用于靶向哺乳動物中的脂肪細胞的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了用于治療劑的診斷、成像或靶向中以治療肥胖癥／肥胖相關(guān)病癥的方法和組合物，其中這些組合物和方法鑒別并使用肽以在體外和體內(nèi)選擇性地靶向哺乳動物中的脂肪組織基質(zhì)細胞。
【專利說明】用于靶向晡乳動物中的脂肪細胞的方法和組合物
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年3月30日提交的第61 / 469，345號美國臨時申請的權(quán)益，該臨時申請出于所有目的通過引用整體并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本公開涉及可用于靶向治療劑的遞送的方法和組合物。更具體地說，本公開涉及用于鑒別并使用在體內(nèi)和體內(nèi)選擇性地靶向哺乳動物中的脂肪組織的肽的組合物和方法。
[0004]背景
[0005]干細胞移植被公認為一種在臨床前試驗中加強組織再生的方式，并且這個策略正在被調(diào)動到臨床中(Kolonin 和 Simmons, Nat.Biotechnol.27，252-253，2009)。干細胞療法將大大得益于靶向特定器官中的間質(zhì)基質(zhì)細胞(MSC)的能力以供成像或治療應(yīng)用。MSC為包含多能成體祖細胞的混合細胞群體(Bianco等人，CellStem Cell2, 313-31 9，2008)。由于這些細胞能夠分化成間質(zhì)譜系，如成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，因此其通常被稱作間質(zhì)干細胞(Pittenger 等人，Science284, 143-147,1999 ；Prockop, Science276, 71-74,1997)。最新研究揭示了 MSC發(fā)揮維持血管完整性的血管周細胞(周細胞)的功能(Crisan等人，Cell Stem Cell3, 301-313，2008 ;Tang 等人，Science322, 583-586,2008 ；Traktuev等人，Circ.Res.102，77-85，2008)。
[0006]使用經(jīng)過移植的MSC的臨床前研究和臨床試驗支持這些細胞的治療潛力并表明這些細胞在疾病過程中也被激活以參與組織修復(fù)和再生。然而，MSC用于細胞療法的臨床應(yīng)用需要追蹤并控制這種塑性細胞群體的能力，這是因為關(guān)于其促進癌癥的能力存在安全性擔憂(Zhang 等人，Cancer Res.69，5259-5266，2009)。
[0007]MSC最初從骨髓基質(zhì)中分離并且基于其成纖維細胞形態(tài)而被稱為成纖維細胞集落形成單位(CFU-F) (Friedenstein`, Haematol.Blood.Transfus.25,19-29,1980)。從那時起，已在大多數(shù)成體器官中鑒別出MSC，其中白色脂肪組織(WAT)為MSC的最大儲藏器，這些細胞被稱為脂肪基質(zhì)細胞(ASC:Gimble 等人，Circ.Res.100，1249-1260，2007 ；Daquinag等人，Trends in Pharmacol.Sc1.22,1-8, 2011) ? 雖然 WAT 主要由脂肪細胞組成，但 ASC構(gòu)成基質(zhì)/血管部分(SFV)中的大多數(shù)細胞，該基質(zhì)/血管部分還含有內(nèi)皮細胞(EC)和浸潤造血細胞(Hausman等人，Obes.Rev.2，239-254，2001)。已揭示ASC為展現(xiàn)與骨髓MSC相當?shù)亩嗄苄院驮鲋衬芰?，同時也具有鮮明而獨特的特征的多能祖細胞的豐富來源(Rodeheffer 等人，Celll35, 240-249，2008 ；Tang 等人，2008，同上；Zuk 等人，2001，TissueEng.7，211-228)。
[0008]對MSC與其他組織組分的細胞間相互作用介導(dǎo)組織重塑的機制的當前了解受特異性MSC標記物缺乏所限制。雖然許多細胞表面分子，包括血小板源性生長因子受體-β (PDGFRP)、CD146、CD44、CD90、CD105、CD73、CD29 和 Stro-1,已用于 MSC 的陽性選擇，但其中每一者也在其他細胞類型上表達(Bianco等人，2008，同上；Gimble等人，2007，同上；Nie等人，Stem Cells26，2735-2745，2008)。MSC(包括來自WAT的那些)可以基于泛白細胞標記物⑶45缺乏而區(qū)別于造血細胞，并且基于泛內(nèi)皮細胞標記物⑶31 / PECAM-1缺乏而區(qū)別于內(nèi)皮細胞(EC) (Bianco等人，2008，同上；Rodeheffer等人，2008，同上)。因為⑶34在體內(nèi)若干器官的血管周MSC上表達，所以⑶34+⑶45-⑶31-免疫表型已用于分離MSC與其他細胞(Gimble等人，2007同上；Tang等人，2008，同上Jraktuev等人，2008，同上；Zhang等人，2009，同上)。然而，因為這種特征不會區(qū)分不同組織中的MSC，所以迫切需要用于其他組織中的ASC和MSC的前瞻性分離和追蹤的新標記物并且其總體上限制了干細胞移植的領(lǐng)域。
[0009]此外，脂肪相關(guān)病癥包括(但不限于)肥胖癥、體重和體組成紊亂，包括影響體脂肪和體重調(diào)節(jié)的飲食和其他病癥，這代表了所有工業(yè)化國家中的主要健康問題。在發(fā)達國家中肥胖癥的患病率很高。例如，截止2002年，約30%的美國人是肥胖的(國家健康與營養(yǎng)問卷調(diào)查(National Health and Nutrition Examination Survey))。肥胖癥是相對于瘦體重存在過量體脂肪的病狀，并且被定義為體質(zhì)指數(shù)(重量/高度2)高于30kg /m2 (KopeIman，Nature404 =635-643,2000)。肥胖癥與顯現(xiàn)許多嚴重疾病的風險增加相關(guān)聯(lián)，這些疾病包括(但不限于)2型糖尿病、中風、高血壓、冠狀動脈病、某些癌癥、某些組織中的慢性纖維化、脂肪性肝病、慢性靜脈功能不全、深靜脈血栓形成、關(guān)節(jié)炎、呼吸問題(如阻塞性睡眠呼吸暫停)和膽囊疾病(如膽石病)，以及其他并發(fā)癥(Willett等人，N.Engl.J.Med.341 =427-434,1999) ? [0010]進一步注意到，基質(zhì)細胞是支持器官的實質(zhì)細胞功能的結(jié)締組織細胞。纖維化是一個病理過程,其包括作為對組織損傷的反應(yīng),結(jié)締組織形成疤痕并過度產(chǎn)生細胞外基質(zhì)。融合性纖維化可以除去正常結(jié)構(gòu)和潛在器官或組織的功能。纖維化病癥包括(但不限于)皮膚中的病理性疤痕形成，如膠質(zhì)疤痕和肥厚性疤痕；肝和膽囊的硬化；心臟、眼睛和腎臟、肺部和骨髓中的纖維化、胃腸道中與癌癥如肉瘤和血管外皮細胞瘤相關(guān)的纖維化，以及硬皮病。其他纖維化病癥包括壞血病和自體免疫病癥，如類風濕性關(guān)節(jié)炎和全身性紅斑狼瘡，并且其遺傳病癥的實例尤其包括馬凡氏綜合癥(Marfan syndrome)、埃勒斯-當洛斯綜合癥(Ehlers-Danlos syndrome)、洛伊-迪茨綜合癥(Loeys-Dietz syndrome)、彈性假黃瘤、成骨不全、進行性肌肉骨化癥以及自發(fā)性氣胸。
[0011]上文所提到的疾病相關(guān)性解釋了肥胖癥的經(jīng)濟費用據(jù)估計超過1000億美元的原因(Daniels, Am.J.Nurs.106:40_49，2006)，這個費用據(jù)估計多達總衛(wèi)生保健費用的7 %(Seidell, Int.J.0bes.Relat.Metab.Disord.19(增刊 6):S13_S16，1995)。
[0012]哺乳動物中的體組成的調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜過程，其涉及食欲和能量消耗的調(diào)節(jié)。對人類體組成和體重內(nèi)穩(wěn)定的了解不足。肥胖癥的流行病學強有力地顯示了這種病癥展現(xiàn)出遺傳特征，并且對人類雙胞胎的研究強有力地表明對體組成和體重的控制的實質(zhì)性遺傳基礎(chǔ)，據(jù)估計遺傳率約為80-90%。人類肥胖癥和動物模型的遺傳學研究證實了肥胖癥由食物攝入、食物誘導(dǎo)的能量消耗以及脂質(zhì)與瘦體合成代謝之間的平衡的缺陷性調(diào)節(jié)的復(fù)雜相互作用引起。因此，肥胖癥不僅僅是消極行為的結(jié)果，即，自主攝食過量的結(jié)果，而且由飲食模式、新陳代謝以及神經(jīng)/新陳代謝相互作用的差異引起。這些差異似乎在某種程度上是因為基因表達在水平和基因產(chǎn)物的活性方面有差異(Friedman等人，Mamm.Genomel:130-144，1991)。
[0013]用于控制體重的當前方法包括節(jié)食和手術(shù)程序。然而，節(jié)食常常不能取得成功，并且由美國食品與藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration)批準的少數(shù)肥胖癥治療劑，如芬特明(Phentermen)、芬氟拉明(fenfluramine)、諾美婦(Meridia)、羅氏鮮(Xernical)、奧利司他(Orlistat)、芬特明鹽酸鹽(Adipex-Ρ)、苯甲曲秦(Bontril)和苯丁胺(1nomin)，具有不可接受或危險的副作用，并且那些已經(jīng)得到批準的少數(shù)治療劑已退出市場。用于減輕體重的手術(shù)方法，如吸脂術(shù)、胃繞道手術(shù)或束帶手術(shù)，具有許多風險。目前可用的體重控制方法無一令人滿意并且需要體重減輕和控制的改進方法。
[0014]除了人類群體中的肥胖癥問題以外，伴侶動物(如狗和貓)中的肥胖癥問題也日益增加(German，J.Nutr.136:1940S-1946S, 2006)。在美國，據(jù)估計所有狗和貓中25-40%超重或肥胖。如同在人類中一樣，肥胖癥可能對伴侶動物的健康和壽命具有有害影響。另外，減少或除去市售牲畜飼料中體組成和體重操控劑的使用的能力不僅在飼養(yǎng)者的成本節(jié)約方面而且對消費者并且總體上對社會都具有顯著效用。因此，操控體組成和體重并治療人類和伴侶動物的體組成紊亂(例如(但不限于)肥胖癥)的能力和增大牲畜體型的能力具有廣泛效用并代表重大機遇。
[0015]糖尿病為與體組成紊亂(具體來說，肥胖癥)和代謝綜合征相關(guān)的當前不能治愈的長期病癥，使得顯現(xiàn)由不良血糖控制引起的其他病理性病狀的風險大大增加。慢性、短期風險包括(但不限于)低血糖癥、感染，以及與高血糖癥相關(guān)的病癥(如酮酸中毒)。由糖尿病引起的長期并發(fā)癥包括(但不限于)心臟病、中風、高血壓、血管病、視覺缺陷、腎病變和神經(jīng)病變。根據(jù)2005年由國家糖尿病、消化和腎臟疾病研究所進行的調(diào)查，在美國有超過兩千萬人患有糖尿病，并且糖尿病群體的百分比正迅速增加。2005年在美國，150萬人被診斷出患有糖尿病。一些研究預(yù)測，到2020年全世界有約2.5億人罹患糖尿病(O' Rahilly,BMJ, 314 =955-959,1997)。這種病癥的最普遍形式是胰島素依賴性糖尿病(IDDM或I型)和非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM或II型)。由于糖尿病有高發(fā)病率，并且許多相關(guān)并發(fā)癥引起不可逆的損傷，因此治療成本在美國超過任何其他單一疾病。在2002年，超過1320億美元花費在治療的直接和間接成本上，其中約920億美元用于直接醫(yī)療成本(Hogan等人，Diabetes Care26:917-932,2003)。
[0016]最近，肥胖癥已成為誘使癌`癥患者因晚期癌癥進展而死亡的因素之一(參見例如 Daquinag 等人，Vascular targeting of adipose tissue as an ant1-obesityapproach.Trends in Pharmacol Sc1.22,1-8, 2011 ;Zhang 等人 Adipose-tissue derivedprogenitor cells and cancer, World Journal ofStem Cells(Topic Highlight),2 (5):103-113,2010 ;Bellows 等人，Influence of BMI on Level of Circulating ProgenitorCells, Obesity,在線；Flegal 等人 Cause-specific excess deaths associated withunderweight, overweight, and obesity.JAMA.298，2028-2037，2007 ；Roberts 等人Biological mechanisms linking obesity and cancer risk:new perspectives.Annu RevMed.61:301-316, 2010)?；加星傲邢侔┖腿榉堪┑幕颊叩拇婊盥视捎诜逝职Y而比其他癌癥有所降低。WAT對癌癥進展具有直接影響(Vona-Davis等人，Adiposity，type2diabetesand the metabolic syndrome in breast cancer.0bes Rev ;8:395_408，2007)，作為分泌炎癥和代謝綜合征中所牽涉的眾多可溶性脂肪因子的有效內(nèi)分泌器官(Rosen等人，Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis.Nature ；444:847-853,2006)。類胰島素生長因子(IGF)為可直接剌激腫瘤細胞增殖的那些因子。痩素(Leptin)、白介素-6 (interleukin-6)以及各種其他激素和炎性細胞因子也可以起作用(Baillargeon.0bestity adipokines and prostate cancer (review).1nt J Oncol ；28:737-745 2006)。然而，提出這些因子在癌癥中的作用的臨床和實驗數(shù)據(jù)仍有爭議。例如，在動物模型中，切除循環(huán)的IGF-1已顯示對前列腺腫瘤生長沒有影響(Anzo等人，Targeted deletion of hepatic Igfl in TRAMP mice leads to dramatic alterationsin the circulating insulin-like growth factor axis but does not reduce tumorprogression.Cancer Res ；68 (9):3342-9, 2008)。因此，必須考慮替代機制。
[0017]與生理功能是用來儲存過量能量的WAT相對比，棕色脂肪組織(BAT)負責以熱量的形式消耗能量。WAT與BAT之間的細致平衡是在設(shè)計靶向療法中應(yīng)考慮到的重要問題。嚙齒動物模型所得的許多結(jié)果指示BAT具有對抗肥胖癥的病理結(jié)果的保護作用。在成人中發(fā)現(xiàn)BAT的意義在于可能有用以治療肥胖癥和相關(guān)病癥的新方法。ASC是產(chǎn)生BAT的祖細胞類型之一(Elabd 等人 Human multipotent adipose-derived stem cells differentiateinto functional brown adipocytes.Stem Cells27, 2753-2760, 2009)。更重要的是，白色脂肪細胞可以在培養(yǎng)物中和體內(nèi)直接轉(zhuǎn)化為BAT樣表型(Cint1.Transdifferentiationproperties of adipocytes in the adipose organ.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.297，977-986，2009)。在小鼠中，擴充WAT內(nèi)的殘余BAT “補片(patch) ”可能導(dǎo)致幾乎所有的脂肪庫存在減少WAT的情況下變成BAT樣的。脂肪細胞生理學對血管結(jié)構(gòu)狀態(tài)的明顯依賴性表明血管靶向劑可以被設(shè)計成將WAT轉(zhuǎn)化為BAT，而不會完全破壞組織，作為更符合生理并更安全的抗肥胖癥治療。激活現(xiàn)有殘余BAT的增生、血管形成和/或新陳代謝的藥理學方法的發(fā)展在理論上可以使WAT / BAT平衡傾斜并用于治療肥胖癥。
[0018]總之，脂肪相關(guān)體組成和體重紊亂(如肥胖癥和糖尿病)代表了主要的健康問題。考慮到脂肪相關(guān)體重紊亂的嚴重性、患病率和復(fù)雜性，極大地需要鑒別參與體組成和體重控制的基因和蛋白質(zhì)，并開發(fā)用以治療脂肪相關(guān)體組成紊亂、肥胖癥、代謝綜合征和糖尿病的新藥物和療法。針對脂肪組織(WAT和BAT)中的不同類型細胞(如ASC)的靶向治療和成像模態(tài)可以有益于肥胖癥、癌癥和纖維化中的生物醫(yī)學應(yīng)用。
發(fā)明概要
[0019]本發(fā)明所公開的方法和組合物是部分基于可以用于輔助診斷、預(yù)防和/或治療哺乳動物的脂肪相關(guān)病癥的某些肽的發(fā)現(xiàn)和鑒別，這些脂肪相關(guān)病癥例如(但不限于)體組成紊亂、體重紊亂、糖尿病、肥胖癥或代謝綜合征以及癌癥和纖維化。
[0020]在本發(fā)明的一些實施方案中，靶向肽包含選自由SEQ ID NO:1-16組成的群組的氨基酸序列，其中所述肽結(jié)合于基質(zhì)細胞。在本發(fā)明的另一個實施方案中，靶向肽包含SEQ IDN013和SEQ ID N014的WAT7氨基酸序列SWKYWFGE。在本文所描述的其他實施方案中，蛋白質(zhì)組合物包含靶向肽，并且在另一個實施方案中，蛋白質(zhì)組合物包含WAT7氨基酸序列。
[0021]在一些實施方案中，靶向肽完全由D-氨基酸組成；在其他實施方案中，靶向肽完全由L-氨基酸組成；并且在其他實施方案中，靶向肽可以包含L-氨基酸、D-氨基酸或其組合 ο
[0022]在本發(fā)明的一些實施方案中，蛋白質(zhì)組合物包含WAT7，其中WAT7由D-氨基酸組成，并且其中所述組合物結(jié)合于脂肪組織、纖維化組織或腫瘤組織中的基質(zhì)細胞。在蛋白質(zhì)組合物的一些其他實施方案中，WAT7選擇性地結(jié)合于ASC細胞表面上的ADCN。
[0023]在本發(fā)明的蛋白質(zhì)組合物的一些實施方案中，靶向肽偶合于選自包含以下各項的群組的效應(yīng)劑:成像劑、細胞毒性劑、促細胞凋亡劑、融合蛋白、細胞生長抑制劑、殺細胞劑、放射性同位素、ACS細胞分化劑、有絲分裂抑制劑、抗腫瘤劑、抗生素劑、酶、化學治療劑、抗血管生成劑或其組合。在蛋白質(zhì)組合物的一些實施方案中，靶向肽和效應(yīng)劑由D-氨基酸組成；在蛋白質(zhì)組合物的其他實施方案中，靶向肽由L-氨基酸組成，并且效應(yīng)劑包含D-氨基酸；在蛋白質(zhì)組合物的其他實施方案中，靶向肽由L-氨基酸組成，并且效應(yīng)劑包含L-氨基酸。
[0024]在本文所公開的蛋白質(zhì)組合物的一些實施方案中，靶向肽偶合于效應(yīng)劑并誘導(dǎo)白色脂肪組織轉(zhuǎn)化為棕色脂肪組織。在其他實施方案中，效應(yīng)劑激活白色脂肪組織中的b3-腎上腺素能受體。在蛋白質(zhì)組合物的一些實施方案中，效應(yīng)劑為由D-氨基酸組成的肽。
[0025]在制備用以靶向脂肪組織的蛋白質(zhì)組合物的方法的一個實施方案中，所述方法包括:使效應(yīng)劑偶合于靶向肽，其中靶向肽包含選自由SEQ ID NO:1-16組成的群組的氨基酸序列；并且其中所述靶向肽選擇性地靶向細胞脂肪組織。在其他實施方案中，效應(yīng)劑和靶向肽由D-氨基酸組成。在其他實施方案中，效應(yīng)劑由L-氨基酸組成；并且靶向肽由D-氨基酸組成。
[0026]在本文所公開的制備蛋白質(zhì)組合物的方法的一些實施方案中，偶合包含用連接部分使所述效應(yīng)劑連接于所述靶向肽；在其他實施方案中，連`接部分包含氨基己酸、(ch2)4、(CH2)5, (CH2)6, (CH2)7, (CH2)8或其組合。在本文所公開的制備蛋白質(zhì)組合物的方法的一些實施方案中，效應(yīng)劑是選自包含以下各項的群組:細胞毒性劑、促細胞凋亡劑、成像劑或其組合。
