醛和相應(yīng)醇的微生物合成的制作方法
【專利摘要】一種改良的醇生產(chǎn)過(guò)程，包括使用遺傳修飾的微生物進(jìn)行微生物發(fā)酵產(chǎn)生顯著量的醛，從發(fā)酵培養(yǎng)基中氣提醛并冷凝。在體外過(guò)程中將這樣產(chǎn)生的醛轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇。
【專利說(shuō)明】醛和相應(yīng)醇的微生物合成
[0001] 本申請(qǐng)要求獲得我們共同待決的于2011年3月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/452，519的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明的領(lǐng)域是對(duì)微生物的代謝工程，以產(chǎn)生一種或多種化學(xué)品，特別是醛，然后將它們分離并在體外轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇。
[0003]發(fā)明背景
[0004]2005年，全世界生產(chǎn)和消耗醛和其它羰基化學(xué)品(oxo-chemical)將近960萬(wàn)公噸。由于需求強(qiáng)烈、產(chǎn)量增加和產(chǎn)能合理化(rationalized capacity), 2005年全球的產(chǎn)能利用率(capacity utilization)提高到了 84%，而 2001 年為 79%。2001 年-2005 年，世界醛和其它羰基化學(xué)品的產(chǎn)能以1.6%的平均年增長(zhǎng)率增加，低于世界的消耗率。在同期，世界的消耗率以平均3.4%的平均年增長(zhǎng)率增加。
[0005]最常見(jiàn)地，目前醛和其它羰基化學(xué)品的生產(chǎn)是通過(guò)使用來(lái)自原油裂解的石油化學(xué)品進(jìn)行精煉的方法。例如，C3-C15醒的產(chǎn)生是通過(guò)石臘與合成氣(synthesis gas)的氫甲?；磻?yīng)，然后將所生產(chǎn)的醛轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇、酸或其它衍生物。目前，最高需求的羰基化學(xué)品是正丁醛，隨后是用于生產(chǎn)增塑劑醇的C6-C13醛，和用于生產(chǎn)去污劑醇的異丁醛和C12-C18 醒。
[0006]使用代謝工程化的微生物進(jìn)行微生物合成生物燃料，特別是生產(chǎn)C2-C6醇，在本領(lǐng)域是眾所周知的。例如，在W094/06924中描述了從碳水化合物進(jìn)行微生物乙醇生產(chǎn)，美國(guó)專利N0.8，048, 666中報(bào)道了從C02進(jìn)行乙醇生產(chǎn)。在美國(guó)專利申請(qǐng)N0.2009/0081746中描述了使用代謝工程化細(xì)胞從2-酮酸生產(chǎn)短鏈醇，并且有許多發(fā)表的文章涉及從代謝工程化細(xì)胞生產(chǎn)異丁醇(例如美國(guó)專利Nos.7，851，188和7，993，889，和W02009/086423, W02009/149240, W02010/062597,和 W02010/075504)，在 US2011/0250660 中描述了使用光合活性微生物從 C02 生產(chǎn)醇。Kechun Zhang 等在 Proc.Nat.Acad.Sc1.(2008)，105, n0.52:20653 -20658中也描述了相似的方法。在美國(guó)專利申請(qǐng)N0.2011/0201083中描述了使用代謝工程化細(xì)胞從2-酮酸生產(chǎn)C5-8醇，在美國(guó)專利N0.8，097，439中報(bào)道了從各種碳源生產(chǎn)脂肪醛。本文通過(guò)援引并入這些和在這里所討論的全部其它外部材料的全部?jī)?nèi)容。當(dāng)在并入的參考文獻(xiàn)中定義或使用的術(shù)語(yǔ)與這里所提供的該術(shù)語(yǔ)的定義不一致或相互矛盾時(shí)，采用這里所提供的該術(shù)語(yǔ)的定義，而不使用該術(shù)語(yǔ)在參考文獻(xiàn)中的定義。
[0007]不幸的是，這些方法中有很多用來(lái)生產(chǎn)的醇的產(chǎn)量仍然相對(duì)較低。為了提高至少某些特定醇的產(chǎn)量，可以刪除或抑制內(nèi)源的醇脫氫酶，或者用重組脫氫酶代替它們，如W02009/149240A1中所述。盡管這些修飾經(jīng)常在至少一定程度上符合期望，但是產(chǎn)生了其它的問(wèn)題。例如，各種醇在高于閾值濃度的情況下對(duì)產(chǎn)生醇的細(xì)胞是有毒的，從而趨向于對(duì)整體產(chǎn)量產(chǎn)生限制。而且，大多數(shù)微生物合成的醇可以與發(fā)酵培養(yǎng)基完全混溶，需要相當(dāng)耗能的過(guò)程進(jìn)行分離。然而更糟糕的是，一些醇是共沸混合物，更難以從培養(yǎng)基中分離。
[0008]因此，盡管本領(lǐng)域已知有許多生產(chǎn)醛-羰基化學(xué)品和相應(yīng)醇的系統(tǒng)和方法，但是仍然存在一些困難。因此，仍然需要有改進(jìn)，特別是在使用微生物細(xì)胞生產(chǎn)這些化學(xué)品的情況下。
[0009]發(fā)明簡(jiǎn)沭
