從微藻制備和提取角鯊烯的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以屬于破囊壺菌目物種家族的微藻生產(chǎn)角鯊烯的方法，優(yōu)選以在每100g干生物質(zhì)2g與12g之間的濃度生產(chǎn)。該方法其特征在于它包括由以下項組成的步驟：在25℃與35℃之間、優(yōu)選在28℃與32℃之間、并且更優(yōu)選在大約30℃的溫度下培養(yǎng)屬于破囊壺菌目物種家族的微藻；并且向所述培養(yǎng)基以每升培養(yǎng)基添加1μg與1000μg之間的維生素B12。
【專利說明】從微藻制備和提取角鯊烯的方法
[0001]本發(fā)明涉及從破囊壺菌目物種家族的微藻通過發(fā)酵而最優(yōu)化生產(chǎn)角鯊烯的一種方法。
[0002]出于本發(fā)明的目的，表述“破囊壺菌目物種家族的微藻”旨在指代屬于裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.)、Aurantiochytrium 物種(Aurantiochytrium sp.)以及破囊壺菌屬物種(Thraustochytrium sp.)的微藻。
[0003]角鯊烯是一種三萜烯，一種包含30個碳原子和50個氫原子的類異戊二烯，具有以下化學式:2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯。
[0004]它是由所有較高級別的有機體，包括人類(在皮脂中發(fā)現(xiàn))天然產(chǎn)生的一種脂質(zhì)。角鯊烯實際上是膽固醇、類固醇激素和維生素D生物合成中的一種重要的中間產(chǎn)物(膽固醇代謝途徑的的一種酶一角鯊烯單加氧酶，通過氧化角鯊烯分子末端之一，將誘導其環(huán)化并且產(chǎn)生羊毛留醇，該羊毛留醇被轉(zhuǎn)化成膽固醇和其他類固醇)。
[0005]在工業(yè)上，角鯊烯尤其被用于食品部門、化妝品領域和制藥領域。
[0006]作為一種食品補充劑，角鯊烯通常被配制成膠囊或者油類。
[0007]在化妝品領域中，這個分子可以用作一種抗氧化劑，在保濕霜中用作抗靜電劑和潤膚劑，快速滲透進皮膚而不留下脂肪痕跡或者感覺，并與其他油類和維生素類很好地混合。
[0008]在這個領域，應該注意到，由于角鯊烯非常高的不穩(wěn)定性(6個不飽和狀態(tài))，飽和形式的角鯊烷(通過氫化作用得到)是比角鯊烯更好的抗氧化劑，這種角鯊烷在市場上可以找到，一般具有非常高的純度(99%)。
[0009]毒理學研究顯示，按照在化妝品中使用的濃度，角鯊烯和角鯊烷都不會展示出任何毒性，并且對人體皮膚沒有刺激性或者敏感性。
[0010]在制藥領域，角鯊烯用作疫苗的佐劑。
[0011]這些佐劑是刺激免疫系統(tǒng)并且增加對疫苗的反應的物質(zhì)。
[0012]自從1997年在一種流感疫苗(Fluad,來自Chiron公司，對抗季節(jié)性流感)中以每個劑量大約10mg角鯊烯使用角鯊烯以來，角鯊烯已經(jīng)以添加到接種物質(zhì)中的乳劑的形式使用以便使得疫苗更易產(chǎn)生免疫性。
[0013]如所有含有角鯊烯的疫苗，這些乳劑具有乳白色的外觀。
[0014]角鯊烯還被用作一種疫苗佐劑，特別是實驗疫苗、抗瘧疾物質(zhì)或者靶向新出現(xiàn)的病毒H5N1及2009H1N1的流感疫苗的佐劑，如:
[0015]-葛蘭素史克公司在對抗2009年流感流行時使用的Pandemrix和Arepanrix疫苗中的AS03佐劑系統(tǒng)的獲專利成分，
[0016]-諾華公司使用的MF59佐劑系統(tǒng)的獲專利成分。
[0017]角鯊烯還被添加在流感疫苗中以通過產(chǎn)生記憶⑶4細胞來刺激人體的免疫應答。
[0018]流感疫苗的第一個水包油佐劑已經(jīng)與季節(jié)性流感病毒抗原聯(lián)合上市。
[0019]角鯊烯的純度水平在這個應用領域中是至關重要的。
[0020]實際上，如果口服使用，角鯊烯被認為是完全安全的；但是，注射途徑是爭議主題。[0021]實際上，在醫(yī)學領域，在角鯊烯被雜質(zhì)污染的情況下，對人接受者的傷害的風險增加，因為通過確定，這種佐劑還可以誘導對抗其自身雜質(zhì)的強免疫應答。
