA (100 u g)或 PBS 免疫 24 小時(shí)后 C57BL/6、TLR7敲除(KO)、MYD88K0和IRF5/7K0小鼠的DC、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞中⑷CD86和⑶CD69表達(dá)的編輯圖。通過(guò)FACS分析結(jié)果，并且表示為所分析樣品對(duì)PBS樣品的平均熒光強(qiáng)度(MFI)比。
[0044]圖13示出了描繪用PapMV PapMV VLP ssRNA(用抗-BST2抗體處理或不用抗-BST2處理)免疫C57BL/6小鼠24小時(shí)后(A)CD69、(B)MHC-1和(C)CD86表達(dá)的流式細(xì)胞分析的編輯圖。***p〈0.001，**p〈0.01，*p〈0.05，NS:不顯著。
[0045]圖14示出了描繪以下內(nèi)容的圖:(A)通過(guò)ELISA對(duì)血清中IFN-a產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)的評(píng)價(jià)；⑶用100 u gPapMV VLP ssRNA免疫后C57BL/6小鼠的脾；以及(C)用100 u gPapMVVLP ssRNA或PBS免疫6小時(shí)后C57BL/6小鼠和不同敲除小鼠中血清IFN-a的ELISA定量。
[0046]圖15示出了描繪以下內(nèi)容的圖:來(lái)自用PapMV VLP ssRNA或PBS免疫24小時(shí)后C57BL/6和IFNAR KO小鼠之脾的(A)B淋巴細(xì)胞和⑶樹(shù)突細(xì)胞中⑶86、MHC_I和⑶69表達(dá)的編輯圖；以及(C)PapMV VLPssRNA免疫后不同時(shí)間點(diǎn)上C57BL/6和IFNAR KO小鼠血清中對(duì)抗PapMV VLP ssRNA的抗體的ELISA定量。
[0047]圖16示出了描繪用IOOii gPapMV VLP ssRNA (實(shí)心方形)或PBS (空心圓)處理6小時(shí)后用2 X IO6PFU LCMV克隆13感染的C57BL/6小鼠血液中LCMv克隆13的病毒動(dòng)力學(xué)的圖(滴度以PFU/毫升血液表示；L0D:檢測(cè)限)。
[0048]圖17示出了描繪用2X IO6PFU LCMV克隆13感染15天后C57BL/6和TLR7敲除(KO)小鼠的(A)脾、⑶腎、(C)肝和⑶腦中的病毒滴度的圖；小鼠用IOOii g PapMV VLPssRNA、100 ii gR837或PBS處理6小時(shí)后進(jìn)行感染(滴度以PFU/器官表示)。LOD:檢測(cè)限。
[0049]圖18示出了描繪以下內(nèi)容的圖:對(duì)分離自用IOOiigPapMV VLPssRNAUOO U gR837或PBS免疫6小時(shí)后用2X IO6Pfu LCMV克隆13感染并在感染15天后處死的小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行GP33再刺激之后，產(chǎn)生(A) IFN- y、(B) TNF- a和(C)兩種細(xì)胞因子的⑶8+T細(xì)胞的比例；在GP33再刺激后由CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的(D) IFN- y量和(E) TNF- a量，(F)GP33特異性⑶8+T淋巴細(xì)胞中I3D-1表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)，以及(G)脾細(xì)胞中DbGP33+⑶8+⑶44+的百分比。
[0050]圖19示出了描繪用2X IO6PFU LCMV克隆13感染45天后C57BL/6小鼠的(A)脾、(B)腎、(C)腦和(D)肝中的病毒滴度的圖；小鼠用IOOiigPapMV VLP ssRNA或PBS處理6小時(shí)后進(jìn)行感染(滴度以PFU/器官表示)。LOD:檢測(cè)限。
[0051]圖20示出了描繪用PapMV VLP ssRNA刺激18小時(shí)后人PBMC(CD14+CDllb+細(xì)胞群)中CD86表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析的示圖(MF1:平均熒光強(qiáng)度)。
[0052]圖21示出了描繪以2周間隔用2個(gè)劑量PapMV VLP ssRNA處理之后用亞致死劑量肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)攻擊的小鼠存活的圖。
[0053]圖22示出了描繪慢性感染LCMV并且(A)在感染后第1、2、3、4和5天，以及(B)僅在感染后第6天和第7天用100 u gPapMV VLP ssRNA靜脈內(nèi)處理(一次/天)的小鼠的病毒載量的圖(滴度以PFU/mL表示)。
[0054]圖23示出了描繪在如圖22所述處理第15天(實(shí)驗(yàn)結(jié)束)的小鼠不同器官中的病毒滴度的圖。
[0055]圖24示出了說(shuō)明以I周間隔用PapMV VLP處理I次(Ix)、2次(2x)、5次(5x)和10次(IOx)并在最后一次處理3天后用流感WSN/33病毒攻擊的小鼠重量減輕的圖。
[0056]圖25示出了顯示出用(A)緩沖液和⑶PapMV VLP處理的小鼠的支氣管肺泡灌洗(broncho-aleolar lavage,BAL)中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞(中性粒細(xì)胞標(biāo)有圓圈)的電子顯微圖，以及(C)描繪BAL中發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞的數(shù)目的圖。
[0057]圖26示出了描繪在用與三價(jià)滅活流感疫苗(TIV)組合之PapMV VLP經(jīng)鼻內(nèi)免疫的小鼠血液中測(cè)量的IgG和IgG2a滴度的圖，(A) 一次免疫后的總IgG滴度，⑶以14天間隔兩次免疫后的總IgG滴度，以及(C)兩次免疫后測(cè)量的IgG2a滴度。
[0058]圖27示出了描繪如`圖23所述進(jìn)行免疫的小鼠在兩次免疫之后測(cè)量的抗體滴度的圖，(A)支氣管肺泡灌洗(BAL)中的IgA滴度，(B)BAL中的總IgG滴度，和(C)排泄物中的
IgAo
[0059]圖28示出了顯示出如圖26所述進(jìn)行免疫并在第15天用ILD5tl流感WSN/=33病毒攻擊的小鼠重量減輕的圖，跟蹤重量減輕14天的時(shí)間。
[0060]圖29示出了說(shuō)明細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的PapMV VLP與人單核細(xì)胞系(THP-1)中的TLR-2和⑶14相互作用并且該相互作用被對(duì)抗TLR-2和⑶14之抗體(Ac)阻斷的圖。
[0061]圖30示出了顯示出接種與作為佐劑的不同量PapMV VLP組合的來(lái)自流感病毒HlNlA/加利福尼亞/7/2009之10 y gNP的小鼠中IgG2水平的圖(與單獨(dú)的NP(10 u g)相比，*p〈0.05)。
[0062]圖31示出了顯示出用來(lái)自流感病毒HlNlA/加利福尼亞/7/2009之NP單獨(dú)免疫或與作為佐劑的PapMV VLP混合免疫并且用異源亞型株H1N1WSN/33攻擊的小鼠的(A)重量減輕和(B)癥狀的圖。癥狀如圖9所述。
[0063]圖32示出了 PapMV sm VLP(“PapMV sm”)和通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的PapMVVLP( “新PapMV”)對(duì)三價(jià)流感疫苗(TIV)的佐劑作用的比較，(A)對(duì)抗TIV的總IgG的滴度，和⑶對(duì)抗TIV的IgG2的滴度。
[0064]發(fā)明詳述
[0065]本發(fā)明提供了由重組PapMV外殼蛋白和ssRNA制備番木瓜花葉病毒(PaMV)病毒樣顆粒(VLP)的體外方法，其允許以高產(chǎn)率大規(guī)模生產(chǎn)PapMV VLP。
[0066]之前由單體重組PapMV外殼蛋白制備PapMV VLP的方法(如Tremblay等,2006所述，出處同上)允許以VLP形式回收總表達(dá)之PapMV外殼蛋白的約20%。在分離自宿主細(xì)胞的表達(dá)外殼蛋白進(jìn)行超離心之后，僅保留包含VLP的沉淀，并棄去上清液(包含低分子量形式的PapMV外殼蛋白， 包括單體、二聚體、以及多至20-mer的盤(disc))中剩余的約80%的PapMV外殼蛋白。相反地,本文所述的體外方法使用由宿主細(xì)胞中回收的低分子量形式的PapMV外殼蛋白(主要是但不是唯一地，單體)，并且可提供多至約80%的PapMV外殼蛋白轉(zhuǎn)化為VLP。因此，在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致PapMV外殼蛋白的損失降低3至4倍(并因此，每升細(xì)胞培養(yǎng)物得到的VLP產(chǎn)量增加3至4倍)。這樣的提高有利于大規(guī)模制造并且還降低了生產(chǎn)成本。
[0067]此外，根據(jù)本發(fā)明的體外方法消除了對(duì)去污劑的需要，在Tremblay等(2006，出處同上)所述的方法中，需要去污劑以從以VLP形式分離自細(xì)菌細(xì)胞的PapMV外殼蛋白中移除LPS。如本領(lǐng)域已知的，去污劑可難以從蛋白質(zhì)制備物中移除因此殘留量可保留在通過(guò)之前方法制備的最終VLP制備物中。因此，在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法允許制備具有最小批次間變化的VLP。
[0068]雖然多種ssRNA可用于根據(jù)本發(fā)明的方法，但是在某些實(shí)施方案中，使用了合成ssRNA。使用合成序列可例如，允許最終產(chǎn)物的一致性，以及允許操縱序列(如果有必要的話)以使體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的可能性最小化。
[0069]本發(fā)明的某些實(shí)施方案還提供了通過(guò)本文所述方法制備的包含ssRNA的PapMVVLP。如本文所述，某些實(shí)施方案提供了激活位于核內(nèi)體中的toll樣受體7(TLR-7)和/或刺激干擾素a生產(chǎn)的包含ssRNA的PapMV VLP。相反地，通過(guò)在大腸桿菌細(xì)胞中自組裝產(chǎn)生的PapMV VLP似乎更強(qiáng)地靶向位于免疫細(xì)胞表面的TLR-2和⑶14。不受任何具體的理論束縛，認(rèn)為通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備VLP可允許VLP更有效地進(jìn)入核內(nèi)體并與TLR-7相互作用，而在VLP制備中使用去污劑導(dǎo)致了結(jié)構(gòu)改變并且使與細(xì)胞表面處TLR-2的相互作用更顯著。此外，與通過(guò)Tremblay等(2006，出處同上)所述方法制備的PapMV VLP相比，根據(jù)本發(fā)明之方法制備的包含ssRNA之PapMV VLP傾向于是免疫原性更強(qiáng)且是更有效的佐劑。(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例19)。
[0070]本發(fā)明提供的包含ssRNA之PapMV VLP可用作佐劑以增強(qiáng)抗原(包括商用疫苗)的免疫原性，并且單獨(dú)用作先天免疫應(yīng)答的刺激物以提供保護(hù)和/或治療作用。
[0071]定義
[0072]除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的含義。
[0073]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“約”是指給定值的約+/-10%變化。應(yīng)理解，這樣的變化常常包括在本文所提供的任何給定值中。
[0074]當(dāng)在本文中術(shù)語(yǔ)“包含”不與數(shù)量詞一起使用時(shí)可以表示“一”，但其也符合“一或更多”、“至少一”以及“一或多于一”的含義。
[0075]本文中使用的措辭“包含”(及其語(yǔ)法變體，例如“含”)、“具有”(及其語(yǔ)法變體)、“包括”(及其語(yǔ)法變體)或“含有”(及其語(yǔ)法變體)是包括性的或開(kāi)放性的并且不排除另外的、未引用的元素或方法步驟。
[0076]本文中使用的“天然的”(如用于指對(duì)象)是指對(duì)象可在自然中發(fā)現(xiàn)的事實(shí)。例如，可分離自天然來(lái)源并且未在實(shí)驗(yàn)室中被人有意地改造的生物體或存在于生物體中的多肽或多核苷酸序列是天然的。
[0077]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“減弱”、“抑制”、“預(yù)防”及其語(yǔ)法變體是指給定參數(shù)或事件的可測(cè)量降低。
[0078]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指在施用于對(duì)象時(shí)能夠產(chǎn)生有益免疫應(yīng)答的組合物。
[0079]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“病原體”是指能夠在宿主中引起疾病或病癥的生物體，包括但不限于細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌和寄生動(dòng)物。
[0080]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”或“患者”是指有治療需要的動(dòng)物。
[0081]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”是指人和非人動(dòng)物二者，包括但不限于哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)和魚(yú)，并且包括家畜、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、動(dòng)物園動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物和野生動(dòng)物，例如牛、豬、馬、山羊、綿羊或其他有蹄動(dòng)物、狗、貓、雞、鴨、非人靈長(zhǎng)類、豚鼠、兔、雪貂、大鼠、倉(cāng)鼠和小鼠。
[0082]VLP與一種或更多種其他治療劑“組合”施用旨在包括同時(shí)(同步)施用和連續(xù)施用。連續(xù)施用旨在包括治療劑和VLP以多種順序施用于對(duì)象，其中治療劑和VLP施用分隔開(kāi)限定的時(shí)間段，其可以短(例如，幾分鐘左右)或長(zhǎng)(例如，幾天或幾周左右)。
[0083]在本文中可交換使用的術(shù)語(yǔ)“免疫刺激(immune stimulation) ”和“免疫性刺激(immunostimulation) ”是指與動(dòng)物病原體或疾病無(wú)關(guān)的分子通過(guò)刺激免疫系統(tǒng)和/或改善動(dòng)物的免疫系統(tǒng)響應(yīng)于感染或疾病的能力來(lái)提供對(duì)抗病原體感染或?qū)辜膊〉谋Ｗo(hù)。免疫刺激可具有預(yù)防作用、治療作用或其組合。
[0084]本文中關(guān)于核酸或氨基酸序列使用的術(shù)語(yǔ)“基本相同”是指，當(dāng)最佳比對(duì)(例如，使用下述方法)時(shí)，核酸或氨基酸序列與限定的第二核酸或氨基酸序列(或“參考序列”)共有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性?！盎就恍浴笨捎糜谥感蛄?例如全長(zhǎng)序列、功能性結(jié)構(gòu)域、編碼序列和/或調(diào)節(jié)序列、啟動(dòng)子和基因組序列)的多種類型和長(zhǎng)度。兩條氨基酸或核酸序列之間的百分比同一性可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)中的多種方式來(lái)確定，例如，使用公開(kāi)可得的計(jì)算機(jī)軟件，例如Smith Waterman Alignment (Smith, T.F.和M.S.Waterman(1981) J Mol Bioll47:195-7) ;“BestFit” (Smith 和 Waterman, Advancesin Applied Mathematics,482-489(1981)),合并到 GeneMatcher Plus?, Schwarz 和Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence 和 Structure, Dayhof, M.0.編，第 353-358頁(yè)中;BLAST 程序(基本局部比對(duì)檢索工具(Altschul, S.F.，ff.Gish, et al.(1990) J MolBiol215:403-10)及其變體，包括 BLAST-2、BLAST-P, BLAST-N、BLAST-X, WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAI^PMegalign(DNASTAR)軟件。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定用于測(cè)量比對(duì)的合適參數(shù)，包括在待比較序列長(zhǎng)度上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的算法。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于氨基酸序列，比較序列的長(zhǎng)度為至少10個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，實(shí)際長(zhǎng)度取決于待比較序列的總長(zhǎng)度，并且可以是至少20個(gè)、至少30個(gè)、至少40個(gè)、至少50個(gè)、至少60個(gè)、至少至少70個(gè)、至少80個(gè)、至少90個(gè)、至少100個(gè)、至少110個(gè)、至少120個(gè)、至少130個(gè)、至少140個(gè)、至少150個(gè)或至少200個(gè)氨基酸，或者其可以是全長(zhǎng)的氨基酸序列。對(duì)于核酸，比較序列的長(zhǎng)度一般是至少25個(gè)核苷酸,但可以是至少50個(gè)、至少100個(gè)、至少125個(gè)、至少150個(gè)、至少200個(gè)、至少250個(gè)、至少300個(gè)、至少350個(gè)、至少400個(gè)、至少450個(gè)、至少500個(gè)、至少550個(gè)或至少600個(gè)核苷酸，或者其可以是全長(zhǎng)的核苷酸序列。