[0027]在將效應(yīng)劑遞送到脂肪組織的方法的一些實施方案中，所述方法包括:使包含以下各項的蛋白質(zhì)組合物暴露于包含脂肪組織的細胞群體:偶合于肽的效應(yīng)劑，其中所述肽包含長度小于100個氨基酸的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列包含脂肪組織靶向肽部分，所述部分具有選自由SEQ ID NO:1-16組成的群組的氨基酸序列。在其他實施方案中，蛋白質(zhì)組合物包含連接子，并且所述連接子可以包含氨基己酸、(CH2)4、(CH2)5, (CH2)6,(CH2) 7、(CH2)8或其組合。在一些實施方案中，靶向肽基序由D-氨基酸組成。在其他實施方案中，效應(yīng)劑和所述靶向肽由D-氨基酸組成。在本文所描述的將效應(yīng)劑遞送到脂肪組織的方法的一些實施方案中，所述劑包含:細胞毒性劑、促細胞凋亡劑、成像劑或其組合；并且在其他實施方案中，所述劑由D-氨基酸組成。
[0028]在將效應(yīng)劑遞送到脂肪組織的方法的一些實施方案中，所述暴露包含:使受試者暴露于所述蛋白質(zhì)組合物以治療肥胖相關(guān)病癥，其中所述病癥包含肥胖癥、纖維化、癌癥或其組合；并且在其他實施方案中，所述細胞群體在哺乳動物受試者中；在其他實施方案中，細胞群體在人類受試者中；在一些其他實施方案中，細胞群體為薄的組織切片。
[0029]將效應(yīng)劑遞送到脂肪組織的方法的一些實施方案進一步包含基于蛋白質(zhì)組合物與所述脂肪組織的所述選擇性結(jié)合來檢測所述群體中的脂肪基質(zhì)細胞。在將效應(yīng)劑遞送到脂肪組織的方法的其他實施方案中，肥胖相關(guān)病癥為體組成紊亂、體重紊亂、肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病、代謝綜合征、纖維化、癌癥或其組合。
[0030]在一個實施方案中，所公開的肽包含選自由SEQ ID NO:17-24組成的群組的氨基酸序列，其中所述肽結(jié)合于肺組織。在其他實施方案中，所公開的蛋白質(zhì)組合物包含有包含選自SEQ ID NO:17-24的序列或其組合的肽。在其他實施方案中，蛋白質(zhì)組合物由D-氨基酸組成。在蛋白質(zhì)組合物的一些實施方案中，肽偶合于成像劑、細胞毒性劑、促細胞凋亡劑或其組合。
[0031]在本文所公開的蛋白質(zhì)組合物的一些實施方案中，組合物包含靶向肽和效應(yīng)劑，其中所述效應(yīng)劑包含:短桿菌肽(gramicidin)、娃皮素(magainin)、蜂毒素(mellitin)、防御素(defensing)、殺菌妝(cecropin)、(KFAKFAK) 2、(KFXAKFXAK) 2、(KHexAKHexAK) 2、(KLAKLAK) 2、(KLAKKLA) 2、(KAAKKAA) 2、(KLGKKLG) 3、血管緊張素(angiotensin)、層粘連蛋白肽(laminin peptide)、纖連蛋白肽(fibronectin peptide)、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12(interleukinl2)、血小板因子4、IP-10、Gro-β、凝血栓蛋白(thrombospondin)、2_ 甲氧基雌二醇(2-methoxyoestradiol)、增殖蛋白相關(guān)蛋白(proliferin-related protein)、甲酉先胺基三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、馬立馬司他(Marimastat)、多硫戍聚糖(pentosan polysulphate)、血管生成素
2(angiopoietin2) (Regeneron)、干擾素-α、除莠霉素 A (herbimycin A)、PNU145156E、16K催乳素片段(16K prolactin fragment)、利諾胺(Linomide)、沙利度胺(thalidomide)、己酮可可堿(pentoxifylline)、染料木素(genistein)、TNP470、內(nèi)皮抑素(endostatin)、紫杉醇(paclitaxel)、阿庫汀(accutin)、血管抑素(angiostatin)、西多福韋(cidofovir) >長春新堿(vincristine)、博萊霉素(bleomycin)、AGM-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素(minocycline)、5_氟尿嘧唳、博萊霉素、白消安(busulfan)、喜樹堿(camptothecin)、卡鉬(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉬(cisplatin ；CDDP)、環(huán)憐酸胺(cyclophosphamide)、放線菌素 D (dactinomycin)、道諾霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊苷(etoposide ;VP16)、法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱(gemcitabine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)、諾維本(navelbine)、亞硝基脲、匹可霉素(plicomycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷洛昔芬(raloxifene)、他莫西芬(tamoxifen)、泰素(taxol)、替莫唑胺(temazolomide) (DTIC的水性形式)、反鉬(transplatinum)、長春堿(vinblastine)和甲氨蝶呤(methotrexate)、長春新堿、燒化齊?、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、皮質(zhì)類固醇激素、有絲分裂抑制劑、亞硝基脲、激素劑、有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、酶、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、植物生物堿(plant alkaloid)、多烯紫杉醇(docetaxel)、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷(teniposide)、紫杉醇、泰素、長春堿、長春新堿、長春瑞濱(vinorelbine)、PPAR-Y激動劑噻唑燒二酮、羅格列酮(rosiglitazone)、突光團、螯合金屬絡(luò)合物、放射性同位素、熒光標記物、脲酶、堿性磷酸酶、脂質(zhì)體、微囊體、微粒、納米粒子、磁珠、微型裝置(microdevice)、博萊霉素、放線菌素D、道諾霉素、阿霉素(亞德里亞霉素(Adriamycin))、普卡霉素(plicamycin)(光輝霉素(mithramycin))和依達比星(idarubicin)、鉬配位絡(luò)合物、蒽二酮(anthracenedione)、經(jīng)取代的脲、甲肼衍生物、安口丫P定(amsacrine)、L-天冬酰胺酶和維甲酸(tretinoin)、卡鉬、順鉬(順式-DDP)、米托蒽醌(mitoxantrone)、羥基脲、丙卡巴肼、IgFc融合蛋白、酶融合蛋白、突光蛋白、發(fā)光蛋白或其組合和類似物。
[0032]因此，本文所描述的實施方案包含打算解決與診斷、預(yù)防和/或治療脂肪相關(guān)病癥的現(xiàn)有技術(shù)方法相關(guān)的各種不足的特征和優(yōu)點的組合。上文所描述的各種特征以及其他特性將在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀以下發(fā)明詳述之后并通過參考附圖顯而易見。
[0033]附圖簡述
[0034]圖1描繪MSC導(dǎo)向肽的篩選。㈧描繪導(dǎo)向器官特異性MSC群體的肽的篩選的示意圖。三種經(jīng)噬菌體展示的環(huán)狀肽文庫的混合物用于4輪同步多器官生物淘選。在每一輪選擇中，使紅系細胞(TER119+)、內(nèi)皮細胞(⑶31+)和造血細胞(⑶45+)免疫耗竭，然后使用FACS從WAT、肺、骨髓和骨骼肌收集CD34+CD31-CD45-細胞(MSC)。(B)與結(jié)合于對照器官的MSC的噬菌體-肽平行地定量、擴增、匯集結(jié)合于WAT MSC(ASC)的噬菌體-肽，并用于下一輪生物淘選。在連續(xù)輪次中噬菌體轉(zhuǎn)化單位(TU)的回收率增加反映了導(dǎo)向個別靶器官的MSC的噬菌體-肽富集。(C)以WAT⑶34+⑶31-⑶45-細胞上回收的TU與肺⑶34+⑶31-⑶45-細胞上回收的TU的比率針對獨立地注射到小鼠中的個別噬菌體-肽克隆評估ASC導(dǎo)向的相對特異性。Fd-Tet:對照無插入噬菌體。所示值是三次重復(fù)測量的平均值 +SD0 [0035]圖2描繪導(dǎo)向ASC的環(huán)狀WAT7肽(SEQ ID NO:13)的驗證。圖A-D是在從靜脈內(nèi)注射有噬菌體展示W(wǎng)AT導(dǎo)向肽WAT7 (SEQ ID N0:13和14)或肺導(dǎo)向肽LU2(SEQ ID NO:19)的小鼠得到的經(jīng)過福爾馬林(formalin)固定的WAT和肺的石蠟切片中的共焦抗噬菌體(紅色)和抗⑶31 (亮綠色)免疫熒光。數(shù)字通道合并后的紅色信號指示噬菌體在非內(nèi)皮細胞血管周細胞上的定位(箭號)，對于WAT7(SEQ ID NO:13)觀測到定位于WAT(A)中而非肺(B)中，并且對于LU2(SEQ ID NO:19)觀測到定位于肺(D)而非WAT (C)中。圖E-J說明靜脈內(nèi)注射后I小時生物素化肽WAT7的生物分布，其通過檢測鏈霉親和素_Cy3(紅色)的共焦顯微術(shù)揭示并與通過免疫熒光檢測的I3DGFRii (紅色)、⑶31 (亮綠色)或⑶45 (綠色)的組織表達對比。注意以與在ASC(F-G)上表達的TOGFRP重疊的模式，環(huán)狀WAT7 (SEQID NO:13)特異性地與血管周WAT細胞(E)的相關(guān)性(箭號)。如同TOGFRP —樣，WAT7不與⑶31+內(nèi)皮細胞(E)或⑶45+造血細胞⑶相關(guān)。在肺中未檢測到WAT7 (I)，不過富含PDGFR β +LSC(J)。核 T0PR03 染色是藍色。比例尺:100 μ Μ。
[0036]圖3描繪作為WAT7結(jié)合蛋白的核心蛋白聚糖(decorin)的純化。(A)將共價連接于EDC瓊脂糖的半胱氨酸環(huán)化合成肽WAT7 (SEQ ID NO:13)和WAT2(SEQ ID NO:3:對照)與從小鼠ASC得到的膜蛋白提取物一起孵育。洗滌后，用WAT2 (級分1-4)、WAT7 (級分5_8)和0.1M pH2.5甘氨酸(級分9-12)連續(xù)洗脫結(jié)合于WAT7親和柱的蛋白質(zhì)；對于WAT2親和柱來說，肽洗脫的順序顛倒。通過Bradford分析法測量每個級分中的蛋白濃度并繪制隨0D595吸光度而變的曲線。(B)將從每個級分得到的脫鹽蛋白質(zhì)涂布于塑料上并暴露于噬菌體展示的WAT7或WAT2。7/7:WAT7親和/ WAT7-噬菌體；2 / 7:WAT2親和/ WAT7-噬菌體；7/2:WAT7親和/ WAT2-噬菌體；2 / 2:WAT2親和/ WAT2-噬菌體?；谒拗骷毦腥竞蟮腡U回收率來定量噬菌體結(jié)合:WAT7親和級分5的WAT7噬菌體結(jié)合增加指示W(wǎng)AT7-結(jié)合蛋白的洗脫。(C)通過梯度4-15 % SDS-PAGE解析從WAT7親和級分I (對照)和5得到的蛋白質(zhì)。凝膠的考馬斯染色(Coomassie staining)顯示了用WAT7特異性洗脫的40kDa條帶(箭號)。質(zhì)譜法將相應(yīng)蛋白質(zhì)鑒別為DCN。
[0037]圖4描繪WAT中核心蛋白聚糖的過度表達。具有用內(nèi)皮細胞特異性抗⑶31抗體(亮綠色)復(fù)染的抗小鼠DCN或抗小鼠TOGFRii抗體(紅色)的經(jīng)過福爾馬林固定的石蠟包埋小鼠組織的共焦免疫熒光顯示了 DCN (箭號)和TOGFRii (箭頭)都在WAT中的血管周細胞(ASC)上表達(A、D)。發(fā)現(xiàn)DCN表達與肺(B)中的血管僅有很少關(guān)聯(lián)并且在骨髓(C)中無法檢測到，而I3DGFRii在肺基質(zhì)(E)和骨髓(F)中普遍表達。藍色:核T0PR03染色。比例尺:100μΜ。[0038]圖5說明DCN裂解片段(Λ DCN)是ASC上的WAT7受體。(A)從具有DCN抗體的小鼠WAT亞群提取的膜相關(guān)蛋白和可溶性蛋白的免疫印跡，其顯示了 ADCN(箭號)由ASC而不是由脂肪細胞特異性地表達。具有肌動蛋白抗體的凝膠的對照免疫印跡顯示了同等蛋白上樣。(B)從小鼠膜WAT SVF提取物得到的ADCN的親和純化。凝膠的考馬斯藍染色鑒別抗DCN IgG的輕鏈與重鏈之間的預(yù)期40kDa條帶(箭號)。(C)與全長小鼠和人類DCN比對的⑶中分離的ΔDCN的埃德曼降解微序列(Edman degradation microsequence)。指示先前所報告的蛋白酶裂解位點，從而促成前肽和核心DCN的加工。未示出對應(yīng)于mDCN的氨基酸56-295的序列。(D)測量WAT7與經(jīng)過細菌純化的重組小鼠ADCN的結(jié)合，通過ELISA與經(jīng)過細菌純化的重組全長核心小鼠DCN(mDCN)、全長糖基化小鼠DCN(mDCN*)、糖基化牛DCN(bDCN*)和BSA相比。繪制0D450吸光度隨肽濃度而變的曲線，其顯示了劑量依賴性ADCN-WAT7和mDCN-WAT7結(jié)合。示出三個重復(fù)孔的平均值土 SD ;*P〈0.05。(E)從小鼠WAT SVF提取的總細胞和細胞膜相關(guān)蛋白的抗DCN免疫印跡，其顯示了 Λ DCN(箭號)與細胞膜相關(guān)。(F) ADCN于小鼠ASC表面上的暴露，其通過用生物素化試劑處理細胞來評估。對生物素化蛋白(用鏈霉親和素珠分離)進行抗DCN免疫印跡法，揭示了 ADCN(箭號)在新鮮分離的ASC上而不是經(jīng)過培養(yǎng)的ASC上經(jīng)歷生物素化。(G)用慢病毒(Ientivirus)表達GFP (載體)、全長核心小鼠DCN-GFP融合體(DCN)或小鼠Λ DCN-GFP融合體(ADCN)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的3T3-L1細胞。GFP免疫熒光顯示GFP-ADCN融合體的細胞表面定位。比例尺:10 μ Μ。
[0039]圖6描繪通過模擬抵抗素(resistin)的WAT7與ADCN的結(jié)合。㈧上圖:凝膠的考馬斯染色，其顯示了 GST(I)和重組GST融合肽1411(2)、14了2(3)、14了7(4)、1^2(5)的純化，與以下對照平行分析:KGGRAKD肽(6)、抑制素蛋白(prohibitin protein) (7)和WLGEWLG肽。中圖:具有抗WAT7抗體的相同凝膠的免疫印跡。下圖:具有從用于產(chǎn)生抗WAT7抗體的兔得到的免疫前血清的相同凝膠的免疫印跡。(B)從小鼠培養(yǎng)的3T3-L1成纖維細胞、培養(yǎng)的ASC、培養(yǎng)的LSC以及從具有抗WAT7抗體的WAT、骨髓或肺新鮮分離的細胞中提取的總蛋白的免疫印跡檢測了特異性13kDa蛋白(箭頭)。(C)具有從WAT提取物得到的抗WAT7抗體的小鼠蛋白的親和純化。凝膠考馬斯染色揭示關(guān)于抗WAT7IgG的輕(L)和重(H)鏈的相同13kDa蛋白，鑒別為抵抗素。(D)測量FLAG標記的抵抗素和對照蛋白(BAP)與經(jīng)過細菌純化的重組小鼠ADCN的結(jié)合，通過ELISA與經(jīng)過細菌純化的重組全長核心小鼠DCN(mDCN)、his6標記的對照蛋白CLIC4 (Ctrl-prot)、全長糖基化小鼠DCN(mDCN*)、糖基化牛DCN(bDCN*)和BSA比較。繪制0D450吸光度隨FLAG標記的蛋白濃度而變的曲線，其顯示了劑量依賴性ADCN /抵抗素結(jié)合。
[0040]圖7說明Λ DCN表達對前脂肪細胞的影響。對用慢病毒表達GFP (載體)、全長核心小鼠DCN-GFP融合體(DCN)或小鼠ADCN-GFP融合體(ADCN)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的3T3-L1細胞進行功能分析法。(A)通過MTT分析法測量在指定時間點5，000個粘附細胞的增殖。示出三個重復(fù)孔的平均值士 SD ;*Ρ〈0.05。(B)通過轉(zhuǎn)移小室(Transwell)分析法測量的25，000個預(yù)饑餓細胞通過5μ M孔隙朝向10% FBS的遷移。12小時后，將轉(zhuǎn)移小室底部的細胞固定，染色并計數(shù)。所示值為三個重復(fù)孔的平均值土SD ;*Ρ〈0.05。(C)下圖:在誘導(dǎo)脂肪生成后10天通過用相差顯微術(shù)檢測的脂滴累積而測量的脂肪細胞分化。比例尺:10 μ Μ。
[0041]圖8Α為同步體內(nèi)噬菌體展示篩選的示意性描述。在每一輪選擇中，靜脈內(nèi)施用噬菌體，同時從η個靶組織回收，擴增，匯集并用于下一輪選擇。在稍后的輪次中噬菌體轉(zhuǎn)化單位(TU)的回收率增加反映了選擇優(yōu)先導(dǎo)向靶器官的肽。 [0042]圖8Β說明通過流式細胞測量術(shù)對MSC的鑒別。示出代表性皮下WAT分析。對表達⑶34+的活細胞進行門控(左散點圖)，然后基于⑶31和⑶45表達進行門控(右散點圖)，將⑶34+⑶45-⑶31-ASC鑒別為Q3中的紫色事件。Ql中的紫色事件對應(yīng)于⑶34+⑶45-⑶31+內(nèi)皮細胞。Q2和Q4中的事件對應(yīng)于⑶45+造血細胞。
[0043]圖9Α說明使用噬菌體-細胞結(jié)合分析法評估噬菌體展示篩選中分離的若干肽的選擇性。分析表達肽 WATl (SEQ ID NO:1 和 2)、WAT2(SEQ ID NO:3 和 4)、WAT7 (SEQ ID NO:13 和 14)、LU2 (SEQ ID NO:19 和 20)、mPep (SEQ ID NO:35 和 36)的噬菌體或無插入噬菌體(Fd-Tet)對以下各項的結(jié)合:(1)4T1.2細胞，從人類乳腺癌得到的內(nèi)皮細胞；(2)小鼠3T3-L1細胞(可以分化成類脂肪細胞表型的前脂肪細胞系)；(3)從WAT得到的原代小鼠SVF細胞；(4)從肺得到的原代小鼠SVF細胞；以及(5)從WAT得到的人類ASC細胞的第4代(從左到右的條棒)。在37C下加入指定肽-噬菌體以及無插入Fd-tet對照噬菌體(IO8TU),持續(xù)I小時。用RPMI / I % BSA洗滌3次后，用勻化器使細胞急速下降。使用所回收的噬菌體感染K91大腸桿菌，并在四環(huán)素(tetracyline)選擇后，對集落進行計數(shù)以定量平均轉(zhuǎn)化單位(TU)。示出三個個別涂板土SEM(誤差條)的平均值。
[0044]圖9B說明使用噬菌體-細胞結(jié)合分析法評估噬菌體展示篩選中分離的若干肽的選擇性。分析表達肽 WATl (SEQ ID NO:1)、WAT2 (SEQ ID NO:3)、WAT7 (SEQ ID NO:13)、LU2 (SEQ ID NO: 19), mPep (SEQ ID NO:35)的噬菌體或無插入噬菌體(Fd-Tet)對未傳代的人類WAT SVF的結(jié)合。在37°C下加入指定肽-噬菌體以及無插入Fd-tet對照噬菌體(IO8TU)，持續(xù)I小時。用RPMI / 1% BSA洗滌3次后，用勻化器攪勻(dounce)細胞。使用所回收的噬菌體感染K91大腸桿菌，并在四環(huán)素(tetracyline)選擇后，對集落進行計數(shù)以定量平均轉(zhuǎn)化單位(TU)。示出三個個別涂板土SEM(誤差條)的平均值。
[0045]圖10說明靶向的嵌合細胞毒性肽的結(jié)構(gòu)，其中導(dǎo)向或靶向環(huán)狀肽經(jīng)連接子偶合于細胞毒性肽/促細胞凋亡肽。
[0046]圖 11 說明 WAT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NO:13_SEQ ID NO:31)全 D 肽(0.01mM、0.05mM和0.1OmM)的劑量依賴性體外殺死活性并由此說明稱為WAT7 (SEQ ID NO:13)的ASC導(dǎo)向肽靶向培養(yǎng)物中原代小鼠ASC的有效殺死的能力，如使用錐蟲藍排除法可視化。
[0047]圖12 說明細胞凋亡是經(jīng)過 WAT7-KLAKLAK2(SEQ ID NO:13_SEQ ID NO:31)全 D 肽處理的細胞的死亡原因的驗證。使用AP0-TRACE試劑(Sigma)和流式細胞測量術(shù)來檢測經(jīng)過處理的細胞中的細胞凋亡誘導(dǎo)以驗證細胞凋亡是細胞死亡的機制。示出經(jīng)過未靶向的細胞凋亡肽處理的細胞和經(jīng)過WAT7靶向的細胞凋亡肽處理的那些細胞。