[0022]因此擁有高質(zhì)量的無雜質(zhì)(痕量金屬，特別是汞，以及痕量的其他毒素類)的角鯊烯至關重要。
[0023]在文獻中建議了一些生產(chǎn)角鯊烯的路徑。
[0024]它是常常發(fā)現(xiàn)儲存在軟骨魚(例如深海鯊)的肝臟中的一種化合物(因此而得名)。
[0025]因此這是它們?yōu)槭裁幢贿^度捕漁的原因之一，鯊魚已經(jīng)由于其魚鰭而被獵殺?，F(xiàn)在又將鯊魚的肝臟出售以生產(chǎn)描述為“有益健康”的凝膠膠囊。
[0026]然而，雖然上市的角鯊烯因此主要從鯊魚的肝臟中提取，但是并非沒有健康問題。
[0027]這是因為鯊魚能被一些病原體感染，這些病原體可以產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)。另外，鯊魚的肝臟，它是有機體消除和純化的器官，可能包含對人體有害的例如真鯊毒素的毒素類。
[0028]這些環(huán)境問題(大大降低了鯊魚的數(shù)量)以及健康問題(魚的肝臟還儲存了涉及健康的毒素類)促使了從植物類的提取。
[0029]因此有可能將它從橄欖油、和棕櫚油中分離，以及從來自谷物類的或者源于莧菜、種子、米糠或小麥胚芽的其他油類中分離。
[0030]但是，這種情況中的主要缺點是角鯊烯被提取出的量非常少，按重量計大約為從0.1% 至 0.7%。
[0031]通常從鯊魚肝臟或從植物類提取的這些方法由于進行大量富集和純化過程而很昂貴，已經(jīng)提出了作為這些方法的第一個替代方法，該第一個方法是從以下微生物中產(chǎn)生角S烯:天然酵母或重組酵母，特別是酵母菌屬(Saccharomyces)類型。
[0032]由此，釀酒酵母以其產(chǎn)生角鯊烯的能力而為人了解，但是產(chǎn)生的量非常少:大約0.041mg/g生物量(巴塔查爾吉(Bhattachar jee，P.)等人，2001，《世界微生物生物技術雜志》(World J.Microb.Biotechnol.) 17,第 811-816 頁)。
[0033]因此已經(jīng)通過基因重組的方式進行了優(yōu)化這些生產(chǎn)能力的工作。
[0034]產(chǎn)生角鯊烯的重組酵母因此具有以下優(yōu)勢:
[0035]-受益于與宿主細胞相同的GRAS(通常認為安全)狀態(tài)，
[0036]-跟宿主細胞一樣沒有病原體、沒有朊病毒或沒有毒素類，以及
[0037]-已經(jīng)被用在疫苗領域(例如這些表達了包含乙肝抗原的載體的酵母菌)。
[0038]然而，如專利申請W02010/023551對于醫(yī)學領域所呈現(xiàn)的(生產(chǎn)純度高于97%的角鯊烯作為疫苗佐劑)，只有使得重組酵母菌超生產(chǎn)角鯊烯(高于菌體干重的15%)變得有可能，這第一個替代方法才可以工業(yè)化。
[0039]如果可以發(fā)生的話，獲得這些重組細胞需要:進行大量的、艱苦的、冗長并復雜的代謝工程化步驟，使用分子生物學工具，導致刺激角鯊烯生物合成路徑并且抑制角鯊烯的分解代謝途徑。
[0040]實際上，如所述專利申請W02010/023551另外介紹的，在角鯊烯生物合成中涉及很多基因:包含甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶、異戊二烯焦磷酸異構酶、HMGR (3-羥基-3-甲戊二酰-輔酶A還原酶)以及角鯊烯合成酶 。
[0041]對于分解代謝途徑，基因編碼在角鯊烯轉(zhuǎn)化成麥角固醇中涉及的眾多酶，包括角鯊烯環(huán)氧酶(ERG1)、羊毛留醇合成酶、C14-二甲基化酶、dl4-還原酶、C4-甲基氧化酶、C4-脫羧酶(ERG26)、3-酮還原酶、C24-甲基轉(zhuǎn)移酶、C8-異構酶、C5-去飽和酶、d22_去飽和酶和d24-還原酶。
[0042]另外，還必須考慮到其他分解代謝酶:LEU2 ( [ β ]_異丙基蘋果酸脫氫酶)，環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶，酵母留醇-24-甲基轉(zhuǎn)移酶以及麥角留-5，7，24 (28)-三烯醇-22-脫氫酶。
[0043]作為從鯊魚肝臟或從植物類提取方法的第二個替代方法，已經(jīng)提出了從破囊壺菌目家族 (包含破囊壺菌屬、Aurantiochytrium屬和裂殖壺菌屬)、更特別地從Schizochytrium mangrovei 或 Schizochytrium Iimacinum 的微藻中生產(chǎn)角藍烯的有希望的方法。