[0010]本發(fā)明涉及使用混合的合成過(guò)程來(lái)生產(chǎn)醛和醇化合物的設(shè)備和方法，所述過(guò)程中，代謝工程化的微生物細(xì)胞利用碳源產(chǎn)生醛，然后將所述醛連續(xù)地或半連續(xù)地在汽相中從發(fā)酵培養(yǎng)基移出。在特別優(yōu)選的方面中，代謝工程化的微生物細(xì)胞基本上沒(méi)有任何醇的產(chǎn)生。醛然后從汽相中冷凝，并在體外被還原成相應(yīng)的醇。預(yù)期的方法有利地克服了各種困難，特別是與產(chǎn)物抑制和從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離醇相關(guān)的各種問(wèn)題。
[0011]在本發(fā)明主題的一個(gè)方面中，生產(chǎn)醇的方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基(優(yōu)選地具有葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纖維素、半纖維素、甘油、二氧化碳、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和/或氨基酸作為碳源)中培育多個(gè)微生物細(xì)胞的步驟，其中該細(xì)胞被遺傳修飾從而與非遺傳修飾的細(xì)胞相比具有增加的代謝活性。特別優(yōu)選的是，增加的代謝活性是丙酮酸或2-酮丁酸向醛的轉(zhuǎn)化增加，和醇脫氫酶活性降低。細(xì)胞產(chǎn)生的醛被連續(xù)地或半連續(xù)地在汽相中從發(fā)酵培養(yǎng)基移出。在另一個(gè)步驟中，將醛從汽相中冷凝，在另外一個(gè)步驟中，將冷凝的醛還原成相應(yīng)的醇。
[0012]在一些實(shí)施方案中，增加的代謝活性是丙酮酸通過(guò)重組的丙酮酸脫羧酶向乙醛的轉(zhuǎn)化增加，而在其它實(shí)施方案中，增加的代謝活性是2-酮丁酸通過(guò)重組的2-酮異戊酸脫羧酶向丙醛的轉(zhuǎn)化增加。并且/或者，優(yōu)選的是，該微生物細(xì)胞通過(guò)重組的2-酮異戊酸脫羧酶而在對(duì)2-酮戊酸、2-酮己酸、2-酮庚酸、2-酮辛酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-酮-4-甲基己酸、2-酮-5-甲基庚酸、2-酮 -6-甲基辛酸、2-酮-異戍酸、2-酮-異己酸、2-酮-5-甲基己酸、或2-酮-6-甲基辛酸中的一種或多種的脫羧中的代謝活性也增加。因此，特別優(yōu)選的發(fā)酵產(chǎn)物包括乙醛、丙醛、丁醛和2-甲基-1-丙醛。
[0013]在更進(jìn)一步的預(yù)期方面中，所述微生物細(xì)胞通過(guò)重組的ilvGMCD基因或重組的ilvBNCD基因而在將2_麗丁酸分支碳鏈延伸(branched carbon chain elongation)而成為2-酮-3-甲基戊酸中具有增加的代謝活性，和/或通過(guò)重組的alsS-1lv⑶基因或重組的ilvIHCD基因而在將丙酮酸分支碳鏈延伸成為2-酮-3-異戊酸中具有增加的代謝活性。更進(jìn)一步尤其優(yōu)選地，所述微生物細(xì)胞通過(guò)重組的IeuABCD基因而在直碳鏈延伸中也具有增加的代謝活性。
[0014]盡管不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制，一般優(yōu)選地，微生物細(xì)胞中醇脫氫酶的活性與非遺傳修飾的細(xì)胞相比降低至少70%，更典型地至少90%。
[0015]在特別優(yōu)選的方法中，在汽相中除去醛的步驟包括攪拌發(fā)酵培養(yǎng)基，用惰性氣體氣提(stripping)發(fā)酵培養(yǎng)基，用含有氧的氣體氣提發(fā)酵培養(yǎng)基，和/或?qū)⑷┡c結(jié)合劑暫時(shí)結(jié)合。更典型地，將醛連續(xù)地從發(fā)酵培養(yǎng)基移出。然后將如此分離的醛還原成相應(yīng)的醇，例如通過(guò)使用電化學(xué)還原、酶還原和/或利用氫的催化還原。
[0016]合適的微生物細(xì)胞從如下的屬中選出:埃希氏菌屬，芽孢桿菌屬，棒狀桿菌屬，羅爾氏菌屬(Ralstonia),發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas),梭菌屬，乳桿菌屬(Lactobacillus),聚球藻屬(Synechococcus),集胞藻屬(Synechocystis),酵母屬，畢赤酵母屬，假絲酵母屬，漢遜酵母屬，和曲霉屬。因此，特別優(yōu)選的微生物細(xì)胞包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，細(xì)長(zhǎng)聚球藻(Synechococcus elongatus),真養(yǎng)羅爾氏菌(Ralstonia eutropha),和釀酒酵母。[0017]因此，從不同的角度考慮，產(chǎn)生代謝工程化的微生物細(xì)胞用于在體外從醛產(chǎn)生有價(jià)值的產(chǎn)物(例如醇)的生產(chǎn)過(guò)程的方法，包括:遺傳修飾微生物細(xì)胞使其丙酮酸或2-酮丁酸到醛的轉(zhuǎn)化增加的步驟，和進(jìn)一步地遺傳修飾微生物細(xì)胞使其醇脫氫酶活性降低，從而使該微生物細(xì)胞基本上沒(méi)有醇產(chǎn)生的步驟。在另外一個(gè)步驟中，對(duì)經(jīng)修飾的微生物細(xì)胞的下述性質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn):在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生揮發(fā)性醛，其產(chǎn)量足以允許揮發(fā)性的醛從發(fā)酵培養(yǎng)基中氣提，從而允許在體外將醛轉(zhuǎn)化成有價(jià)值的產(chǎn)物(例如將醛還原成相應(yīng)的醇)。
