細環(huán)病毒診斷學的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測樣品中豬細環(huán)病毒（TorqueTenovirus）存在的方法、檢測樣品中豬細環(huán)病毒復制的方法、細環(huán)病毒(RT)-PCR引物和探針、以及用于檢測樣品中豬細環(huán)病毒的存在和復制的診斷測試試劑盒。
【專利說明】細環(huán)病毒診斷學
[0001]本發(fā)明涉及用于檢測樣品中豬細環(huán)病毒(Torque Teno virus)的存在的方法、檢測樣品中豬細環(huán)病毒復制的方法、細環(huán)病毒(RT)-PCR引物和探針、以及用于檢測樣品中豬細環(huán)病毒的存在和復制的診斷測試試劑盒。
[0002]細環(huán)病毒(TTV’ s)是具有環(huán)狀負義單鏈DNA(ssDNA)基因組的小的、無被膜病毒。它們屬于環(huán)病毒科iAnello viri dae )。
[0003]第一例TTV由Nishizawa T等在1997年表征。該病毒在遭受輸血后肝炎并表現(xiàn)出異常的肝酶類水平但無典型的肝炎病毒的患者的血液中鑒定到。后來在許多非人物種諸如非人靈長類、貓、犬、樹斷I和豬中檢測到TTV(Leary等，1999，Martinez等，2006)。
[0004]豬細環(huán)病毒l(7br<7?<? teno sus virus I OTSuVI))和豬細環(huán)病毒 2(tenoSUS virus 2 (TTSuV2))均感染家豬和野豬(并且因此也稱為豬TTV’s或簡稱為sTTV’ s)，被分類于壬型細環(huán)病毒屬genus)ο認為TTV’s通過存在于血液或組織中可以影響某些疾病的發(fā)生或甚至調(diào)節(jié)疾病的結(jié)果(Okamoto，2009)。
[0005]目前已經(jīng)顯示了TTV’ s明確的致病作用，并且它在與其他病原體尤其是關(guān)于豬圓環(huán)病毒病(PCVDs)共感染過程中的作用仍在爭論(Kekarainen等，2006，Ellis等，2008，Taira 等，2009)。
[0006]TTV’s與經(jīng)濟上重要的豬和家禽的環(huán)狀ssDNA病毒即豬圓環(huán)病毒-2 (PCV2)和雞貧血病毒(CAV)(均為環(huán)狀病毒科的成員)共有保守的基因組區(qū)和保守的功能。sTTV’s具有與感染人的TTV’ s相似的基因組組成，但它們具有低于45%的核苷酸序列同一性(Niel等，2005; Okamoto等，2002)。近期研究還表明多種sTTV’s諸如sTTVl和sTTV2之間高度的遺傳變異性(Huang等，2010，Cortey等，2010)。sTTV的基因組長度大約為2.8 kbp，并且從核苷酸序列中可以推斷出兩個主要的潛在蛋白編碼基因，可讀框(ORF) I和0RF2。通過與相關(guān)的ssDNA病毒類比，認為ORFl編碼病毒殼體蛋白。0RF2編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，認為其參與病毒復制(Hijikata等，1999; Huang等，2010)。TTV 0RF2還已經(jīng)與NF78 KB途徑抑制相關(guān)(Zheng等，2007)。sTTV核苷酸序列分析揭示存在額外的ORF (0RF3),其通過RNA剪切產(chǎn)生并且它的5 ‘端與0RF2共用。認為0RF3編碼具有未知功能的非結(jié)構(gòu)蛋白(Okamoto 等，2000; Biagini 等，2001)。
[0007]對環(huán)病毒的研究已經(jīng)幾乎僅僅依賴于PCR技術(shù)。近期，已經(jīng)報道了據(jù)說支持人TTV復制(雖然增殖效率低)的組織培養(yǎng)體系(Kakkola等，2007; L印pik等，2007)。然而，對于sTTV，還不知道支持sTTV生長和復制的組織培養(yǎng)體系。