[0085]術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于”或“相當(dāng)于”指核酸序列與參考核酸序列的全部或一部分相同。相
比之下，術(shù)語(yǔ)“與......互補(bǔ)”在本文中用于指核酸序列與參考核酸序列的互補(bǔ)鏈的全部
或一部分相同。為了說(shuō)明，核酸序列“TATAC”對(duì)應(yīng)于參考序列“TATAC”并且與參考序列“GTATA”互補(bǔ)。在本文中術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于”和“相當(dāng)于”當(dāng)用于使DNA和RNA序列互相參考時(shí)指DNA序列與參考RNA序列的全部或一部分相同(或者反之亦然)，但是，DNA序列在對(duì)應(yīng)于RNA序列中尿嘧啶(U)殘基的位置處包含胸腺嘧啶(T)殘基。因此，為了說(shuō)明，DNA序列“TATAC”對(duì)應(yīng)于RNA參考序列“UAUAC”。
[0086]考慮了本文所討論的任何實(shí)施方案可關(guān)于本發(fā)明的任何方法或組合物實(shí)施，并且反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物和試劑盒可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
[0087]用于制備病毒樣顆粒的方法
[0088]根據(jù)本發(fā)明的方法允許在體外組裝重組外殼蛋白和ssRNA (本文中稱為ssRNA模板或“SRT”)以形成VLP。
[0089]雖然通篇引用PapMV外殼蛋白描述了所述方法，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易地理解，所述方法同樣適用于其他馬鈴薯X病毒外殼(或衣殼)蛋白。許多馬鈴薯X病毒的外殼蛋白的序列和基因組在本領(lǐng)域是已知的并且可得自于公共數(shù)據(jù)庫(kù)，例如GenBank。
[0090]圖3至6提供了本發(fā)明方法的一些示例性實(shí)施方案。簡(jiǎn)言之，所述方法包括在中性pH和約2°C至約37°C的溫度下，將蛋白質(zhì):RNA比按重量計(jì)在約1:1與約50:1之間的重組外殼蛋白與SRT組合足以允許VLP形成的時(shí)間。隨后，用核酸酶處理VLP以從移除從VLP中突出的任何RNA，然后經(jīng)歷一步或更多步純化步驟以提供最終的重組VLP (例如，參見(jiàn)圖3)。所述方法的某些實(shí)施方案還包括從表達(dá)重組蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中分離重組蛋白質(zhì)(例如，參見(jiàn)圖4)和/或由質(zhì)粒DNA制備SRT (例如，參見(jiàn)圖5)。
[0091]根據(jù)本發(fā)明的方法可以擴(kuò)大規(guī)模，并因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了適合于以高產(chǎn)率生產(chǎn)大量VLP的大規(guī)模方法。
[0092]PapMV外殼蛋白[0093]用于制備VLP的PapMV外殼蛋白可以是完整的PapMV外殼蛋白或其一部分，或者其可以是野生型PaPMV外殼蛋白的經(jīng)遺傳修飾形式，例如，包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸缺失、插入、替換等，前提是所述外殼蛋白保留自組裝成VLP的能力。野生型PapMV外殼(或衣殼)蛋白的氨基酸序列在本領(lǐng)域中是已知的(參見(jiàn)Sit等，1989，J.Gen.Virol.,70 =2325-2331,和GenBank登記號(hào)NP_044334.1)，并且在本文中提供為SEQ ID N0:1(參見(jiàn)圖1A)。已知該序列的變體，例如，Noa-Carrazana&SiIva-Rosales (2001, Plant Science, 85:558)所述的PapMV的Mexican分離物之外殼蛋白的序列與SEQ ID NO:1具有88%的同一丨丨生并且可得自于GenBank。PapMV外殼蛋白的核苷酸序列在本領(lǐng)域中也是已知的(參見(jiàn)，Sit等，ibid.,和GenBank登記號(hào)NC_001748 (5889至6536位核苷酸))并且在本文中提供為SEQ ID NO:2(參見(jiàn)圖1B)。
[0094]如上所述，PapMV外殼蛋白的氨基酸序列不需要精確對(duì)應(yīng)于親本(野生型)序列，即，其可以是“變體序列”。例如，PapMV外殼蛋白可通過(guò)一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的替換、插入或缺失來(lái)突變，使得該位點(diǎn)的殘基不對(duì)應(yīng)于親本(參考)序列。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，這樣的突變將不是廣泛的，并且不會(huì)大大影響重組PapMV CP組裝成VLP的能力。
[0095]因此，本發(fā)明還考慮了使用保留多聚和組裝成VLP之能力的野生型外殼蛋白的片段(即，“功能性”片段)制備的重組PapMV CP用于所述方法。例如，片段可以包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸從蛋白質(zhì)的N-末端、C-末端或內(nèi)部或其組合缺失。一般來(lái)說(shuō)，功能性片段的長(zhǎng)度為至少100個(gè)氨基酸，例如，至少150個(gè)氨基酸、至少160個(gè)氨基酸、至少170個(gè)氨基酸、至少180個(gè)氨基酸或至少190個(gè)氨基酸。在野生型蛋白的N-末端處進(jìn)行的缺失應(yīng)一般缺失少于13個(gè)氨基酸以保留蛋白質(zhì)自組裝的能力。
[0096]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，當(dāng)重組外殼蛋白包含變體序列時(shí)，該變體序列與參考序列具有至少約70%的同一性，例如與參考序列有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約98%的同一性。在某些實(shí)施方案中，參考氨基酸序列是SEQ ID NO:`1 (圖1A)。
[0097]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，用于制備重組PapMV VLP的PapMV外殼蛋白是PapMV外殼蛋白的經(jīng)遺傳修飾(即變體)形式。在一些實(shí)施方案中，對(duì)PapMV外殼蛋白進(jìn)行遺傳修飾以從蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端缺失氨基酸和/或包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換。在一些實(shí)施方案中，對(duì)PapMV外殼蛋白進(jìn)行遺傳修飾以從蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端缺失約I至約10個(gè)氨基酸，例如約I至約5個(gè)氨基酸。
[0098]在某些實(shí)施方案中，PapMV外殼蛋白已被遺傳修飾以移除接近野生型蛋白質(zhì)N-末端存在的(即，在SEQ ID NO:1的第I位和6位)兩個(gè)甲硫氨酸密碼子中的一個(gè)，并且可以起始翻譯。翻譯起始密碼子中的一個(gè)的移除使得產(chǎn)生同源蛋白質(zhì)群體?？衫缤ㄟ^(guò)替換構(gòu)成該密碼子的一個(gè)或更多個(gè)核苷酸使得該密碼子編碼除甲硫氨酸以外的氨基酸或者變?yōu)闊o(wú)義密碼子來(lái)移除所選甲硫氨酸密碼子。或者，可缺失密碼子的全部或一部分，或包含所選密碼子的編碼蛋白質(zhì)之核酸的5’區(qū)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，對(duì)PapMV外殼蛋白進(jìn)行遺傳修飾以從蛋白質(zhì)的N-末端缺失I至5個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的PapMV外殼蛋白具有與SEQ ID NO:3(圖2A)基本相同的氨基酸序列，并且可任選地包含多至6個(gè)組氨酸殘基的組氨酸標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，對(duì)PapMV外殼蛋白進(jìn)行遺傳修飾以在C-末端包括額外的氨基酸(例如，約I至約8個(gè)氨基酸)，這是由于在編碼核苷酸序列中包含進(jìn)一個(gè)或更多個(gè)特異性限制酶位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，PapMV外殼蛋白具有與SEQID NO:4(圖2B)基本相同的氨基酸序列(有或沒(méi)有組氨酸標(biāo)簽)。
[0099]當(dāng)使用包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換的變體PapMV外殼蛋白序列制備重組PapMVVLP時(shí)，這些可以是“保守”替換或“非保守”替換。保守替換涉及用具有相似側(cè)鏈性質(zhì)的另一個(gè)殘基替換一個(gè)氨基酸殘基。如本領(lǐng)域中已知的，可以根據(jù)其側(cè)鏈的物理化學(xué)性質(zhì)將二十種天然氨基酸分組。合適的組包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸(疏水側(cè)鏈)；甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺(極性，不帶電側(cè)鏈)；天冬氨酸和谷氨酸(酸性側(cè)鏈)以及賴氨酸、精氨酸和組氨酸(堿性側(cè)鏈)。另一組氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳族側(cè)鏈)。保守替換涉及用來(lái)自同組的另一氨基酸替換一個(gè)氨基酸。非保守替換涉及用具有不同側(cè)鏈性質(zhì)的另一個(gè)殘基替換一個(gè)氨基酸殘基，例如用中性或堿性殘基替換酸性殘基，用酸性或堿性殘基替換中性殘基，用親水性殘基替換疏水性殘基等等。
[0100]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述變體序列包含一個(gè)或更多個(gè)非保守替換。將一個(gè)氨基酸替換為具有不同性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸可以改進(jìn)所述外殼蛋白的性質(zhì)。例如，如之前所述，外殼蛋白第128位殘基的突變促進(jìn)蛋白質(zhì)組裝成VLP (Tremblay等.2006,FEBSJ.，273:14-25)。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述外殼蛋白包含外殼蛋白第128位殘基處的突變，其中該位的谷氨酸殘基替換為中性殘基。在一些實(shí)施方案中，第128位處的谷氨酸殘基替換為丙氨酸殘基。
[0101]已表明用另一個(gè)疏水性殘基替換野生型PapMV外殼蛋白的F13位處的苯丙氨酸殘基導(dǎo)致與使用野生型蛋白質(zhì)序列相比，表達(dá)重組蛋白質(zhì)時(shí)形成較高比例的VLP (Lalibert6_Gagn6 等，2008，F(xiàn)EBSJ.，275:1474-1484)。在本發(fā)明的上下文中，認(rèn)為下述氨基酸殘基是適合于在F13位替換的疏水性殘基:Ile、Trp、Leu、Val、Met和Tyr。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述外殼蛋白包含在13位用Ile、Trp、Leu、Val、Met或Tyr替換Phe。在一些實(shí)施方案中，所述外殼蛋白包含在13位用Leu或Tyr替換Phe。
[0102]在某些實(shí)施方案中，所述外殼蛋白F13位的突變可以與E128位的突變、N-末端的缺失或其組合相組合。`
[0103]同樣地，用于制備重組PapMV外殼蛋白的編碼PapMV外殼蛋白的核酸序列不需要精確對(duì)應(yīng)于親本參考序列，而是可通過(guò)遺傳密碼的簡(jiǎn)并性不同，和/或使得其編碼如上所述的變體氨基酸序列。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，編碼變體外殼蛋白的核酸序列與參考序列具有約70%的同一性，例如，與參考序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%或至少約90%的同一性。在某些實(shí)施方案中，參考核酸序列是SEQ ID N0:2(圖1B)。
[0104]在某些實(shí)施方案中，外殼蛋白是包含與一種或更多種抗原肽融合的PapMV外殼蛋白或其變體的融合蛋白。所述肽可在C端、N端或內(nèi)部位置處融合，前提是外殼蛋白仍可組裝到VLP中(參見(jiàn)，例如，國(guó)際專利申請(qǐng)N0.PCT/CA2007/002069(W02008/058396)、PCT/CA2007/001904 (W02008/058369), PCT/CA2008/000154 (W02008/089569)和 PCT/CA2009/00636 (W02010/012069)) ?如以下更詳細(xì)描述的，抗原肽可來(lái)源于病毒、細(xì)菌、真菌或其他病原體，或者其可以是變應(yīng)原(allergen)或腫瘤相關(guān)抗原。
[0105]合適的抗原肽的大小可不同，但是一般來(lái)說(shuō)長(zhǎng)度在約3個(gè)氨基酸與約50個(gè)氨基酸之間，例如長(zhǎng)度在約3個(gè)與約40個(gè)氨基酸之間。在一些實(shí)施方案中，抗原肽的長(zhǎng)度是至少5個(gè)、至少6個(gè)或至少7個(gè)氨基酸，并且長(zhǎng)度多至約50、40、35、30、25或20個(gè)氨基酸。
[0106]制備重組外殼蛋白
[0107]用于制備PapMV VLP的重組PapMV外殼蛋白可容易地由技術(shù)人員通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)遺傳工程技術(shù)來(lái)制備。遺傳改造蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域所公知的(參見(jiàn)，例如Ausubel等(1994&更新)Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, New York),野生型PapMV外殼蛋白的序列也是如此(參見(jiàn)，例如，SEQ ID NO:1和2)。
[0108]例如，編碼野生型蛋白質(zhì)的核酸序列的分離和克隆可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)，例如，Ausubel等，出處同上)。例如，核酸序列可經(jīng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提取RNA，然后由RNA模板合成cDNA(例如，通過(guò)RT-PCR)從PapMV中直接得到。PapMV可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由顯示出花葉癥狀的感染植物葉片中純化。
[0109]然后將編碼外殼蛋白的核酸序列直接或在一步或更多步亞克隆步驟之后插入到合適的表達(dá)載體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所使用的確切載體對(duì)于本發(fā)明不是決定性的。合適載體的實(shí)例包括但不限于，質(zhì)粒、曬菌粒(phagemid)、粘粒、曬菌體、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或DNA病毒。然后可如之前和以下所述來(lái)表達(dá)和純化外殼蛋白。一般來(lái)說(shuō)，選擇載體和對(duì)應(yīng)的宿主細(xì)胞使得重組外殼蛋白在細(xì)胞中表達(dá)為低分子量種類而不是VLP。在這一點(diǎn)上，適當(dāng)載體和宿主細(xì)胞組合的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
[0110]或者，編碼外殼蛋白的核酸序列可通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)體外定點(diǎn)誘變技術(shù)進(jìn)一步改造成引入一個(gè)或更多個(gè)突變，如以下所述的那些。突變可通過(guò)構(gòu)成編碼序列的適當(dāng)核苷酸的一個(gè)或更多個(gè)的缺失、插入、替換、倒置或其組合引入。這可例如通過(guò)基于PCR的技術(shù)實(shí)現(xiàn)，對(duì)于所述基于PCR的技術(shù)，設(shè)計(jì)引入一個(gè)或更多個(gè)核苷酸錯(cuò)配、插入或缺失的引物。突變的存在可通過(guò)多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)驗(yàn)證，例如，通過(guò)限制分析或通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證。
[0111]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，編碼外殼蛋白的DNA可以以多種方式變化而不影響所編碼蛋白質(zhì)的活性。例如，DNA序列中的變化可用于根據(jù)表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中的密碼子偏好性來(lái)優(yōu)化，或者可包括有助于表達(dá)的其他序列改變。