[0018]在特別優(yōu)選的方面中，所述微生物細(xì)胞通過(guò)重組的丙酮酸脫羧酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醛的代謝活性增加，或者通過(guò)重組的2-酮異戊酸脫羧酶將2-酮丁酸轉(zhuǎn)化成丙醛的代謝活性增加。并且/或者，所述微生物細(xì)胞通過(guò)重組的IeuABCD基因具有更高的直碳鏈延伸代謝活性，和/或通過(guò)重組的ilvGMCD基因或重組的ilvBNCD基因具有更高的將2-酮丁酸分支碳鏈延伸成為2-酮3-甲基戊酸的代謝活性，或者通過(guò)重組的alsS-1lvCD基因或重組的ilvIHCD基因具有更高的將丙酮酸分支碳鏈延伸成為2-酮-異戊酸的代謝活性。
[0019]本發(fā)明的各種目標(biāo)、特征、方面和優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)如下優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述以及相應(yīng)的附圖變得更加顯而易見(jiàn)，附圖中同樣的數(shù)字代表同樣的組分。
[0020]附圖簡(jiǎn)沭
[0021]圖1A是產(chǎn)生直鏈醒的代謝通路的示意圖。
[0022]圖1B是產(chǎn)生分支鏈醛的代謝通路的示意圖。
[0023]詳細(xì)說(shuō)明
[0024]本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，微生物細(xì)胞能夠被代謝工程化而實(shí)質(zhì)性增加各種(特別是揮發(fā)性的)醛的產(chǎn)生，它們不會(huì) 或者僅以可忽略的程度被進(jìn)一步代謝成相應(yīng)的醇。這種方法是特別出人意料的，因?yàn)槿┩ǔ＞哂斜认鄳?yīng)的醇更明顯的毒性，并且由于內(nèi)源醇脫氫酶的抑制，醛會(huì)以更快的速度產(chǎn)生(并在細(xì)胞內(nèi)潛在積累)。然后，以連續(xù)或半連續(xù)的方式(即以間歇性的方式，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中使用至少兩個(gè)除去周期)將如此產(chǎn)生的醛在汽相中從發(fā)酵培養(yǎng)基中移出，優(yōu)選通過(guò)用氣提氣(stripping gas)氣提該培養(yǎng)基而移出。
[0025]在本發(fā)明的特別優(yōu)選的方面中，微生物細(xì)胞被遺傳修飾，從而具有更高的將丙酮酸或2-酮丁酸轉(zhuǎn)化成醛的轉(zhuǎn)化，以及降低的醇脫氫酶活性。丙酮酸或2-酮丁酸向醛的轉(zhuǎn)化的增加最典型地是由于存在一種或多種這樣的核酸構(gòu)建體(例如作為質(zhì)粒提供和/或整合到宿主細(xì)胞基因組中)，其編碼導(dǎo)致可催化丙酮酸或2-酮丁酸轉(zhuǎn)化為醛的反應(yīng)的酶的形成的一個(gè)或多個(gè)基因。因此，在大多數(shù)情況下，轉(zhuǎn)化的增加是由于代謝產(chǎn)物通過(guò)細(xì)胞內(nèi)通向期望的醛終產(chǎn)物的生化反應(yīng)序列的通量增加所致。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，一種或多種內(nèi)源(非重組)酶可能是所述的細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)序列的一部分。
[0026]圖1A描述了一組用于增加細(xì)胞內(nèi)直鏈醛的產(chǎn)生的代謝工程化通路的實(shí)例。這里，從丙酮酸通過(guò)丙酮酸脫羧酶(Pdc)形成乙醛，從2-酮異戊酸(2-KB)通過(guò)2-酮異戊酸脫羧酶(kivD)形成丙醛。為了產(chǎn)生更長(zhǎng)鏈的產(chǎn)物，包括丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛等，代謝工程化通路可以進(jìn)一步包括編碼2-異丙基蘋果酸合酶(LEUA)，3-異丙基蘋果酸脫氫酶(IeuB), 3-異丙基蘋果酸異構(gòu)酶大亞基(IeuC),和3-異丙基蘋果酸異構(gòu)酶,小亞基(IeuD)的基因。最優(yōu)選地，這些基因被組織成處于合適控制下的操縱子，用于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。因此，被工程化而表達(dá)IeuAB⑶和kivD的細(xì)胞適合用于如圖所示從2-酮丁酸產(chǎn)生丁醛、戊醛、己醛、庚醛等，通過(guò)從2-KB起連續(xù)鏈延伸成為2-酮戊酸(2-KV)、2-酮己酸(2-KC)、2-酮庚酸(2-KH)和2-酮辛酸(2-KO)，最后脫羧。