[0008]體外無法生長sTTV已經(jīng)嚴重地阻礙了 sTTV研究。為此原因，目前，研究主要集中于不同的人TTV基因型的分子病毒學、轉(zhuǎn)錄和表達策略。在cos-ι細胞中用含有由推定的啟動子驅(qū)動的TTV基因型I基因組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，產(chǎn)`生了三種mRNA (Kamahora等，2000)。然而，已經(jīng)描述了可變剪切和可變翻譯過程后來自基因型6的六種不同蛋白和來自分離株P(guān)/1C1 (基因型I)的七種不同蛋白(Qiu等，2005; Mueller等，2008)。在淋巴瘤來源的和T細胞白血病細胞系中鑒定到了 TTV’s額外的剪切事件和基因組內(nèi)重排(Leppik等，2007)。[0009]僅存在少數(shù)關(guān)于人TTV蛋白定位的研究并且結(jié)果相當矛盾。TTV基因型6 ORFl和0RF2蛋白定位于轉(zhuǎn)染細胞的細胞質(zhì)中(Qiu等，2005)。相反，在更近期的研究中，ORFl蛋白定位于細胞核中(具體而言，在核仁內(nèi))，而觀察到0RF3在細胞核中但不在核仁中。在同一研究中，如之前描述，發(fā)現(xiàn)0RF2在細胞質(zhì)中(Mueller等，2008)。研究之間觀察到的差異暗示TTV分離株中發(fā)現(xiàn)的基因組多樣性可能與病毒蛋白的表達和定位的不同策略相關(guān)(Mueller 等，2008)。
[0010]已經(jīng)暗示sTTV的轉(zhuǎn)錄譜與在人TTV’s中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄譜類似(Okamoto等，2002),但仍缺乏實驗證據(jù)。
[0011]由于無法在細胞培養(yǎng)中增殖sTTV，所以sTTV檢測和診斷目前仍基于常規(guī)聚合酶鏈反應(PCR)方法。尤其對于檢測ssDNA病毒如TTV’ S，其甚至在感染相同的特異宿主或宿主群的亞群中都具有高度可變的基因組，因此選擇合適的PCR引物結(jié)合位點以及如需要時的探針結(jié)合位點是至關(guān)重要的。
[0012]用于sTTV檢測的PCR引物的常見問題是盡管它們可以對相同地理來源和相同基因型的sTTV毒株具有高度特異性，但它們可能不會與不同地理來源或另一種基因型的sTTV毒株反應。結(jié)果是，在豬群以及在生物材料中存在某些sTTV毒株可能仍未被注意。
[0013]如果僅檢測動物中sTTV存在與否，很明顯可靠且通用的用于檢測豬群中sTTV的診斷工具是必要的。
[0014]此類工具還將對于監(jiān)測sTTV的地理分布是必要的。尤其這能夠揭示來自不同地理位置的豬中的某一地理來源或某一基因型的sTTV菌株的存在與否。
[0015]在疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域還存在對可靠診斷工具的需求。許多豬病毒疫苗(并且不僅僅是豬疫苗)在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。某些細胞培養(yǎng)基組分和細胞系是豬來源的。因此重要的是檢查在這些細胞培養(yǎng)物以及使用這些細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的疫苗中不存在sTTV。
[0016]存在能夠在多種類型的樣品材料中不僅給出存在的指示，而且還能給出sTTV的量的指示的定量方法和檢測工具的更大需求。尤其是這將大大促進sTTV病理學的研究。
[0017]并且最重要的是，sTTV能夠存在于組織中并且在那復制或不復制。已知TTV實際上發(fā)現(xiàn)于所有組織和器官中，但不知道發(fā)現(xiàn)它在那里是否僅是由于通過血液將它運輸?shù)侥且唤M織，或者是否它在那里活躍地復制。
[0018]因此，能夠區(qū)分sTTV在例如組織中僅僅存在而已與所述病毒在該組織中活躍復制的測試是高度需要的。這樣的測試將使其可能檢測細胞培養(yǎng)物中痕量的sTTV是否是或不是非復制形式。這將使在細胞培養(yǎng)物中的sTTV疫苗生產(chǎn)更為安全。
[0019]因此，存在對能夠檢測sTTV毒株而不考慮那些sTTV毒株的地理來源和基因型的可靠的方法和診斷工具的明確需求。并且此外，存在對能夠檢測此類sTTV毒株的病毒復制活性的可靠的方法和診斷工具的需求。
[0020]本發(fā)明的目標是提供這樣的方法和診斷工具。