[0044]這些微藻在異養(yǎng)條件下(無光；提供葡萄糖作為碳源)產(chǎn)生角鯊烯，并且因此可以由微生物發(fā)酵領域的普通技術人員容易地操作。
[0045]因此，這些方法通過可控制的發(fā)酵條件提供高質(zhì)量的角鯊烯，這些角鯊烯的純化可以很容易地進行以滿足食品、化妝品和醫(yī)學需求。
[0046]然而在破囊壺菌目家族的這些微藻中，角鯊烯是感興趣的其他脂質(zhì)化合物(例如二十二碳六烯酸(或DHA)、ω 3族的多元不飽和脂肪酸)的副產(chǎn)品，。
[0047]因此似乎角鯊烯被特別描述為商業(yè)DHA油類的非皂化部分(連同類胡蘿卜素類和甾醇類)的成分之一。
[0048]相比較而言，Schizochytrium mangrovei FBI菌株產(chǎn)生DHA的比例為菌體干重的
6.2%，角鯊烯為0.017%。
[0049]結(jié)論是，天然產(chǎn)生角鯊烯的這些微生物類其產(chǎn)量是非常低的:
[0050]對于Thraustochytrid ACEM6063,大約為 0.lmg/g 生物質(zhì)(參見 Lewis 等人，《海洋生物技術》(Mar.Biotechnol.)，2001，439-447)，
[0051]對于Schizochytrium mangrovei FBI,大約為 0.162mg/g 生物質(zhì)(參見 Jiang 等人，《農(nóng)業(yè)與食品化學雜志》(J.Agric.Food Chem.)，2004，52，第1196-1200頁)。
[0052]為了增加產(chǎn)量，由此顯現(xiàn)出優(yōu)化這些發(fā)酵條件至關重要。
[0053]在Qian Li等人在《農(nóng)業(yè)與食品化學雜志》(J.Agric.FoodChem.，2009, 57，4267-4272)的文章中描述了角鯊烯是留醇生物合成的一種關鍵中間體，并且角鯊烯轉(zhuǎn)化成留醇的第一個步驟是由一種氧依賴性角鯊烯環(huán)氧酶進行催化。
[0054]因此，反之，如果希望的話，應禁止富含溶解氧的條件從而累積細胞內(nèi)的角鯊烯。
[0055]因此，在一個低的溶解氧水平(O至5%飽和度)下培養(yǎng)ThraustochytridACEM6063，使得有可能累積超過lmg/g的角鯊烯，然而在一個較高的溶解氧水平(40%至60%)下的生長使得有可能獲得僅僅0.0 lmg/g的角鯊烯。
[0056]相似地,在15°C的溫度下培養(yǎng)使得由Thraustochytrid ACEM6063生產(chǎn)出1.2mg/g角鯊烯，然而在20°C的溫度下培養(yǎng)僅僅產(chǎn)生0.7mg/g (參見Lewis等人，《海洋生物技術》(Mar.Biotechnol.),2001,3,439-447)。
[0057]在G.Chen 等人在《新生物技術》(New Biotechnology, 2010, 27-4, 382-389 頁)的文章中，回顧了裂殖壺菌主要通過聚酮合酶(首字母縮略詞:PKS)途徑產(chǎn)生DHA，然而角鯊烯是通過膽固醇生物合成途徑合成，這意味著產(chǎn)生這兩種化合物時破囊壺菌的營養(yǎng)需求是不同的。[0058]因此他們工作的目標是系統(tǒng)地研究在生產(chǎn)角鯊烯中不同氮源的效果。
[0059]G.Chen等人由此發(fā)現(xiàn)，在包含由谷氨酸鈉、酵母提取物和胰蛋白胨組成的氮源混合物的培養(yǎng)基中，裂殖壺菌可以快速生長并且累積“高”量的角鯊烯。[0060]盡管這樣，所謂的“高”的角鯊烯產(chǎn)量完全是相對而言的。
[0061]雖然相對于基礎培養(yǎng)基的值，這些作者成功地分別以26.3%和10.1%顯著增加角鯊烯的含量和產(chǎn)率，但是這些優(yōu)化的條件實際上產(chǎn)生含量為0.72mg/g和滴度為5.90mgl/l的角鯊烯。
[0062]帶著優(yōu)化角鯊烯產(chǎn)量的相同目標，K.ff.Fan等人(在《世界微生物生物技術雜志》(World J.Microbiol.Biotechnol.) , 2010, 26-3, 1303-1309 頁中)使用了角S烯單加氧酶(甾醇生物合成中的一種關鍵酶)的抑制劑:特比萘芬羥基氯化物。