[0027]圖1B描述了另一組用于增加細(xì)胞內(nèi)分支鏈醛的產(chǎn)生的代謝工程化通路的實(shí)例。這里，在如下基因產(chǎn)物的作用下，將2-ΚΒ分支化成2-Ket-3-甲基戊酸(2-K-3-MV):乙酰羥酸合成酶II大亞基(ilvG)，乙酰羥酸合酶II小亞基(ilvm)，乙酰羥酸異構(gòu)還原酶(ilvC)，和二羥酸脫水酶(ILVD)，或者乙酰羥酸合酶I大亞基(ilvB)，乙酰羥酸合酶I小亞基(ilvN)，乙酰羥酸異構(gòu)還原酶(ilvC)，和二羥酸脫水酶(ILVD)。然后，2-K-3-MV可以被kivD脫羧形成2-甲基-1-丁醛，或者可以通過(guò)由IeuAB⑶編碼的蛋白被連續(xù)地延伸為2-酮-4-甲基己酸(2-K-4MH)或2-酮-5-甲基庚酸(2_Κ_5ΜΗρ)，隨后被kivD脫羧而分別形成3-甲基-1-丙醛和4-甲基-1-己醛(以及更長(zhǎng)的分支產(chǎn)物)。當(dāng)起始材料是丙酮酸時(shí)，丙酮酸首先被乙酰乳酸合酶(alsS)、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶(ilvC)、和二羥酸脫水酶(ILVD)基因的表達(dá)產(chǎn)物分支化，這些基因優(yōu)選地組織成功能性的表達(dá)盒子alsS-1lv⑶；或者被乙酰羥酸合酶III (ilvl)的大亞基、乙酰羥酸合酶III (ilvH)的小亞基、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶(ilvC)、和二羥酸脫水酶(ILVD)基因的表達(dá)產(chǎn)物分支化而形成2-酮異戊酸(2-KIV)。2-KIV脫羧產(chǎn)生2-甲基-1-丙醛，而通過(guò)IeuAB⑶的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鏈延伸產(chǎn)生2-酮異己酸(2-KIC)和2-酮-5-甲基己酸(2-K-5Mhx)和更高級(jí)的產(chǎn)物。如前文所述，2-KIC和2_K_5Mhx隨后被脫羧成為相應(yīng)的3-甲基-1- 丁醛和4-甲基-1-戊醛，和更高級(jí)的產(chǎn)物。
[0028]因此，在本發(fā)明主題的特別優(yōu)選的方面中，這里構(gòu)想的微生物細(xì)胞將會(huì)通過(guò)表達(dá)重組ilvGMCD基因或表達(dá)重組ilvBNCD基因而在將2-酮丁酸分支碳鏈延伸為2-酮-3-甲基戊酸中具有增加的代謝活性，和/或通過(guò)表達(dá)重組alsS-1lv⑶基因或表達(dá)重組ilvIHCD基因而在將丙酮酸分支碳鏈延伸為2-酮-異戊酸中具有增加的代謝活性。
[0029]在更進(jìn)一步的優(yōu)選方面中，構(gòu)想的細(xì)胞還將會(huì)通過(guò)表達(dá)重組2-酮異戊酸脫羧酶(優(yōu)選地kivD)而在對(duì)2-酮戊酸、2-酮己酸、2-酮庚酸、2-酮辛酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-酮-4-甲基己酸、2-酮-5-甲基庚酸、2-酮-6-甲基辛酸、2-酮-異戍酸、2-酮-異己酸、2-酮-5-甲基己酸、或2-酮-6-甲基辛酸中的一種或多種的脫羧中具有增加的代謝活性，和/或通過(guò)表達(dá)重組丙酮 酸脫羧酶而在將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛中具有增加的代謝活性，和/或通過(guò)表達(dá)重組2-酮異戊酸脫羧酶而在將2-酮丁酸轉(zhuǎn)化為丙醛中具有增加的代謝活性。在特別優(yōu)選的方面中，細(xì)胞將被進(jìn)一步遺傳修飾，從而通過(guò)表達(dá)重組IeuABCD基因而具有增加的直碳鏈延伸的代謝活性。
[0030]當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，所有所述的基因均可以是未被修飾的，或者可以被工程化而賦予期望的選擇性、更高的轉(zhuǎn)換率等(見(jiàn)例如Proc.Nat.Acad.Sc1.(2008)，105, n0.52:20653 - 20658;W02009/149240Al)o 對(duì)代謝工程化細(xì)胞的活性合適的基因在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且認(rèn)為結(jié)合本文提出的教導(dǎo)來(lái)使用所有這些基因都是合適的。而且，認(rèn)為所有已知的制作代謝工程化細(xì)胞的方式也適合于在這里使用。例如，代謝工程化細(xì)胞可以通過(guò)基因組插入一個(gè)或多個(gè)基因、操縱子或用質(zhì)?；蚴删＾D(zhuǎn)染來(lái)加以修飾，這是本領(lǐng)域眾所周知的。在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中還可以使用突變體微生物，并可以根據(jù)期望進(jìn)一步進(jìn)行修飾。
[0031]在進(jìn)一步的特別優(yōu)選方面中，內(nèi)源醇脫氫酶活性至少被降低，更優(yōu)選被抑制；應(yīng)當(dāng)注意，在優(yōu)選的方面中，所有或者基本上所有的醇脫氫酶將被抑制或刪除。例如，被抑制或刪除的脫氫酶包括adhE，IdhA，frdB，和pflB。還應(yīng)當(dāng)注意，脫氫酶活性可以通過(guò)多種眾所周知的方式加以抑制或刪除，包括下調(diào)(例如通過(guò)反義RNA或siRNA)或破壞編碼脫氫酶的基因，引入敲低(knock-down)或敲除(knock-out)突變等)。結(jié)果，構(gòu)想的遺傳修飾細(xì)胞的超過(guò)I種脫氫酶將被突變或抑制。