[0112]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解,表達(dá)載體還可包含調(diào)節(jié)元件,例如有效轉(zhuǎn)錄編碼衣殼蛋白或融合蛋白的DNA序列所需的轉(zhuǎn)錄元件。可合并到載體中的調(diào)節(jié)元件的實(shí)例包括但不限于，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子和多腺苷酸化信號(hào)。因此，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了包含與編碼經(jīng)遺傳改造之外殼蛋白的核酸序列可操作性連接的調(diào)節(jié)元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，合適調(diào)節(jié)元件的選擇取決于為表達(dá)經(jīng)遺傳改造之外殼蛋白所選的宿主細(xì)胞，并且這樣的調(diào)節(jié)序列可來(lái)源于多種來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、病毒、哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)基因。
[0113]在本發(fā)明的上下文中，表達(dá)載體可另外地包含有助于純化所表達(dá)蛋白質(zhì)的異源核酸序列。這樣的異源核酸序列的實(shí)例包括但不限于，親和標(biāo)簽(例如，金屬親和標(biāo)簽)、組氨酸標(biāo)簽、親和素/鏈霉親和素編碼序列、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)編碼序列和生物素編碼序列。由異源核酸序列編碼的氨基酸可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法在使用之前從所表達(dá)的外殼蛋白中移除?；蛘撸绻麑?duì)應(yīng)于異源核酸序列表達(dá)的氨基酸不干擾其到VLP的后續(xù)組裝，則其可保留在外殼蛋白上。
[0114]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，外殼蛋白表達(dá)為組氨酸標(biāo)簽化蛋白。組氨酸標(biāo)簽可位于外殼蛋白的羧基端或氨基端。
[0115]可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法之一將表達(dá)載體引入到合適的宿主細(xì)胞或組織中。這樣的方法在Ausubel等(出處同上)中進(jìn)行了一般性的描述，并且包括例如，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔和用重組病毒載體感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，用于表達(dá)外殼蛋白的適當(dāng)宿主細(xì)胞的選擇取決于所選擇的載體。宿主細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所使用的確切宿主細(xì)胞對(duì)于本發(fā)明不是決定性的。外殼蛋白可在原核宿主(例如，大腸桿菌、殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)或枯草桿菌(B.subtilis))中或在真核宿主(例如，酵母屬(Saccharomyces)或畢赤酵母屬(Pichia)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，C0S、NIH3T3、CH0、BHK，293或HeLa細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞或植物細(xì)胞)中表達(dá)。
[0116]在某些實(shí)施方案中，外殼蛋白在大腸桿菌或巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)中表達(dá)。
[0117]如果期望，則外殼蛋白可通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從宿主細(xì)胞中純化(參見(jiàn)，例如，Current Protocols in Protein Science, Coligan, J.E.等編,ffiley&Sons, NewYork, NY)并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)肽測(cè)序技術(shù)使用完整蛋白質(zhì)或其蛋白水解片段進(jìn)行測(cè)序以確定蛋白質(zhì)的身份。
[0118]ssRNA 模板
[0119]用于根據(jù)本發(fā)明的方法的ssRNA模板可以是例如，合成ssRNA、天然ssRNA、經(jīng)修飾的天然ssRNA、天然或合成ssRNA的片段等。
[0120]通常，用于體外組裝的ssRNA的長(zhǎng)度是至少約50個(gè)核苷酸，并且長(zhǎng)度多至約5000個(gè)核苷酸，例如長(zhǎng)度為至少約100、250、300、350、400、450或500個(gè)核苷酸并且長(zhǎng)度多至約5000,4500,4000或3500個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，用于體外組裝的ssRNA的長(zhǎng)度在約500與約3000個(gè)核苷酸 之間，例如長(zhǎng)度在約1000與約3000個(gè)核苷酸之間，或長(zhǎng)度在約1200與約2800個(gè)核苷酸之間。
[0121 ] 在某些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)ssRNA模板使得其不包含任何ATG (AUG)起始密碼子以使體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列的機(jī)會(huì)最小化。但是，不排除使用包含ATG起始密碼子的ssRNA模板，原因是如果ssRNA未加帽，則體內(nèi)轉(zhuǎn)錄仍然不太可能。
[0122]在某些實(shí)施方案中，用于體外組裝的ssRNA包含來(lái)自天然PapMV RNA5’末端的約38至約100個(gè)核苷酸，其包含至少部分假定包裝信號(hào)。不包含假定包裝信號(hào)的ssRNA模板也可用于某些實(shí)施方案。圖7中提供了基于可用于產(chǎn)生ssRNA模板的PapMV基因組的序列的非限制性實(shí)例[SEQ ID NO:5和6]。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中也考慮了用于產(chǎn)生ssRNA模板的這些序列的片段，以及多至5000個(gè)核苷酸的延長(zhǎng)形式。在某些實(shí)施方案中，用于體外組裝的ssRNA包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:5核苷酸17至54的序列。在某些實(shí)施方案中，用于體外組裝的ssRNA包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:5核苷酸17至63的序列。
[0123]還已知富含A和C核苷酸的ssRNA序列與PapMV外殼蛋白組裝(Sit，等，1994，Virology，-199:238-242)。因此，在某些實(shí)施方案中，ssRNA是富含A和/或C的序列，包括聚A和聚C ssRNA模板。在一些實(shí)施方案中，還考慮了基于其他馬鈴薯X病毒(例如馬鈴薯病毒X (PVX)、三葉草黃花葉病毒(CYMV)、馬鈴薯黃斑花葉病毒(PAMV)和錦葵花葉病毒(MaMV))之序列的全部或一部分的ssRNA模板用于所述方法。
[0124]制備ssRNA模板
[0125]可通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離和/或制備ssRNA模板(參見(jiàn)，例如，Ausubel等(1994& 更新)Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons-NewYork)。
[0126]例如，對(duì)于合成ssRNA，可將編碼ssRNA模板的序列插入到可用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主細(xì)胞的合適質(zhì)粒中。在適當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞之后，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒DNA并通過(guò)限制酶消化進(jìn)行線性化(linearized)。
[0127]然后使用合適的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄ssRNA并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0128]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所使用的確切質(zhì)粒對(duì)于本發(fā)明不是決定性的，前提是其能夠?qū)崿F(xiàn)其期望目的。同樣地，所使用的具體宿主細(xì)胞也不是決定性的，前提是其能夠使所選質(zhì)粒擴(kuò)增。
[0129]也可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)化學(xué)方法合成較短的ssRNA模板。多種商業(yè)RNA合成服務(wù)也是可獲得的。
[0130]可在使用之前任選地對(duì)最終的ssRNA模板進(jìn)行滅菌。[0131]體外組裝VLP
[0132]使用所制備的重組外殼蛋白和ssRNA模板在體外進(jìn)行組裝反應(yīng)。雖然在組裝之前通常對(duì)重組衣殼蛋白和ssRNA模板進(jìn)行純化，但是在一些實(shí)施方案中也考慮了使用粗制備物或經(jīng)部分純化的外殼蛋白和/或ssRNA模板。
[0133]一般來(lái)說(shuō)，在組裝反應(yīng)中采用具有相同氨基酸序列的重組外殼蛋白的制備物，使得最終的VLP在組裝后包含相同的外殼蛋白亞基。在一些實(shí)施方案中也考慮了使用包含具有不同氨基酸序列的多種重組外殼蛋白的制備物，使得最終的VLP在組裝后包含其外殼蛋白亞基的變化。
[0134]用于組裝反應(yīng)的重組外殼蛋白以低分子量種類的形式為主，所述低分子量種類主要由單體和二聚體組成，但是也包括小于20-mer的其他低分子量種類。在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)制備物所含外殼蛋白的至少約70%以低分子量種類存在時(shí)，則認(rèn)為重組外殼蛋白制備物以低分子量種類的形式為主。在某些實(shí)施方案中，用于組裝反應(yīng)的重組外殼蛋白制備物中至少約75%、80%、85%、90%或95%的外殼蛋白以低分子量種類存在。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，重組外殼蛋白制備物由至少約50 %的單體和二聚體構(gòu)成，例如由約60 %、70%、75%或80%的單體和二聚體構(gòu)成。
[0135]組裝反應(yīng)在中性水溶液中進(jìn)行并且不需要任何其他的特定離子。通常，使用緩沖溶液。pH應(yīng)在約pH6.0至約pH9.0的范圍中，例如，在約pH6.5與約pH9.0之間，在約pH7.0至約pH9.0之間，在約pH6.0至約pH8.5之間，在約pH6.5至約pH8.5之間或在約pH7.0至約pH8.5之間。
[0136]緩沖液的性質(zhì)對(duì)于本發(fā)明不是決定性的，前提是其可將pH維持在上述范圍中。用于上述pH范圍的緩沖液的實(shí)例包括但不限于，Tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液等。
[0137]高濃度氯化鈉(NaCl)的存在可影響PapMV外殼蛋白的組裝。因此，在某些實(shí)施方案中，組裝反應(yīng)在基本不含NaCl的溶液中進(jìn)行，例如在包含小于0.05M NaCl的溶液中進(jìn)行。
[0138]組裝反應(yīng)可使用多種蛋白質(zhì):ssRNA比進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，可使用按重量計(jì)在約1:1與約50:1之間(例如按重量計(jì)在至少約1:1、2:1、3:1、4:1或5:1并且不多于按重量計(jì)約50:1,40:1或30:1)的蛋白質(zhì):ssRNA比。在某些實(shí)施方案中，用于組裝反應(yīng)的蛋白質(zhì):ssRNA比按重量計(jì)在約5:1與約40:1之間或約10:1與約40:1之間。
[0139]組裝反應(yīng)可在約2°C至約37°C之間的不同溫度下進(jìn)行，例如，至少約:TC、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C或10°C與約37°C、35°C、30°C或28°C之間。在某些實(shí)施方案中，組裝反應(yīng)在約15°C與約37°C之間的溫度下進(jìn)行，例如，約20°C與約37°C之間或約22°C至約
37。。。
[0140]使組裝反應(yīng)進(jìn)行足夠的時(shí)間以使得VLP形成。時(shí)間根據(jù)所采用重組外殼蛋白和ssRNA的濃度以及反應(yīng)的溫度而不同，并且可由技術(shù)人員容易地確定。通常，采用至少約60分鐘的時(shí)間。如果需要，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如動(dòng)態(tài)光散射或電子顯微鏡來(lái)監(jiān)測(cè)外殼蛋白至VLP的組裝。
[0141]在使組裝反應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間后，使VLP經(jīng)歷“平端化(blunting)”步驟以移除從顆粒中突出(protruding)的RNA。平端化反應(yīng)使用能夠切割RNA的核酸酶實(shí)現(xiàn)。多種核酸酶是可商購(gòu)的并且其使用條件在本領(lǐng)域中是已知的。
[0142]組裝后就可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如透析、滲濾(diafiItration)或色譜)從其他反應(yīng)成分中純化VLP。
[0143]在純化步驟之前或之后，可任選地通過(guò)例如超離心或滲濾濃縮(或富集)VLP制備物。如果期望，可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如電子顯微鏡觀察VLP。重組VLP的特征
[0144]組裝后，PapMV VLP各包含長(zhǎng)螺旋狀陣列的外殼蛋白亞基。野生型病毒包含超過(guò)1200個(gè)外殼蛋白亞基并且長(zhǎng)度為約500nm。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的重組PapMV VLP可具有類似的大小，或者可比野生型病毒更短或更長(zhǎng)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，重組PapMV VLP包含至少40個(gè)外殼蛋白亞基。在一些實(shí)施方案中，重組PapMV VLP可包含約40至約1600個(gè)外殼蛋白亞基，但是，也考慮`了包含更多數(shù)目外殼蛋白的VLP。重組PapMV VLP通常寬約10至20nm并且長(zhǎng)度在約40nm與幾百nm之間。在某些實(shí)施方案中，重組PapMVVLP的制備物的平均長(zhǎng)度在約40nm與`約600nm之間，例如，在約40nm與約500nm之間，在約40nm與約400nm之間或在約40nm與約300nm之間。
[0145]重組PapMV VLP是穩(wěn)定的并且可容易地儲(chǔ)存在室溫下。當(dāng)在更低溫度下(例如，在約2°C與約8°C之間)儲(chǔ)存時(shí)，重組PapMV VLP在至少幾個(gè)月并且多至幾年中是穩(wěn)定的。
[0146]重組VLP的方法和用途
[0147]本發(fā)明提供了重組PapMV VLP的多種應(yīng)用和用途。例如，重組PapMV VLP可用作佐劑以增強(qiáng)抗原的免疫原性，或者當(dāng)與抗原融合時(shí)用作疫苗。在某些實(shí)施方案中，PapMV VLP可單獨(dú)用于在對(duì)象中刺激先天免疫應(yīng)答，并從而治療或預(yù)防感染。因此，用于制備藥物(包括疫苗和/或藥物組合物)的重組PapMV VLP的用途也在本發(fā)明的范圍中。
[0148]可用根據(jù)本發(fā)明的疫苗治療或預(yù)防的疾病和病癥的實(shí)例包括，例如傳染病(例如病毒或細(xì)菌疾病)、變態(tài)反應(yīng)、免疫疾病和癌癥。
[0149]適合于與PapMV VLP—起使用或與重組PapMV外殼蛋白融合的抗原可以是與多種疾病或病癥相關(guān)的抗原。多種這樣的抗原在本領(lǐng)域中是已知的。基于例如VLP的期望最終用途(例如，其待對(duì)抗的疾病或病癥和/或其待施用于的動(dòng)物)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地選擇適當(dāng)?shù)目乖?br> [0150]例如，抗原可來(lái)源于能夠在動(dòng)物中引起疾病或病癥(例如癌癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)或自身免疫病)的物質(zhì)(agent)，或者其可以是適用于誘導(dǎo)對(duì)抗藥物、激素或毒素相關(guān)疾病或病癥的免疫應(yīng)答的抗原。抗原可來(lái)源于本領(lǐng)域已知的病原體，例如，細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌、寄生動(dòng)物或傳染性顆粒(例如朊病毒)，或者其可以是腫瘤相關(guān)抗原、自身抗原或變應(yīng)原。
[0151]在某些實(shí)施方案中，PapMV VLP與可商購(gòu)疫苗組合使用以增強(qiáng)疫苗的效力。