[0048]圖13示出了用2mg對照或用靶向的細胞毒性肽WAT7_KLAKLAK2 (SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:31)全D肽處理后48小時的肥胖小鼠?？梢钥闯觯?jīng)過靶向的細胞毒性肽WAT7-KLAKLAK2(SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全D肽處理的小鼠中脂肪組織的量減少。[0049]圖14示出了用靶向的細胞毒性肽WAT7-KLAKLAK2(SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全D肽處理已消耗掉皮下WAT中所存在的ASC(圖F對圖E)，但對腹膜內(nèi)WAT的影響顯著更大(圖H對圖G)，而且促使腫瘤壞死(如圖B對圖A和圖D對圖C中所示)。
[0050]圖15 說明通過用細胞毒性 WAT7-KLAKLAK2(SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全 D 肽處理而誘導(dǎo)的細胞凋亡被限制在靶組織。使用AP0-TRACE試劑(Sigma)和流式細胞測量術(shù)來檢測皮下和腹膜內(nèi)WAT細胞中而不是從腎或外周血得到的細胞中的細胞凋亡誘導(dǎo)。非靶向的細胞凋亡的缺少指示細胞毒性嵌合肽對蛋白水解有抗性。
[0051]圖16說明(A)從具有針對小鼠DCN的抗體的小鼠WAT、肺和骨髓(B.M.)中提取的膜相關(guān)蛋白和可溶性蛋白的免疫印跡。指示非糖基化核心DCN(箭頭)和WAT特異性同工型(箭號)的遷移。具有ANX2A抗體的凝膠的對照免疫印跡顯示了同等膜蛋白上樣。(B)通過ELISA測量WAT7 (上圖)和WAT2對照(下圖)肽與重組核心小鼠DCN(mDCN)、糖基化牛DCN(bDCN*)和BSA的結(jié)合。繪制0D450吸光度隨肽濃度而變的曲線，其顯示了劑量依賴性 mDCN-WAT7 結(jié)合。
[0052]序列表簡述
[0053]序列表提供結(jié)合哺乳動物脂肪組織和肺組織的肽的氨基酸序列。結(jié)合于白色脂肪組織(WAT1-8)的半胱氨酸環(huán)化肽的氨基酸序列呈現(xiàn)于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15中。相應(yīng)非半胱氨酸環(huán)化肽呈現(xiàn)于SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12和14中。
[0054]結(jié)合肺組織(LU1-4)的半胱氨酸環(huán)化肽的氨基酸序列呈現(xiàn)于SEQ ID NO:17,19,21和23中，而相應(yīng)非半胱氨酸環(huán)化肽呈現(xiàn)于SEQ ID NO: 18、20、22和24中。
[0055]先前所公開的脂肪結(jié)合肽(半胱氨酸環(huán)化)的氨基酸序列以SEQ ID NO:25呈現(xiàn)，而相應(yīng)非半胱氨酸環(huán)化肽序列以SEQ ID N0:26呈現(xiàn)。
[0056]各種對照肽的氨基酸序列以半胱氨酸環(huán)化肽形式呈現(xiàn)于SEQ ID NO ,21和29中，而相應(yīng)非半胱氨酸環(huán)化對照肽呈現(xiàn)于SEQ ID NO:28和30中。各種已知細胞毒性肽和/或促細胞凋亡肽的氨基酸序列以半胱氨酸環(huán)化肽形式呈現(xiàn)于SEQ ID NO:31和33中，而相應(yīng)非半胱氨酸環(huán)化肽呈現(xiàn)于SEQ ID NO:32和34中。
[0057]稱為mP印的肽的氨基酸序列以半胱氨酸環(huán)化肽形式呈現(xiàn)于SEQ ID NO:35中，而相應(yīng)非半胱氨酸環(huán)化肽呈現(xiàn)于SEQ ID NO:36中。
[0058]發(fā)明詳述
[0059]定義
[0060]在本公開中，除非另有特別規(guī)定，否則單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)，詞語“一個(種)”意味著“至少一個(種)”，并且“或”的使用意味著“和/或”。此外，術(shù)語“包括”以及其他形式(如“包括了”和“已包括”)的使用沒有限制性。而且，除非另有特別規(guī)定，否則如“要素”或“組分”的術(shù)語涵蓋包含一個單元的要素和組分和包含一個以上單元的要素或組分。
[0061]本文所用的章節(jié)標題僅僅是出于組織目的，并且不應(yīng)視為限制所描述的主題。本申請中所引用的所有文獻或文獻部分，包括(但不限于)專利、專利申請、文章、書籍和論文，特此出于任何目的通過引用整體明確并入本文中。在所并入的文獻和類似材料中的一者或多者以與一個術(shù)語在本申請中的定義相矛盾的方式定義那個術(shù)語的情況下，以本申請為準。
[0062]如本文所用并 且除非另有指示，否則術(shù)語脂肪相關(guān)病癥包括(但不限于)白色或棕色脂肪組織的病癥、脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂，其包括(但不限于)與體重相關(guān)的病癥，如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、代謝綜合征，以及與體重增加、維持體重減輕、體重減輕后體重反彈的風險相關(guān)的病狀，以及相關(guān)的血糖紊亂、糖尿病、高血壓、纖維化病狀和癌癥。
[0063]如本文所用并且除非另有指示，否則術(shù)語“治療(treat / treating /treatment) ”和“療法”涵蓋在患者罹患白色脂肪相關(guān)病癥的同時所發(fā)生的行為，其減輕如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂的一種或多種癥狀或影響的嚴重性。在上下文允許的情況下，術(shù)語“治療”也指代為了確保如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂的風險增加的個體能夠在如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂發(fā)作之前接受適當手術(shù)和/或其他醫(yī)療干預(yù)而采取的行為。如本文所用并且除非另有指示，否則術(shù)語“預(yù)防(prevent/preventing / prevention) ”涵蓋在患者開始罹患如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂之前所發(fā)生的行為，其延遲如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂的發(fā)作，和/或抑制或減輕其嚴重性。
[0064]如本文所用并且除非另有指示，否則術(shù)語“管理(manage / managing /management)”涵蓋在已經(jīng)罹患如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂的患者中預(yù)防、延遲這種疾病、病癥或病狀復(fù)發(fā)，或減輕這種疾病、病癥或病狀復(fù)發(fā)的嚴重性。該術(shù)語涵蓋調(diào)節(jié)如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂的開始、發(fā)展和/或持續(xù)時間，或改變患者對脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂作出反應(yīng)的方式。
[0065]如本文所用并且除非另有規(guī)定，否則化合物的“治療有效量”為足以在治療或管理如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂方面提供任何治療效益或使與如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂相關(guān)的一種或多種癥狀延遲或減到最小的量?；衔锏闹委熡行Я恳馕吨鴨为毣蚺c一種或多種其他療法和/或治療劑組合的化合物的量，其在治療或管理如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂方面提供任何治療效益。術(shù)語“治療有效量”可以涵蓋緩和如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂，改善或減輕如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂，改善總體療法，或增強另一種治療劑的治療功效的量。
[0066]如本文所用并且除非另有規(guī)定，否則化合物的“預(yù)防有效量”為足以預(yù)防或延遲如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂或者與如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂相關(guān)的一種或多種癥狀的發(fā)作，或預(yù)防或延遲其復(fù)發(fā)的量。化合物的預(yù)防有效量意味著單獨或與一種或多種其他治療和/或預(yù)防劑組合的化合物的量，其在預(yù)防如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂方面提供預(yù)防效益。術(shù)語“預(yù)防有效量”可以涵蓋預(yù)防如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂，改善總體預(yù)防，或增強另一種預(yù)防劑的預(yù)防功效的量。“預(yù)防有效量”可以在例如脂肪組織相關(guān)病癥發(fā)展之前開立。[0067]如本文所用，“患者”或“受試者”包括能夠罹患本文所描述的如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪組織相關(guān)體組成或體重紊亂的有機體，如人類和非人類哺乳動物。優(yōu)選的人類動物包括人類受試者。如本文所用的術(shù)語“非人類哺乳動物”包括所有哺乳動物，例如，嚙齒動物、小鼠、大鼠等；以及非人類靈長類動物、伴侶動物和牲畜，例如，綿羊、狗、奶牛、馬等。
[0068]如本文所用，“靶向肽”為包含氨基酸的連續(xù)序列的肽，其特征在于選擇性定位到器官、組織或細胞類型。選擇性定位可以例如通過以下所公開的方法來確定，其中將推定靶向肽序列并入到在噬菌體的外表面上展示的蛋白質(zhì)中。將已經(jīng)過遺傳工程改造以表達眾多具有不同氨基酸序列的這些靶向肽的這種噬菌體的文庫施用受試者之后，從該受試者收集一種或多種器官、組織或細胞類型并鑒別在那個器官、組織或細胞類型中所發(fā)現(xiàn)的噬菌體。如果表達靶向肽序列的噬菌體在一個組織或器官中與對照組織或器官相比展現(xiàn)出較高結(jié)合的話，那么就認為這種噬菌體選擇性地定位到那個組織或器官。優(yōu)選地，靶向肽的選擇性定位應(yīng)使得噬菌體在靶器官、組織或細胞類型中的富集是在對照器官、組織或細胞類型中的兩倍或更多倍。使得在靶器官中富集是在對照器官、組織或細胞類型中的至少三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍或更多倍的選擇性定位為更優(yōu)選的。或者，展現(xiàn)出選擇性定位的表達靶向肽序列的噬菌體優(yōu)選地顯示出在靶器官中的富集與對照器官相比增加，此時將從靶器官回收的噬菌體再注射到第二宿主中以供另一輪篩選。在第三輪篩選之后可以展現(xiàn)出進一步富集。用以確定選擇性定位的另一種替代方式為表達推定靶向肽的噬菌體所展現(xiàn)的在靶器官中的富集優(yōu)選地是表達非特異性肽或未經(jīng)遺傳工程改造以表達任何推定靶向肽的對照噬菌體的兩倍，更優(yōu)選地是三倍或更多倍?！鞍邢螂摹焙汀皩?dǎo)向肽”在本文中同義使用。
[0069]如本文所用，“噬菌體展示文庫”意味著已經(jīng)過遺傳工程改造以在外表面上表達一組推定靶向肽的噬菌體的集合。在優(yōu)選實施方案中，將編碼推定靶向肽的DNA序列框內(nèi)插入到編碼噬菌體封套蛋白的基因中。在其他優(yōu)選實施方案中，推定靶向肽序列一部分是所有二十種氨基酸的隨機混合物，并且一部分是非隨機混合物。在某些優(yōu)選實施方案中，噬菌體展示文庫的推定靶向肽在靶向肽序列內(nèi)的固定位置處展現(xiàn)一個或多個半胱氨酸殘基。半胱氨酸可以用于例如形成環(huán)狀肽。
[0070]“大分子復(fù)合物”是指在排`列方面可以隨機、有序或部分有序的分子的集合。該術(shù)語涵蓋生物有機體，如噬菌體、病毒、細菌、單細胞病原性有機體、多細胞病原性有機體以及原核或真核細胞。該術(shù)語也涵蓋分子的無生命裝配體，如脂質(zhì)體、微囊體、微粒、納米粒子、磁珠和微型裝置。唯一的要求是復(fù)合物含有多于一個分子。這些分子可以是相同的，或可以彼此不同。
[0071]靶向肽的“受體”包括(但不限于)結(jié)合于靶向肽的任何分子或大分子復(fù)合物。受體的非限制性實例包括肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、表位、脂質(zhì)、碳水化合物、多分子結(jié)構(gòu)、一個或多個分子的特定構(gòu)象，以及形態(tài)解剖學實體(morphoanatomic entity)。在優(yōu)選實施方案中，“受體”是靶器官、組織或細胞類型內(nèi)形成血管的細胞的腔表面上所存在的天然產(chǎn)生的分子或分子復(fù)合物。
[0072]提供用于產(chǎn)生選擇性靶向肽的組合物和方法。在一些實施方案中，提供對脂肪組織具有選擇性或特異性的特定靶向肽，包括(但不限于)SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18 或 SEQID NO:19 ;并且在其他實施方案中，對脂肪組織具有選擇性的靶向肽可以用于選擇性或特異性地將治療劑遞送到靶組織，如脂肪組織。在某些實施方案中，所述方法涉及對特定靶細胞、組織或器官(如脂肪)具有選擇性或特異性的靶向肽的制備和鑒別。脂肪靶向肽包括(佃不限于)CKGGRAKDC(SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26 和 SEQ ID N0:l_16)。對照肽包括(但不限于)CARAC (SEQ ID NO:27 和 28)或 CGDKAKGRC (SEQ ID NO:29 和 30)。[0073]白色脂肪代表獨特的組織，其如同腫瘤一樣，可以迅速增生并擴充(Wasserman，Handbook of Physiology, Renold 和 Cahill 編，第 87-100 頁，American PhysiologicalSociety, Washington, D.C.，1965 ；Cinti, Eat.Weight.Disord.5:132-142, 2000)。對脂肪組織的研究揭示了其高度血管化。多個毛細血管與每個脂肪細胞接觸，表明血管結(jié)構(gòu)對維持脂肪質(zhì)量的重要性(Crandall等人，Microcirculation4:211-232,1997)。脂肪組織增生可能依靠血管生成，這類似于腫瘤。如果是這樣的話，那么破壞脂肪新生血管結(jié)構(gòu)可以防止肥胖癥的發(fā)展，而靶向現(xiàn)有脂肪血管可以潛在地促使脂肪衰退。使用脂肪靶向肽的方法可以包括誘導(dǎo)重量減輕，治療肥胖癥或其他脂肪相關(guān)病癥，例如(但不限于)癌癥和纖維化的成像或治療。
[0074]公開以下兩項的組合:體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)(如以下文獻以及其他文獻中所描述:美國專利申請 US20090104117、US20060094672、US20060239968、US20090221505、US20080176792、US20080124277、US20100172864、US20040170955、US20010046498,以及Kolonin等人，Nature Medicine ； 10,625-32, 2004)與用于分離導(dǎo)向所關(guān)注器官中的選擇性細胞群體的肽的熒光激活細胞分選(FACS)。這種體內(nèi)選擇系統(tǒng)與噬菌體展示文庫組合使用以鑒別器官、組織或細胞類型-靶向肽。在噬菌體表面上表達轉(zhuǎn)基因肽的噬菌體展示文庫可以通過將隨機寡核苷酸插入到編碼噬菌體表面蛋白的cDNA中，產(chǎn)生以許多變換展示獨特肽的噬菌體粒子的集合來產(chǎn)生。噬菌體展示是噬菌體文庫表達例如并入到噬菌體外殼蛋白中的一組具有規(guī)定長度的隨機肽序列的技術(shù)，并且結(jié)合于靶分子、細胞、組織(例如脂肪組織)或器官的肽序列是通過將噬菌體展示文庫與標靶一起孵育并選擇結(jié)合的肽來鑒別。洗掉未結(jié)合的噬菌體，并且將結(jié)合的噬菌體洗脫并收集?？梢詳U增所收集的噬菌體，并進行進一步結(jié)合/擴增周期以富集肽庫中選擇性和/或特異性地結(jié)合于標靶的那些肽。在每個周期下，富集庫中含有針對所關(guān)注標靶的靶向肽的噬菌體部分。在若干周期之后，可以通過DNA測序來表征個別噬菌體克隆以鑒別靶向肽序列(生物淘選，參見例如 US20050187161 以及 Pasqualini 和 Ruoslahti, Nature380:364-66,1996 ；Arap 等人，Science279:377-80,1998)。
[0075]將噬菌體展示文庫靜脈內(nèi)(1.V.)施用小鼠之后，從個別器官回收噬菌體。基于在噬菌體外表面上表達的特異性靶向肽序列，回收能夠選擇性導(dǎo)向脂肪組織的噬菌體。通過這種方法已鑒別多種器官和腫瘤導(dǎo)向肽(參見例如美國專利文獻:US20060094672、US20080124277、US20090104117、US20090221505 和 US20100172864)。
[0076]以下特定實例提供這種方法當應(yīng)用于白色脂肪(adipose / fat)組織(WAT)時的有效性的顯示，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，這種技術(shù)可以應(yīng)用于棕色脂肪組織(BAT)并且甚至應(yīng)用于從各種組織和器官得到的其他細胞類型。WAT含有充足供應(yīng)的周細胞性脂肪基質(zhì)細胞(ASC)，其屬于間質(zhì)干細胞(MSC)的類別。MSC具有⑶34+⑶31-⑶45-細胞表面特征。MSC和ASC的多能性質(zhì)以及其高增殖速率和遷移能力意味著其可以是有益的和病原性的。ASC已顯示負責肥胖癥中的脂肪組織擴充，而且促進癌癥進展并可能促進伴有纖維化的其他疾病(Zhang 等人，Cancer Res.69:5259-5266,2009)。
[0077]為了顯示體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)與FACS篩選方法的該組合的成功性，在活小鼠中篩選針對ASC標記物的肽文庫。篩選包含環(huán)狀CX7C、CXS(^P CX9C (其中C代表半胱氨酸并且X代表任何殘基)的隨機肽文庫的混合物。將噬菌體-肽文庫注射到動物中并進行4輪體內(nèi)同步多器官生物淘選以富集WAT導(dǎo)向肽。在每一輪選擇中，靜脈內(nèi)施用噬菌體并從WAT和對照器官的基質(zhì)/血管部分(SVF)回收，擴增，匯集，并且用于下一輪。使用FACS消耗掉結(jié)合于內(nèi)皮細胞(⑶31+)和造血細胞(⑶45+)的噬菌體-肽并收集結(jié)合于⑶34+⑶31TD45_ASC的噬菌體-肽。在每個后續(xù)輪次中噬菌體轉(zhuǎn)化單位(TU)的回收率增加顯示了噬菌體富集，這反映了選擇導(dǎo)向WAT和其他靶器官的⑶34+⑶31TD45—細胞的噬菌體-肽。
[0078]結(jié)果為使用包括在內(nèi)以供反選擇的對照器官來鑒別當體內(nèi)注射時導(dǎo)向ASC，而不導(dǎo)向MSC的肽。所篩選的器官包括肺、骨、骨髓和骨骼肌。指定為WAT7 (序列CSWKYWFGEC和SffKYffFGE:分別為SEQ ID NO:13和14)的一種特定肽顯示最確定的ASC靶向模式，而肽LU-2(序列CESGFPTVGC:SEQ ID NO:19和20)被選作靶向肺中的MSC的對照肽。
[0079]個別噬菌體-肽克隆導(dǎo)向WAT的⑶34+⑶31_CD45_細胞的特異性通過注射到小鼠中來顯示。帶有WAT-7肽的噬菌體的結(jié)合與肺MSC的結(jié)合相比在ASC上高度富集(見圖1C)。相比之下，所測試的α5β I導(dǎo)向肽mPep(Nie等人，2008，同上)和其他對照肽并未展示出任何WAT特異性。