[0032]從另一不同的角度看，因此構(gòu)想經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生任何顯著量的短鏈(最多到C6，直鏈或分支)醇。例如，相對(duì)于相應(yīng)的醇，這些修飾的細(xì)胞會(huì)向發(fā)酵培養(yǎng)基釋放顯著更高量的醛，最典型地，醛與相應(yīng)醇(例如丁醛:丁醇)的摩爾比為至少3:1，更典型地至少4:1，最典型地至少5:1。結(jié)果，發(fā)酵培養(yǎng)基中總的短鏈(最多到C6，直鏈或分支)醇將少于發(fā)酵培養(yǎng)基的lwt%，更典型地少于0.5wt%，最典型的少于0.lwt%0因此，在特別優(yōu)選的方面中，將修飾的細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生任何可檢測(cè)的醇(即少于10mg/l發(fā)酵培養(yǎng)基)。
[0033]重組微生物可以是任何合適的微生物，包括細(xì)菌、藍(lán)藻或真菌。然而，非光合活性微生物是特別優(yōu)選的。因此，在一些實(shí)施方案中，微生物細(xì)胞屬于從下組選出的屬:埃希氏菌屬，芽孢桿菌屬，棒狀桿菌屬，羅爾氏菌屬，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞屬，梭菌屬，乳桿菌屬，聚球藻屬，集胞藻屬，酵母屬，畢赤酵母屬，假絲酵母屬，漢遜酵母屬，和曲霉屬。在優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，細(xì)長(zhǎng)聚球藻，真養(yǎng)羅爾氏菌(Ralstoniaeutropha ),和釀酒酵母。
[0034]應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，培養(yǎng)條件通常會(huì)取決于微生物的具體選擇，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地選擇合適的培養(yǎng)基。除了其它合適的選擇之外，一般而言優(yōu)選的是，培養(yǎng)基的碳源為糖類，特別是葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纖維素、半纖維素、甘油、二氧化碳、蛋白質(zhì)和/或氨基酸。然而，許多其他碳源也被認(rèn)為是合適的，其他碳源的實(shí)例包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、C02、CH4、復(fù)雜的有機(jī)混合物(例如生物固體(biosolids)、肉類加工廢料、基于植物的材料等)。無(wú)論具體的培養(yǎng)條件為何，將揮發(fā)性的醛在汽相中從發(fā)酵培養(yǎng)基移出。更優(yōu)選地，這種移出在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中以連續(xù)的方式實(shí)施，該移出可以是基于攪動(dòng)發(fā)酵培養(yǎng)基、用惰性氣體氣提發(fā)酵培養(yǎng)基、用含氧氣體氣提發(fā)酵培養(yǎng)基、和/或?qū)⑷┡c結(jié)合劑暫時(shí)結(jié)合?；蛘?，醛的移出還可以在發(fā)酵之后 實(shí)施，或者以半連續(xù)的方式實(shí)施(例如通過(guò)與氣提氣間歇性接觸)。
[0035]關(guān)于進(jìn)一步的處理，應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，醛的冷凝可以通過(guò)各種方式實(shí)施，優(yōu)選地使用本領(lǐng)域眾所周知的冷凝器，并且這樣冷凝的醛產(chǎn)物可以使用常規(guī)方式在一個(gè)或多個(gè)步驟中進(jìn)一步純化，或者可以直接用于還原反應(yīng)以產(chǎn)生相應(yīng)的醇。本領(lǐng)域已知有許多用于醛的還原反應(yīng)，認(rèn)為所有這些均適合于在這里使用。例如，特別合適的還原反應(yīng)包括電化學(xué)還原、酶還原和利用氫的催化還原。
[0036]因此，應(yīng)當(dāng)理解，產(chǎn)生供醇生產(chǎn)過(guò)程中使用的代謝工程化微生物細(xì)胞的方法包括:遺傳修飾微生物細(xì)胞使之具有更高的從丙酮酸或2-酮丁酸到醛的轉(zhuǎn)化；遺傳修飾微生物細(xì)胞使之具有更低的醇脫氫酶活性，從而使該微生物細(xì)胞基本上沒(méi)有醇的產(chǎn)生；并測(cè)試經(jīng)修飾的微生物細(xì)胞是否在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生足以容許從發(fā)酵培養(yǎng)基中氣提、并藉此容許將其在體外還原成相應(yīng)的醇的量的揮發(fā)性醛。
[0037]如果期望，還構(gòu)想這里提出的細(xì)胞不需要用于醇的生產(chǎn)，而是用于產(chǎn)生各種醛，特別是揮發(fā)性醛。在這種情況下，將細(xì)胞如上所述地加以遺傳修飾，并在適合于產(chǎn)生醛的條件下培養(yǎng)。更典型地，隨后將如此生產(chǎn)的醛從培養(yǎng)培養(yǎng)基中氣提出來(lái)，并冷凝供銷售、或供進(jìn)一步使用，或供儲(chǔ)存。[0038]此外，應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，構(gòu)想的方法、細(xì)胞和處理還可有利地允許產(chǎn)生除醇之外的期望化合物，如果期望化合物的前體是醛的話。例如，當(dāng)遺傳修飾的細(xì)胞的發(fā)酵產(chǎn)物是乙醛時(shí)，特別優(yōu)選的從乙醛體外制備的產(chǎn)物是乙醇和乙酸。類似地，當(dāng)遺傳修飾的細(xì)胞的發(fā)酵產(chǎn)物是丙醛時(shí)，特別優(yōu)選的從丙醛體外制備的產(chǎn)物包括正丙醇、乙酸正丙酯、丙酸、和乙酸丙酸纖維素。