[0063]已知角鯊烯含量和產(chǎn)率與微生物培養(yǎng)的年齡相聯(lián)系。
[0064]細胞培養(yǎng)年齡越長，它累積的角鯊烯越少；實際上，它在留醇生物合成路徑中消耗所述角鯊烯越多。
[0065]因此特比萘芬通過防止角鯊烯向甾醇路徑的這種消耗而起作用，并且因此使得其有可能刺激角鯊烯在細胞內(nèi)累積至相對于對照品高達36%至40%。
[0066]但是,在這個研究中從所使用的Aurantiochytrium mangrovei FB3菌株獲得的最高的角S烯產(chǎn)量，即使比對于釀酒酵母(s.cerevisiae) (0.04lmg/g生物質(zhì))所描述的高很多、或者甚至比對于戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii) (0.24mg/g生物質(zhì))所描述的還高，卻僅僅是0.53mg/g生物質(zhì)。
[0067]此外，雖然這些代謝途徑的轉(zhuǎn)移允許產(chǎn)生相對更高量的角鯊烯，它的風險是通過相應地限制對產(chǎn)生這些相同細胞的類脂膜至關重要的留醇類的產(chǎn)生而弱化這些細胞。
[0068]在這些最高的角鯊烯產(chǎn)量結(jié)果中，使用如在由C-J Yue和Y.Jiang在《過程生物化學》(Process Biochemistry, 2009, 44, 923-927)的文獻文章中所報道的微藻,表明最大角S烯含量為1.17±0.6mg/gSchizochytrium mangrovei生物質(zhì),其中使用茉莉酸甲酯通過直接作用于角鯊烯合成酶(一種所述代謝途徑的關鍵酶)來調(diào)節(jié)角鯊烯合成的代謝途徑。
[0069]因此，盡管作了所有的努力，這些值遠遠低于橄欖油的參考值(大約4.24mg/g)，并且遠非工業(yè)規(guī)模所需的值。
[0070]考慮到開發(fā)比現(xiàn)有技術中描述的那些更有效并且更便宜的一種生產(chǎn)方法，本 申請人:公司已經(jīng)發(fā)展了自己在破囊壺菌目物種家族的微藻的發(fā)酵條件優(yōu)化上的研究。
[0071]因此本發(fā)明涉及一種用于獲得對于100g的干生物質(zhì)而言Ig角鯊烯規(guī)模的方法，也就是，超過這個領域的文獻中通常所描述的量高達1000倍。
[0072]本發(fā)明還涉及一種從得到的發(fā)酵培養(yǎng)基提取和純化角鯊烯的方法。
[0073]通過發(fā)酵裂殖壺菌來生產(chǎn)角鯊烯
[0074]對本 申請人:公司最主要的榮譽是發(fā)現(xiàn)，在控制發(fā)酵的所有參數(shù)中，其中兩個使得它們本身有可能在這些微藻中大量提高角鯊烯的產(chǎn)量水平。
[0075]這兩個關鍵參數(shù)是培養(yǎng)基的溫度、以及維生素類的添加，更準確地說是維生素BI和B6并且尤其是維生素B12的添加。
[0076]因此本發(fā)明涉及由屬于破囊壺菌目物種家族的微藻來生產(chǎn)角鯊烯的一種方法，其特征在于它包含以下步驟:[0077]-在25°C與35 °C之間、優(yōu)選在28 °C與32 °C之間、更優(yōu)選大約30 V的溫度下，培養(yǎng)屬于破囊壺菌目物種家族的微藻，并且
[0078]-向該培養(yǎng)基中以每升培養(yǎng)基添加Iμ g至1000 μ g的維生素B12。
[0079]優(yōu)選地，如以下將表明的，本 申請人:公司推薦添加:
[0080]〇每升培養(yǎng)基0.1mg至200mg的維生素BI,和/或
[0081]〇每升培養(yǎng)基0.1mg至200mg的維生素B6。
[0082]當然，該方法可以包括回收富含角鯊烯生物質(zhì)的一個步驟和/或回收或提取角鯊烯的一個步驟。
[0083]更具體地，已經(jīng)測試了以下可商購的菌株:
[0084]-裂殖壺菌屬物種，參考號ATCC20888，
[0085]-Aurantiochytrium 物種，參考號 ATCC PRA276。