[0080]WAT7 為環(huán)狀八肽(氨基酸序列 CSffKYffFGEC 和 SffKYffFGE (SEQ ID NO: 13 和 14)，其當全身施用時導(dǎo)向ASC，而不導(dǎo)向其他器官中的MSC。WAT7可以經(jīng)由末端CYS部分來環(huán)化。WAT-7用作引誘物來以生物化學方式純化相應(yīng)ASC表面受體，將其鑒別為先前所忽視的核心蛋白聚糖(DCN)蛋白同工型，即缺乏糖基化位點的溶蛋白性裂解片段。已確定，這種截短DCN (稱為Λ DCN (deIta-DCN))由ASC過度表達并且暴露于細胞表面上，由此提供新ASC標記物。另外，通過扭轉(zhuǎn)想法并且篩選模擬WAT-7的蛋白質(zhì)，將抵抗素鑒別為WAT中的ADCN的內(nèi)源性配體。前脂肪細胞中ADCN`的異常表達誘導(dǎo)與先前以抵抗素所報道的一致的表型，這支持以下結(jié)論:抵抗素-ADCN相互作用控制信號傳導(dǎo)級聯(lián)，這些信號傳導(dǎo)級聯(lián)控制ASC的命運?？梢匀碜⑸渌_的肽以消耗選擇性細胞群體。在下文的實施例中，詳細描述靶向白色脂肪組織(WAT)中的脂肪干細胞(ASC)的肽。ASC靶向可以有益地作為肥胖癥、癌癥和纖維化的療法。
[0081]使用肽作為靶向肽并且產(chǎn)生例如偶合于顯示靶組織(包括(但不限于)脂肪組織)的選擇性和/或特異性結(jié)合的促細胞凋亡雜合肽的體內(nèi)細胞靶向雜合肽先前已有報道(參見例如美國專利申請公布US20090104117、US20060094672, US20060239968、US20090221505、US20080176792、US20080124277 和 US20100172864)。這些雜合肽是由兩個功能結(jié)構(gòu)域組成的合成肽:結(jié)合于在所關(guān)注細胞上差異性表達的受體的導(dǎo)向(細胞靶向)結(jié)構(gòu)域和引起使肽內(nèi)化的細胞發(fā)生凋亡性死亡的細胞毒性結(jié)構(gòu)域。導(dǎo)向肽典型地為7到8個氨基酸的長度并且為環(huán)狀(由兩個二硫鍵鍵合的半胱氨酸限制)。細胞毒性結(jié)構(gòu)域為兩親性肽序列KLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO:31)，指定為(KLAKLAK)2，其在受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)化后破壞線粒體膜并且促使程序性細胞死亡(細胞凋亡)。這些細胞毒性肽還包括包含具有式(FXR)n的那些的細胞毒性肽，其中n=4、6、8和10，并且其中F為苯丙氨酸，F(xiàn)x為環(huán)己基-丙氨酸并且Hex為6碳烷基鏈殘基，實例為(KFAKFAK)2、(KFxAKFXAK)2和(KHexAKHexAK) 2,以及例如以下文獻中所描述的那些:Horton, KL和Kelley, S0.EngineeredApoptosis-1nducing Peptides with Enhanced Mitochondrial Localization andPotency.J.Med.Chem.52, 3293-3299, 2009 ；Yousif, L.F., Stewart, K.M., Horton, K.L.和Kelley, S.0.Mitochondria-Penetrating Peptides:Sequence Effects and ModelCargo Transport.ChemBioChem, 10:2081-2088,2009 ；Kelley SO, Stewart KM, MourtadaR.Development of novel peptides for Mitochondrial drug delivery:amino acidsfeaturing delocalized lipophilic cations.Pharm Res.Nov ；28 (11):2808-19,2011.Epub2011 年 8 月 11 日；Horton, KL, Pereiral, MP, Stewart, KM, Fonseca SB 和 Kelley,S0.Tuning the Activity of Mitochondria-Penetrating Peptides for Delivery orDisruption, ChemBioChem, 13 (3), 476-485, 2012.在線公布:2012 年 I 月 11 日。
[0082]然而，這些雜合肽的成功性先前已受限制，并且可能與毒性相關(guān)聯(lián)，這是因為導(dǎo)向結(jié)構(gòu)域和所公布的Gly-Gly連接子在傳統(tǒng)上由L-氨基酸組成，這些L-氨基酸在體內(nèi)可能經(jīng)歷蛋白水解。蛋白水解使活性雜合肽還原并且可能最終導(dǎo)致各種子肽釋放，其中一些子肽可能代表雜合肽的靶向或效應(yīng)部分。例如(但不限于)促細胞凋亡肽，如dKLAKLAK2(SEQID NO:31)的效應(yīng)肽而非靶向肽的可能釋放，可能導(dǎo)致有害反應(yīng)，如腎中毒。另外，因蛋白水解所致的不穩(wěn)定性會增加用于注射以獲得治療水平所必需的肽量。因此，現(xiàn)有技術(shù)的效應(yīng)肽的臨床功效和安全性受限制。
[0083]此外，因為包含早先描述的連接子區(qū)域的甘氨酸不會呈D型存在，所以全D促細胞凋亡肽的合成先前并不可能，直到如本文所描述用氨基己酸替換連接子才可能。另外，先前尚未嘗試從D型氨基酸構(gòu)建導(dǎo)向/靶向肽結(jié)構(gòu)域，這是由于關(guān)注到從L型(其中肽經(jīng)過原始分離)到D型的轉(zhuǎn)變可能導(dǎo)致構(gòu)象變化，這會使得與靶受體不相容和識別損失以及相應(yīng)的導(dǎo)向損失。然而，如本文所描述的這些全D肽以及現(xiàn)有技術(shù)的L肽可以導(dǎo)向靶細胞。
[0084]在一些實施方案中，組合物包括經(jīng)過分離的肽，其包含選自由SEQ ID NO:1_16組成的群組的氨基酸序列，其中所述肽結(jié)合于脂肪組織。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)組合物包含選自由SEQ IDNO:1-16組成的群組的氨基酸序列，并且在一些實施方案中，蛋白質(zhì)組合物完全由D-氨基酸組成。在一些其他實施方案中，蛋白質(zhì)組合物包含偶合于成像劑的肽。在一些實施方案中，靶向肽偶合于細胞毒性劑或促細胞凋亡劑。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)組合物包含偶合于誘導(dǎo)白色脂肪組織轉(zhuǎn)化為棕色脂肪組織的試劑的肽。在一些實施方案中，肽由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，肽經(jīng)連接子偶合于試劑或其他肽。在一些實施方案中，連接子包含氨基己酸。在一些實施方案中，連接子包含(CH2)4、(CH2)5, (CH2)6,(CH2)7, (CH2)8或其組合。在一些實施方案中，試劑激活白色脂肪組織上的b3-腎上腺素能受體。在一些實施方案中，試劑為肽；并且在一些實施方案中，肽由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，肽由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，肽經(jīng)連接子偶合于試劑或其他肽。在一些實施方案中，連接子包含氨基己酸。
[0085]在一些其他實施方案中，經(jīng)過分離的核酸組合物包含編碼選自由SEQ ID NO:1_16組成的群組的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些實施方案中，重組宿主細胞包含經(jīng)過分離的核酸分子，并且在一些其他實施方案中，表達載體包含經(jīng)過分離的核酸分子。在一些實施方案中，宿主細胞包含表達載體。
[0086]在一些實施方案中，將細胞毒性肽、細胞凋亡肽、反式發(fā)育(transdevelopmental)肽或成像肽遞送到脂肪組織的方法包括(a)偶合于具有選自由SEQ ID NO:1-16組成的群組的氨基酸序列的靶向肽，其中所述靶向肽選擇性地結(jié)合脂肪細胞。在一些實施方案中，肽由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，肽經(jīng)連接子肽偶合，并且在一些實施方案中，連接子包含氨基己酸。
[0087]在一些其他實施方案中，將化合物或試劑遞送到脂肪組織的方法包括:a)獲得選擇性地結(jié)合于脂肪組織的肽，其中所述肽的長度小于100個氨基酸并且包括具有選自由SEQ ID NO:1-16組成的群組的氨基酸序列的脂肪組織靶向基序，其中肽偶合于希望靶向脂肪組織的化合物或試劑jPb)使肽暴露于疑似含有脂肪組織的細胞群體。在一些實施方案中，肽包含連接子。在一些實施方案中，肽由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，肽和試劑都是由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，偶合經(jīng)連接子肽發(fā)生，并且在一些實施方案中，連接子包含氨基己酸。在一些實施方案中，試劑包含細胞毒性肽或促細胞凋亡肽。在一些實施方案中，試劑包含成像劑。在一些實施方案中，(b)包括使受試者暴露于肽以治療脂肪相關(guān)病癥。在一些實施方案中，細胞群體在人類受試者中。在一些實施方案中，細胞群體為薄的組織切片。在其他實施方案中，方法進一步包括檢測所述群體中的脂肪干細胞。在一些實施方案中，脂肪相關(guān)病癥為體組成紊亂、體重紊亂、肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病、代謝綜合征、纖維化或癌癥。
[0088]在其他實施方案中，經(jīng)過分離的肽包含選自由SEQ ID NO: 17-24組成的群組的氨基酸序列，并且其中所述肽結(jié)合于肺組織。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)組合物包含選自由SEQ ID NO:17-24組成的群組的氨基酸序列，并且在一些實施方案中，蛋白質(zhì)組合物完全由D-氨基酸組成。在其他實施方案中，提供蛋白質(zhì)組合物，其中肽偶合于成像劑。在一些實施方案中，提供蛋白質(zhì)組合物，其中肽偶合于細胞毒性劑或促細胞凋亡劑。在一些實施方案中，肽由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，偶合經(jīng)連接子肽發(fā)生，并且在一些實施方案中，連接子包含氨基己酸。
[0089]在嵌合細胞毒性肽組合物的`一種例示性組合物中，兩個結(jié)構(gòu)域中的所有氨基酸都已經(jīng)由D-對映異構(gòu)體構(gòu)建，并且由此對體內(nèi)蛋白水解有抗性，從而允許在全身施用后肽發(fā)揮長期作用。連接兩個結(jié)構(gòu)域的連接子為氨基己酸(Ahx):NH-(CH2) 5-C0，其在體內(nèi)也不會經(jīng)歷蛋白酶裂解。對于在下文的實施例中使用來說，嵌合肽在商業(yè)上生產(chǎn)(例如，由Anaspec、Bachem或Celtek生產(chǎn))并且通過常規(guī)肽化學法(“梅里菲爾德合成法(Merrifieldsynthesis)”)合成。
[0090]如下文的實施例中所描述，首先在體外使用經(jīng)過處理和未經(jīng)過處理的原代鼠類ASC 培養(yǎng)物的錐蟲藍染色來顯示由 Celtek(Celtek Bioscience, Nashville, TN37210)合成的WAT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全D肽的細胞毒性活性。使用Apo-Trace (Sigma, St.Louis, USA)和流式細胞測量分析,顯示祀向WAT7的促細胞凋亡肽確實誘導(dǎo)經(jīng)過處理的ASC細胞的細胞凋亡和細胞死亡(參見下文的實施例8)。為顯示W(wǎng)AT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全D肽的體內(nèi)活性和功效，將2mg肽注射到小鼠中，并且在用WAT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全D肽處理后48小時在WAT中檢測細胞死亡。在腎中和外周血中沒有鑒別出細胞死亡，并且甚至在肽劑量加大(至多100毫克/公斤體重)的情況下仍沒有達到MTD。這些發(fā)現(xiàn)明顯地顯示了使用靶向肽使細胞毒性結(jié)構(gòu)域靶向脂肪組織的功效，這種靶向肽是使用所公開的方法鑒別并且由于全D氨基酸組成而具有較高穩(wěn)定性。在一些實施方案中，對脂肪組織中的血管生成性血管結(jié)構(gòu)具有選擇性的靶向肽可以用于治療肥胖相關(guān)病癥，例如用于減輕體重或用于預(yù)防體重增加。通過使抗血管生成部分或毒性部分連接于脂肪靶向肽，可以選擇性地抑制供應(yīng)新脂肪組織的血管，從而防止新的脂肪沉積體生長并且潛在地除去現(xiàn)有的脂肪沉積體。因為棕色脂肪組織血管化程度更高，所以基于血管結(jié)構(gòu)的靶向方法非常有效地將治療試劑遞送到BAT以激活該組織。
[0091]在某些實施方案中，替代治療劑可以連接于靶向肽或融合蛋白以選擇性地遞送到例如白色脂肪組織。適合于使用的試劑或因子可以包括誘導(dǎo)細胞凋亡、細胞死亡、細胞停滯和/或抗血管生成的任何化合物。細胞凋亡或程序性細胞死亡是正常胚胎發(fā)育的基本過程，從而維持成體組織中的內(nèi)穩(wěn)定，并且抑制癌形成。這些肽的偶合和使用的實例包括(但不限于)美國專利申請 US20090104117、US20060094672、US20060239968、US20090221505、US20080176792和US20080124277。本公開的范圍內(nèi)所涵蓋的促細胞凋亡劑的非限制性實例包括短桿菌肽、蛙皮素、蜂毒素、防御素、殺菌肽、(KLAKLAK)2 (SEQ ID NO:31)、(KLAKKLA) 2 (SEQ ID NO:32)、(KAAKKAA) 2 (SEQ ID NO:33)或(KLGKKLG) 3 (SEQ ID NO:34)。
[0092]在某些實施方案中，包括施用連接于抗血管生成劑的靶向肽，抗血管生成劑如血管緊張素、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、凝血栓蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、甲酰胺基三唑、CM101、馬立馬司他、多硫戍聚糖、血管生成素2 (Regeneron)、干擾素-α、除莠霉素A、PNU145156EU6K催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可堿、染料木素、ΤΝΡ470、內(nèi)皮抑素、紫杉醇、阿庫汀、血管抑素、西多福韋、長春新堿、博萊霉素、AGM-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。
[0093]在某些實施方案中，施用連接于細胞毒性劑的靶向肽。這些細胞毒性化學治療劑包括(但不限于)5-氟尿嘧啶、博萊霉素`、白消安、喜樹堿、卡鉬、苯丁酸氮芥、順鉬(CDDP)、環(huán)磷酰胺、放線菌素D、道諾霉素、阿霉素、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊苷(VP16)、法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法侖、絲裂霉素、諾維本、亞硝基脲、匹可霉素、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫西芬、泰素、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反鉬、長春堿和甲氨蝶呤、長春新堿，或前述物質(zhì)的任何類似物或衍生物變體。大多數(shù)化學治療劑屬于以下類別:烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、皮質(zhì)類固醇激素、有絲分裂抑制劑和亞硝基脲、激素劑、天然產(chǎn)物、混雜劑(miscellaneous agent),以及其任何類似物或衍生物變體。
[0094]天然產(chǎn)物一般是指最初從天然來源分離，并且鑒別為具有藥理活性的化合物。這些化合物、其類似物和衍生物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)從天然來源分離，以化學方式合成或以重組方式產(chǎn)生。天然產(chǎn)物包括以下類別，如有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、酶和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。這些天然產(chǎn)物的實例包括(但不限于)可以抑制細胞分裂或有絲分裂所需的任一種蛋白質(zhì)合成的植物生物堿和其他天然劑，例如(但不限于)多烯紫杉醇、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、泰素、長春堿、長春新堿和長春瑞濱。[0095]化學治療劑和施用方法、劑量等為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見例如"Physicians Desk Reference", Goodman&Gilman' s" The Pharmacological Basisof Therapeutics〃和〃Remington' s Pharmaceutical Sciences"第 15 版,第 1035-1038頁和第1570-1580頁，相關(guān)部分通過引用并入本文中)，并且可以與根據(jù)本文的公開內(nèi)容所公開的組合物組合。取決于所治療的受試者的病狀，將必要地發(fā)生一些劑量變化。負責施用的人員在任何情況下將決定用于個別受試者的適當劑量。本文還描述了特定化學治療劑和劑量方案的實例。當然，本文所描述的所有這些劑量和試劑都是例示性而非限制性的，并且技術(shù)人員可以針對特定患者和應(yīng)用而使用其他劑量或試劑。介于這些點之間的任何劑量或其中可引出的范圍也預(yù)期包括在某些實施方案中。 [0096]在一些實施方案中，靶向WAT的肽可以用于遞送促使ASC細胞分化成BAT或促使WAT變成BAT的化合物或試劑?？梢杂肞PAR-Y激動劑使ASC分化成棕色脂肪細胞(Elabd等人Human multipotent adipose-derived stem cells differentiate into functionalbrown adipocytes.Stem Cells27，2753-2760，2009)。因此，在一些實施方案中，靶向PPAR-Y路徑的化合物或試劑，例如(但不限于)噻唑烷二酮類藥物(如羅格列酮)，也可以偶合于所描述的靶向肽并且用于調(diào)節(jié)脂肪生成以治療或預(yù)防脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂，如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥。
[0097]白色脂肪細胞也已經(jīng)在培養(yǎng)物中和體內(nèi)直接轉(zhuǎn)化為BAT樣表型(Cint1.Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.297,977-986, 2009)。這種轉(zhuǎn)化是通過交感神經(jīng)系統(tǒng)刺激來推動，如低溫和通過激活WAT中的b3-腎上腺素能受體而觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。因此，在一些實施方案中，激活腎上腺素能的化合物或試劑可以偶合于所描述的肽以靶向WAT而使其轉(zhuǎn)化為BAT，并且由此加以使用以治療或預(yù)防脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂，如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥。
[0098]在一些實施方案中，所公開的肽或蛋白質(zhì)可以連接于用于各種患病器官、組織或細胞類型的成像和診斷的成像劑。肽或蛋白質(zhì)經(jīng)過標記或與用作成像劑的熒光團或放射性示蹤劑偶聯(lián)。許多適當成像劑在本領(lǐng)域中是已知的，使用螯合金屬絡(luò)合物、放射性同位素、熒光標記物或酶使成像劑連接于蛋白質(zhì)或肽的方法也是已知的，這些螯合金屬絡(luò)合物、放射性同位素、熒光標記物或酶的存在可以使用比色標記物(例如(但不限于)脲酶、堿性磷酸酶、(辣根)過氧化氫酶和葡萄糖氧化酶)來檢測。