[0152]可用的抗原包括病毒抗原，例如來(lái)源于以下家族的成員:腺病毒科(Adenoviradae);沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如，Ippy 病毒和 Lassa 病毒)；雙 RNA 病毒科(Birnaviridae);布尼亞病毒科(Bunyaviridae);杯狀病毒科(Caliciviridae);冠狀病毒科(Coronaviridae);絲狀病毒科(Filoviridae);黃病毒科(Flaviviridae)(例如，黃熱病病毒、登革熱病毒和丙型肝炎病毒)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviradae)(例如，乙型肝炎病毒)；皰疫病毒科(Herpesviradae)(例如，人單純皰疫病毒I);正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，甲型、乙型和丙型流感病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，腿腺炎病毒、麻疫病毒和呼吸道合胞病毒)^hRNA病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒和甲型肝炎病毒)；痘病毒科(Poxviridae);呼腸孤病毒科(Reoviridae);逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviradae)(例如，BLV-HTLV逆轉(zhuǎn)錄病毒、HIV_1、HIV_2、牛免疫缺陷病毒和貓免疫缺陷病毒)；彈狀病毒科(Rhabodoviridae)(例如，狂犬病病毒)和披膜病毒科(Togaviridae)(例如，風(fēng)疹病毒)。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組PapMV CP包含來(lái)源于主要病毒病原體的一種或更多種抗原性肽，所述病毒病原體例如登革病毒、多種肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、多種流感病毒、西尼羅病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、狂犬病病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、ElB病毒(Epstein Barr virus, EBV)、多瘤病毒或SARS冠狀病毒。
[0153]可用的抗原也可來(lái)源于非常規(guī)病毒或病毒樣物質(zhì)，例如庫(kù)魯病、克雅二氏癥(CJD)、癢病(scrapie)、貂傳染性腦病和慢性消耗性疾病的致病物質(zhì)；或者來(lái)源于如本領(lǐng)域已知的傳染性蛋白性顆粒，例如與瘋牛病有關(guān)的朊病毒。
[0154]可用的細(xì)菌抗原包括例如，表面細(xì)菌抗原成分(superficial bacterialantigenic component)、蛋白性莢膜抗原或鞭毛成分，并且可得自于或來(lái)源于作為疾病原因的已知致病物質(zhì)，所述疾病例如白喉、百日咳、破傷風(fēng)、肺結(jié)核、細(xì)菌性肺炎、真菌性肺炎、霍亂、傷寒、瘟疫、志賀氏菌病、沙門氏菌病、軍團(tuán)病(Legionnaire’s disease)、萊姆病、麻風(fēng)病、痕疾、鉤蟲(chóng)病、盤尾絲蟲(chóng)病、血吸蟲(chóng)病、椎體蟲(chóng)病(trypamasomialsis)、利什曼病、賈弟蟲(chóng)病(giardia)、阿米巴病、絲蟲(chóng)病、包柔氏螺旋體病(borrelia)和毛線蟲(chóng)病。
[0155]可用的腫瘤相關(guān)抗原包括，例如，Her2(乳腺癌)；OT2(成神經(jīng)細(xì)胞瘤)；EGF_R (惡性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)；CEA(甲狀腺髓樣癌)；CD52(白血病)；人黑素瘤蛋白質(zhì)gplOO ;人黑素瘤蛋白質(zhì)melan-A/MART-1 ；NA17-A nt蛋白；p53蛋白；多種MAGE (黑素瘤相關(guān)抗原E)，包括 MAGE1、MAGE2、MAGE3 (HLA-A1 肽)和 MAGE4 ;多種酪氨酸酶(HLA-A2 肽);突變 ras ；p97黑素瘤抗原；與晚期癌癥相關(guān)的Ras肽和p53肽；與宮頸癌相關(guān)的HPV16/18和E6/E7抗原；與乳腺癌相關(guān)的MUCl-KLH抗原；與結(jié)直腸癌相關(guān)的CEA(癌胚抗原)；與肺癌相關(guān)的DKK-1 (Dickkopf-1蛋白)和與前列腺癌相關(guān)的PSA抗原。
`[0156]可用的變應(yīng)原包括，例如，來(lái)源于花粉、動(dòng)物皮屑、草、霉、灰塵、抗生素、針刺昆蟲(chóng)毒液的變應(yīng)原以及多種環(huán)境、藥物和食物變應(yīng)原。常見(jiàn)的樹(shù)變應(yīng)原包括來(lái)自棉白楊(cottonwood)、楊樹(shù)(popular)、白臘木(ash)、樺樹(shù)(birch)、楓樹(shù)、橡樹(shù)、榆樹(shù)(elm)、山核桃(hickory)和美洲山核桃(pecan)樹(shù)的花粉。常見(jiàn)的植物變應(yīng)原包括來(lái)自黑麥、豚草、英國(guó)車前草(English plantain)、酸模(sorrel-dock)和藜(pigweed)的變應(yīng)原，并且植物接觸變應(yīng)原包括來(lái)自毒櫟、毒葉藤和蕁麻的變應(yīng)原。常見(jiàn)的草變應(yīng)原包括梯牧草(Timothy)、約翰遜草(Johnson)、百慕大草(Bermuda)、牛毛草和蘭草的那些變應(yīng)原。常見(jiàn)的變應(yīng)原也可得自于霉或真菌，例如交鏈格孢屬(Alternaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、著色芽生菌屬(Hormodendrum)、曲霉屬(Aspergillus)、小多抱菌屬(Micropolyspora)、毛霉菌屬(Mucor)和嗜熱放線菌(thermophilic actinomycetes)。表皮變應(yīng)原可得自于室內(nèi)或有機(jī)灰塵(通常來(lái)源是真菌)；得自于昆蟲(chóng)，例如室內(nèi)螨蟲(chóng)(塵螨，dermatphagoidespterosinyssis);或者來(lái)自于動(dòng)物來(lái)源，例如羽毛和貓狗皮屑。常見(jiàn)的食物變應(yīng)原包括乳和奶酪(乳制品)、蛋、小麥、堅(jiān)果(例如，花生)、海鮮(例如，貝)、豌豆、豆和麩質(zhì)變應(yīng)原。常見(jiàn)的昆蟲(chóng)變應(yīng)原包括蜜蜂、大黃蜂、胡蜂和螞蟻毒液，以及蟑螂蓋(cockroach calyx)變應(yīng)原。
[0157]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 PapMV VLP在對(duì)象中刺激先天免疫應(yīng)答的用途。對(duì)象可以是人或非人動(dòng)物。如本文所述，PapMV VLP可用于例如治療或預(yù)防感染,包括慢性感染(還參照，2012年5月I日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)N0.— “Papaya Mosaic VirusCompositions and Uses Thereof for Stimulation of the Innate Immune Response, ”,其通過(guò)引用整體并入本文)。
[0158]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 PapMV VLP刺激先天免疫應(yīng)答并從而保護(hù)對(duì)象免于病原體的潛在感染的用途。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，PapMV VLP通過(guò)鼻內(nèi)或肺部途徑施用并且在粘膜內(nèi)和/或呼吸系統(tǒng)中引發(fā)保護(hù)性作用。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，病原體是病毒病原體、細(xì)菌病原體或真菌病原體中的一種或更多種。
[0159]在一些實(shí)施方案中，向?qū)ο笫┯肞apMV VLP作為保護(hù)免于病原體感染的預(yù)防性或預(yù)先性性(pre-emptive)措施。這樣的途徑可用于,例如免疫功能不全患者(例如，患AIDS的患者、化療的患者或服用免疫抑制藥的患者)中，在大流行或流行中以在開(kāi)發(fā)/分配適當(dāng)疫苗之前提供對(duì)群體的初始保護(hù)，以保護(hù)進(jìn)入潛在感染區(qū)域的工作人員(例如救援人員、醫(yī)生和護(hù)士)，以及在具有生物恐怖襲擊的威脅或發(fā)生生物恐怖襲擊的情況下。
[0160]在某些實(shí)施方案中，可以在競(jìng)賽環(huán)境下向非人動(dòng)物施用PapMV VLP作為保護(hù)免于感染的預(yù)先性的措施，所述競(jìng)賽環(huán)境例如，賽馬、狗展、貓展等。在某些實(shí)施方案中也考慮了在大流行/流行情況下向牲畜施用PapMV VLP。
[0161]在某些實(shí)施方案中，PapMV VLP可用于治療感染，例如，病毒病原體、細(xì)菌病原體或真菌病原體的感染，包括慢性感染，例如HIV和HCV。在一些實(shí)施方案中，PapMV組合物可用于治療粘膜表面的感染，例如肺、腸或泌尿生殖器系統(tǒng)中的粘膜表面的感染。
[0162]在某些實(shí)施方案中，PapMV VLP可通過(guò)肺途徑施用于肺癌患者以刺激肺中先天免疫應(yīng)答的抗腫瘤活性。
[0163]在某些實(shí)施方案中，PapMV VLP用作粘膜佐劑以刺激黏膜免疫應(yīng)答并從而提高對(duì)腸、泌尿生殖道和其他粘膜表面(包括肺)的感染和疾病的保護(hù)。
[0164]藥物組合物
[0165][155]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含有效量PapMV VLP以及一種或更多種可藥用載體、稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合物。如期望，組合物中可包含其他活性成分，例如，額外的免疫刺激化合物、標(biāo)準(zhǔn)治療劑、疫苗等。
[0166][156]藥物組合物可配制用于通過(guò)多種途徑施用。例如，組合物可配制用于經(jīng)口、局部(topical)、直腸、經(jīng)鼻或胃腸外施用或者用于通過(guò)吸入或噴霧施用。本文中使用的術(shù)語(yǔ)胃腸外包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。向?qū)ο蟊莾?nèi)施用包括向?qū)ο笾堑阑虮乔坏酿つな┯媒M合物。
[0167][157]在一些實(shí)施方案中，藥物組合物配制用于黏膜施用。黏膜施用可包括例如經(jīng)口、鼻內(nèi)、氣溶膠、經(jīng)直腸或陰道施用。黏膜施用的制劑可包括保留在黏膜部位的透皮器械、氣溶膠、乳膏、洗劑或粉末。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物配制成用于鼻內(nèi)或肺部施用。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物配制成用于經(jīng)直腸或陰道施用。
[0168][158]配制成水性懸液的組合物可包含與一種或更多種合適賦形劑相混合的PapMV VLP,例如，與助懸劑、分散劑或潤(rùn)濕劑相混合，所述助懸劑例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基-P -環(huán)糊精、黃蓍膠和阿拉伯膠，所述分散劑或潤(rùn)濕劑例如有天然磷脂如卵磷脂，或環(huán)氧燒(alkylene oxide)與脂肪酸的縮合產(chǎn)物如硬脂酸聚氧乙烯，或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物如十七碳乙烯氧基鯨蠟醇，或環(huán)氧乙烷與由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的縮合產(chǎn)物，如聚乙烯山梨醇酐單油酸酯。水性混懸劑還可包含一種或更多種防腐劑(例如，對(duì)羥基苯甲酸乙酯或?qū)αu基苯甲酸正丙酯)、一種或更多種著色劑、一種或更多種調(diào)味劑或者一種或更多種甜味劑(例如，蔗糖或糖精)。
[0169][159]在某些實(shí)施方案中，可通過(guò)將PapMV VLP懸浮于植物油(例如，花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(例如，液體石蠟)中將藥物組合物配制成油性混懸劑。油性混懸劑可包含增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。這些組合物可通過(guò)添加抗氧化劑如抗壞血酸保存。
[0170][160] 在某些實(shí)施方案中，藥物組合物可配制成可分散粉末或顆粒，其隨后可通過(guò)添加水來(lái)用于制備水性懸液。這樣的可分散粉末或顆粒提供與一種或更多種分散或潤(rùn)濕劑、助懸劑和/或防腐劑混合的PapMV VLP0合適的分散或潤(rùn)濕劑以及助懸劑已經(jīng)通過(guò)上文提到的那些進(jìn)行了示例。這些組合物中還可包含另外的賦形劑，例如著色劑。
[0171][161]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可配制成水包油乳劑。油相可以是植物油如橄欖油或花生油或者礦物油如液體石臘，或者油相可以是這些油的混合物。這些組合物中包含的合適乳化劑包括天然樹(shù)膠，例如阿拉伯膠或黃蓍膠；天然磷脂，例如大豆，卵磷脂；或由脂肪酸和己糖醇、酐衍生的酯或偏酯，例如山梨醇酐單油酸酯，以及所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯。
[0172][162]在某些實(shí)施方案中，所述藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法并使用一種或更多種合適分散劑或潤(rùn)濕劑和/或助懸劑(例如上文提到的那些)配制成無(wú)菌可注射水性或油性懸液。所述無(wú)菌可注射制劑可以是非毒性的胃腸外可接受稀釋劑或溶劑如1，3-丁二醇的溶液中的無(wú)菌可注射的溶液或懸液。可使用的可接受載劑和溶劑包括但不限于水、林格氏液、乳酸林格氏液和等滲氯化鈉溶液。另一些實(shí)例包括無(wú)菌固定油(其通常用作溶劑或助懸介質(zhì))和各種溫和固定油，包括例如合成甘油一酯或甘油二酯。在可注射劑的制備中還可使用脂肪酸，例如油酸。[0173][163]任選地，藥物組合物可包含防腐劑(例如抗微生物劑)、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體和/或穩(wěn)定劑，例如與合適緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液)一起的碳水化合物(例如，山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖)、蛋白質(zhì)(例如，白蛋白或酪蛋白)或含蛋白質(zhì)的試劑(例如，牛血清或脫脂乳)?？筛鶕?jù)周知的參數(shù)調(diào)節(jié)組合物的PH和多種成分的確切濃度。
[0174][164]可通過(guò)例如將所需量的PapMV VLP引入到具有上文列舉的多種其他成分的合適溶劑中之后無(wú)菌過(guò)濾來(lái)制備無(wú)菌組合物。通常，通過(guò)將多種無(wú)菌活性成分引入到包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的其他成分(來(lái)自上文列舉的那些)的無(wú)菌載劑中來(lái)制備分散體。對(duì)于制備無(wú)菌組合物的無(wú)菌粉末，一些示例的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，這些技術(shù)從之前的無(wú)菌過(guò)濾溶液產(chǎn)生活性成分和任何其他期望成分的粉末。
[0175][165]考慮在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中使用設(shè)計(jì)用于肺部或鼻內(nèi)遞送治療性產(chǎn)品的多種機(jī)械裝置，包括但不限于霧化器、定量吸入器、粉末吸入器和鼻噴霧裝置，其全部都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。
[0176][166]定量吸入器通常使用拋射劑氣體并且在吸入的過(guò)程中需要驅(qū)動(dòng)。干粉吸入器使用呼吸驅(qū)動(dòng)的混合粉末。霧化器由溶液產(chǎn)生氣溶膠，而定量吸入器、干粉吸入器等產(chǎn)生小顆粒氣溶膠。
[0177][167]市售機(jī)械裝置的一些特定實(shí)例包括ULTRAVENT?霧化器(Mailinckrodt, Inc., St.Louis, M0.)、ACORN霧化器(Marquest MedicalProducts, Englewood, Col0.)、MISTY-NEB? 霧化器(Allegiance, McGraw Park,111.) > AEROECL1PSE? 霧化器(Trudell Medical International, Canada)、Accuspray? 鼻噴霧裝置(Becton Dickinson)、Mucosal Atomization 裝置(MAD300)(Wolfe Tory Medical)、OptiNose 裝置(OptiNose, Oslo, Norway)、Nektar DPI 系統(tǒng)(Nektar Therapeutics, Inc., San Carlos, Calif.)、AERx 肺部藥物遞送系統(tǒng)(AradigmCorporation,Hayward,Calif.) 、Spiros? 裝置 (Dura Pharmaceuticals) 和 Respimat?裝置(Boehringer Ingelheim)。