[0086]此外，本 申請人:公司還擁有自己的生產(chǎn)菌株一裂殖壺菌屬物種，于2011年4月14日保藏在法國巴斯德研究所的法國國家微生物保藏中心[Collection Nationale deCultures de Microorganisms],保藏號為CNCM 1-4469,并且還保藏在中國武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢，430072)，保藏號為M209118。
[0087]還將Schizochy trium mangrovei的一個菌株作為對照進行了測試，以下將舉例說明。
[0088]具體地，根據(jù)本發(fā)明的方法使得有可能獲得對于100g干生物質(zhì)而言大于或等于2g、優(yōu)選對于100g干生物質(zhì)而言在2g與12g之間的角鯊烯含量。具體地，可以根據(jù)實驗部分詳述的方法對所產(chǎn)生的角鯊烯進行定量。
[0089]由此，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，首要的基本特征是選擇進行微藻培養(yǎng)和生產(chǎn)角鯊烯的溫度。
[0090]因此將該溫度選擇在25°C與35°C之間，優(yōu)選在28°C與32°C之間，更優(yōu)選大約在
30。。。
[0091]因此本 申請人:公司克服了第一個技術偏見，即要求這些微藻的培養(yǎng)不應超過
25。。。
[0092]事實上，在以上所引用的破囊壺菌目生產(chǎn)角鯊烯的大部分文獻中，基于所研究的微藻的生長溫度(即15 °C、22 °C或25 °C )來設置生產(chǎn)溫度。
[0093]根據(jù)本發(fā)明的方法，本 申請人:公司建議，相反地，在28°C和32°C培養(yǎng)這些微藻，因為已經(jīng)能夠注意到:
[0094]-雖然由菌體生物質(zhì)生產(chǎn)的角鯊烯的濃度隨著溫度高達33°C而增加，超過30°C生物質(zhì)的量將顯著降低，因此限制角鯊烯滴度，
[0095]-在25°C的溫度下，角鯊烯濃度無法檢測到或者非常低。
[0096]因此這個溫度范圍是微藻最佳培養(yǎng)溫度和角鯊烯有效生產(chǎn)溫度之間的一個折衷。
[0097]因此最高25°C的溫度與現(xiàn)有技術中通常使用的溫度不矛盾，這個溫度最佳地促進角鯊烯的生產(chǎn)。
[0098]在根據(jù)本發(fā)明的方法中，第二個基本特征是提供給裂殖壺菌培養(yǎng)基來生產(chǎn)角鯊烯的維生素B12的量，即以每升培養(yǎng)基從1μ g至1000 μ g的維生素B12的比例。
[0099]優(yōu)選地，添加維生素B12時還可以補充:[0100]〇每升培養(yǎng)基0.1mg至200mg的維生素BI,和/或
[0101]〇每升培養(yǎng)基0.1mg至200mg的維生素B6。
[0102]在涉及用以上提及的微藻生產(chǎn)角鯊烯的文獻中，維生素類的作用沒有考慮。維生素類的提供常規(guī)地通過添加酵母提取物來進行。
[0103]事實上本領域的普通技術人員熟知這些維生素類是按以下比例天然存在于酵母提取物中的:
[0104]_50mg/kg 至 120mg/kg 的維生素 BI (硫胺素)，
[0105]-40mg/kg 至 80mg/kg 的維生素 B6 (批多辛)，
[0106]-1 μ g/kg 至 5.5 μ g/kg 的維生素 B12 (氰鈷胺)，
[0107]-僅僅提及這三種維生素B。
[0108]但是，對于100ml培養(yǎng)基，僅提供Ig至2g引入培養(yǎng)基中的酵母提取物(參見上面列出的科學文章)，這對應著極其低的維生素劑量(例如，對于維生素B12，由酵母提取物提供的維生素B12對應為0.07 μ g/1)。
[0109]即使這樣，這套文件既沒有描述也沒有建議為了在微藻中生產(chǎn)角鯊烯而控制維生素B1、B6或B12的含量。
[0110]沒有受任何理論的約束，本 申請人:公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)角鯊烯中維生素B12的卓越作用(以下將會示例)表明它是角鯊烯生物合成所涉及的一些關鍵酶的輔因子。
[0111]對于維生素BI，它刺激亮氨酸降解途徑，這將增加細胞內(nèi)角鯊烯前體的量，而維生素B6通過改變細胞色素類的作用而阻止角鯊烯降解。