同樣，當(dāng)遺傳修飾的細(xì)胞的發(fā)酵產(chǎn)物是正丁醛時(shí)，特別優(yōu)選的從正丁醛體外制備的產(chǎn)物包括正丁醇、乙基己醇、聚乙烯縮丁醛、2-乙基己酸、甲基戊酮、正丁酸、乙酸正丁酯、丙烯酸正丁酯、和乙酸丁酸纖維素。當(dāng)遺傳修飾的細(xì)胞的發(fā)酵產(chǎn)物是異丁醛時(shí)，特別優(yōu)選的從異丁醛體外制備的產(chǎn)物包括異丁醇、異丁酸、新戊二醇、甲基異戊酮、乙酸異丁酯、丙烯酸異丁酯、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇，2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇、單異丁酸酯或鹽、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二異丁酸酯、和異丁酸異丁酯。
[0039]實(shí)施例
[0040]DNA操作:實(shí)施例使用的是標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，如Sambrook J等編輯的《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述。
[0041]基因敲除:所有的基因敲除均使用合適的Keio庫(kù)菌株(Keio collectionstrains) (Construction of Escherichia coli K-12in-frame, single-gene knockoutmutants: the Keio collection, Mol.Syst.Biol.2:2006.0008 (2006))，通過(guò) Pl 轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。利用每?jī)蓚€(gè)連續(xù)敲除之間的 pCP20 (One-step inactivation of chromosomal genes inE.coli using PCR products, Proc.Natl.Acad.Sc1., 97:6640-6645 (2000))除去卡那霉素抗性基因。
[0042]發(fā)酵:大腸桿菌菌株在含有合適抗生素的LB中37°C培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，將過(guò)夜細(xì)胞在250ml旋蓋瓶中亞培養(yǎng)(通常1:100)，瓶中含有10_20ml M9培養(yǎng)基(每升水含有64gNa2HPO4.7H20, 15g KH2PO4, 2.5g NaCl, 5g NH4Cl, 2mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, IOmg 硫胺素)和5g/升酵母提取物、40g/升 葡萄糖、和合適的抗生素。隨后將培養(yǎng)物在搖床上(250rpm)37°C溫育。為了減少異丁醛的損失，在取樣前將培養(yǎng)物冷卻到4°C達(dá)30min。
[0043]GC分析:通過(guò)裝備有FID (火焰離子化檢測(cè)器)的氣相質(zhì)譜(GC)對(duì)異丁醛和異丁醇加以定量。系統(tǒng)由一個(gè)7890A型GC和7693型自動(dòng)進(jìn)樣器(Agilent Technologies)組成。使用長(zhǎng) 30m、內(nèi)徑 0.32mm 的 0.25 μ m DB-FFAP 毛細(xì)管柱(Agilent Technologies)。將GC爐溫保持在85°C 3min,以45°C /min的梯度升溫至225°C并保持3min。檢測(cè)器和入口溫度保持在225°C。所用氫氣、空氣和氦氣的流速分別為40ml/min，450ml/min, 45ml/min。培養(yǎng)肉湯的上清以分流進(jìn)樣模式(split injection mode) (1:25分流比)進(jìn)樣,用1_戍醇作為內(nèi)參。
[0044]用于異丁醛生產(chǎn)的質(zhì)粒構(gòu)建:pEB121:質(zhì)粒pEB0121通過(guò)DNA組裝四個(gè)節(jié)段加以構(gòu)建。第一個(gè)節(jié)段含有PLlacOl啟動(dòng)子、pl5A復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素抗性基因，用引物I和2 從 pZE21_MCSl 的衍生物(Independent and tight regulation of transcriptionalunits in Escherichia coli via the LacR/0, the TetR/0 and AraC/Il_I2regulatoryelements.Nucleic Acids Res25:1203-10 (1997))中將該節(jié)段擴(kuò)增出來(lái)。在該 pZE21_MCSl衍生物中，作為利用AatI和Acc65I限制位點(diǎn)與pZE12_luc進(jìn)行啟動(dòng)子交換的結(jié)果，PLtetOl 被 PLlacOl 所代替(Independent and tight regulation of transcriptionalunits in Escherichia coli via the LacR/0, the TetR/0 and AraC/Il_I2regulatoryelements.Nucleic Acids Res25:1203-10 (1997))。以枯草芽抱桿菌B.subtilis基因組DNA為模板，用引物3和4擴(kuò)增出第二節(jié)段。以大腸桿菌基因組DNA(ATCC10789D-5)為模板，用引物5和6擴(kuò)增出含有ilvC的第三節(jié)段。以大腸桿菌基因組DNA(ATCC10789D-5)為模板，用引物7和8擴(kuò)增出含有ilvD的第四節(jié)段。