[0021]令人驚奇的是，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特異性引物組(如需要的話，組合有特異性探針)能夠檢測STTV毒株存在與否，而不考慮那些TTV毒株的地理來源和基因型。
[0022]在根據(jù)本發(fā)明的方法中，樣品中TTV的檢測現(xiàn)在可以通過進行以下方法步驟來完成:
a)使用引物組進行所述樣品的聚合酶鏈反應(PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物或結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及
b)檢測步驟(a)的PCR擴增結(jié)果
使用術(shù)語“引物”來描述能夠識別并且結(jié)合互補多核苷酸并且作為沿互補鏈進行核酸合成或復制的起始點的寡核苷酸。
[0023]術(shù)語“能夠結(jié)合互補多核苷酸”表示能夠在雜交條件下與該多核苷酸形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。
[0024]術(shù)語“探針”指與目標多核苷酸互補并且能夠在雜交條件下與該多核苷酸形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。
[0025]詞語“探針”基本上具有額外攜帶特異性標記物的引物多核苷酸的特征。這樣的標記物尤其可以是熒光團，諸如用于例如TaqMan探針中的熒光團(見下文)。
[0026]本文使用術(shù)語“寡核苷酸”來描述核酸的短聚合物。這樣的短聚合物通常會具有10-100個核酸的長度。
[0027]術(shù)語“雜交條件”涉及允許引物或探針與目標多核苷酸退火的條件。這些條件依賴于進行雜交的溫度和溶液中的離子強度。雜交反應和條件是本領(lǐng)域眾所周知的，并且尤其描述于由Maniatis/Sambroo k的標準實驗室手冊中(34)。
[0028]對于確定雜交條件，基本使用以下公式:
對于長于13個核苷酸的序列的基礎(chǔ)解鏈溫度(Tm)計算，使用以下方程:
Tm= 64.9 +41* (yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)
其中W、X、y和z分別是序列中堿基A、T、G和C的數(shù)目(來自Marmur, J.，和Doty, P.(1962) J Mol Biol 5:109-118)
額外信息提供于:Wallace, R.B., Shaffer, J., Murphy, R.F., Bonner, J.,Hirose, T.,和 Itakura, K.(1979) Nucleic Acids Res 6:3543-3557 和 Sambrook, J.和Russell, D.ff.(2001) Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press; Cold Spring Harbor, NY。
[0029]方程假定退火發(fā)生在50 nM primer、50 mM Na+和pH 7.0的標準條件下 對于基礎(chǔ)鹽調(diào)整的解鏈溫度(Tm)計算，可以使用以下方程:
Tm= 100.5 + (41 * (yG+zC)/(wA+xT+yG+zC)) - (820/(wA+xT+yG+zC)) +
16.6*log10([Na+])
其中w、x、y和z分別是序列中堿基A、T、G和C的數(shù)目。
[0030]術(shù)語16.6*log10([Na+])調(diào)整Tm對鹽濃度中的變化。(額外信息提供于=Howley,P.M; Israel, M.F.; Law, M-F.;和 M.A.Martin "k rapid method for detectingand mapping homology between heterologous DNAs.Evaluation of polyomavirusgenomes."J.Biol.Chem .254, 4876-4883，1979)。