[0099]在一些實施方案中，成像偶聯(lián)物也將使用放射性同位素加雙標記以通過核方法組合成像并且制成獨特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)并針對結(jié)合親和力和藥代動力學進行優(yōu)化。這些試劑可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的眾多方法施用，包括(但不限于)經(jīng)口施用、吸入、皮下(sub-q)、靜脈內(nèi)(1.V.)、腹膜內(nèi)(1.P.)、肌內(nèi)(1.M.)或鞘內(nèi)注射，或如下文更詳細描述。在一些實施方案中，本文所描述的方法和組合物可以單獨使用或與其他技術(shù)組合使用，以診斷脂肪相關(guān)病癥的發(fā)病并監(jiān)測和引導(dǎo)脂肪相關(guān)病癥的的療法。
[0100]在一些實施方案中，靶向肽可以用于引導(dǎo)分子的無生命裝配體的遞送，這些無生命裝配體如脂質(zhì)體、微囊體、微粒、納米粒子、磁珠和微型裝置，其呈單獨或組合形式，含有抗微生物活性和細胞毒性活性的抗生素或與這些抗生素偶合，抗生素包括(但不限于)博萊霉素、放線菌素D、道諾霉素、阿霉素(亞德里亞霉素)、普卡霉素(光輝霉素)和依達比星?？梢允褂盟_的靶向肽遞送的其他類型的細胞毒性劑包括(但不限于)鉬配位絡(luò)合物、蒽二酮、經(jīng)取代的脲、甲肼衍生物、安吖啶、L-天冬酰胺酶和維甲酸。鉬配位絡(luò)合物包括如卡鉬和順鉬(順式-DDP)的化合物。一種例示性蒽二酮是米托蒽醌。一種例示性的經(jīng)取代的脲是羥基脲。一種例示性甲肼衍生物是丙卡巴肼(N-甲肼;MIH)。這些實例沒有限制性，并且預(yù)期任何已知的細胞毒性劑、細胞生長抑制劑或殺細胞劑可以連接于本發(fā)明所公開的靶向肽并施用至被靶向的器官、組織或細胞類型。可以用于各種實施方案中的所需靶向肽、細胞毒性肽或雜合肽氨基酸序列包括本文所描述的氨基酸序列，以及其類似物和衍生物。實際上，在一些實施方案中，可以使用由特定核苷酸序列編碼的任何所需肽氨基酸序列，也可以使用編碼所需肽氨基酸序列的所有或任何部分的任何多核苷酸序列。遺傳密碼的簡并性質(zhì)也是眾所周知的，并且，因此，每個編碼靶向肽、細胞毒性肽或雜合肽氨基酸的核苷酸序列一般代表熟知的核酸“三聯(lián)體”密碼子，或在許多情況下代表可以編碼氨基酸的密碼子。因而，如本文所預(yù)期，本文所描述的靶向肽、細胞毒性肽或雜合肽氨基酸序列當與遺傳密碼一起時(參見例如"Molecular Cell Biology〃，第109頁表4-1 (Darnell等人編,W.H.Freeman&Company, New York, NY, 1986)) —般代表可以編碼這些氨基酸序列的核酸序列的所有各種變換和組合。
[0101]這些功能上等效的靶向肽、細胞毒性肽、成像肽或雜合肽氨基酸序列包括(但不限于)由核苷酸序列編碼的氨基酸序列內(nèi)氨基酸殘基的加入或取代，但其會引起沉默變化(silent change),由此產(chǎn)生功能上等效的基因產(chǎn)物?？梢曰谒婕暗臍埢臉O性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)的相似性來進行氨基酸取代。舉例來說:非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷酰胺；帶正電荷的(堿性)氨基酸包括 精氨酸、賴氨酸和組氨酸；并且?guī)ж撾姾傻?酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0102]或者，可以基于氨基酸的親疏水性指數(shù)(hydropathic index)來進行氨基酸取代。每種氨基酸已基于其疏水性和電荷特征而賦予親疏水性指數(shù)。其為:異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。在賦予蛋白質(zhì)相互作用性生物功能方面使用親疏水性氨基酸指數(shù)在本領(lǐng)域中有所了解(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157:105-132,1982)。據(jù)知，在某些情況下，某些氨基酸可以取代具有類似親疏水性指數(shù)或分數(shù)的其他氨基酸，并且仍保持類似的生物活性。在基于親疏水性指數(shù)進行改變時，在某些實施方案中，包括親疏水性指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸取代；而在其他實施方案中，包括親疏水性指數(shù)在士 I以內(nèi)的氨基酸取代；并且在其他實施方案中，包括親疏水性指數(shù)在士
0.5以內(nèi)的氨基酸取代。
[0103]或者，可以基于親水性來進行氨基酸取代，特別是在由此產(chǎn)生的生物功能性蛋白質(zhì)或肽旨在用于免疫學實施方案中的情況下。在某些實施方案中，蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性(如由其相鄰氨基酸的親水性所主導(dǎo))與其免疫原性和抗原性相關(guān)聯(lián)，即，與蛋白質(zhì)的生物特性相關(guān)聯(lián)。以下親水性值已被賦予這些氨基酸殘基:精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0 士 I);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷酰胺(+0.2);甘氨酸(O);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5 士 I);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。在基于類似親水性值進行改變時，在某些實施方案中，包括親水性值在士 2以內(nèi)的氨基酸取代；在某些實施方案中，包括親水性值在±1以內(nèi)的氨基酸取代；并且在某些實施方案中，包括親水性值在±0.5以內(nèi)的氨基酸取代。還可以基于親水性鑒別來自初級氨基酸序列的表位。
[0104]全長多肽或肽、或肽的截短或突變型式與不相關(guān)的蛋白質(zhì)、多肽或肽融合的融合蛋白的使用可以基于本文所描述的所需肽編碼核酸和/或氨基酸序列來設(shè)計。這些融合蛋白包括(但不限于)=IgFc融合體，其使蛋白質(zhì)或肽穩(wěn)定并延長體內(nèi)半衰期；與可使融合蛋白錨定細胞膜的任何氨基酸序列的融合體；或與提供標記物功能的酶、熒光蛋白或發(fā)光蛋白的融合體。
[0105]在一些實施方案中，靶向肽可能連接于基于脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物的遞送系統(tǒng)。這些技術(shù)的實例描述于〃Liposomes:A Practical Approach " (Torchilin 和 Weissig 編，Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2003)以及美國專利第 4，594，595 號、第 5，459，127 號、第 5，948，767 號和第 6，110，490 號中。
[0106]在某些實施方案中，融合蛋白可以通過利用選擇性地結(jié)合于所表達的融合蛋白的抗體而容易地純化。在替代實施方案中，融合蛋白可以通過以下方式純化:將肽編碼核酸序列亞克隆到重組質(zhì)?；蚱湟徊糠种?，以轉(zhuǎn)譯方式與由六個組氨酸殘基組成的氨基末端(N末端)或羧基末端(C末端)標簽(“His標簽”,參見例如Janknecht等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88 =8972-8976,1991)融合。將從表達這種構(gòu)建體的細胞得到的提取物加載到Ni2+次氮基乙酸-瓊脂糖柱上，并且用含咪唑緩沖液選擇性地洗脫組氨酸標記的蛋白質(zhì)。
[0107]雖然所描述的所需肽氨基酸序列可以通過化學方式合成(參見例如"Proteins:Structures and Molecular Principles"(Creighton編，W.H.Freeman&Company,New York,NY, 1984))，但大的多肽序列可通過重組DNA技術(shù)，使用本領(lǐng)域中所熟知的用于表達含有編碼所需肽的核酸序列的核酸的技術(shù)來產(chǎn)生。這些方法可以用于構(gòu)建含有肽編碼核苷酸序列以及適當轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯控制信號的表達載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組(參見例如〃Molecular Cloning, A Laboratory Manual",同上,和"Current Protocols in Molecular Biology〃，同上)。或者,編碼所需肽編碼核苷酸序列的RNA和/或DNA可以通過化學方式,使用例如合成器來合成(參見例如"OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach"(Gait 編，IRL Press, Oxford, United Kingdom,1984))。
[0108]可以利用多種宿主表達載體系統(tǒng)來表達肽編碼核苷酸序列。當所需肽或多肽可溶或為可溶性衍生物時，可以在不分泌肽或多肽的情況下從宿主細胞培養(yǎng)物中，即從宿主細胞中回收肽或多肽，并且在宿主細胞分泌肽或多肽的情況下從培養(yǎng)基中回收。然而，適合的表達系統(tǒng)還涵蓋經(jīng)過工程改造的宿主細胞，其表達錨定于細胞膜中的所需多肽、肽或功能等效物。所需肽從這些表達系統(tǒng)中的純化或富集可以使用適當清潔劑和脂質(zhì)微團以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法來實現(xiàn)。此外，這些經(jīng)過工程改造的宿主細胞本身可以在不僅希望保留肽的結(jié)構(gòu)和功能特征，而且希望評估生物活性(例如，在某些藥物篩選分析法中)的情況下使用。
[0109]在某些應(yīng)用中，短暫表達系統(tǒng)是所希望的。然而，對于重組蛋白質(zhì)或肽的長期、高產(chǎn)量生產(chǎn)來說，穩(wěn)定表達一般是優(yōu)選的。例如，可以對穩(wěn)定表達所需蛋白質(zhì)、多肽、肽或融合蛋白的細胞系進行工程改造。勝過使用含有病毒復(fù)制起點的表達載體，可以使用由適當表達控制元件(例如，啟動子、增強子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷酸化位點等)和可選擇標記物控制的DNA使宿主細胞轉(zhuǎn)化。在引入外來DNA之后，使經(jīng)過工程改造的細胞在富集培養(yǎng)基中生長約1-2天，然后換到選擇培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的可選擇標記物賦予抗選擇性，并且允許細胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到其染色體中并生長形成聚點(foci)，繼而可以克隆并擴充到細胞系中。有利的是，這種方法可用于對表達所需基因產(chǎn)物或其部分的細胞系進行工程改造。這些經(jīng)過工程改造的細胞系可以特別適用于篩選和評價影響所需蛋白質(zhì)、多肽或肽的內(nèi)源性活性的化合物。
[0110]可以使用許多選擇系統(tǒng)，包括(但不限于)單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cellll =223-232,1977)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA48:2026-2034,1962)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy 等人，Cell22 =817-823,1980)基因，其可以分別用于tk_、hgprt_或aprt_細胞中?？勾x物抗性也可以用作針對以下基因進行選擇的基礎(chǔ):二氫葉酸還原酶(dhfr)，其賦予對甲氨蝶呤的抗性(Wigler 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:3567_3570，1980，和 O ' Hare 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:1527-1531,1981);鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)，其賦予對霉酚酸的抗性(Mulligan 和 Berg，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:2072-2076,1981);新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo),其賦予對氨基糖苷G-418的抗性(Colbere-Garapin等人，J.Mol.Biol.150:1-14，1981);和潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)，其賦予對潮霉素的抗性(Santerre等人，Gene30:147-156，1984)。
[0111]可以用于提供所公開的方法中使用的組合物的目的的宿主細胞/表達系統(tǒng)包括(但不限于)微生物，如用含有所需肽編碼核苷酸序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌(例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis));用含有所需肽編碼核苷酸序列的重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(Pichia pas`toris));用含有所需肽編碼核苷酸序列的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus ；CaMV);煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus ；TMV))感染，或用含有所需肽編碼核苷酸序列的重組質(zhì)粒表達載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或哺乳動物細胞系統(tǒng)(例如，C0S、CH0、BHK、293、3T3)，其具有含有所需肽編碼核苷酸序列和來源于哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或來源于哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子)的重組表達構(gòu)建體。
[0112]在細菌系統(tǒng)中，許多不同表達載體宜取決于打算用于所表達的所需基因產(chǎn)物的用途而選擇。例如，當將要產(chǎn)生大量的這種蛋白質(zhì)時，例如為了產(chǎn)生包含所需肽的醫(yī)藥組合物，或為了形成針對蛋白質(zhì)的抗體，可能需要引導(dǎo)高水平的容易純化的融合蛋白產(chǎn)物的表達的載體。這些載體包括(但不限于):大腸桿菌表達載體pUR278(Ruther和MUller-Hill，EMBO J.2:1791-1794,1983)，其中所需肽編碼序列可以個別地接合到框內(nèi)具有IacZ編碼區(qū)的載體中，從而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye和Inouye, Nucleic Acids Res.13:3101-3110,1985，以及 Van Heeke 和 Schuster，J.Biol.Chem.264:5503-5509,1989)；等等。pGEX載體(GE Healthcare, Piscataway, NJ)也可以用于表達呈與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白形式的所需肽部分。一般來說，這些融合蛋白可溶并且可以通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，隨后在游離谷胱甘肽存在下進行洗脫而容易地從溶解的細胞中純化。PGEX載體被設(shè)計成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點，以使得經(jīng)過克隆的所需肽編碼基因產(chǎn)物可以從GST部分中釋放。因為，在一些實施方案中，D-氨基酸是優(yōu)選的，例如，尤其 Park 等人(Production of D-amino acid using whole cells ofrecombinant Escherichia coli with separately and coexpressed D—hydantoinase andN-carbamoylase.Biotechnol Prog.七月-八月；16 (4):564-70, 2000)所描述的那些方法。[0113]在一個例示性昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus ；AcNPV)用作表達所需肽編碼序列的載體。這種病毒在草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞中生長。可以將所需肽編碼序列個別地克隆到病毒的非必需區(qū)域(例如多角體基因)中，并且置于AcNPV啟動子(例如多角體啟動子)的控制下。所需肽編碼序列的成功插入將使得多角體基因失活并且產(chǎn)生非封閉型重組病毒(即，缺乏由多角體基因編碼的蛋白質(zhì)外殼的病毒)。然后，使用重組病毒感染其中表達插入的多核苷酸的草地貪夜蛾細胞(參見例如Smith等人，J.Virol.46 =584-593,1983，和美國專利第4，215，051號)。
[0114]在哺乳動物宿主細胞中，可以利用許多基于病毒的表達系統(tǒng)。在腺病毒用作表達載體的情況下，可以使所需肽編碼核苷酸序列接合到腺病毒轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯控制復(fù)合物，例如晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。然后，可以通過體外或體內(nèi)重組將這種嵌合序列插入到腺病毒基因組中。插入到病毒基因組的非必需區(qū)域(例如，區(qū)域El或E3)中將產(chǎn)生存活的并且能夠在受感染的宿主中表達所需肽產(chǎn)物的重組病毒(參見例如Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:3655-3659,1984)。特定起始信號也可能為插入的所需肽編碼核苷酸序列的有效轉(zhuǎn)譯所需要。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。在一些情況下，可以提供外源性轉(zhuǎn)譯控制信號，可能包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子應(yīng)與編碼所需肽的編碼序列同相以確保整個插入物的轉(zhuǎn)譯。這些外源性轉(zhuǎn)譯控制信號和起始密碼子可以具有多種天然和合成的起點。表達效率可以通過包括適當轉(zhuǎn)錄增強子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等而增強(參見例如 Nevins, CRC Crit.Rev.Biochem.19 =307-322,1986)。
[0115]在酵母中，可以使用許多含有組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體。關(guān)于評論，參見例如"Current Protocols in Molecular Biology〃，同上,第第 13 章；Bitter 等人，Meth.Enzymol.153:516-544,1987, " DNA Cloning〃，第 II 卷，第 3 章(Glover 編，IRL Press,Washington, D.C.，1986) ；Bitter, Meth.Enzymo1.152:673-684,1987, " The MolecularBiology of the Yeast Saccharomyces:Life Cycle and Inheritance" (Strathern 等人編，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1981);以及"The MolecularBiology ofthe Yeast Saccharomyces:Metabolism and Gene Expression" (Strathern等人編，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982) ?