[0178][168]所有這些裝置需要使用適于分散PapMV VLP的制劑。通常，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，每一種制劑是所使用裝置類型特異的，并且除了可用于治療的常用稀釋劑、佐劑和/或載體外可涉及使用合適的拋射劑材料。另外，考慮了使用脂質(zhì)體、微囊或微球、包合絡(luò)合物(inclusion complex)或其他類型的載體。
[0179][169]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，藥物組合物為鼻內(nèi)施用的，因此組合物配制成鼻用凝膠、乳膏、糊劑或軟膏劑，其提供與鼻粘膜表面更持久的接觸。這些制劑的粘度通常為約10至約250，000厘泊(cp)，例如約2500至約100，000cp、或約5，000至50，OOOcp。這樣的制劑可基于例如烷基纖維素和/或本領(lǐng)域中周知的其他高粘度的生物相容性載體。烷基纖維素的非限制性實(shí)例是甲基纖維素，其可以以合適的濃度被包含在內(nèi)，例如每100ml載體約5mg至約1000mg,或每100ml載體約25mg至約mg。在某些實(shí)施方案中，包含PapMVVLP的載體可以浸入到可施加到鼻粘膜表面的合適的基底(例如織物材料，如紗布)中以允許PapMV VLP滲透進(jìn)入粘膜。
[0180][170]在某些實(shí)施方案中，凝膠制劑還可包含滲透促進(jìn)劑(穿透促進(jìn)劑)。滲透促進(jìn)劑包括但不限于亞砜，例如二甲基亞砜和癸基甲基亞砜；表面活性劑，例如月桂酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲溴化胺、苯扎氯銨、泊洛沙姆(231，182，184) ,Tween(20,40,60,80)和卵磷脂；1_取代的氮雜環(huán)庚-2-酮，尤其是1-正十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮；脂肪醇，例如月桂醇、肉豆蘧醇、油醇等；脂肪酸，例如月桂酸、油酸和戊酸；脂肪酸酯，例如肉豆蘧酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、丙酸甲酯和油酸乙酯；多元醇及其酯，例如丙二醇、乙二醇、甘油、丁二醇、聚乙二醇和聚乙二醇單月桂醇酯；酰胺及其他含氮化合物，例如尿素、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、2_吡咯烷酮、1-甲基-2吡咯烷酮、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺、萜烯；烷酮(alkanone)和有機(jī)酸，尤其是水楊酸和水楊酸鹽/酯、檸檬酸和琥珀酸。滲透促進(jìn)劑的存在量可以是約0.1%至約30% w/w。凝膠組合物還可包含緩沖劑，例如，碳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、鹽酸、乳酸、酒石酸、無(wú)機(jī)堿和有機(jī)堿。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，根據(jù)所使用的緩沖劑的類型，緩沖劑的存在濃度可以為約I至約10重量百分比，例如，約2至約5重量百分比。但是，緩沖劑的濃度可以不同，在一些實(shí)施方案中，緩沖劑可以代替組合物中多至100%的水量。
[0181][171]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，藥物組合物被配制成經(jīng)直腸或陰道施用，并且可作為栓劑存在，其可通過(guò)將活性成分與一種或更多種合適的無(wú)刺激性賦形劑或載體混合來(lái)制備。所述賦形劑或載體的非限制性實(shí)例包括可可豆脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸鹽/酯，它們?cè)谑覝叵率枪腆w，但是在體溫下是液體，因此在直腸或陰道腔內(nèi)融化并且釋放出活性成分。本發(fā)明適合經(jīng)陰道施用的制劑還包括含本領(lǐng)域中已知合適的載體的陰道栓(pessary)、塞(tampon)、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑。
[0182][172]本發(fā)明還包括包含與市售疫苗組合的PapMV VLP的藥物組合物。
[0183][173]其他藥物組合物和制備藥物組合物的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且描述在例如 “Remington:The Science and Practice of Pharmacy(原名 “RemingtonsPharmaceutical Sciences，，)；Gennaro, A., Lipp incott, Willi am s&ffilkins,Philadelphia, PA(2000)中。
[0184]試劑盒
`[0185][174]本發(fā)明另外地提供了包含用于制備VLP之體外方法的成分的試劑盒以及包含PapMV VLP的藥物試劑盒。
[0186]制備重組VLP的試劑盒
[0187][175]本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了包含用于本文所述體外方法之成分的試劑盒。例如，試劑盒可包含編碼PapMV外殼蛋白的質(zhì)粒和/或編碼ssRNA模板的質(zhì)粒，或者試劑盒可包含經(jīng)純化的PapMV外殼蛋白和/或經(jīng)純化的ssRNA模板。
[0188][176]試劑盒還可任選地包含用于制備重組PapMV外殼蛋白或ssRNA或者用于組裝反應(yīng)或者用于純化重組VLP的一種或更多種其他成分，例如培養(yǎng)基、聚合酶、限制酶、緩沖液、誘導(dǎo)物、核酸酶等。
[0189][177]試劑盒的各個(gè)成分包裝在分開(kāi)的容器中并且在某些實(shí)施方案中一些成分可以以干燥或凍干形式提供。試劑盒還可包含使用說(shuō)明書(shū)。
[0190]藥物試劑盒(pharmaceuticalkit)
[0191][178]本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了包含用作佐劑、免疫調(diào)節(jié)劑或疫苗之重組PapMV VLP的藥物試劑盒。試劑盒的各個(gè)成分可包裝在分開(kāi)的容器中，并且與這些容器一起的可以是這樣的形式的通知，其由調(diào)控藥物或生物制品的制造、使用或銷售的政府機(jī)關(guān)開(kāi)據(jù)，所述通知反映制造、使用或銷售是經(jīng)機(jī)關(guān)批準(zhǔn)的。試劑盒可任選地包含指出重組PapMVVLP之使用方法或施用方案的說(shuō)明或指示。
[0192][179]當(dāng)試劑盒包含用作佐劑的重組PapMV VLP時(shí)，所述試劑盒還可包含與重組PapMV VLP組合使用的一種或更多種抗原。在某些實(shí)施方案中，抗原可以是疫苗形式，例如市售疫苗。
[0193][180]當(dāng)作為溶液(例如水溶液或無(wú)菌水溶液)提供試劑盒的一種或更多種成分時(shí)，容器器具本身可以是吸入器、注射器、移液管、滴眼器(eye dropper)等其他這樣的裝置，從其中溶液可施用至對(duì)象或者施用至藥物試劑盒的其他成分并且與其混合。
[0194][181]試劑盒的成分還可以以干燥或凍干形式提供，并且試劑盒可額外包含用于重構(gòu)凍干成分的合適溶劑。不論容器的數(shù)量或種類為何，本發(fā)明的試劑盒還可包含輔助向患者施用所述組合物的工具。這樣的工具可以是吸入器、鼻噴霧裝置、霧化器、注射器、移液管、鑷子、稱量匙、滴眼器或類似的醫(yī)學(xué)上批準(zhǔn)的遞送運(yùn)載物。
[0195][182]為了更好的理解本文描述的本發(fā)明，給出了以下實(shí)施例。應(yīng)理解的是這些實(shí)施例旨在描述本發(fā)明示例的實(shí)施方案，而不是旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
[0196]實(shí)施例1:制備包含ssRNA之PAPMV VLP的方法:概述
[0197][183]該實(shí)施例中描述的方法總結(jié)于圖6所示的流程圖中。由該方法產(chǎn)生的重組VLP (rVLP)為15nm寬、50至數(shù)千nm長(zhǎng)的棒狀納米顆粒。rVLP的一般制備物具有15 X IOOnm的平均大小?？赏ㄟ^(guò)若個(gè)rVLP的大分子聚合的組裝反應(yīng)之后增加rVLP的大小，使得最終rVLP多至數(shù)千nm長(zhǎng)。1.中間產(chǎn)物I的產(chǎn)生(重組外殼蛋白(rCP))
[0198][184]在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下在轉(zhuǎn)化有包含rCP基因之質(zhì)粒DNA的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生rCP。經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。通過(guò)向培養(yǎng)基中添加生物化學(xué)誘導(dǎo)物來(lái)觸發(fā)蛋白質(zhì)表達(dá)。在誘導(dǎo)期結(jié)束時(shí)，收獲細(xì)胞，懸浮于裂解緩沖液中，然后破碎。通過(guò)除去基因組DNA和膜來(lái)使細(xì)胞裂解物澄清。rCP通過(guò)離子-基質(zhì)親和樹(shù)脂進(jìn)行捕獲，之后從內(nèi)毒素和小aMW分子中純化出來(lái)。最終中間產(chǎn)物I為通過(guò)過(guò)濾滅菌的蛋白質(zhì)溶液。在2~8°C下儲(chǔ)存的無(wú)菌產(chǎn)物穩(wěn)定儲(chǔ)存數(shù)年。
[0199]1.1宿主載體組合
[0200][185]宿主:使用大腸桿菌菌株DH5- a、BL21和BD792，以及酵母巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)GSl 15 菌株。
[0201][186]載體:pET24和PQE8tl質(zhì)粒DNA與原核細(xì)胞一起使用，以及pPICZ a質(zhì)粒DNA與酵母細(xì)胞一起使用。
[0202]1.2牛物質(zhì)牛產(chǎn)(培養(yǎng))
[0203][187]原核生物質(zhì)在燒瓶和生物反應(yīng)器二者中生產(chǎn)。
[0204][188]酵母生物質(zhì)僅在燒瓶中生產(chǎn)。
[0205][189]數(shù)種類型的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)生物質(zhì)(使用甘油或葡萄糖作為唯一碳源的確定的培養(yǎng)基，以及，使用酵母提取物和胰蛋白胨作為碳源的較常見(jiàn)培養(yǎng)基)。
[0206]1.3重組基因表達(dá)的誘導(dǎo)[0207][190]采用多種量的IPTG(0.3至2mM)和多種孵育時(shí)間(3至24小時(shí))在20。。、22°C、25°C、32°C或37°C下進(jìn)行重組基因表達(dá)的誘導(dǎo)。在0.7~ImM IPTG在22~25°C下進(jìn)行6~9小時(shí)時(shí)獲得最佳的誘導(dǎo)。
[0208][191]在32°C下進(jìn)行具有特定葡萄糖/甘油/乳糖比率的自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0209]1.4生物質(zhì)收獲、濃縮和緩沖液更換
[0210][192]可通過(guò)離心來(lái)濃縮細(xì)胞?？蓪竦纳镔|(zhì)在低于_60°C下冷凍儲(chǔ)存數(shù)個(gè)月。細(xì)胞破碎之前，將細(xì)胞懸浮于高滲中性裂解緩沖液(例如，IOmM Tris pH8.0,500mM NaCl)中。
[0211][193]細(xì)胞濃縮和緩沖液更換還可通過(guò)切向流過(guò)濾來(lái)進(jìn)行。在緩沖液更換期間應(yīng)使用高滲溶液以防止rCP體內(nèi)組裝至細(xì)菌RNA。細(xì)胞懸液可在低于_60°C下冷凍儲(chǔ)存數(shù)個(gè)月或者在2~8°C下儲(chǔ)存72小時(shí)。
[0212]1.5細(xì)朐破碎
[0213][194]使用French壓碎機(jī)、勻漿機(jī)或超聲器機(jī)械破碎細(xì)胞。
[0214]1.6細(xì)胞裂解物的液化和澄清
[0215][195]DNA酶處理用于使細(xì)菌基因組DNA片段化。使用多種類型的DNA酶，包括Benzonase?0
[0216][196]通過(guò)離 心或切向流過(guò)濾(300kDa至0.45 截留分子量(MWCO)膜)從細(xì)胞裂解物中除去大的細(xì)胞碎片和膜。
[0217][197]可通過(guò)切向流過(guò)濾(0至30kDa MWCO膜)除去低分子量污染物。
[0218]1.7離子基質(zhì)親和色譜法(IMAC)捕獲和純化
[0219][198]rCP包含6 XHis標(biāo)簽并且通過(guò)離子基質(zhì)親和色譜法進(jìn)行捕獲和純化。低濃度咪唑用于降低在經(jīng)澄清細(xì)胞提取物的IMAC上樣期間的背景?？刹捎胮H梯度或采用咪唑從IMAC柱中洗脫rCP。
[0220]1.8內(nèi)毒素除去
[0221][199]可使用陰離子交換色譜法/過(guò)濾除去存在于rCP溶液中的污染內(nèi)毒素。
[0222]1.9瞇啤除去
[0223][200]可通過(guò)透析或切向流過(guò)濾(5至30kDa MWCO膜)除去存在于rCP溶液中的污染咪唑。
[0224]2.中間產(chǎn)物2的產(chǎn)生(ssRNA模板(SRT))
[0225][201]將PapMV的多突變基因組插入質(zhì)粒DNA中。重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)物中捕獲并純化質(zhì)粒DNA。
[0226][202]通過(guò)DNA限制酶在合成RNA轉(zhuǎn)錄本將結(jié)束的位置消化來(lái)使質(zhì)粒DNA線性化。
[0227][203]使用RNA聚合酶進(jìn)行SRT的轉(zhuǎn)錄。設(shè)計(jì)表達(dá)載體，使得源自RNA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄本在DNA切割位點(diǎn)從DNA模板釋放。體外產(chǎn)生SRT并純化以除去DNA、蛋白質(zhì)和游離核苷酸。最終中間產(chǎn)物2為通過(guò)過(guò)濾滅菌的RNA溶液。無(wú)菌產(chǎn)物在_60°C以下穩(wěn)定儲(chǔ)存數(shù)年。
[0228]2.1宿主載體組合
[0229][204]可使用允許質(zhì)粒DNA復(fù)制的多種細(xì)菌宿主以及在選定細(xì)菌宿主中可復(fù)制的多種標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)載體。表達(dá)載體應(yīng)具有用于SRT轉(zhuǎn)錄的原核RNA聚合酶啟動(dòng)子。[0230]2.2質(zhì)粒DNA產(chǎn)牛和鈍化
[0231][205]本領(lǐng)域已知的多種質(zhì)粒DNA提取和純化方法可用于制備和純化質(zhì)粒DNA。
[0232]2.3質(zhì)粒DNA線件化
[0233][206]選擇用于使質(zhì)粒DNA線性化的限制性核酸內(nèi)切酶以滿足以下條件:⑴限制酶必須不切割RNA聚合酶啟動(dòng)子與待存在于SRT中的最后的核苷酸之間的DNA序列；和
(ii)限制酶必須切割緊接在待存在于SRT中的最后的核苷酸之后的DNA序列。
[0234]3.3RNA模板的合成
[0235][207] SRT的5'端具有PapMV外殼蛋白成核信號(hào)，而其他核苷酸序列來(lái)源于多突變形式的PapMV5'端基因組。編碼示例性ST序列的DNA序列在圖7中提供[SEQ ID NO:5 和 6]。
[0236]3.4SRT 的鈍化
[0237][208]可通過(guò)切向流過(guò)濾使用與SRT大小相關(guān)的MWCO膜從游離核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸中純化全長(zhǎng)SRT。例如，使用IOOkDa MWCO膜從游離核苷酸中純化1500nt長(zhǎng)SRT。
[0238]3.rVLP 的產(chǎn)生
[0239][209]通過(guò)使中間產(chǎn)物I和2組合來(lái)體外組裝rVLP。在中性緩沖溶液中進(jìn)行組裝反應(yīng)。使新組裝的rVLP與低量RNA酶一起孵育，以除去從rVLP突出的任何RNA ;該操作促進(jìn)了 rVLP的溶解性。之后從污染物和游離rC`P (未組裝單體)中純化平端化rVLP。最終產(chǎn)物為通過(guò)過(guò)濾滅菌的rVLP液體懸液。無(wú)菌產(chǎn)物在2~8°C下穩(wěn)定儲(chǔ)存數(shù)年。
[0240]3.1組裝反應(yīng)
[0241][210]組裝反應(yīng)方法在中性水性緩沖液中進(jìn)行并且不需要任何其他特定的離子。其基于rCP的天然特性以在ssRNA上組裝。
[0242][211]可使用多種蛋白質(zhì):RNA比率進(jìn)行組裝反應(yīng)。1500nt長(zhǎng)SRT的最佳比率為Img RNA15 ~30mg 蛋白質(zhì)。
[0243][212]組裝反應(yīng)可在2至37°C的不同溫度下進(jìn)行一段時(shí)間，這取決于中間產(chǎn)物的濃度和溶液的溫度。
[0244]3.2rVIP 平端化
[0245][213]可在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用多種類型的核酸酶從rVLP除去突出的RNA。
[0246]3.3rVLP富集和鈍化
[0247][214]可通過(guò)滲濾使用IOOkDa MWCO膜進(jìn)行rVLP富集。
[0248][215]可通過(guò)滲濾使用10~IOOkDa MWCO膜除去污染的游離核苷酸。
[0249][216]可通過(guò)滲濾使用IOOkDa MWCO膜除去污染的核酸酶。
[0250]實(shí)施例2:制備包含ssRNA之PAPMV VLP的示例性方法
[0251]rCP的產(chǎn)生