[0031]PCR技術(shù)同樣是本領(lǐng)域眾所周知的，并且它們還廣泛描述于標準實驗室手冊中，諸如“Real-Time PCR:Current Technology and Applications”、在“PCR primers, alaboratory manual” 中和在 Maniatis/Sambrook 中(見下文的文獻列表)。[0032]技術(shù)人員的確認識到引物或探針不需要與目標多核苷酸完全互補，只要雜交條件使得退火能夠發(fā)生而不管不完整的互補性。
[0033]原則上，可以通過降低Tm或通過改變鹽濃度例如使用上文給出的方程或上文引用的文獻中的大量信息來補償一個或多個核苷酸的錯配。
[0034]應該認識到使用具有錯配的引物通常需要使用更低嚴格雜交條件。并且這有時依次可以導致更低的特異性。由于TTV基因組大小較小，所以這不會必然成為問題。具有錯配的引物結(jié)合到非特異性TTV序列上的機率是非常小的。
[0035]然而，明確的是包含與具有如SEQ ID N0.: 1、2或3中所示序列的寡核苷酸的至少14個連續(xù)的核苷酸的一段100%互補匹配的引物是優(yōu)選的。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的引物和探針尤其可以用于在動物或該動物的樣品中檢測sTTV。
[0037]本文使用術(shù)語“樣品”來指懷疑包含sTTV的任何生物材料。生物材料尤其可以是組織諸如豬肝組織、脾組織、骨組織或肌肉組織，但它還可以是體液諸如例如血液、尿、排泄物、羊水。材料還可以是泄殖腔、口腔或鼻腔拭子或例如破裂的細胞。
[0038]不言而喻待測試材料還可以是非豬來源的。非?？赡艿氖菓岩煞秦i物種攜帶sTTV,或者對其測試以排除它們攜帶sTTV。
[0039]還稱為PCR的聚合酶鏈反應包括以下步驟:在引物組存在的情況下加熱DNA分子至高于解鏈溫度的溫度，隨后冷卻以允許引物組的引物結(jié)合各個互補DNA鏈。DNA-引物復合體形成了互補DNA鏈的合成的起始點，所述互補DNA鏈的合成在以三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)的形式的四種DNA結(jié)構(gòu)單元A、T、G和C存在的情況下使用酶DNA聚合酶。用這些結(jié)構(gòu)單元，DNA聚合酶合成新的DNA鏈。
[0040]根據(jù)樣品中sTTV-DNA的量(假設(shè)它存在)，在存在可被檢測的足夠材料之前，將需要進行幾個PCR循環(huán)。平均30-45循環(huán)將`是正常的。技術(shù)人員將能夠基于引物和探針的序列使用例如上文給出的或標準實驗室手冊中的公式來確定PCR循環(huán)的多個步驟的最佳溫度條件。(見上文)。
[0041]術(shù)語“結(jié)合具有SEQ ID N0.:中所示序列的寡核苷酸的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的引物”意指引物應該至少具有結(jié)合該SEQ ID NO中所示的寡核苷酸的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的長度。僅僅作為實例=FDNA-TTV可以具有如SEQ ID N0.:1中所示的序列cgaatggctgagtttatgccgc。因此，術(shù)語“結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的引物”應該至少由來自核苷酸cgaatggctgagtttatgccgc以該順序的至少14個連續(xù)核苷酸的一段組成。然而，它可以是更長的引物，其例如包含核苷酸cgaatggctgagtttatgccgc,并且在5’端和/或3’端具有一個或多個額外的核苷酸。
[0042]對于探針也是同樣(盡管明確的是探針不應該具有猝滅分子不再猝滅熒光團的長度；見下文)。如SEQ ID N0.: 2中所示的寡核苷酸具有17個核酸的長度，但再一次地，根據(jù)本發(fā)明的引物或探針的寡核苷酸應該具有結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸的至少14個連續(xù)核苷酸的最小長度。