[0116]在植物中，可以使用多種不同植物表達載體，并且所需肽編碼序列的表達可以由許多啟動子推動。例如，可以使用病毒啟動子，如CaMV的35S RNA或19S RNA啟動子(Brisson 等人，Nature310:511-514,1984),或 TMV 的外殼蛋白啟動子(Takamatsu 等人，EMB0J.6:307-311，1987)?；蛘撸梢允褂弥参飭幼?，如RUBISCO的小亞單位的啟動子(Coruzzi 等人，EMB0J.3:1671-1679,1984，和 Broglie 等人，Science224:838-843,1984)，或熱激啟動子，例如大豆 hspl7.5-E 或 hspl7.3-B (Gurley 等人，Mol.Cell.Biol.6:559-565，1986)?？梢允褂美鏣i質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射或電穿孔將這些構(gòu)建體引入到植物細胞中。關(guān)于這些技術(shù)的評論，參見例如Weissbach andWeissbach," Methods in Plant Molecular Biology〃,第 VIII 節(jié)(Schuler和 Zielinski編，Academic Press, Inc.，New York, NY, 1988),和"Plant Molecular Biology",第 2 版，第 7-9 章(Grierson 和 Covey 編，Blackie&Son, Ltd., Glasgow, Scotland, United Kingdom,1988)。
[0117]另外，可以選擇調(diào)節(jié)插入的所需肽編碼序列的表達，或以所需方式修飾和加工所需肽編碼核酸序列的宿主細胞株。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這些修飾(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)可能影響蛋白質(zhì)的某些功能。不同宿主細胞對于蛋白質(zhì)和肽的轉(zhuǎn)譯后加工和修飾具有特征性和特異性機制?？梢赃x擇適當細胞系或宿主系統(tǒng)以確保所表達的所需蛋白質(zhì)、多肽或肽的正確或所需修飾和加工。為此，可以使用具有用于初級轉(zhuǎn)錄物的所需加工，以及所需肽編碼核酸序列的糖基化和/或磷酸化的細胞機構(gòu)的真核宿主細胞。這些哺乳動物宿主細胞包括(但不限于)中國倉鼠卵巢(CHO)、VERO、幼倉鼠腎(BHK)、HeLa、猴腎(COS)、MDCK、293、3T3、WI38、人肝細胞癌(例如，Hep G2)和U937細胞。
[0118]在某些實施方案中，本發(fā)明所公開的組合物用于治療脂肪相關(guān)體組成或體重紊舌L如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥。
[0119]在某些實施方案中，本發(fā)明所公開的組合物可以與一種或多種用于治療、管理和/或預(yù)防脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的其他化合物或試劑(“其他活性劑”)組合施用。這些療法可以按治療有效劑量施用至患者以治療或改善脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂，如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥。治療有效劑量是指足以促成疾病癥狀的任何發(fā)作延遲、改善或阻滯的化合物量。
`[0120]在一些實施方案中，提供經(jīng)過分離的肽，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDN0:9、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且其中所述肽體內(nèi)結(jié)合于基質(zhì)細胞。在一些實施方案中，基質(zhì)細胞位于脂肪組織、纖維化病灶或腫瘤中。
[0121]在一些實施方案中，提供蛋白質(zhì)組合物，其包含具有SEQ ID N0:U SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14、SEQID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的肽。在一些實施方案中，肽或蛋白質(zhì)組合物完全由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，肽或蛋白質(zhì)組合物偶合于成像劑。在一些實施方案中，肽或蛋白質(zhì)組合物偶合于細胞毒性劑或促細胞凋亡劑。在一些實施方案中，肽或蛋白質(zhì)組合物偶合于誘導(dǎo)白色脂肪組織轉(zhuǎn)化為棕色脂肪組織的試劑。在一些實施方案中，肽或蛋白質(zhì)組合物偶合于激活白色脂肪組織中的b3-腎上腺素能受體的試劑。在一些實施方案中，試劑為由D-氨基酸組成的肽。在一些實施方案中，肽經(jīng)連接子偶合，并且在一些實施方案中，連接子包含氨基己酸。
[0122]在其他實施方案中，提供經(jīng)過分離的肽，其包含SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18、SEQID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:2U SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 或 SEQ ID NO:24
的氨基酸序列，并且其中所述肽體內(nèi)結(jié)合于基質(zhì)細胞。在一些實施方案中，基質(zhì)細胞位于肺組織、纖維化病灶或腫瘤中。
[0123]在一些實施方案中，提供蛋白質(zhì)組合物，其包含具有SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23 或 SEQ IDNO:24的氨基酸序列的肽。在一些實施方案中，肽或蛋白質(zhì)組合物完全由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，肽或蛋白質(zhì)組合物偶合于成像劑。在一些實施方案中，肽或蛋白質(zhì)組合物偶合于細胞毒性劑或促細胞凋亡劑。在一些實施方案中，試劑為由D-氨基酸組成的肽。在一些實施方案中，肽經(jīng)連接子偶合，并且在一些實施方案中，連接子包含氨基己酸。 [0124]在一些實施方案中，蛋白質(zhì)組合物完全由D-氨基酸組成，并且包含具有SEQ IDNO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:
7、SEQID NO:8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的肽，并且其中所述組合物體內(nèi)結(jié)合于位于例如脂肪組織、纖維化組織或腫瘤組織中的基質(zhì)細胞。在一些實施方案中，肽偶合于成像劑、細胞毒性劑、促細胞凋亡劑。在一些實施方案中，肽偶合于誘導(dǎo)白色脂肪組織轉(zhuǎn)化為棕色脂肪組織的試劑，例如(但不限于)激活白色脂肪組織中的b3-腎上腺素能受體的試劑。
[0125]在一些實施方案中，提供經(jīng)過分離的核酸分子，其包含編碼SEQ ID NO:1、SEQ IDN0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些實施方案中，提供包含這些核酸分子的表達載體和包含表達載體的宿主細胞。
[0126]在一些實施方案中，提供將細胞毒性肽、促細胞凋亡肽、反式發(fā)育肽或成像肽遞送到脂肪組織的方法，所述方法包括:(a)使細胞毒性肽、促細胞凋亡肽、反式發(fā)育肽或成像肽偶合于具有選自由以下各項組成的群組的氨基酸序列的靶向肽:SEQ ID N0:U SEQ IDNO:2, SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:
8、SEQIDNO:9, SEQ IDNO:10、SEQ IDNO: 11, SEQ IDNO: 12, SEQ IDNO: 13, SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16 ;和(b)使經(jīng)過偶合的靶向肽選擇性地結(jié)合于脂肪細胞。在一些實施方案中，肽由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，肽經(jīng)連接子偶合，并且在一些實施方案中，連接子包含氨基己酸。
[0127]在其他實施方案中，提供將化合物或試劑遞送到脂肪組織的方法，其包括:使化合物或試劑偶合的肽暴露于疑似含有脂肪組織的細胞群體，其中所述化合物或試劑偶合的肽包含偶合于選擇性地結(jié)合于脂肪組織的肽的化合物或試劑，其中所述肽的長度小于100個氨基酸并且包括具有選自由以下各項組成的群組的氨基酸序列的脂肪組織靶向基序=SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:160 在一些實施方案中，肽由 D-氨基酸組成。在一些實施方案中，肽經(jīng)連接子偶合，并且在一些實施方案中，連接子包含氨基己酸。在一些實施方案中，肽和試劑都是由D-氨基酸組成。在一些實施方案中,試劑包含細胞毒性肽或促細胞凋亡肽。在一些實施方案中，肽由D-氨基酸組成。在一些實施方案中，試劑包含成像劑。在一些實施方案中，暴露包含使受試者暴露于可以偶合于試劑的肽，以治療肥胖相關(guān)病癥，例如(但不限于)肥胖癥、纖維化或癌癥。在一些實施方案中，細胞群體來自人類受試者或在人類受試者中。在一些實施方案中，細胞群體來自獸類受試者或在獸類受試者中。
[0128]在一些實施方案中，細胞在離體(ex vivo)細胞群體中，如同薄的組織切片一樣。在一些實施方案中，提供基于化合物或試劑偶合的肽與所述脂肪組織的所述選擇性結(jié)合來檢測異質(zhì)細胞群體中的脂肪基質(zhì)細胞的方法。在一些實施方案中，提供檢測脂肪基質(zhì)細胞的方法，同樣地鑒別將得益于用肽治療的患者，靶向肽偶合于化合物或試劑，例如(但不限于)細胞毒性劑或促細胞凋亡劑?；颊叩膶嵗净俭w組成紊亂、體重紊亂、肥胖癥、月旨肪營養(yǎng)不良、糖尿病、代謝綜合征、纖維化或癌癥的人類或獸類患者。
[0129]提供關(guān)于WAT7肽(SEQ ID NO:13和14)的分離和表征的具體細節(jié)，而且還提供其他WAT靶向肽(SEQ ID NO:1-16)和肺靶向肽(SEQ ID NO: 17-24)，其顯示了所公開的方法的一般適用性。
[0130]這些組合物的毒性和治療功效可以通過標準醫(yī)藥程序在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏袦y定，例如，用于測定LD5tl (50 %群體的致死劑量)和ED5tl (50 %群體的治療有效劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數(shù)，以比率LD5tl / ED5tl表示。展現(xiàn)較大治療指數(shù)的組合物是優(yōu)選的。在某些 實施方案中可以使用展現(xiàn)毒性副作用的化合物，然而，通常應(yīng)該謹慎地設(shè)計使這些組合物優(yōu)先靶向受影響組織的部位的遞送系統(tǒng)，以使得對未感染細胞的潛在損害降到最低并從而減少副作用。
[0131]從細胞培養(yǎng)分析法和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于制定用于人類的劑量范圍。這些組合物的劑量優(yōu)選地處于包括ED5tl而具有極少或沒有毒性的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量可以在該范圍內(nèi)變化，取決于所采用的劑型和所利用的施用途徑。對于任何組合物來說，治療有效劑量可以最初通過細胞培養(yǎng)分析法估計。劑量可以在動物模型中制定以獲得包括如在細胞培養(yǎng)物中所測定的IC5tl ( 即，實現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的測試組合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。該信息可以用于更精確地確定人類的適用劑量。血漿水平可以例如通過高效液相色譜法來測量。
[0132]當預(yù)期對如肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病或代謝綜合征、纖維化和癌癥的脂肪相關(guān)體組成或體重紊亂進行治療處理時，也可以使用動物研究來確定適當劑量以確定每公斤體重的測試受試者對生物活性劑的最大耐受劑量或MTD。一般來說，所測試的至少一種動物物種為哺乳動物。本領(lǐng)域技術(shù)人員有規(guī)律地推斷出對其他物種(包括人類)有功效并避免毒性的劑量。在進行人類功效研究之前，I期臨床研究幫助確立安全劑量。
[0133]另外，生物活性劑可以與多種完善的組合物或結(jié)構(gòu)偶合或復(fù)合，這些組合物或結(jié)構(gòu)例如增強生物活性劑的穩(wěn)定性，或以其他方式增強其藥理學特性(例如，延長體內(nèi)半衰期，降低毒性，等)。
[0134]這些治療劑可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的眾多方法施用，包括(但不限于)吸入、皮下(sub-q)、靜脈內(nèi)(1.V.)、腹膜內(nèi)(1.P.)、肌肉內(nèi)(1.M.)或鞘內(nèi)注射，或局部施用(經(jīng)皮、軟膏、乳膏、油膏、滴眼劑，等等)，如下文更詳細描述。
[0135]根據(jù)本發(fā)明所描述的組合物使用的醫(yī)藥組合物可以通過常規(guī)方式使用一種或多種生理學上可接受的載劑或賦形劑來配制。
[0136]醫(yī)藥組合物可以包含用于改變、維持或保存例如組合物的pH值、滲透性、粘度、透明度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩(wěn)定性、溶解或釋放速率、吸附或穿透的配制材料。適合的配制材料包括(但不限于):氨基酸(例如，甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和賴氨酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(例如，抗壞血酸、亞硫酸鈉和亞硫酸氫鈉)；緩沖劑(例如，硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽和其他有機酸)；膨脹劑(例如，甘露糖醇和甘氨酸)；螯合劑(例如，乙二胺四乙酸(EDTA));絡(luò)合劑(例如，咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、環(huán)糊精和羥丙基環(huán)糊精)；填充劑；單糖、二糖和其他碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖和糊精)；蛋白質(zhì)(例如，血清白蛋白、明膠和免疫球蛋白)；著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量肽；成鹽平衡離子(例如，鈉)；防腐劑(例如，苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳萊(thimerosal)、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸和過氧化氫)；溶劑(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)；糖醇(例如，甘露糖醇和山梨糖醇)；懸浮劑；表面活性劑或濕潤劑(例如，普朗尼克(pluronic)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯(例如，聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80)、triton、氨丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、膽固醇和泰洛沙泊(tyloxapal));穩(wěn)定性增強劑(例如，蔗糖和山梨糖醇)；張度增強劑(例如，堿金屬鹵化物(例如，氯化鈉或氯化鉀)、甘露糖醇和山梨糖醇；遞送媒介物；稀釋劑；賦形劑；以及醫(yī)藥佐劑("Remington' s Pharmaceutical Sciences〃,第18版(Gennaro 編，Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990))。
[0137]另外，所描述的治療肽可以連接于半衰期延長媒介物。某些例示性半衰期延長媒介物在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括(但不限于)Fe結(jié)構(gòu)域、聚乙二醇和葡聚糖(參見例如PCT專利申請公布第W099 / 25044號)。
[0138]可以配制這些試劑用于通過`注射進行胃腸外施用，例如，通過快速注射或連續(xù)輸注。用于注射的配制品可以呈單位劑量形式，例如，于添加有防腐劑的安瓿或多劑量容器中。組合物可以采用以下形式，如于油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以呈粉末形式，以供在使用前用適合的媒介物(例如，無菌無熱原質(zhì)水)復(fù)原。
[0139]試劑也可以配制成用于直腸施用的組合物，如栓劑或保留灌腸劑，例如，其含有常規(guī)栓劑基質(zhì)，如可可脂或其他甘油酯。
[0140]除了先前所描述的配制品以外，試劑也可以配制成貯存制劑。這些長效配制品可以通過植入(例如皮下或肌肉內(nèi))或通過肌肉內(nèi)注射來施用。例如，試劑可以與適合的聚合或疏水材料(例如呈于可接受的鹽中的乳液形式)、粒子交換樹脂或微溶性衍生物(例如微溶性鹽)一起配制。必要時，組合物可以存在于包裝或分配裝置中，其可以含有一個或多個含活性成分的單位劑型。包裝可以例如包含金屬或塑料箔，如泡罩包裝。包裝或分配裝置可以附有施用說明書。
[0141]活性組合物可以通過控制釋放方式或由本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的遞送裝置來施用。實例包括(但不限于)美國專利第3，845，770號、第3，916，899號、第3，536，809號、第 3，598，123 號、第 4，008，719 號、第 5，674，533 號、第 5，059，595 號、第 5，591，767 號、第5，120，548 號、第 5，073，543 號、第 5，639，476 號、第 5，354，556 號和第 5，733，566 號中所描述的那些遞送裝置。這些劑型可以用于使用例如羥丙基甲基纖維素、其他聚合物基質(zhì)、凝膠、可透膜、滲透系統(tǒng)、多層涂層、微粒、脂質(zhì)體、微球體或其組合提供一種或多種活性成分的緩慢或控制釋放，從而提供不同比例的所需釋放特征。例示性的持續(xù)釋放基質(zhì)包括(但不限于)聚酯、水凝膠、聚交酯(參見例如美國專利第3，773，919號和歐洲專利申請公布第EP058，481號)、L-谷氨酸與Y -乙基-L-谷氨酸的共聚物(參見例如Sidman等人，Biopolymers22:547-556,1983)、聚(甲基丙烯酸2-輕乙酯)(參見例如Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15: 167-277,1981,和 Langer, Chemtech12:98-105,1982)、乙稀乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)，以及聚-D (-) -3-羥基丁酸(歐洲專利申請公布第EP133, 988號)。持續(xù)釋放組合物可以包括脂質(zhì)體，其可以通過本領(lǐng)域中已知的若干方法中的任一種來制備(參見例如 Eppstein 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82 =3688-3692,1985,以及歐洲專利申請公布第EP036，676號、第EP088，046號和第EP143，949號)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合的控制釋放配制品，包括本文所描述的那些配制品，可以容易地選擇以供與本發(fā)明所公開的組合物一起使用。某些實施方案涵蓋適合于經(jīng)口施用的單個單位劑型，例如(但不限于)適宜于控制釋放的片劑、膠囊、囊形片(gelcap)和囊片。
[0142]所有控制釋放的醫(yī)藥產(chǎn)品具有改善療法以超過其非控制對應(yīng)物所達到的結(jié)果的共同目標。理想地，在藥物治療中使用經(jīng)過最佳設(shè)計的控制釋放制劑的特征在于采用最少的原料藥在最少量的時間內(nèi)治愈或控制病狀?？刂漆尫排渲破返膬?yōu)點包括藥物的活性延長、施用頻率減少和患者順應(yīng)性提高。另外，控制釋放配制品可以用于影響起始作用時間或其他特征(如藥物的血液水平)，并且由此可以影響副作用(例如，不良作用)的出現(xiàn)。
[0143]大多數(shù)控制釋放配制品經(jīng)過設(shè)計以最初釋放快速產(chǎn)生所需治療作用的量的活性成分，并且逐漸并連續(xù)地釋放在延長的時間段內(nèi)維持這種水平的治療或預(yù)防作用的其他量的活性成分。為了在體內(nèi)維持這種相對恒定水平的活性成分，藥物必須以將替代經(jīng)過新陳代謝并且從體內(nèi)排出的活性成分的量的速率從劑型中釋放?；钚猿煞值目刂漆尫趴梢杂筛鞣N條件來刺激，包括(但不限于)PH值、溫度、酶、水，或其他生理條件或組成。
[0144]在一些情況下，所公開的方法和組合物的活性成分優(yōu)選地并不同時或通過相同施用途徑施用至患者。因此，在一些實施方案中，提供試劑盒，其當由開業(yè)醫(yī)師使用時可以簡化適量活性成分向患者的施用。