[0252][217]DNA包含在誘導(dǎo)性啟動(dòng)子控制下的rCP基因。簡(jiǎn)要地，將包含6 XHis標(biāo)簽的PapMV CP克隆至pQE80載體(QIAGEN)中，其側(cè)翼為限制酶NcoI和BamHI并且在T5啟動(dòng)子的控制下。大腸桿菌BD-792經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并且在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。通過(guò)向培養(yǎng)基中添加IPTG (0.7~ImMIPTG在22~25°C下進(jìn)行6~9小時(shí))來(lái)觸發(fā)蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0253][218]在誘導(dǎo)期結(jié)束，收獲細(xì)胞，懸浮于裂解緩沖液(IOmM Tris pH8.0,500mMNaCl)中，然后使用French壓碎機(jī)、勻漿機(jī)或超聲器機(jī)械地破碎細(xì)胞。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA酶處理除去基因組DNA并且通過(guò)離心或切向流過(guò)濾(300kDa至0.45 ii m MWCO膜)除去大的細(xì)胞碎片和膜來(lái)使細(xì)胞裂解物澄清。rCP采用離子-基質(zhì)親和樹(shù)脂進(jìn)行捕獲并且使用標(biāo)準(zhǔn)程序采用咪唑進(jìn)行洗脫?？刹捎?50mM至IM咪唑洗脫P(yáng)apMC外殼蛋白。還可使用pH梯度實(shí)現(xiàn)洗脫。隨后，通過(guò)陰離子交換色譜法/過(guò)濾從內(nèi)毒素中并且通過(guò)切向流過(guò)濾(0至30kDaMWCO膜)從小的低分子中純化rCP。通過(guò)透析或切向流過(guò)濾(5至30kDa MWCO膜)除去存在于rCP溶液中的任何污染咪唑。通過(guò)過(guò)濾對(duì)最終rCP蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行滅菌。SRT的產(chǎn)生
[0254][219]圖 7A 中提供了編碼 SRT 的 DNA 序列[SEQ ID NO:5]。SRT 基于 PapMV 的基因組并且具有5'端的PapMV外殼蛋白成核信號(hào)(圖7A中的框)。其余核苷酸序列為多突變的，其中所有ATG密碼子突變成TAA終止密碼子。序列的開(kāi)始16個(gè)核苷酸(圖7A中的下劃線)包含位于pBluescript表達(dá)載體的17轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并且存在于RNA轉(zhuǎn)錄本內(nèi)。在圖7A中下劃線示出五聚體重復(fù)。整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度為1522個(gè)核苷酸。圖7B所示的較長(zhǎng)SRT[SEQ ID NO:6]也成功地用于體外組裝。
[0255][220]使用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)?duì)應(yīng)于SRT的DNA插入包含原核RNA聚合酶啟動(dòng)子的DNA質(zhì)粒中。重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞并且隨后經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化質(zhì)粒DNA，之后通過(guò)采用限制酶MluI在緊接在SRT序列的最后核苷酸之后的DNA序列位點(diǎn)處切割使質(zhì)粒DNA線性化。
[0256][221]使用RiboMAX?試劑盒(Promega，USA)根據(jù)制造商推薦方案采用17RNA聚合酶進(jìn)行SRT的轉(zhuǎn)錄。設(shè)計(jì)表達(dá)載體，使得源自RNA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄本在DNA切割位點(diǎn)從DNA模板釋放。通過(guò)切向流過(guò)濾使用IOOkDa MWCO膜來(lái)純化SRT以除去DNA、蛋白質(zhì)和游離核苷酸。通過(guò)過(guò)濾對(duì)最終RNA溶液進(jìn)行滅菌。
[0257]rVLP 的產(chǎn)生
[0258][222]通過(guò)將rCP與SRT組合來(lái)體外組裝rVLP。在中性緩沖溶液(IOmM Tris-HClPH8)中進(jìn)行組裝反應(yīng)。使用對(duì)于Img RNA而言15~30mg蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì):RNA比率進(jìn)行組裝反應(yīng)。使新組裝的rVLP與低量RNA酶(0.0001 u gRNA酶/ y gRNA) 一起孵育，以除去從rVLP突出的任何RNA。之后通過(guò)滲濾使用10~IOOkDa MWCO膜從污染物和游離rCP (未組裝單體rCP)中純化平端化rVLP。通過(guò)過(guò)濾對(duì)最終rVLP液體懸液進(jìn)行滅菌。
[0259]實(shí)施例3:通過(guò)施用含有合成ssRNA的PAPMV VLP在小鼠中誘導(dǎo)抗病毒應(yīng)答
[0260][223]已經(jīng)證明聚肌酸-聚胞苷酸(多聚1:C，dsRNA，一種周知的toll樣受體3 (TLR-3)配體)通過(guò)誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子如IL-6、CXCLlO, JE、KC、mGCSF、CCL3、CCL5和TNF的分泌成為肺中先天免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)物(Stowell等,2009, Respir.Res.，10:43)。還已知TLR-7通過(guò)與配體如ssRNA和R837 (鳥(niǎo)苷類似物)結(jié)合激活先天免疫應(yīng)答。
[0261][224]在提高PapMV VLP引發(fā)先天免疫應(yīng)答和發(fā)生抗病毒應(yīng)答的能力的嘗試中，通過(guò)實(shí)施例2中描述的方法制備含聚1:C dsRNA或ssRNA的PapMV VLP。PapMV外殼蛋白在體外與聚 1:C (dsRNA ;InvivoGen，San Diego, CA)或 ssRNA 組裝，產(chǎn)生含各自 RNA 的 VLP。ssRNA 用 Promega T7Ribomax Express 大規(guī)模 RNA 生產(chǎn)系統(tǒng)(Promega, Madison, WI)在體外制備。
[0262][225]用電子顯微鏡檢查組裝的VLP并且觀察到與通過(guò)Tremblay等(2006，F(xiàn)EBSJ.，273:14-25)中描述的方法制備的VLP類似(見(jiàn)圖8A:含ssRNA的PapMV VLP和圖SB:含聚 1:C 的 PapMV VLP)。
[0263][226]評(píng)價(jià)兩種VLP在誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒攻擊的保護(hù)中的效力。將Balb/C小鼠(每組 10 只)用 60 ii g 含 ssRNA 的 PapMV VLP ( “PapMV VLPssRNA”)、含聚 1:C 的 PapMVVLP ( “PapMV VLP聚1:C”)或等價(jià)量的RNA (即，3 y g聚1:C或ssRNA)處理。對(duì)照組小鼠用60 ii gPapMV外殼蛋白(CP)單體(不含RNA)或用對(duì)照緩沖液(IOmM Tris-HCl pH8)處理。以7天間隔用60 ii g PapMV VLP鼻內(nèi)處理小鼠2次并且在最后處理后3天用200pfu流感病毒株WSN/33攻擊。在接下來(lái)的14天中每天一次測(cè)量動(dòng)物的體重、癥狀和存活。處死表現(xiàn)為重量減輕超過(guò)20%的動(dòng)物。
[0264][227]結(jié)果表示在圖9A~B中。用PapMV VLP ssRNA處理的小鼠表現(xiàn)出在處理組中最佳的表現(xiàn)。具體地，用PapMV VLP ssRNA處理的小鼠未損失任何顯著量的體重(圖A)并且表現(xiàn)出非常少(若有的話)的癥狀(圖9B)。用PapMV VLP聚1:C或單獨(dú)用多、聚1:C處理的組表現(xiàn)出對(duì)攻擊的部分保護(hù)，與對(duì)照組相比有降低的重量減輕(圖9A)和癥狀(圖9B)。用PapMV CP單體處理未提供任何保護(hù)，在用單體處理的小鼠中觀察的重量減輕的量(圖9A)和癥狀(圖9B)與在用PBS對(duì)照處理的小鼠中觀察到的類似。隨后PapMV VLP聚
1:C的分析表明這些VLP不像PapMV VLP ssRNA那樣穩(wěn)定，這可能是其表現(xiàn)較差的原因。
[0265]實(shí)施例4:通過(guò)施用PAPMV VLP#1在小鼠中誘導(dǎo)細(xì)胞因子
[0266] [228]為了說(shuō)明肺內(nèi)PAPMV VLP誘導(dǎo)的機(jī)理，以7天間隔采用60 ii g包含ssRNA的PapMV VLPU5 u gPamCSK4 (TLR-2 配體并且 I 型 IFN 的非誘導(dǎo)物)(Cedarlane，Burlington，ON)或采用對(duì)照緩沖液(10mM Tris HCl pH8)兩次鼻內(nèi)接種小鼠(每組5只)。在第二次處理后24小時(shí)進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL),并且用Luminex技術(shù)(Milliplex Mouse cytokinepremixed32-plex immunoassay kit ；Millipore)篩選細(xì)胞因子的存在。
[0267][229]通過(guò)用PapMV VLP或PamCSK4處理，誘導(dǎo)了兩種主要的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-9(IL-9)和干擾素I誘導(dǎo)蛋白IOkDa(IP-1O)(圖10A&B)。IL-9是由CD4+T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其促進(jìn)T細(xì)胞增殖并抑制凋亡。IP-10作為IFN-Y分泌的結(jié)果出現(xiàn)并且在刺激部位T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集中具有重要作用。PamCSK4 (為已知的TLR-2配體和病原體相關(guān)分子模式(PAMP)分子)和PapMV VLP對(duì)兩種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)表明VLP也可以是PAMP。
[0268]實(shí)施例5:通過(guò)施用PAPMV VLP#2在小鼠中誘導(dǎo)細(xì)胞因子
[0269][230]進(jìn)行與實(shí)施例4中的描述類似的實(shí)驗(yàn)，不同之處在于在處理后6小時(shí)進(jìn)行BAL,并且處理是接種I次或以7天間隔接種2次。與之前一樣，在實(shí)驗(yàn)中使用60y g含ssRNA的PapMV VLP。用Luminex (32細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒)篩選處理后處理后早期產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
[0270][231]結(jié)果表示在圖1lA~R中，并且表明用PapMV VLP處理2次比處理一次在誘導(dǎo)小鼠中的細(xì)胞因子和趨化因子上更有效。此外，在處理后6比處理后24小時(shí)檢測(cè)到更多種類的細(xì)胞因子和趨化因子(比較圖11和圖10)。
[0271][232]在用 PapMV VLP 處理的小鼠的 BAL 中發(fā)現(xiàn) MIP-1 a、MIP-1 β、MIP-2、mKC、TNF-a和MCP-1非常豐富(圖1lA~E和H)。這些細(xì)胞因子和趨化因子激活人粒細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)，其可導(dǎo)致急性中性粒細(xì)胞炎癥。它們還誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成和分泌其他促炎性細(xì)胞因子，例如TNF-a、IL-6和IL_1 a /旦(Maurer 和 von Stebut,2004, The International Journal of Biochemistry&CellBiology, 36:1882-1886)，這也表現(xiàn)為由 PapMV VLP 誘導(dǎo)(分別見(jiàn)圖 8E、N、o 和 P)。MIP-1蛋白還可通過(guò)誘導(dǎo)針對(duì)傳染性病原體如病毒(包括流感病毒)(Menten等，2002，Cytokine Growth Factor Reviews,13:455-481)和寄生生物(Aliberti 等，2000,VaturalImmunology, 1:83-87)的炎癥應(yīng)答來(lái)促進(jìn)健康,這與之前實(shí)施例中所示結(jié)果一致。
[0272][233]還觀察到IL-6響應(yīng)于PapMV VLP施用的分泌(圖11N)。有趣的是，在抵抗細(xì)菌肺炎球菌(Pneumococcus pneumoniae)的感染中表現(xiàn)為需要IL-6的分泌(van derPoll 等，1997，JInfect Dis.，176 (2):439-44)。
[0273][234]用PapMV VLP處理強(qiáng)烈地誘導(dǎo)了 IP_10(圖111)。IP-10是趨化性趨化因子，其有利于炎癥部位T細(xì)胞的募集，并且其還有利于自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的增殖和激活。
[0274][235]用PapMV VLP處理還誘導(dǎo)白細(xì)胞介素17(圖11J)。與干擾素Y類似，IL-17是通過(guò)增加多種組織中趨化因子的產(chǎn)生從而向炎癥部位募集單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞來(lái)發(fā)揮作用的細(xì)胞因子。IL-17由T輔助細(xì)胞產(chǎn)生，并且也是響應(yīng)細(xì)胞外病原體入侵免疫系統(tǒng)的促炎性細(xì)胞因子。IL-17通過(guò)上調(diào)促炎性細(xì)胞因子和趨化因子如IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子、TNFa、IL-1、KC、MCP-1 和 MIP-2 來(lái)協(xié)調(diào)局部組織炎癥(Z 印p 等，2011，Trends Immunol.Apr 12.[印刷前網(wǎng)絡(luò)公開(kāi)])，其也表現(xiàn)為被PapMV VLP處理誘導(dǎo)。
[0275][236] PapMV VLP 處理(圖1lQ 和 R)還誘導(dǎo)了 G-CSF 和 GM-CSF,已知 G-CSF 和GM-CSF刺激干細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)和單核細(xì)胞。單核細(xì)胞離開(kāi)循環(huán)并且遷移進(jìn)入組織，其在此處成熟為巨噬細(xì)胞。因此，G-CSF和GM-CSF是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一部分，通過(guò)它們少量巨噬細(xì)胞的激活可迅速導(dǎo)致其數(shù)量增加，這是與感染戰(zhàn)斗的重要過(guò)程(Metcalf, 2010, Nature Reviews Cancer, 20:425-434)。
[0276][237]如通過(guò)免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子譜所表現(xiàn)的，該實(shí)施例和實(shí)施例4中描述的結(jié)果表明用PapMV VLP處理小鼠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的普遍的炎癥應(yīng)答。細(xì)胞因子和趨化因子的水平在處理后6小時(shí)最大，在處理后24小時(shí)顯著降低。可能是炎性細(xì)胞因子和趨化因子誘導(dǎo)免疫細(xì)胞和粒細(xì)胞的遷移，因此導(dǎo)致所觀察到的經(jīng)接種動(dòng)物的超過(guò)5天的抗病毒狀態(tài)。誘導(dǎo)細(xì)胞因子還可導(dǎo)致I型IFN的分泌，還已知其繼而提供抗流感活性。
[0277]實(shí)施例6:PAPMV VLP ssRNA 對(duì) TLR-7 的激活
[0278][238]用 100 u gPapMV VLP ssRNA 或 IOOu IPBS 對(duì) C57BL/6、TLR7 敲除(KO)、MYD88K0和IRF5/7K0小鼠(3~5只小鼠每組)進(jìn)行靜脈內(nèi)免疫，在免疫后24小時(shí)分離脾細(xì)胞并且分析在樹(shù)突細(xì)胞(DC)、⑶8+T細(xì)胞和B細(xì)胞中⑶86和⑶69的表達(dá)。用FACS分選細(xì)胞并且通過(guò)⑶69或⑶86特異性抗體的結(jié)合借助熒光強(qiáng)度評(píng)價(jià)⑶86和⑶69的水平。結(jié)果在圖12中作為所分析樣品對(duì)PBS樣品的平均熒光強(qiáng)度(MFI)的比率表示。
[0279][239]簡(jiǎn)要地，這些結(jié)果表明抗原遞呈細(xì)胞如DC和B細(xì)胞以及⑶8+T細(xì)胞被PapMVVLP ssRNA納米顆粒激活。激活依賴于IRF5/7、Myd88和TLR-7，因?yàn)樵谇贸齀RF5/7、Myd88或TLR7的小鼠中未激活。認(rèn)為TLR-7通過(guò)VLP中包含的ssRNA觸發(fā)。用PapMV外殼蛋白(單體或其他低分子量形式)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)無(wú)法激活TLR-7。