[0045]引物1: 5’ -ACGCGTGCTAGAGGCATCAAA-3’ ；引物 2: 5 ’ -TGTACCTTTCTCCTCTTTAATGAATTCGGTCAGTGCG-3，;引物 3:5，-TTAAAGAGGAGAA AGGTACAATGTTGACAAAAGCAACAAAAGAACAAA-3’ ;引物 4:5’-CAT GGTGATTCCTCGTCGACCTAGAGAGCTTTCGITTTCA-3’ ；引物5:5，-GTCGACGAGGAATCACCATGGCTAACTACTTCAATAC-3，;引物 6:5，-ATGGTATATCTCCTTCCGGGTTAACCCGCAACAGCAATAC-3，;引物 7:5，-CCCGGAAGGAGATATACCATGCCTAAGTACCGTTCCGC-3，;引物 8:5，-TTGATGCCTCTAGCACGCGTTTAACCCCCCAGTTTCGATT-3，。
[0046]pEB5:質(zhì)粒pEB0005通過(guò)兩個(gè)節(jié)段的DNA組裝加以構(gòu)建。載體通過(guò)用引物9和10 擴(kuò)增 pZE12_luc (Independent and tight regulation of transcriptional units inEscherichia coli via the LacR/0, the TetR/0 and AraC/Il-12 regulatory elements.Nucleic Acids Res 25:1203-10 (1997))來(lái)擴(kuò)增。Kivd基因用引物11和12從乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)基因組 DNA 擴(kuò)增。
[0047]引物9:5 ’ -TCTAGAGGCATCAAATAAAACGAAAGG-3 ’ ;引物 10:5 ’ -GGTACCTTTCTCCTCTTTAATGAATTC-3’ ;引物 11:5’ -TTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGTATACAGTAGGAGATTA-3’ ；引物12:5’ -TTTTATTTGATGCCTCTAGAATGATTTATTTTGTTCAGCA-3，。
[0048]異丁醒生產(chǎn)宿主菌株的構(gòu)建:大腸桿菌BW25113 (Datsenko and Warner 2000)用作野生型。為了消除IPTG誘導(dǎo)，首先敲除了 IacI基因。然后，依次敲除主要的醇脫氫酶，以構(gòu)建用于異丁醛生產(chǎn)的平臺(tái)菌株EB4 (大腸桿菌BW25113 Δ IacI Δ adhE Δ yqhD Δ yiaY)。去除醇脫氫酶可以通過(guò)阻斷向異丁醇的轉(zhuǎn)化而增加異丁醛產(chǎn)生，如表1所示(所有菌株均帶有兩個(gè)質(zhì)粒PEB5和pEB121)。
[0049]表1
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)醇的方法，包括: 在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)多個(gè)微生物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞被遺傳修飾從而與非遺傳修飾的細(xì)胞相比具有增加的代謝活性； 其中該增加的代謝活性以增加的丙酮酸或2-酮丁酸到醛的轉(zhuǎn)化為特征； 其中所述多個(gè)微生物細(xì)胞還被遺傳修飾從而具有降低的醇脫氫酶活性； 連續(xù)或半連續(xù)地將醛在汽相中從發(fā)酵培養(yǎng)基中移出； 從汽相中冷凝醛；和 將冷凝的醛還原為相應(yīng)的醇。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物細(xì)胞通過(guò)表達(dá)重組的丙酮酸脫羧酶而在丙酮酸到乙醛的轉(zhuǎn)化中具有增加的代謝活性。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物細(xì)胞通過(guò)表達(dá)重組的2-酮異戊酸脫羧酶而在2-酮丁酸到丙醛的轉(zhuǎn)化中具有增加的代謝活性。
4.權(quán)利要求1的方法，其中該微生物細(xì)胞通過(guò)表達(dá)重組的2-酮異戊酸脫羧酶而在對(duì)2-酮戊酸、2-酮己酸、2-酮庚酸、2-酮辛酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-酮-4-甲基己酸、2-酮-5-甲基庚酸、2-酮-6-甲基辛酸、2-酮-異戍酸、2-酮-異己酸、2-酮-5-甲基己酸、或2-酮-6-甲基辛酸中一種或多種的脫羧中具有增加的代謝活性。
5.權(quán)利要求1的方法,其中所述微生物細(xì)胞通過(guò)表達(dá)重組的iIvGMCD基因或表達(dá)重組的ilvBNCD基因而在2 -酮丁酸到2-酮-3-甲基戊酸的分支碳鏈延伸中具有增加的代謝活性。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物細(xì)胞通過(guò)表達(dá)重組的alsS-1lv⑶基因或表達(dá)重組的ilvIHCD基因而在丙酮酸到2-酮-異戊酸的分支碳鏈延伸中具有增加的代謝活性。