[0145]典型試劑盒包含一種或多種所公開的治療劑的單個單位劑型，其是單獨的或與可以與所公開的組合物組合使用的另一種試劑的單個單位劑型組合。所公開的試劑盒可以進一步包含用于施用活性成分的裝置。這些裝置的實例包括(但不限于)注射器、點滴袋、貼片和吸入器。
[0146]所公開的試劑盒可以進一步包含醫(yī)藥學上可接受的媒介物，其可以用于施用一種或多種活性成分。例如，如果活性成分以必須經(jīng)過復(fù)原以供胃腸外施用的固體形式提供，那么試劑盒可以包含具有適合媒介物的密封容器，活性成分可以溶解于這種媒介物中以形成適合于胃腸外施用的無微粒無菌溶液。醫(yī)藥學上可接受的媒介物的實例包括(但不限于):注射用水USP ;水性媒介物，例如(但不限于)氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringei^ sInjection)、右旋糖注射液、右旋糖和氯化鈉注射液，以及乳酸化林格氏注射液(LactatedRinger' s Injection);水可混溶媒介物,例如(但不限于)乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及非水性媒介物，例如(但不限于)玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蘧酸異丙酯和苯甲酸苯甲酯。然而，在具體實施方案中，所公開的配制品并不含有任何醇或其他共溶劑、油或蛋白質(zhì)。
[0147]以下章節(jié)提供關(guān)于各種實施方案的實施例的更多細節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，以下實施例中所公開的技術(shù)代表本
【發(fā)明者】所發(fā)現(xiàn)的能很好發(fā)揮作用的技術(shù)和/或組合物。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒于本公開應(yīng)了解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以在所公開的具體實施方案中進行許多改變并且仍獲得相同或類似的結(jié)果。這些實施例為本文所描述的方法和系統(tǒng)的說明并且不旨在限制本發(fā)明的范圍。提供關(guān)于WAT7肽(SEQ IDNO:13和14)的分離和表征的具體細節(jié)，而且還提供其他WAT靶向肽(SEQ ID NO: 1-16)和肺靶向肽(SEQ ID NO:17-24)，其顯示了所公開的方法的一般適用性。
實施例
[0148]細胞分離和培養(yǎng):雌性C57BL/ 6小鼠用于篩選肽文庫。為了排除品系/性別特異性變量，雌性CDl小鼠用于肽導(dǎo)向驗證和后續(xù)細胞分離。用阿佛丁(Avertin)將小鼠麻醉以進行所有研究。
[0149]如先前在美國專利申請20090104117中以及例如Traktuev等人，2008，同上和Zhang等人，2009，同上中所描述，將從皮下和腹膜內(nèi)WAT的混合物得到的WAT細胞亞群和從對照器官得到的細胞分離。用分散酶(dispase) (BD Biosciences) / I型膠原酶(Worthington Biochemical)消化切碎的組織。在200g離心后作為漂浮的細胞部分分離脂肪細胞。經(jīng)70 μ m Nitex篩網(wǎng)過濾SVF部分和從對照器官得到的細胞。使用FACSAria(BDBiosciences),以下列IgG克隆將經(jīng)過分離的細胞分離成個別細胞群體:PE偶聯(lián)的抗CD34MEC14.7、APC偶聯(lián)的抗CD31MEC13.3和APC_Cy7 偶聯(lián)的 CD4530-F11 (BD Biosciences)。如有指示，則在未經(jīng)涂布的塑料上使細胞于補充有10%胎牛血清(FCS)的DMEM中生長。附著于塑料過夜后，如所描述(Traktuev等人,2008,同上；Zhang等人,2009,同上)從基質(zhì)細胞培養(yǎng)物中洗掉污染細胞群體。通`過流式細胞測量術(shù)，以CD31和CD45抗體，使用LSR II和FacsDiva軟件(BD Biosciences)確認經(jīng)過培養(yǎng)的細胞群體的純度。
[0150]噬菌體文庫篩選:將基于在pill蛋白質(zhì)上展示插入物CX7C、CX8C和CX9C的源自M13的噬菌體載體fUSE5的隨機肽文庫混合(1:1:1)成組合的IOltlTU混合文庫用于基于尾靜脈注射后體內(nèi)同步生物淘選而進行的篩選(參見例如US20050074747和Arap等人，Nat.Med.8:121-127,2002 ；Kolonin 等人，F(xiàn)ASEBJ.20:979-981,2006)。
[0151]對于競爭性導(dǎo)向?qū)嶒瀬碚f，將對于11個所選噬菌體克隆中每一個的5X IO9TU混合，并且注射組合的5.5X 101(ITU。為了驗證個別克隆，注射對于每個噬菌體克隆的IXIOi0TUo用IOml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)循環(huán)和心臟灌注I小時后，收集WAT、脛骨/股骨、骨相關(guān)骨骼肌和肺。通過沖洗脛骨/股骨來分離骨髓。由涂布有抗TER119、抗⑶31和抗⑶45抗體(BD Biosciences)的Dynabeads (Invitrogen)消耗掉每個器官的細胞懸浮液中的造血細胞和內(nèi)皮細胞，之后通過FACS處理剩余細胞以純化⑶34+⑶31-⑶45-細胞。通過感染K91大腸桿菌來回收結(jié)合的噬菌體，通過噬菌體轉(zhuǎn)化單位(TU)計數(shù)來定量，并且進行處理以如Arap等人2002，同上和Kolonin等人，2006，同上中所描述對肽編碼DNA進行測序。為了鑒別保守肽基序，使用ClustalW2軟件。 [0152]通過免疫熒光進行小鼠組織和細胞分析:經(jīng)由尾靜脈注射(500μ g)以化學方式合成、經(jīng)由N末端和C末端半胱氨酸環(huán)化、純化到至少95%純度(Genemed)和生物素化的肽，并使其循環(huán)I小時。對于所有組織分析來說，用IOml PBS心臟灌注之后從麻醉的小鼠中回收器官。在基于EDTA的抗原修復(fù)(DAKO)，用0.3% Triton X-100洗滌并且在無血清蛋白阻斷劑(DAKO)中阻斷之后，如先前所描述(Arap等人，2002，同上，和Kolonin等人，2006，同上)，在福爾馬林固定組織的石蠟切片中進行抗原的免疫定位。將鏈霉親和素-Cy3(Zymed，l:20)或一級抗體(4°C，12-16小時)和二級抗體(室溫，I小時)施加于PBS / 0.05% Tween-20中。使用以下一級抗體:來自Sigma的兔抗卩遼菌體抗體(I:500)、來自Santa Cruz的山羊抗小鼠0)31 (1:150)、來自eBiosciences的大鼠抗小鼠CD45(1:150)、來自 Epitomics 的兔抗小鼠 PDGFRβ 抗體(1:150)，和來自 R&D Systems的山羊抗小鼠DCN抗體(1:200)。二級驢Alexa488偶聯(lián)和Cy3偶聯(lián)的IgG來自JacksonImmunoResearch。用 Hoechst33258 或 T0PR03 (Invitrogen)將核染色。用來自 Genetex的抗 GFP 抗體(I: 100)對腔室玻片(Lab-Tek II ；Nalge Nunc International)中培養(yǎng)的細胞進行免疫熒光分析。將免疫染色的組織切片或細胞制劑安放在Vectashield(VectorLaboratories)中。用 Olympus 1X70 倒置突光顯微鏡 / Magnafire 軟件(Olympus)獲取突光圖像。用Leica TCS SP5顯微鏡/ LAS AF軟件獲取共焦圖像。
[0153]通過親和色譜法分離蛋白質(zhì):通過使用杜恩斯勻化器(Dounce homogenizer)在含有0.2mM苯基甲烷磺酰氟/ Roche Ρ混合液的PBS中使細胞破裂；使用離心(在4°C下以15，OOOg離心30分鐘)將可溶性蛋白與膜小球分離。如先前在美國專利申請20090104117和Nie等人，2008 (Stem Cells26:2735-2745)中所描述使細胞膜蛋白溶解。簡單地說，在4°C下于含有ImM CaCl2UmM MgCl2、50mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、0.2mM苯基甲烷磺酰氟/ Roche PI混合液(柱緩沖液)的PBS中孵育膜小球過夜，并進行離心(在4°C下以15，OOOg離心30分鐘)以移除不可溶碎片。為了純化WAT7受體，使5mg半胱氨酸環(huán)化肽(Genemed Synthesis)偶合(經(jīng)由C末端)到0.25ml EDC瓊脂糖(Pierce)上，并且用含有1% Triton X-100的柱緩沖液使柱平衡。將肽偶合的樹脂與40mg膜提取物一起孵育，用柱緩沖液通過重力流動大量洗滌。用1.0mM肽、隨后用0.1M甘氨酸(pH2.8)進行洗脫(0.5ml級分)。為了對洗脫液進行淘選，將20 μ IlO5TU指定噬菌體克隆在4°C下與使用固定在塑料上的Microcon過濾器(Millipore)脫鹽的2ml每個級分一起孵育。用大量PBS洗掉未結(jié)合的噬菌體，然后通過直接在板上感染宿主K91大腸桿菌來定量結(jié)合的噬菌體。對剩余WAT7-噬菌體結(jié)合級分進行十二烷基硫酸鈉(SDS) -PAGE ；由ProtTech在WAT7特異性條帶中進行蛋白質(zhì)的質(zhì)譜法鑒別。為了純化ΛDCN，將20mg抗DCN抗體固定在蛋白質(zhì)A /G珠(Pierce)上，并且與40mg膜提取物一起孵育。用蛋白質(zhì)A / G結(jié)合緩沖液(Pierce)洗漆后，在貝勒大學醫(yī)學院蛋白質(zhì)組學研究室(Baylor College of Medicine proteomicsfacility)中對通過SDS-PAGE鑒別的40kDa條帶進行N末端微量測序。為了純化抵抗素，使用針對環(huán)化KLH偶合的半胱氨酸環(huán)化WAT7 (Genemed Synthesis)產(chǎn)生的免疫前和免疫后兔抗血清。為了驗證抗體特異性，通過將編碼CX7C氨基酸的片段與GST標簽框內(nèi)克隆到PGEX4T-1載體中并使用GST結(jié)合試劑盒(Novagen)來產(chǎn)生谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標記的肽。先前在Nie等人，2008，同上中描述了 GST偶聯(lián)的肽KGGRAKD (SEQ ID NO:25和26)和抑制素以及肽mP印WLGEffLG (SEQ ID NO:35和36)。
[0154]如上所述從總小鼠WAT SVF提取物中下拉(pull down)結(jié)合于WAT7特異性抗體的蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE解析，并且由ProtTech以質(zhì)譜法鑒別。為了分離生物素化的ASC蛋白質(zhì)，使用鏈霉親和素偶合的Dynabeads M270 (Invitrogen)。為了分析血衆(zhòng)膜蛋白，使用Qproteome PM分離試劑盒(Qiagen)制備血衆(zhòng)膜富集部分。如Kolonin等人,Nat.Med.10:625-632，2004中所描述，使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce)進行細胞表面蛋白生物素化。
[0155]免疫印跡和結(jié)合分析法:將在SDS-PAGE上解析的蛋白質(zhì)制劑點潰到Immobilon-FL 膜(Millipore)上，用 Odyssey 阻斷緩沖液(Licor Biosciences)阻斷，并且如所指示用山羊抗DCN(R&D Systems，1: 1，000)、兔抗ANX2A(Aviva，1:1，000)、兔抗小鼠b-肌動蛋白(Abcam，l =10,000)抗體，或針對WAT7的免疫前和免疫后抗血清(1:1,000)探測(于PBS / 0.05% Triton X-100中)。通過Odyssey成像系統(tǒng)，使用抗山羊IRDye800CW或抗兔IRDye680 (兩者都來自Licor Biosciences)檢測信號。牛DCN來自Sigma-Aldrich,源自 NSO 的鼠類 DCN 來自 R&D Systems。使用 Superscript 試劑盒(Invitrogen)從 WAT總RNA產(chǎn)生鼠類DCN cDNA。對于細菌表達，通過分別將編碼小鼠DCN cDNA(OriGene)或CLIC4eDNA (OriGene)的氨基酸1-354和45-354的片段與His6標簽框內(nèi)克隆到pET28a載體中來產(chǎn)生全長小鼠核心DCN和ADCN同工型。用His標簽試劑盒(Novagen)純化His6標記的蛋白質(zhì)。對于ELISA結(jié)合分析法，涂布100 μ IlOyg / ml指定His6-DCN制劑、His6-CLIC4(對照His6-蛋白質(zhì))、NSO細胞表達的小鼠DCN(R&D Systems)、經(jīng)純化的牛DCN(Sigma-Aldrich)或 BSA,并且在 4°C下固定到 Maxisorb Immunoplates (96 孔；NUNC)上過夜，隨后用3% BSA阻斷， 然后與100 μ I指定濃度的WAT7或?qū)φ誛AT2肽一起孵育。對于脂肪因子結(jié)合分析法，將ΗΕΚ293細胞(Enzo Life Sciences)中產(chǎn)生的FLAG標記的小鼠抵抗素、或?qū)φ誇LAG-BAP蛋白質(zhì)(Sigma-Aldrich)在指定濃度下孵育。用相應(yīng)的兔抗肽 Genemed 抗體(1:2,000)或兔抗 FLAG 抗體(Sigma-Aldrich, 1:2,000)探測結(jié)合的肽或FLAG-抵抗素，隨后用二級山羊抗兔HRP偶聯(lián)抗體(Millipore，l:5,000)探測，并且用Ultra-TMB (Pierce)底物進行信號檢測并在450nm下測量吸光度。
[0156]功能分析法:為了產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞系，將編碼全長小鼠核心DCN和ADCN同工型的CDNA(OriGene)片段克隆到pLVX_AcGFP-Cl載體(Clontech)中。根據(jù)制備商的方案，使用Lent1-X HTX封裝系統(tǒng)在Lenti_X293T細胞中產(chǎn)生慢病毒。使用具有單獨載體、DCN或ADCN的慢病毒來轉(zhuǎn)導(dǎo)NIH3T3-L1細胞(ATCC)。72小時后，用2 μ g / ml嘌呤霉素處理細胞4-5天以選擇穩(wěn)定的細胞系，之后將其維持于含有0.5μ g / ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基中。為了通過MTT分析法測量細胞增殖，將相等數(shù)目(5，000個細胞)的早代慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)體(P2)涂在96孔板上。在指定時間點，在37°C下用CellTiter-Blue試劑(Promega)處理細胞4小時，之后在560發(fā)射波長和590激發(fā)波長下測量熒光。為了通過如(Nie等人，2008，同上)所描述的轉(zhuǎn)移小室分析法測量細胞遷移，在DMEM / 0.1% FBS中使細胞饑餓2小時，然后將25，000個細胞接種在轉(zhuǎn)移小室插入物(5 μ M孔徑)上的相同培養(yǎng)基中。將插入物放置在含有DMEM / 10% FBS的下腔室的頂部，使細胞歷時12小時遷移到轉(zhuǎn)移小室的底部，固定，用蘇木精/曙紅染色并計數(shù)。將3T3-L1穩(wěn)定細胞系(60，000個細胞/孔)放置在12孔板上。如Nie等人，2008，同上中所描述誘導(dǎo)脂肪生成:在匯合后2天，加入含有0.5mMΙΒΜΧ、1.7mM膜島素、I μ M地塞米松(dexamethasone)和 0.2mM 吲哚美辛(indomethacin)的DMEM / 10% FBS，并且在72小時后用每2天更新一次的含有1.7mM胰島素的DMEM / 10%FBS替換。
[0157]統(tǒng)計分析:通過使用司徒登氏t檢驗(Student' s ttest)進行，顯著性指定為Ρ〈0.05。
[0158]實施例1:鑒別ASC導(dǎo)向肽
[0159]將通過熒光激活細胞分選(FACS)基于C34+⑶31-⑶45-免疫表型從器官細胞懸浮液中分離MSC的方法(圖SB)與噬菌體展示組合，并且針對ASC進行優(yōu)化。通過修改先前(Kolonin等人，2006，同上)所描述的“同步體內(nèi)生物淘選”方法，篩選環(huán)狀CX7CXX8C和CX9C (C:二硫鍵鍵合的半胱氨酸；Χ:任何氨基酸)隨機肽文庫的混合物(圖1Α)。這種方法可以從超過IO11個組合肽的庫中選擇MSC探針。在整個篩選中，觀測到從WAT得到以及從所選對照器官:肺、骨髓和骨骼肌得到的MSC上回收的噬菌體粒子數(shù)目的漸進式富集(圖1Β)。
[0160]編碼肽插入物的DNA的測序揭示了從CX7C和CX8C文庫中選擇克隆，而來自CX9C文庫的克隆已有顯著損失，這可能是由于在PlII蛋白質(zhì)中含有較長肽插入物的噬菌體的繁殖缺點。
[0161]在4輪同步體內(nèi)生物淘選之后，鑒別出以高于I %的頻率從ASC重復(fù)回收的八個CX7C和CX8C序列，其被稱為WATl到WAT8 (見下表1)。平行地，對導(dǎo)向肺基質(zhì)細胞(LSC)的匹配數(shù)目的肽插入物進行測序，作為對照。WAT導(dǎo)向肽中沒有一個在肺中富集。以高于1%的頻率從肺中重復(fù)回收的四個序列被稱為LUl到LU4(見下表1)。體內(nèi)個別噬菌體克隆的比較分析揭示了導(dǎo)向ASC (LSC的1，000`倍)的WAT7，作為對ASC具有最高特異性的肽(圖1C)?？寺AT8在類似于mPep的水平下與LSC相比對ASC展現(xiàn)適度優(yōu)選性，mPep為先前經(jīng)過表征的模擬SPARC的肽(Nie等人，2008，同上)。與該觀測結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)WAT8肽的序列(CGQWLGNWLC:SEQ ID NO:15)類似于 mP印(CWLGEWLGC:SEQ ID NO:35)，從而指示整合素β I (integrin β I)(先前確立的MSC標記物)作為WAT8肽的可能受體。因為該研究的焦點是WAT特異性MSC，所以從進一步分析中排除該克隆。對其他所選肽進行體內(nèi)競爭分析法以鑒別具有最高結(jié)合特異性的那些肽。將呈現(xiàn)肽WATl到WAT7 (SEQ ID NO:1-14)和LUl到LU4(SEQ ID NO:17-24)的針對11個克隆的等量噬菌體混合并注射到小鼠中。通過定量編碼在從WAT或肺中分離的C34+CD31-CD45-細胞上選擇的每個肽的噬菌體的頻率來評估每個克隆的導(dǎo)向特異性。與上述數(shù)據(jù)(圖1C) 一致，肽WAT7基于其重導(dǎo)向到WAT細胞的顯著能力而突出:其代表87.4%的克隆從WAT回收并且只有5.8%的克隆從肺回收。相反地，克隆LU-1和LU-2展現(xiàn)出重導(dǎo)向到肺(分別為52.2%和40.2% )，但不重導(dǎo)向到WAT (見下表1)。
[0162]實施例2:驗證 WAT7 (序列 CSWKYWFGEC 和 SWKYWFGE (SEQ ID NO: 13 和 14))作為靶向ASC的肽
[0163]基于組合的導(dǎo)向數(shù)據(jù)，選擇顯示出最確定的ASC靶向的肽WAT7(序列CSWKYWFGEC:SEQ ID NO:13)用于進一步分析。選擇肽LU2 (序列CESGFPTVGC SEQ ID NO:19)作為靶向肺中而非WAT中的MSC的對照肽。通過分析靜脈內(nèi)注射后小鼠組織中WAT7展示噬菌體的生物分布來驗證WAT7的導(dǎo)向。小鼠組織切片中的免疫熒光顯示了噬菌體累積與WAT(圖2A)而非肺(圖2B)或其他對照器官的基質(zhì)/血管結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。相反地，LU2累積與肺(圖2D)而非WAT (圖2C)的基質(zhì)/血管結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。為了驗證在噬菌體情形外肽導(dǎo)向的能力，將側(cè)接有二硫鍵鍵合的半胱氨酸的以化學方式合成的環(huán)狀WAT7和LU2進行生物素化。將每個肽靜脈內(nèi)施用于小鼠中，隨后用鏈霉親和素偶聯(lián)的熒光團對組織進行免疫熒光分析再產(chǎn)生WAT7對WAT的選擇性(圖2)。用分別鑒別內(nèi)皮細胞和周細胞的CD31特異性抗體和PDGFR^特異性抗體進行共染色，以鑒別靶細胞群體。共焦成像揭示了與先前已確立為ASC的TOGFRP +細胞(圖2E-G)相關(guān)聯(lián)的WAT7的血管周定位(參見Traktuev等人，2008，同上)。重要的是，WAT7不會與內(nèi)皮細胞(圖3E)或與滲入WAT的⑶45+造血細胞(圖2H)共定位。與關(guān)于噬菌體生物分布的數(shù)據(jù)一致，在經(jīng)過注射的動物的肺中未檢測到WAT7肽(圖21)，不過通過TOGFRii免疫熒光揭示了富含MSC (圖2J)。與體內(nèi)導(dǎo)向數(shù)據(jù)相符，展示W(wǎng)AT7的噬菌體顯示了與原代未傳代ASC的高水平的特異性結(jié)合，但對從相同動物中分離的LSC或?qū)?T3-L1小鼠前脂肪細胞和4T1.2小鼠腺癌細胞并沒有顯示出這種結(jié)合(圖9)。[0164]實施例3:分離WAT7受體