[0112]因此本 申請人:公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)維生素B12的提供(使溫度達到28°C和30°C的情況下)是極大增加角鯊烯產(chǎn)量(在lg/100g干生物質(zhì)規(guī)模上)的關鍵，并且事實上維生素BI和B6的提供使得尤其有可能增加角鯊烯的生產(chǎn)率，如以下將證明。
[0113]根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個特征是添加維生素類可以在整個發(fā)酵過程中、或者在一些步驟中、并且不僅僅在生產(chǎn)階段進行。
[0114]但是，必須堅持在整個發(fā)酵過程中提供在I μ g/Ι與1000 μ g/Ι之間的維生素B12。
[0115]常規(guī)地，在涉及優(yōu)化實驗室中進行的由微藻生產(chǎn)角鯊烯的條件的工作的文獻中，發(fā)酵是基于常規(guī)微生物接種和生產(chǎn)鏈進行的，并且通常是最大多數(shù)使用的生產(chǎn)條件。
[0116]實際上從破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯需要三個連續(xù)步驟:在一個瓊脂培養(yǎng)皿上從一個分離的菌落開始，預培養(yǎng)以恢復菌株，并且最后實質(zhì)培養(yǎng)(=生產(chǎn))。
[0117]例如，上面提到的G.Chen的文章描述了包含以下連續(xù)步驟的方法:
[0118]-從在包含葡萄糖、谷氨酸鈉、酵母提取物和各種微量元素(traceelement)的瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基上保存的菌株開始，
[0119]-在一個定軌搖床上在錐形燒瓶(Erlenmeyerflask)中，在pH為6、溫度為25°C時，制備預培養(yǎng)物，以便獲得恢復的生物質(zhì)，
[0120]-向具有與在預培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基的另一系列錐形生產(chǎn)燒瓶接種大約0.5% (v/v)的前述步驟獲得的生物質(zhì)，并且保持在25°C的溫度下。
[0121]如果發(fā)生的話，如可以在所述文章中讀到(但是在本領域的其他文章中也證實這是真實的)的，在后面培養(yǎng)步驟的水平上，專家們?yōu)榱藘?yōu)化發(fā)酵條件而采取行動。
[0122]換句話說，現(xiàn)有技術優(yōu)化研究包含改變生產(chǎn)培養(yǎng)基的一種或多種組分以便研究其對角鯊烯生產(chǎn)的影響。
[0123]但是正相反，如以下將被開發(fā)的，本 申請人:公司建議從第一步驟就開始控制發(fā)酵條件，即使證實在工業(yè)規(guī)模上實現(xiàn)更加復雜。
[0124]在這個規(guī)模上，事實上，接種鏈可以在實際生產(chǎn)步驟之前包含一系列的幾個預培
養(yǎng)步驟。
[0125]根據(jù)本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實施例因此可以包含以下連續(xù)步驟:
[0126]-在錐形燒瓶中，在28°C的溫度下，從一個瓊脂培養(yǎng)皿上的一個分離的菌落對破囊壺菌目家族的微藻進行第一次預培養(yǎng)，持續(xù)24至36小時，
[0127]-在錐形燒瓶中，在28°C的溫度下，用1%(v/v)的從第一次預培養(yǎng)得到的接種物進行第二次預培養(yǎng)，持續(xù)24至36小時，
[0128]-在30°C的溫度下,在一個設定了條件以便觀察到最高45mmol/l/hr氧傳遞的一個發(fā)酵罐內(nèi)，用0.5%至2% (v/v)的從第二次預培養(yǎng)得到的接種物培養(yǎng)60至150小時。
[0129]在這個鏈條中，如以下將示例的，取決于操作條件，維生素類的添加可以在一個單一的預培養(yǎng)步驟中、在兩個預培養(yǎng)步驟中或貫穿整個培養(yǎng)鏈進行。
[0130]如以下將證明的，在一個單一預培養(yǎng)步驟中添加維生素類已經(jīng)使得有可能獲得顯著的結(jié)果，最佳模式則需要在所執(zhí)行的所有步驟中進行添加。
[0131]微藻生長所需的碳源優(yōu)選地是葡萄糖。
[0132]本 申請人:公司因此建議控制葡萄糖的添加，從而提供按重量計從15%至22.5%的