7.權(quán)利要求4、5或6中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物細(xì)胞通過(guò)表達(dá)重組的IeuAB⑶基因而在直碳鏈延伸中具有增加的代謝活性。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物細(xì)胞中降低的醇脫氫酶活性是與非遺傳修飾的細(xì)胞相比降低至少70%。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物細(xì)胞中降低的醇脫氫酶活性是與非遺傳修飾的細(xì)胞相比降低至少90%。
10.權(quán)利要求1的方法，其中在汽相中移出醛的步驟包括選自下組的步驟:攪動(dòng)發(fā)酵培養(yǎng)基，用惰性氣體氣提發(fā)酵培養(yǎng)基，用含氧氣體氣提發(fā)酵培養(yǎng)基，和將醛與結(jié)合劑暫時(shí)結(jié)口 O
11.權(quán)利要求1的方法，其中移出醛的步驟是連續(xù)實(shí)施的。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述醛選自下組:乙醛、丙醛、丁醛和2-甲基-1-丙醛。
13.權(quán)利要求1的方法，其中將冷凝的醛還原成相應(yīng)醇的步驟選自下組:電化學(xué)還原、酶還原和用氫催化還原。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物細(xì)胞屬于選自下組的屬:埃希氏菌屬(Escherichia)，芽抱桿菌屬(Bacillus)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，羅爾氏菌屬(Ralstonia)，發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)，梭菌屬(Clostridium)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，聚球藻屬(Synechococcus)，集胞藻屬(Synechocystis)，酵母屬(Saccharomyces)，畢赤酵母屬(Pichia)，假絲酵母屬(Candida)，漢遜酵母屬(Hansenula),和曲霉屬(Aspergillus)。
15.權(quán)利要求14的方法,其中微生物細(xì)胞屬于選自下組的種:大腸桿菌(Escherichiacoli),枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis),細(xì)長(zhǎng)聚球藻(Synechococcus elongatus),真養(yǎng)羅爾氏菌(Ralstonia eutropha),和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
16.權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基具有選自下組的碳源:葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纖維素、半纖維素、甘油、二氧化碳、蛋白質(zhì)和氨基酸。
17.—種產(chǎn)生供在體外從醛生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)物的過(guò)程中使用的代謝工程化微生物細(xì)胞的方法，包括: 遺傳修飾微生物細(xì)胞使之具有增加的丙酮酸或2-酮丁酸到醛的轉(zhuǎn)化； 遺傳修飾微生物細(xì)胞使之具有降低的醇脫氫酶活性，從而使該微生物細(xì)胞基本上沒(méi)有醇產(chǎn)生；和 檢驗(yàn)經(jīng)修飾的微生物細(xì)胞是否在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生足夠量的揮發(fā)性醛，所述量足以允許從發(fā)酵培養(yǎng)基中氣提該揮發(fā)性醛，藉此允許在體外將該醛轉(zhuǎn)化成所述有價(jià)值的產(chǎn)物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述微生物細(xì)胞通過(guò)表達(dá)重組的丙酮酸脫羧酶而在丙酮酸到乙醛的轉(zhuǎn)化中具有增加的代謝活性，或者通過(guò)表達(dá)重組的2-酮異戊酸脫羧酶而在2-酮丁酸到丙醛的轉(zhuǎn)化中具有增加的代謝活性。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述微生物細(xì)胞通過(guò)表達(dá)重組的IeuAB⑶基因而在直碳鏈延伸中具有增加的代謝活性。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述微生物細(xì)胞通過(guò)表達(dá)重組的ilvGMCD基因或表達(dá)重組的ilvBNCD基因而在2-酮丁`酸到2-酮-3-甲基戊酸的分支碳鏈延伸中具有增加的代謝活性，或者通過(guò)表達(dá)重組的alsS-1lv⑶基因或表達(dá)重組的ilvIHCD基因而在丙酮酸到2-酮-異戊酸的分支碳鏈延伸中具有增加的代謝活性。
【文檔編號(hào)】C12P7/06GK103635577SQ201280023276
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月14日
【發(fā)明者】W.M.希加施德, K.M.周, S.拉比扎德 申請(qǐng)人:伊塞爾生物技術(shù)有限責(zé)任公司