[0165]為了鑒別ASC導(dǎo)向肽WAT7的受體，使用親和色譜法。從小鼠WAT的SVF中提取膜蛋白并且施加于經(jīng)羧基末端共價偶合于樹脂的半胱氨酸環(huán)化合成WAT7。首先使用WAT2肽(序列CYKNVDSGGC:SEQ ID NO:3)洗脫，以移除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)(圖3A)。然后特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)用WAT7洗脫并且出現(xiàn)在離散子組的級分中。平行地使用WAT2肽親和柱以確認親和純化的蛋白質(zhì)的特異性。測試涂布到塑料上的脫鹽洗脫液的噬菌體-肽結(jié)合確認了這些級分含有結(jié)合于WAT7展示噬菌體，而不結(jié)合于對照WAT2展示噬菌體的蛋白質(zhì)(圖3B)。用來自加載有WAT2的對照親和柱的WAT7洗脫并暴露于相同膜蛋白提取物的級分并不被WAT7展示噬菌體結(jié)合(圖3B)。含有下拉并用WAT7特異性洗脫的蛋白質(zhì)的級分5顯示了與WAT7展示噬菌體的最高水平結(jié)合并被選擇用于受體純化。將在該級分中洗脫的蛋白質(zhì)濃縮并通過變性梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)來解析。用WAT7而不是對照肽WAT2特異性洗脫的條帶遷移到約40kDa(圖3C)。該條帶的質(zhì)譜分析揭示了其含有核心蛋白聚糖(DCN)，或稱為蛋白聚糖II。
[0166]因為DCN是經(jīng)過大量研究的分泌到細胞外基質(zhì)(ECM)中的分子并且控制若干生理過程。DCN的普遍mRNA表達呈現(xiàn)出與導(dǎo)向WAT中的ASC的WAT7不一致。因此，為了分析小鼠器官中的DCN蛋白質(zhì)水平，使用針對全長糖基化小鼠DCN產(chǎn)生的市售抗體對一組小鼠組織切片進行共焦免疫熒光分析。與Bolton等人，2008 (Int.J.0bes.32:1113-1121，2008)的先前研究一致，DCN蛋白質(zhì)可以在許多器官中檢測到，然而，與肺和骨髓相比，其特別高地富含于WAT中(圖4A-C)。這與在所有器官中都類似的TOGFRii表達成鮮明對比(圖4D-F)，如在相同切片中平行地評估。WAT中DCN和TOGFRii的模式難以區(qū)分，并且每個蛋白質(zhì)定位于圍繞⑶31陽性內(nèi)皮的血管周細胞指示了 WAT中的大多數(shù)DCN由ASC產(chǎn)生(圖4A和4D)。然而，檢測肺中(圖5B)和一些其他器官中(數(shù)據(jù)未示出)由一個子組的血管的血管周細胞對DCN的表達表明了由不同亞群的MSC對DCN的表達水平的差異可能不足以說明導(dǎo)向ASC的 WAT7。
[0167]為了表征WAT中的非糖基化DCN的表達，使用針對全長小鼠DCN產(chǎn)生的多克隆抗體對從小鼠組織得到的蛋白質(zhì)提取物進行免疫印跡分析(圖5A)。對從WAT的SVF部分得到以及從肺和骨髓得到的細胞溶質(zhì)蛋白的分析顯示了在這些器官中較高分子量的糖基化DCN同工型的類似表達。相比之下，WAT展現(xiàn)了缺乏硫酸皮膚素/軟骨素(dermatan /chondroitin sulfate)葡糖胺聚糖(GAG)鏈的約40kDa非糖基化核心DCN的較高表達(圖5A)。有趣的是，從三個器官得到的膜蛋白的免疫印跡分析揭示了分子量低于在其他器官中先前經(jīng)過表征的非糖基化核心DCN(Imai等人，Biochem.J.322 (第3部分)，809-814，1997 ;Roughley 等人，Biochem.J.318 (第 3 部分):779-784,1996)的 DCN 同工型的 WAT 特異性表達。在肺和骨髓中這種DCN同工型表達的缺乏從使用針對對照膜蛋白一膜聯(lián)蛋白II (annexin II ；ANX2A)的抗體探測的相同印跡顯而易見,這用于控制蛋白上樣(圖5A)。免疫印跡還用于表征WAT中哪些細胞表達低分子量的DCN同工型。這些發(fā)現(xiàn)指示了其與ASC而非分化的脂肪細胞的膜(而不是細胞溶質(zhì))部分排他性地相關(guān)聯(lián)，圖16A。
[0168]實施例4:新 DCN 同工型為 CSWKYWFGEC (SEQ ID NO:13)受體
[0169]為了確定被稱為ADCN的WAT特異性DCN同工型的身份，使用DCN抗體從WAT中分離出的SVF的小鼠膜提取物中純化DCN。通過變性PAGE分析免疫沉淀的蛋白質(zhì)揭示了對應(yīng)于ADCN的預(yù)期40kDa條帶(圖5B)。從該條帶切出的蛋白質(zhì)的埃德曼降解微量測序揭示了該DCN片段在Leu-45處開始(圖5C)，并且因此比先前所描述的在前肽裂解后產(chǎn)生的成熟核心DCN短了 14個氨基酸(Imai等人，1997,同上；Roughley等人，1996,同上)。因此，Λ DCN無法被糖基化，這是因為其缺少核心DCN中所存在的GAG附著位點SerGly (圖5C) (Scholzen 等人，J.Biol.Chem.269:28270-28281，1994)。在 ADCN 中所缺少的核心DCN序列中甲硫氨酸的缺乏指示了 ADCN是通過溶蛋白性裂解而不是通過選擇性剪接(alternative splicing)來產(chǎn)生。
[0170]為了驗證DCN作為WAT7的標靶，采用使用His6標記的蛋白質(zhì)的酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)。這些體外結(jié)合研究顯示了 WAT7與經(jīng)過細菌純化的重組小鼠DCN的明顯劑量依賴性結(jié)合，而對照肽WAT2并不展現(xiàn)DCN結(jié)合，圖16B。有趣的是，WAT7在高于牛血清白蛋白(BSA)所觀測的背景的水平下不結(jié)合于市售糖基化牛DCN。包括ADCN的進一步分析顯示了結(jié)合于Λ DCN以及結(jié)合于細菌表達(并且因此非糖基化)的DCN核心蛋白的WAT7(圖5D)。缺乏高于背景BSA結(jié)合的結(jié)合于?；蛐∈筇腔疍CN的WAT7 (圖5D)顯示了成熟DCN上的GAG鏈防止WAT7結(jié)合。該發(fā)現(xiàn)可以解釋為何糖基化DCN普遍分泌到除WAT以外的器官中的 ECM 中(Reed 和 1zzo, Glycoconj.J.19:249-255,2002)不會干擾 WAT7 肽的 WAT 導(dǎo)向。
[0171]為了充當WAT7的受體，ADCN必須暴露于ASC的表面上。通過從SVF的總膜制劑中分離質(zhì)膜 蛋白部分，顯示了 ΛDCN與ASC的細胞膜相關(guān)聯(lián)(圖5E)。除了使用替代方法來確認Λ DCN展示于ASC上以外，如(Kolonin等人，2004，同上)所描述對新鮮分離的WATSVF細胞的表面蛋白進行生物素化，之后通過使用鏈霉親和素珠分離生物素化的蛋白質(zhì)，并且進行抗DCN免疫印跡分析。如所預(yù)期，分離出ADCN，從而指示其與細胞表面相關(guān)聯(lián)(圖5F)。有趣的是，在典型地用于MSC / ASC繁殖的條件下WAT SVF細胞在塑料上過夜培養(yǎng)使得ΛDCN從細胞表面蛋白庫中消失(圖5F)。這指示了在體內(nèi)發(fā)生的ΛDCN暴露于細胞表面上在細胞培養(yǎng)物中沒有保留。最后，與在3T3-L1前脂肪細胞中表達的綠色熒光蛋白(GFP)以重組方式融合的ADCN的細胞定位通過使用慢病毒來顯示(圖5G)。對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞主要顯示核GFP信號，其重新分布到表達全長DCN-GFP融合體的細胞中的細胞質(zhì)中。相比之下，表達ADCN-GFP的細胞展現(xiàn)顯著不同的定位模式，類似于細胞表面結(jié)合的SPARC的定位模式(Nie等人，2008，同上)，這確認了細胞膜ADCN定位。
[0172]實施例5:抵抗素作為ADCN的ASC相互作用蛋白(interactor)
[0173]本
【發(fā)明者】所進行的先前工作已顯示了肽通過模擬受體的生物配體的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域而易于識別細胞表面受體。因此，為了表征WAT7-ADCN結(jié)合的潛在生物相互作用并鑒別Λ DCN的生物配體，通過用KLH-肽偶聯(lián)物使兔免疫來引出針對WAT7的抗體，預(yù)期這些偶聯(lián)物識別由WAT7模擬的小鼠蛋白的結(jié)合表位。圖6Α顯示了所產(chǎn)生的WAT7抗體對WAT7具有高特異性并且不識別在篩選中分離的其他ASC導(dǎo)向肽中的任一種。小鼠蛋白提取物的免疫印跡鑒別出約13kDa的由WAT7抗體識別的蛋白質(zhì)(圖6B)。這種蛋白質(zhì)高度富含于從WAT組織新鮮分離的SVF中，但不富含于肺或骨髓中。有趣的是，在典型地用于MSC / ASC繁殖的條件下ASC在塑料上過夜培養(yǎng)之后這種蛋白質(zhì)的表達有損失(圖6B)。這種損失與培養(yǎng)物中Λ DCN細胞表面表達的損失相一致(圖5F)，從而表明Λ DCN暴露于ASC上與其配體的表達相結(jié)合。
[0174]在蛋白質(zhì)A / G珠上固定的抗WAT7免疫球蛋白(IgG)用于分離ΛDCN配體和對SFV蛋白提取物進行親和色譜法。通過PAGE解析親和捕捉的產(chǎn)物(圖6C)，之后切出約13kDa的條帶。質(zhì)譜法將這種蛋白質(zhì)鑒別為已知發(fā)揮WAT分泌的脂肪因子的功能的抵抗素(ADSF) (Steppan 等人，Nature409:307-312,2001 ；Kim 等人，J.Biol.Chem.276:11252-11256,2001)。因為抵抗素與DCN的相互作用先前已有報道，所以為了直接確認與ADCN的相互作用，用FLAG標記的小鼠抵抗素進行體外結(jié)合分析法。FLAG標記的牛堿性磷酸酶(BAP)充當陰性對照(圖6D)。發(fā)現(xiàn)抵抗素在比全長DCN低100倍的摩爾濃度下結(jié)合于ADCN。有趣的是，抵抗素在結(jié)合于糖基化小鼠或牛DCN方面非常低效，如從其類似的背景BSA和BAP結(jié)合顯而易見。這些結(jié)果指示了抵抗素充當ADCN的配體。
[0175]從3T3-L1細胞系得到的細胞是廣泛公認的用于研究脂肪細胞祖細胞的生物學的模型并且用于表征Λ DCN的功能。已經(jīng)確立的3T3-L1培養(yǎng)物用Λ DCN-GFP或全長DCN-GFP融合體以慢病毒方式轉(zhuǎn)導(dǎo)；單獨的GFP載體用作對照(圖5G)。在培養(yǎng)物中24小時和48小時后使用MTT分析法對細胞數(shù)目增加的分析顯示了與表達GFP或全長DCN-GFP的細胞相比，表達ADCN的細胞的增殖增加(圖7Α)。通過使用Boyden腔室轉(zhuǎn)移小室分析法對細胞遷移的分析顯示了與表達GFP的細胞相比，ΛDCN表達細胞的侵入力顯著增加，而表達全長DCN的細胞顯示出相反趨勢(圖7Β)。這些結(jié)果通過體外刮傷分析法來確認(數(shù)據(jù)未示出)。最后，對細胞進行脂肪生成誘導(dǎo)以測試對細胞分化的影響(圖7C)。
[0176]實施例6:其他肽和結(jié)合于人類組織的證據(jù)
[0177]通過噬菌體展示選擇導(dǎo)向小鼠器官的MSC的肽在圖8Α中說明，其含有同步體內(nèi)噬菌體展示篩選工藝的示意性描述。在每一輪選擇中，靜脈內(nèi)施用噬菌體，同時從靶組織回收，擴增，然后匯集并用于下一輪選擇。在稍后的輪次中噬菌體轉(zhuǎn)化單位(TU)的回收率增加反映了選擇優(yōu)先導(dǎo)向靶器官的肽。
[0178]圖SB說明使用流式細胞測量術(shù)鑒別MSC。示出代表性皮下WAT分析。首先進行對CD34+呈陽性的活細胞的門控(左散點圖)，然后基于CD31和CD45的表達進行門控(右散點圖)，組合起來將ASC細胞鑒別為CD34+CD45-CD31-細胞，其以原始散點圖的Q3中的極少紫色事件出現(xiàn)。出現(xiàn)在Ql中的紫色事件對應(yīng)于⑶34+⑶45-⑶31+上皮細胞(EC)。出現(xiàn)在Q2和Q4中的事件對應(yīng)于⑶45+造血細胞。
[0179]鑒別出一系列肽克隆并且使用噬菌體展示篩選在脂肪干細胞(ASC)和肺干細胞(LSC)上富集，如下表1中所列。
[0180]表1
[0181]
【權(quán)利要求】
1.一種靶向肽，其包含選自由SEQ ID NO:1-16組成的群組的氨基酸序列，其中所述肽結(jié)合于基質(zhì)細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向肽，其中所述肽包含SEQID N013和SEQ ID N014的WAT7氨基酸序列SWKYWFGE。
3.一種蛋白質(zhì)組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向肽。
4.一種蛋白質(zhì)組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求2所述的WAT7氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向肽，其中所述靶向肽完全由D-氨基酸組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述WAT7由D-氨基酸組成，并且其中所述組合物結(jié)合于脂肪組織、纖維化組織或腫瘤組織中的基質(zhì)細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述WAT7選擇性地結(jié)合于ASC細胞的表面上的ADCN。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述靶向肽偶合于選自包含以下各項的群組的效應(yīng)劑:成像劑、細胞毒性劑、促細胞凋亡劑、融合蛋白、細胞生長抑制劑、殺細胞劑、放射性同位素、ACS細胞分化劑、有絲分裂抑制劑、抗腫瘤劑、抗生素劑、酶、化學治療劑、抗血管生成劑或其組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述靶向肽和效應(yīng)劑由D-氨基酸組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述靶向肽由L-氨基酸組成，并且所述效應(yīng)劑包含D-氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述靶向肽由L-氨基酸組成，并且所述效應(yīng)劑包含L-氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述肽偶合于誘導(dǎo)白色脂肪組織轉(zhuǎn)變成棕色脂肪組織的效應(yīng)劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述效應(yīng)劑激活白色脂肪組織中的b3-腎上腺素能受體。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述效應(yīng)劑為由D-氨基酸組成的肽。
15.一種制備用以靶向脂肪組織的蛋白質(zhì)組合物的方法，其包括: 使效應(yīng)劑偶合于靶向肽，其中所述靶向肽由選自由SEQ ID NO:1-16組成的群組的氨基酸序列組成；并且其中所述靶向肽選擇性地靶向細胞脂肪組織。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述效應(yīng)劑和靶向肽由D-氨基酸組成。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述效應(yīng)劑由L-氨基酸組成；并且所述靶向肽由D-氨基酸組成。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述偶合包含用連接部分使所述效應(yīng)劑連接于所述靶向肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述連接部分包含氨基己酸、(CH2)4、(CH2)5,(CH2)6、(CH2)7, (CH2)8 或其組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述效應(yīng)劑是選自包含以下各項的群組:細胞毒性劑、促細胞凋亡劑、成像劑或其組合。
21.一種將效應(yīng)劑遞送到脂肪組織的方法，其包括: 使包含以下各項的蛋白質(zhì)組合物暴露于包含脂肪組織的細胞群體:偶合于肽的效應(yīng)劑，其中所述肽由長度小于100個氨基酸的氨基酸序列組成，并且其中所述氨基酸序列包含脂肪組織靶向肽部分，所述脂肪組織靶向肽部分具有選自由SEQ ID ΝΟ:1-16組成的群組的氨基酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)組合物包含連接子。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述靶向肽基序由D-氨基酸組成。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述效應(yīng)劑和所述靶向肽由D-氨基酸組成。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述劑包含:細胞毒性劑、促細胞凋亡劑、成像劑或其組合。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述劑由D-氨基酸組成。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述暴露包含:使受試者暴露于所述蛋白質(zhì)組合物以治療肥胖相關(guān)病癥，其中所述病癥包含肥胖癥、纖維化、癌癥或其組合。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細胞群體是在人類受試者中。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細胞群體為薄的組織切片。
30.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其進一步包括基于蛋白質(zhì)組合物與所述脂肪組織的所述選擇性結(jié)合來檢測所述群體中的脂肪基質(zhì)細胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述肥胖相關(guān)病癥為體組成紊亂、體重紊亂、肥胖癥、脂肪營養(yǎng)不良、糖尿病、代謝綜合征、纖維化、癌癥或其組合。
32.—種肽，其包含選自由SEQ ID NO:17-24組成的群組的氨基酸序列，并且其中所述肽結(jié)合于肺組織。
33.一種蛋白質(zhì)組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求32所述的肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)組合物由D-氨基酸組成。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的蛋白質(zhì)組合物，其中所述肽偶合于成像劑、細胞毒性劑、促細胞凋亡劑或其組合。
36.一種包含靶向肽和效應(yīng)劑的蛋白質(zhì)組合物，其中所述效應(yīng)劑包含:短桿菌肽、蛙皮素、蜂毒素、防御素、殺菌肽、(KFAKFAK) 2、(KFXAKFXAK)2、(KHexAKHexAK)2、(KLAKLAK)2,(KLAKKLA) 2、(KAAKKAA) 2、(KLGKKLG) 3、血管緊張素、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、凝血栓蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、甲酰胺基三唑、CM101、馬立馬司他、多硫戊聚糖、血管生成素2 (Regeneron)、干擾素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可堿、染料木素、TNP470、內(nèi)皮抑素、紫杉醇、阿庫汀、血管抑素、西多福韋、長春新堿、博萊霉素、AGM-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素、5-氟尿嘧啶、博萊霉素、白消安、喜樹堿、卡鉬、苯丁酸氮芥、順鉬(CDDP)、環(huán)磷酰胺、放線菌素D、道諾霉素、阿霉素、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊苷(VP16)、法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法侖、絲裂霉素、諾維本、亞硝基脲、匹可霉素、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫西芬、泰素、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反鉬、長春堿和甲氨蝶呤、長春新堿、烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、皮質(zhì)類固醇激素、有絲分裂抑制劑、亞硝基脲、激素劑、有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、酶、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、植物生物堿、多烯紫杉醇、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、泰素、長春堿、長春新堿、長春瑞濱、PPAR- Y激動劑噻唑烷二酮、羅格列酮、熒光團、螯合金屬絡(luò)合物、放射性同位素、熒光標記物、脲酶、堿性磷酸酶、脂質(zhì)體、微囊體、微粒、納米粒子、磁珠、微型裝置、博萊霉素、放線菌素D、道諾霉素、阿霉素(亞德里亞霉素)、普卡霉素(光輝霉素)和依達比星、鉬配位絡(luò)合物、蒽二酮、經(jīng)取代的脲、甲肼衍生物、安吖啶、L-天冬酰胺酶和維甲酸、卡鉬、順鉬(順式-DDP)、米托蒽醌、羥基脲、 丙卡巴肼、IgFc融合蛋白、酶融合蛋白、熒光蛋白、發(fā)光蛋白或其組合和類似物。
【文檔編號】C12P21/06GK103703140SQ201280023148
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月30日
【發(fā)明者】米哈伊爾·G·科隆尼, 阿列克斯·達丘那, 張琰 申請人:德克薩斯大學系統(tǒng)董事會