葡萄糖總量。
[0133]盡管如此，如以下將用所選擇的裂殖壺菌菌株舉例說明的，優(yōu)選在非零殘留葡萄糖含量下、最高等于按重量計8%含量下工作。
[0134]關于氮源的性質(zhì)，本 申請人:公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有可能從由以下項組成的組中選擇:酵母提取物、尿素、谷氨酸鈉和硫酸銨，單獨使用一個或它們的組合。
[0135]有可能優(yōu)選酵母提取物，通常用于現(xiàn)有技術的方法中，補充了維生素混合物的尿素，例如Sigma公司銷售的BME混合物，使用量為5ml/l。
[0136]類似地，有可能完全或部分用谷氨酸鈉替代尿素，或者使用谷氨酸鈉與硫酸銨的混合物。
[0137]本 申請人:公司尤其建議不使用硝酸形式的氮源。
[0138]關于培養(yǎng)基的pH,如以下將不例的,將維持在5.5與6.5之間,優(yōu)選固定在6的值。
[0139]該pH值可以通過本領域的普通技術人員已知的任何方式進行調(diào)整，例如通過添加2N硫酸，然后加入8N氫氧化鈉。
[0140]最后，可以將溶解氧含量調(diào)整至20%與0%之間的一個值，優(yōu)選在溶解氧成為0%之前的最初的24或48小時期間、優(yōu)選36小時期間維持在5%，。
[0141]關于氧傳遞，可以用已知的任何方式而且是對于本領域的普通技術人員已知的任何方式調(diào)整，以便不超過45mmol/l/hr。
[0142]如以下將示例的，在發(fā)酵結(jié)束時，按照這些操作條件獲得的生物質(zhì)高于50g/l、優(yōu)選在50g/l與100g/l之間，大約為80g/l。
[0143]角鯊烯的含量，就其部分而言，對于100g干生物質(zhì)而言為高于lg，優(yōu)選地對于100g干生物質(zhì)而言為2g與15g之間，甚至更優(yōu)選地對于100g干生物質(zhì)而言為5g與IOg之間。
[0144]從發(fā)酵培養(yǎng)基提取和純化角鯊烯
[0145]通過本領域普通技術人員本身已知的任何方法從發(fā)酵培養(yǎng)基恢復生物質(zhì),例如可以將生物質(zhì)從發(fā)酵罐中移除并且通過微孔過濾或離心法簡單地濃縮，或者用一種水性溶液通過連續(xù)濃縮-稀釋來洗滌。
[0146]為了提取脂質(zhì)含量進行的細胞破裂可以通過各種途徑進行，其中有機械的、化學的或酶的途徑。
[0147]在幾步連續(xù)提取中用己烷/乙醇從細胞裂解物提取油。
[0148]分離己烷部分，并且然后將己烷蒸發(fā)掉以便分離原油。
[0149]本發(fā)明最后涉及用本發(fā)明的任何一種方法生產(chǎn)的角鯊烯在制備預期用于醫(yī)學領域、化妝品領域和食品部門的組合物中的用途。因此，它涉及一種用于制備預期用于醫(yī)學領域、化妝品領域和食品部門的組合物的方法，該方法包括使用本發(fā)明的任何一種方法生產(chǎn)角鯊烯，并且進而制備預期用于醫(yī)學領域、化妝品領域和食品部門的組合物。
[0150]借助下述實例將更清晰地理解本發(fā)明，這些實例旨在說明性的而非限制性的。
[0151]實例1:添加維生素B1、B6和B12的研究以及溫度對角鯊烯生產(chǎn)的影響的研究
[0152]預培養(yǎng)和培養(yǎng)基
[0153]在此，微藻的發(fā)酵在實際培養(yǎng)/生產(chǎn)階段之前通過兩個先前的連續(xù)的預培養(yǎng)階段進行。
[0154]對于此實驗，在第一次預培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)添加了維生素類，但是在第二次預培養(yǎng)的培養(yǎng)基中以及在生產(chǎn)中維生素類的添加是可任選的。
[0155]因此預培養(yǎng)的培養(yǎng)基具有下表1和II給出的組分:
[0156]表1
[0157]
【權利要求】