[0280][240] IRF5/7是干 擾素響應(yīng)因子，其通過(guò)TLR-7的刺激誘導(dǎo)并且導(dǎo)致產(chǎn)生干擾素a。Myd88分子是適配體分子，其負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移由TLR-7觸發(fā)的信號(hào)。提出的反應(yīng)級(jí)聯(lián)是:1)由VLP中的ssRNA觸發(fā)TLR-7 ;和2)Myd88加入，之后誘導(dǎo)IRF5/7，其將導(dǎo)致干擾素a產(chǎn)生的增加。最后，干擾素a有助于PapMV VLP納米顆粒的免疫調(diào)節(jié)作用。
[0281]實(shí)施例7:漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞參與PAPMV VLP免疫原性
[0282][241]用 100 u gPapMV VLP ssRNA 對(duì) C57BL/6 小鼠(5 只每組)通過(guò) 1.v.進(jìn)行免疫接種，免疫接種之前進(jìn)行或不進(jìn)行耗盡BST2+細(xì)胞的處理。為了耗盡，在用PapMV VLP ssRNA免疫接種前48小時(shí)和24小時(shí)用500 ii g抗-BST2抗體(mAb927)通過(guò)1.p.注射C57BL/6小鼠。在用PapMV VLP ssRNA進(jìn)行免疫接種后24小時(shí)通過(guò)FACS分析分離的脾細(xì)胞中⑶69、MHC-1和⑶86的表達(dá)。
[0283][242]結(jié)果表示在圖13中，并且表明BST2+細(xì)胞(主要為漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞)對(duì)于小鼠中PapMV VLP ssRNA納米顆粒的免疫原性很重要。具體地，在BST2+細(xì)胞耗盡的小鼠中觀察到B細(xì)胞、CD8+細(xì)胞和DC無(wú)激活，表明激活通過(guò)漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)行。
[0284]實(shí)施例8 =PAPMV VLP#1對(duì)干擾素-a產(chǎn)生的刺激
[0285][243]用 100 u gPapMV VLP ssRNA 或 100 u IPBS 對(duì)兩組 C57BL/6 小鼠以及 TLR-7K0和MYD88K0小鼠(4只小鼠每組)通過(guò)1.v.進(jìn)行免疫接種。一組C57BL/6小鼠首先如實(shí)施例7中所述用抗-BST2抗體進(jìn)行處理。在免疫接種后6、12、24和48小時(shí)(圖14A)或免疫接種后 6 小時(shí)(圖 14B)通過(guò) ELISA (VeriKine? Mouse Interferon Alpha ELISAKit ；PBLInterferonSource)監(jiān)測(cè)血清和脾中IFN-a的產(chǎn)生。
[0286][244]結(jié)果表示在圖14中，并且表明PapMV VLP ssRNA納米顆粒對(duì)IFN-a的產(chǎn)生的刺激依賴于MYD88、TLR7和BST2+細(xì)胞。
[0287]實(shí)施例9 =PAPMV VLP#2對(duì)干擾素-a產(chǎn)生的刺激
[0288][245]用 100 u `gapMV VLP ssRNA 或 100 u IPBS 對(duì) C57BL/6 和 IFNAR KO 小鼠(3 只小鼠每組)通過(guò)1.v.進(jìn)行免疫接種。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)在免疫接種后24小時(shí)從小鼠的脾分離的B淋巴細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞中⑶86、MHC-1和⑶69的表達(dá)。
[0289][246]結(jié)果表示在圖15A和B中，并且表明I型IFN受體是PapMV VLP ssRNA納米顆粒激活小鼠免疫細(xì)胞所必需的。敲除了 I型IFN受體(IFNAR K0)的小鼠未表現(xiàn)出PapMVVLP ssRNA納米顆粒對(duì)免疫細(xì)胞的激活。
[0290][247]通過(guò)間接ELISA測(cè)量與PapMV VLP ssRNA涂覆平板結(jié)合的總IgG，分析在用100 u gPapMV VLP ssRNA 進(jìn)行免疫接種后第 4、8、12、20 和 30 天的 C57BL/6 和 IFNAR KO 小鼠(9只小鼠每組)血清中針對(duì)PapMV VLP ssRNA的抗體的水平。
[0291][248]結(jié)果表示在圖15C中，并且表明I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺失導(dǎo)致針對(duì)PapMVVLP ssRNA納米顆粒的抗體應(yīng)答顯著延遲。
[0292]實(shí)施例10:用PAPMV VLP預(yù)處理幫助控制慢性感染
[0293][249]LCMV是慢性感染(例如HCV感染)的相關(guān)動(dòng)物模型。LCMV的克隆13變體建立了小鼠中的持續(xù)性感染。與HCV感染類似，LCMV感染主要受CTL控制，并且CTL應(yīng)答疲耗盡與ro-1表達(dá)相關(guān)。
[0294][250]用 100 u gPapMV VLP ssRNA、100 u gR837 (市售 TLR-7 配體)或 100 y IPBS 通過(guò)1.V.處理C57BL/6和TLR7敲除(KO)小鼠(3~6只小鼠每組)，6小時(shí)之后用2 X IO6PFULCMV克隆13感染(1.v.)。在第5、11、15、25和45天采集血液樣品以通過(guò)LCMV焦點(diǎn)形成測(cè)定(focus-forming assay)評(píng)估病毒滴度。在感染后15天或45天處死小鼠以通過(guò)FACS測(cè)定脾中的免疫應(yīng)答，并且如之前描述(Lacasse等，2008，J.Virology, 82:785-794)用大鼠抗LCMV-NP單克隆Ab (VL-4)在MC57成纖維細(xì)胞上通過(guò)LCMV焦點(diǎn)形成測(cè)定測(cè)定脾、肝、腎和腦中的病毒滴度。
[0295][251] C57BL/6小鼠的血液中LCMV克隆13的病毒動(dòng)力學(xué)描述在圖16中，并且表明用PapMV VLP ssRNA納米顆粒預(yù)處理控制LCMV誘導(dǎo)的慢性感染。
[0296][252]感染后第15天C57BL/6和TLR7K0小鼠脾、腎、肝和腦中的病毒滴度表示在圖17中，表明用PapMVVLP ssRNA納米顆粒預(yù)處理比市售TLR7配體(R837)更有效并且以TLR7依賴的方式降低了不同器官中的病毒載量。認(rèn)為PapMV VLP ssRNA納米顆粒中的TLR-7配體是ssRNA成分，其占分子的約5%。因此，盡管向小鼠每種施用了 100iig，PapMVVLP ssRNA納米顆粒在降低小鼠中的LCMV病毒載量方面比R837有效20倍。
[0297][253]圖18顯示出在用LCMV克隆13感染之前施用PapMV VLP ssRNA納米顆粒使GP33特異性⑶8+T細(xì)胞的功能提高。對(duì)于NP396特異性⑶8+T細(xì)胞得到了類似結(jié)果。具體地，圖14F表明通過(guò)用PapMV VLP ssRNA納米顆粒預(yù)處理，GP33特異性CD8+T淋巴細(xì)胞中表達(dá)的I3D-1的量顯著降低。I3D-1是免疫耗竭的指示劑，其表達(dá)是LCMV克隆13感染的特征。用PapMV VLP ssRNA納米顆粒預(yù)處理小鼠導(dǎo)致I3D-1水平保持在如未感染小鼠中的一樣低，表明在這些小鼠中免疫系統(tǒng)未耗竭，這是這些小鼠能夠抗感染的原因。
[0298][254]圖19顯示出感染后第45天C57BL/6小鼠的脾、腎、肝和腦中的病毒滴度。該結(jié)果表明因用PapMV VLP ssRNA納米顆粒預(yù)處理造成的病毒載量的降低在處理后數(shù)周依然明顯。
[0299]實(shí)施例11 =PAPMV VLP在體外激活人單核細(xì)胞
[0300][255]通過(guò) Ficoll 梯度分離人 PBMC 并且用 100 u g/ml PapMV VLP ssRNA 或 PBS處理。在處理后18小時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析⑶14+⑶Ilb+細(xì)胞群(單核細(xì)胞)的⑶86表達(dá)。
[0301][256]結(jié)果表示在圖20中，表明人單核細(xì)胞也被PapMV VLP ssRNA納米顆粒激活。這些結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0302]實(shí)施例12 =PAPMV VLP對(duì)抗細(xì)菌應(yīng)答的誘導(dǎo)
[0303][257]通過(guò)鼻內(nèi)途徑用單獨(dú)緩沖液(IOmM Tris pH8)或用60 y g PapMV VLP ssRNA以7天間隔處理小鼠(10只小鼠每組)兩次。在處理后第3天，用220CFU(集落形成單位)的毒性肺炎鏈球菌菌株感染小鼠。
[0304][258]在4天中每12小時(shí)密切監(jiān)測(cè)存活率。結(jié)果表示在圖21中。用PapMV VLPssRNA納米顆粒處理的組中的全部小鼠在感染中存活。用緩沖液處理的組表現(xiàn)出70%存活率。
[0305][259]盡管在本實(shí)施例中使用的肺炎鏈球菌的劑量是亞致死劑量，但是數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明用PapMV納米顆粒預(yù)處理將通過(guò)誘導(dǎo)肺內(nèi)的先天免疫應(yīng)答來(lái)提供對(duì)細(xì)菌感染的保護(hù)。本實(shí)施例和之前的實(shí)施例表明，由PapMV納米顆粒賦予的保護(hù)是非特異性的，因?yàn)槠溆行п槍?duì)病毒和細(xì)菌的感染。
[0306]實(shí)施例13 =PAPMV VLP治療LCMV慢性感染
[0307][260]將C57BL/6小鼠(3只小鼠每組)在第0天用2 X IO6個(gè)PFU LCMV克隆13通過(guò)1.v.進(jìn)行感染，并且在第1、2、3、4和5天(A組)或僅在第6和第7天(B組)用100 u gPapMV VLP ssRNA或100 u IPBS每天一次通過(guò)1.v.進(jìn)行處理。在感染后第5、10和15采集血樣并且在第15天處死小鼠以通過(guò)LCMV焦點(diǎn)形成測(cè)定來(lái)測(cè)定血、脾、腎和腦中的病
毒滴度。
[0308][261]在動(dòng)物血液中發(fā)現(xiàn)的病毒滴度表示在圖22中。盡管在第15天，用PapMVVLP ssRNA納米顆粒處理的小鼠表現(xiàn)出與對(duì)照相同的滴度，觀察到在第10天在兩組小鼠中病毒滴度顯著降低(A組動(dòng)物中降低接近于1glO)。該結(jié)果強(qiáng)烈表明通過(guò)調(diào)節(jié)處理方案，在用PapMV VLP ssRNA納米顆粒處理的小鼠中將可實(shí)現(xiàn)病毒載量的進(jìn)一步降低。例如，可增加處理次數(shù)。在第I至5或6和7天提供處理表現(xiàn)為L(zhǎng)CMV滴度降低，可能的是增加第6和7天后的處理次數(shù)將進(jìn)一步降低病毒載量。可替換的或另外的，可增加PapMV VLP的施用量，例如增加為200iig每劑量。
[0309][262]在動(dòng)物多種器官中發(fā)現(xiàn)的病毒滴度表示在圖23中。盡管在第6天和第7天(B組)處理的動(dòng)物腦中病毒載量表現(xiàn)為顯著降低，但是經(jīng)處理小鼠其他器官中病毒載量未表現(xiàn)為顯著降低。這最可能是由于在第15天測(cè)量滴度，其給予感染足夠時(shí)間以在處理后“反彈”。預(yù)期隨后到第6天和第7天的處理將導(dǎo)致病毒載量更顯著的降低。
[0310]實(shí)施例14:用PAPMV VLP多次處理延長(zhǎng)保護(hù)期
[0311][263]已經(jīng)顯示出通過(guò)PapMV VLP處理誘導(dǎo)的保護(hù)用于持續(xù)約5天時(shí)間。為了研究如果用多劑量PapMV VLP進(jìn)行處理是否可提供更長(zhǎng)的保護(hù)期，以I周間隔經(jīng)60 y g包含ssRNA的PapMV VLP鼻內(nèi)接種小鼠I次(I X)、2次(2 X)、5次(5 X)或10次(10 X)。最后處理后3天，用流感WSN/33病毒(約ILD5tl)對(duì)小鼠進(jìn)行攻擊。
[0312][264]小鼠的重量減輕表示在圖24中。還注意到動(dòng)物未受到多次處理的影響，并且與對(duì)照動(dòng)物一樣在處理期間體重正常增加。
[0313][265]這些結(jié)果表明多`次處理可使由PapMV VLP納米顆粒誘導(dǎo)的保護(hù)期延長(zhǎng)至超過(guò)10周。結(jié)果還表明用PapMV VLP多次處理不使動(dòng)物的先天免疫耗竭。最后，如已知的，PapMV VLP的抗體在第一次處理后7天出現(xiàn)并隨著加強(qiáng)處理而增加，這些結(jié)果表明PapMVVLP觸發(fā)先天免疫應(yīng)答的能力不受抗體產(chǎn)生的影響。
[0314]實(shí)施例15 =PAPMV VLP對(duì)中性粒細(xì)胞募集的誘導(dǎo)
[0315][266]根據(jù)實(shí)施例3的方案對(duì)小鼠2次滴注含ssRNA的PapMV VLP,并且在第二次處理后6小時(shí)進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL)。結(jié)果表示在圖25中。圖25B中圓圈內(nèi)的是發(fā)現(xiàn)進(jìn)入用PapMV VLP處理的小鼠的BAL中的中性粒細(xì)胞。與對(duì)照組相比,處理的小鼠中觀察到了 3倍的中性粒細(xì)胞。
[0316][267]中性粒細(xì)胞代表第一道防線。該實(shí)施例表明在用PapMV VLP處理的小鼠中中性粒細(xì)胞迅速募集，僅在處理后6小時(shí)。已知中性粒細(xì)胞在控制肺內(nèi)細(xì)菌和病毒的感染中具有關(guān)鍵作用，因此很可能在PapMV處理小鼠中觀察到的保護(hù)中具有重要作用。
[0317]實(shí)施例16:包含ssRNA的PAPMV VLP對(duì)黏膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)
[0318][268]通過(guò)以14天間隔兩次滴注20 ii g PapMV VLP ssRNA和2 ii g三價(jià)滅活流感疫苗(TIV)處理Balb/C小鼠(10只每組)。在第0、14和28天取血。根據(jù)同一方案，另一組小鼠通過(guò)s.c.途徑進(jìn)行免疫接種的動(dòng)物作為對(duì)照。在第15天用ILD5tl的流感WSN/33病毒攻擊小鼠，在14天時(shí)間中跟蹤重量減輕。[0319][269]用TIV的抗體通過(guò)ELISA測(cè)量經(jīng)免疫接種的動(dòng)物血液中的IgG滴度，結(jié)果表示在圖26中。在使用相同途徑進(jìn)行免疫接種時(shí)，與單獨(dú)用TIV進(jìn)行免疫接種的組相比，向TIV中添加PapMV VLP使總IgG和IgG2a應(yīng)答顯著增加。有趣的是，對(duì)于動(dòng)物血液中IgG和IgG2a的產(chǎn)生，s.c.途徑比1.n.途徑更有效。
[0320][270]用TIV的抗體通過(guò)ELISA在經(jīng)免疫接種的動(dòng)物的支氣管肺泡灌洗(BAL)和糞便中測(cè)量抗體滴度，結(jié)果表示在圖27中。從這些結(jié)果，很顯然僅1.n.處理觸發(fā)BAL中IgA的產(chǎn)生。與單獨(dú)滴注TIV相比，向TIV中添加PapMV VLP使肺中IgA的量顯著增加。與單獨(dú)用TIV的組相比，在用PapMV VLP和TIV處理的動(dòng)物中還觀察到BAL中顯著提高的總IgG。從得自在鼻內(nèi)用PapMV VLP處理并且通過(guò)1.n.施用TIV的小鼠的BAL中總IgG的量與得自用所述組合皮下處理的小鼠的無(wú)顯著差異。最后，有趣的是注意到在用所述組合鼻內(nèi)處理的小鼠的腸中也觀察到了黏膜免疫應(yīng)答，如在該器官中出現(xiàn)針對(duì)TIV的IgA所表明的(圖27C)。
[0321][271]用流感病毒攻擊之后小鼠的重量減輕表示在圖28中。所述攻擊表明通過(guò)鼻內(nèi)途徑進(jìn)行免疫接種在保護(hù)小鼠對(duì)抗異源亞型菌株中比通過(guò)s.c.途徑更強(qiáng)且有效。在用PapMV VLP和TIV的組合通過(guò)1.n.途徑進(jìn)行免疫接種的組中，小鼠體重增加并且不表現(xiàn)出任何癥狀。通過(guò)s.c.施用所述組合僅提供局部保護(hù)。但是，通過(guò)s.c.施用3iigTIV和30 u gPapMV VLP可取得完全的保護(hù)。用單獨(dú)TIV (通過(guò)任何途徑)、單獨(dú)PapMV VLP或?qū)φ站彌_液進(jìn)行免疫接種的全部其他組不能保護(hù)，表現(xiàn)出疾病癥狀并且體重有顯著量減輕。[0322][272]該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明PapMV VLP可作為黏膜佐劑。佐劑觸發(fā)黏膜免疫應(yīng)答的能力對(duì)于有效預(yù)防或治療通過(guò)黏膜進(jìn)入身體的微生物引起的感染和疾病(包括流感、結(jié)核和幽門螺桿菌感染)很重要。經(jīng)免疫接種的動(dòng)物的糞便中IgG的存在表明用PapMV VLP作為佐劑通過(guò)1.n.接種疫苗可用于抵御腸內(nèi)細(xì)菌或病毒的感染。另外，由于通過(guò)PapMV VLP觸發(fā)的黏膜免疫應(yīng)答是普遍性的，所以用PapMV VLP作為佐劑通過(guò)1.n.接種疫苗還可潛在地用于抵御陰道黏膜內(nèi)細(xì)菌或病毒的感染(例如，HIV-1)。
[0323][273]盡管在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中未在單獨(dú)用PapMV VLP 1.n.處理的小鼠中看到保護(hù)，但是這與之前實(shí)施例中的結(jié)果一致，其表明通過(guò)PapMV VLP誘導(dǎo)的非特異性保護(hù)僅持續(xù)約5天時(shí)間。在該實(shí)驗(yàn)中，在第二次滴注VLP后14天進(jìn)行攻擊。
[0324]實(shí)施例17:PAPMV VLP 對(duì) TLR-2 和 CD14 的激活