1.一種由屬于破囊壺菌目物種家族的微藻生產(chǎn)角鯊烯的方法，其特征在于它包含由以下項組成的步驟: -在25 °C與35 °C之間、優(yōu)選在28 °C與32 °C之間、更優(yōu)選大約30 °C的溫度下培養(yǎng)屬于破囊壺菌目物種家族的微藻，并且 -向預培養(yǎng)基或培養(yǎng)基以每升培養(yǎng)基添加I μ g至1000 μ g的維生素B12。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于加入了以下物質(zhì): ο每升培養(yǎng)基0.1mg至200mg的維生素BI,和/或 ο每升培養(yǎng)基0.1mg至200mg的維生素B6。
3.如權利要求1和2中任一項所述的方法，其特征在于這種破囊壺菌目家族的的微藻選自下組，該組由以下各項組成:裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.)、Aurantiochytrium 物種以及破囊壺菌屬物種(Thraustochytrium sp.)。
4.如權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于這種破囊壺菌目家族的微藻選自下組，該組由以下各項組成:裂殖壺菌屬物種ATCC20888, Aurantiochytrium物種ATCCPRA276,以及保藏在巴斯德研究所(Institut Pasteur)的法國國家微生物保藏中心、編號為N0.CNCM 1-4469的裂殖壺菌屬物種菌株。
5.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于所獲得的角鯊烯含量對于100g的干生物質(zhì)而言為大于 或等于2g，優(yōu)選地對于100g的干生物質(zhì)而言為在2g與12g之間。
6.如權利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于這種屬于破囊壺菌目物種家族的微藻的該培養(yǎng)通過以下連續(xù)步驟進行: -在錐形燒瓶內(nèi)，在28°C溫度下，從在一個瓊脂培養(yǎng)皿上的一個分離的菌落進行第一次預培養(yǎng)，持續(xù)24至36小時， -在錐形燒瓶內(nèi)，在28°C溫度下，用1% (v/v)的從該第一次預培養(yǎng)得到的接種物進行第二次預培養(yǎng)，持續(xù)24至36小時， -在30°C,在一個設定了條件以便觀察到最高45mmol/l/hr的氧傳遞的發(fā)酵罐內(nèi)，用0.5%至2% (v/v)的從該第二次預培養(yǎng)得到的接種物培養(yǎng)60至150小時。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于在這兩次預培養(yǎng)步驟中進行維生素B12的添加，從而使得維生素的總含量在I μ g/i與ιομ g/i培養(yǎng)基之間。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于還在這兩次預培養(yǎng)步驟中添加維生素BI和B6，從而使得維生素的總含量在100 μ g/1與200 μ g/1培養(yǎng)基之間。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于維生素B12的添加是如下進行: -在這兩次預培養(yǎng)步驟中，使得維生素的總含量在I μ g/Ι與10 μ g/1培養(yǎng)基之間， -在生產(chǎn)步驟中，使得維生素的總含量為大約1000 μ g/Ι培養(yǎng)基。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于還如下添加了維生素BI和B6: -在這兩次預培養(yǎng)步驟中，使得維生素的總含量在100 μ g/1與200 μ g/1培養(yǎng)基之間， -在生產(chǎn)步驟中，使得維生素的總含量在150mg/l與200mg/l培養(yǎng)基之間。
11.通過如權利要求1至10中的任一個方法生產(chǎn)的角鯊烯的用途，用于制備預期用于醫(yī)學領域、化妝品領域和食品部門的組合物。
【文檔編號】C12P5/02GK103620041SQ201280024524
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年5月18日 優(yōu)先權日:2011年5月20日
【發(fā)明者】伯納德·波拉, 錢云, 伯納德·考利爾, 塞吉·科米尼, 菲利皮·盧騰, 勞倫特·塞蓋拉 申請人:羅蓋特兄弟公司