[0325][274]如在之前實(shí)施例中證明的，在細(xì)菌宿主細(xì)胞中制備的PapMV VLP和用ssRNA通過(guò)體外自組裝制備的PapMV VLP 二者都能夠刺激固有免疫應(yīng)答。但是，通過(guò)兩種不同方法制備的VLP激活不同的TLR。如上文所示，用ssRNA通過(guò)體外自組裝制備的PapMV VLP激活TLR-7。相比之下,如先前描述(Tremblay等,2006, ibid.)通過(guò)在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)PapMV外殼蛋白和自組裝制備的PapMV VLP激活TLR-2和CD14。
[0326][275]簡(jiǎn)言之,用100 ii g PapMV VLP (根據(jù)Tremblay等制備)或已知的TLR配體(獲自金黃色葡萄球菌(LTA)的100 u g脂磷壁酸:TLR2和⑶14配體；1 y gPam3SCK4:TLR2配體；或10 ii g鞭毛蛋白:TLR5配體)和抗CD14、抗TLR2或抗TLR5抗體處理THPl-XBlue?-CD14 細(xì)胞(InvivoGen，San Diego, CA)。THPl-XBlue?-CD14 細(xì)胞具有多個(gè)TLR(包括TLR2、4、5)，并且被改造為在TLR與配體結(jié)合時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色。結(jié)合之后，細(xì)胞變?yōu)樗{(lán)色并且可用分管光度計(jì)容易地評(píng)價(jià)結(jié)合的強(qiáng)度。在將細(xì)胞在37°C下孵育24小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量。
[0327][276]結(jié)果表示在圖29中。針對(duì)CD14，TLR2或TLR5的抗體(Ac)阻止各自TLR或⑶14的結(jié)合，并且揭示了每一種測(cè)試分子產(chǎn)生的相互作用。在使用抗TLR2抗體與PapMVVLP 一起時(shí)觀察到光密度顯著降低，在使用抗CD14抗體時(shí)觀察到強(qiáng)烈降低。在該實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)使用Pam3CSK4(已知的TLR2配體)時(shí)，TLR2的抗體不能像預(yù)期的那樣產(chǎn)生較高地降低。這很可能是在試驗(yàn)中Pam3CSK4的使用量過(guò)高。
[0328][277]用在細(xì)菌中組裝的PapMV VLP觀察到的TLR激活的差異可由于在從細(xì)菌中分離之后對(duì)VLP進(jìn)行的去污劑處理的結(jié)果。該處理可影響PapMV VLP的表面，例如暴露出疏水殘基并導(dǎo)致VLP成為TLR2的配體。與存在于核內(nèi)體中的TLR7不同，TLR2和⑶14 二者暴露于免疫細(xì)胞表面。
[0329]實(shí)施例18:包含ssRNA之PAPMV VLP的佐劑活性
[0330][278]來(lái)自HlNl大流感病毒菌株A/加利福尼亞/7/2009的核蛋白(NP)在大腸桿菌中表達(dá)為His標(biāo)簽蛋白并且采用鎳親和柱進(jìn)行純化。使NP抗原(IOyg)與實(shí)施例2所述制備的10、30、60或90 ii gPapMV VLP相混合并用于接種Balb/C小鼠(每組10只)。接種后21天，采集血液樣品并通過(guò)ELISA使用GST-NP抗原進(jìn)行分析，以評(píng)估體液應(yīng)答。
[0331][279]結(jié)果示于圖30中，并且表明使用10 U gNP和10 U gPapMV VLP的組合足以使針對(duì)NP的體液應(yīng)答飽和。
[0332][280]在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，以14天間隔采用包含僅IOii gNP(來(lái)自HlNl菌株A/加利福尼亞/7/2009)或者其與作為佐劑的PapMV VLP (10、30、60或90 y g)相混合的制劑s.c.免疫Balb/C小鼠(每組10只)3次。采用異源亞型流感株H1N1WSN/33 (約ILD5tl)在最后免疫后14天攻擊小鼠。對(duì)于攻擊后14天跟蹤癥狀。每天對(duì)重量減輕和癥狀進(jìn)行計(jì)分。
[0333][281]結(jié)果示于圖31中并且示出了佐劑化的制劑所免疫的小鼠顯示對(duì)流感攻擊的最佳保護(hù)。經(jīng)NP (IOii g)+90 ii gPapMV接種的組顯示出最低癥狀和最低重量減輕。針對(duì)流感異源亞型株所觀察到的保護(hù)明顯地表明采用PapMV佐劑針誘導(dǎo)了對(duì)高度保守蛋白質(zhì)NP的CTL應(yīng)答，針對(duì)感染提供了較好的保護(hù)。圖30所示NP的抗體不太可能中和感染，因?yàn)镹P發(fā)現(xiàn)于病毒的內(nèi)部，所以表明CTL應(yīng)答參與在受攻擊小鼠中所觀察到的保護(hù)。當(dāng)與PapMVVLP佐劑相混合時(shí)針對(duì)NP的IgG2a同種型的存在表明誘導(dǎo)了 Thi應(yīng)答，這與觸發(fā)CTL應(yīng)答—致。
[0334][282]所以該結(jié)果表明使用包含ssRNA的PapMV VLP作為佐劑增強(qiáng)了抗體誘導(dǎo)和CTL應(yīng)答二者。
[0335]實(shí)施例19:包含ssRNA的PAPMV VLP和PAPMV SM VLP的佐劑活性
[0336][283]該實(shí)施例比較了通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法所制備PapMV VLP與通過(guò)Tremblay等(2006，同上)所述方法所制備PapMV VLP (PapMV sm)的佐劑活性。兩種類型的VLP在電子顯微鏡下具有相同外觀。
[0337][284]簡(jiǎn)要地，通過(guò)皮下途徑經(jīng)單獨(dú)的或者用30 U gPapMV sm或根據(jù)實(shí)施例2所述方法制備之PapMV VLP佐劑化的市售三價(jià)滅活流感疫苗(TIV) (2009-2010)免疫Balb/C小鼠(10只/組)。注射后14天從小鼠中采集血液并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案獲得血清。使用血清進(jìn)行針對(duì)TIV和總IgG或IgG2a滴度的ELISA。
[0338][285]結(jié)果示于圖32中并且表明單次注射后，根據(jù)實(shí)施例2所示方法制備的PapMVVLP導(dǎo)致總IgG或IgG2a滴度顯著地高于采用單獨(dú)TIV所觀察到的。根據(jù)實(shí)施例2所示方法制備的PapMV VLP所獲得的滴度還優(yōu)于在接受用PapMV sm佐劑化TIV的組中所觀察到的那些。
[0339][286]該結(jié)果明顯表明，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明之方法制備的PapMV VLP能夠提供比PapMV sm更強(qiáng)的佐劑作用，即使它們的結(jié)構(gòu)類似也是如此。
[0340][287]僅注射PapMV VLP (沒(méi)有TIV)的實(shí)驗(yàn)還表明針對(duì)VLP的IgG2應(yīng)答對(duì)于根據(jù)實(shí)施例2所述方法制備的VLP而言比對(duì)于PapMV sm而言更強(qiáng)。
[0341][288]本說(shuō)明書(shū)中參照的全部專利、出版物(包括公開(kāi)的專利申請(qǐng))和數(shù)據(jù)庫(kù)條目的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體清楚并入本文，其程度如同每一這些單獨(dú)專利、出版物和數(shù)據(jù)庫(kù)條目清楚并且單獨(dú)提到通過(guò)引用并入本文。
[0342][289]盡管參照某些特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是不脫離本發(fā)明的精神和范圍對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的所有這些修 改旨在包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于制備病毒樣顆粒(VLP)的體外方法，其包括以下步驟: a)在約6.0至約9.0的pH下和約2°C至約37°C的溫度下，將蛋白質(zhì):RNA比按重量計(jì)為約1:1至50:1的重組馬鈴薯X病毒外殼蛋白與ssRNA組合足以允許VLP組裝的時(shí)間； b)用核酸酶處理所述VLP以移除從所述顆粒中突出的任何RNA;以及 c)將所述VLP與其他處理成分分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述重組馬鈴薯X病毒外殼蛋白是重組番木瓜花葉病毒(PapMV)外殼蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述重組馬鈴薯X病毒外殼蛋白是經(jīng)遺傳修飾的外殼蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組外殼蛋白與一種或更多種抗原肽融合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組病毒外殼蛋白主要為低分子量種類的形式。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白質(zhì):RNA比按重量計(jì)為約5:1 至 50:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白質(zhì):RNA比按重量計(jì)為約10:1 至 50:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述pH為約pH6.5至pH8.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述pH為約pH7.0至pH8.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溫度為約5°C至約37°C。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溫度為約10°C至約37°C。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溫度為約20°C至約37°C。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組外殼蛋白在大腸桿菌(E.coli)中產(chǎn)生。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述ssRNA是合成的ssRNA、天然ssRNA、經(jīng)修飾的天然ssRNA或天然ssRNA的片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約1000個(gè)核苷酸至約3000個(gè)核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述ssRNA是合成的ssRNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述合成的ssRNA不包含任何AUG密碼子。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述合成的ssRNA包含對(duì)應(yīng)于SEQID NO:5第17至54位核苷酸的序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述合成的ssRNA包含對(duì)應(yīng)于SEQID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
21.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法制備的病毒樣顆粒(VLP)。
22.番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)，其包含重組PapMV外殼蛋白和ssRNA，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約50個(gè)核苷酸至約5000個(gè)核苷酸并且包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的PapMVVLP，其中所述ssRNA的長(zhǎng)度為約1000至約3000個(gè)核苷酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的PapMV，其中所述ssRNA包含對(duì)應(yīng)于SEQID NO:5第17至54位核苷酸的序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的PapMV，其中所述ssRNA包含對(duì)應(yīng)于SEQID NO:5所示核酸序列的序列。
26.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)所述的VLP以及可藥用載體或稀釋劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其還包含一種或更多種抗原。
28.根據(jù)權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)所述的VLP，其用作佐劑以在有此需要的對(duì)象中增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的VLP，其中所述免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答或CTL免疫應(yīng)答。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的VLP，其中所述免疫應(yīng)答是黏膜免疫應(yīng)答。
31.根據(jù)權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)所述的VLP，其用于在對(duì)象中刺激先天免疫應(yīng)答并從而預(yù)防所述對(duì)象中的微生物感染或降低其嚴(yán)重程度。
32.根據(jù)權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)所述的VLP，其與一種或更多種抗原組合用作疫苗。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的VLP在制備藥物中的用途。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其中所述藥物是用于在對(duì)象中增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的佐劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的用途，其中所述免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答或CTL免疫應(yīng)答。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的用途，其中所述免疫應(yīng)答是黏膜免疫應(yīng)答。
37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其中所述藥物用于在對(duì)象中刺激先天免疫應(yīng)答并從而預(yù)防所述對(duì)象中的微生物感染或降低其嚴(yán)重程度。
38.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其中所述藥物與一種或更多種抗原組合用作疫苗。
39.一種在對(duì)象中增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述對(duì)象施用包含根據(jù)權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)所述之VLP的佐劑。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答或CTL免疫應(yīng)答。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是黏膜免疫應(yīng)答。
42.一種在對(duì)象中刺激先天免疫應(yīng)答并從而預(yù)防所述對(duì)象中的微生物感染或降低其嚴(yán)重程度的方法，其包括向所述對(duì)象施用根據(jù)權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)所述的VLP。
43.一種在對(duì)象中刺激免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述對(duì)象施用與一種或更多種抗原相組合的根據(jù)權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)所述的VLP。
44.一種用于制備番木瓜花葉病毒(PapMV)病毒樣顆粒(VLP)的體外方法，其包括以下步驟: a)在pH為約6.5至約8.5的緩沖溶液中和約22°C至約37°C的溫度下，將蛋白質(zhì):RNA比按重量計(jì)為約5:1至40:1的重組PapMV外殼蛋白與ssRNA組合足以允許VLP組裝的時(shí)間，其中所述重組PapMV主要為低于20-mer的低分子量種類的形式；b)用核酸酶處理所述VLP以移除從所述顆粒中突出的任何RNA;以及c)將所述VLP與其他處理成分`分離。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK103687942SQ201280022947
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年5月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月13日
【發(fā)明者】德尼·勒克萊爾, 皮埃爾·薩瓦爾 申請(qǐng)人:弗利亞生物技術(shù)公司