[0043]如果選擇的引物(或探針)在5’端和/或3’端具有額外的核苷酸，這樣的核苷酸可能與或可能不與引物結(jié)合的互補鏈的3’ -和/或5’ -側(cè)翼區(qū)互補。在某些情況下，多種RT-PCR循環(huán)的溫度應該能夠適應引物增加的長度并且適應額外的核苷酸的一個或多個是互補的這一事實。并且再一次地；技術(shù)人員將能夠基于引物和探針的序列使用例如上文給出的或本文提及的PCR教科書中的公式來確定PCR循環(huán)的多個步驟的最佳溫度條件(見上文)。
[0044]結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 1-8中所示的序列的寡核苷酸的一段15、16、17、18、19或甚至20或更多個連續(xù)核苷酸(對于SEQ ID NO: 2最多為17)的引物優(yōu)選以該優(yōu)先順序，這是由于它們對sTTV序列更加選擇性地退火。
[0045]結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2和5中所示的序列的寡核苷酸的一段15、16、17、18、19、20或更多個連續(xù)核苷酸(對于SEQ ID NO: 2最多為17)的探針優(yōu)選以該優(yōu)先順序，這是由于它們也對sTTV序列更加選擇性地退火。
[0046]原則上，在本發(fā)明的方法的步驟a)之后，存在不同的方式進行步驟b)。PCR步驟產(chǎn)生其長度和量可以例如通過常規(guī)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢查的PCR產(chǎn)物。在sTTVDNA存在于樣品中的情況下，引物對會退火并因此在步驟a)后，將在凝膠上檢測到預期長度的PCR產(chǎn)物。如果樣品中不存在sTTV DNA，引物對或引物的至少一條將無法退火，并且因此將不會檢測到預期長度的PCR產(chǎn)物。
[0047]正如將注意到的，SEQ ID NO: 1、2、3、4和5中存在的寡核苷酸反映了各個病毒的序列在這些區(qū)域中的(少數(shù))差異。開發(fā)引物的可能后果在下文中討論(見下文)。
[0048]表1提供了 69種已知的sTTV序列的序列比對，并且在該表中編號1_5的箭表示SEQ ID NO: 1、2、3、4和5大致所處的位置。
[0049]如從表1中可見，包含結(jié)合FDNA-TTV的根據(jù)本發(fā)明的正向引物和結(jié)合RDNA-TTV-rl的根據(jù)本發(fā)明的反向引物的引物組或包含結(jié)合結(jié)合FDNA-TTV的本發(fā)明的正向引物和結(jié)合RDNA-TTV-r2的本發(fā)明的反向引物的引物組在所有情況下即與所有測試的野外分離株均能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，而無論它們的地理來源或它們的基因型。
[0050]如表1所示，由結(jié)合FDNA-TTV和RDNA-TTV_r2的引物組產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物會具有大概83-88個核苷酸的長度。當然這依賴于兩條引物之間區(qū)域的準確長度。并且由于引物之間區(qū)域的變異性高，甚至在sTTV組內(nèi)，也不可能預測準確長度。然而，PCR產(chǎn)物的準確長度并不重要:只有PCR產(chǎn)物是否存在是相關(guān)的，而非它的準確大小。
[0051]潛在PCR產(chǎn)物通過常規(guī)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳的耗時分析的替代方法是使用SYBR Green體系(見上文和下文)。SYBR Green是嵌入雙鏈(ds) DNA的染料。這種嵌入導致SYBR Green發(fā)出熒光。因此，如果在存在SYBR Green的情況下完成PCR反應，每一新的dsDNA拷貝將獲得一定量的SYBR Green并導致其發(fā)出熒光。實時PCR儀器能夠檢測這種熒光并且專用軟件能夠從熒光的強度計算Ct值。這允許產(chǎn)生的cDNA的量的直接定量。(然而SYBR Green的使用不允許指示反應步驟是否如預期進行的內(nèi)部對照的存在)?；赟YBR Green的RT-PCR方法已經(jīng)由Mackay, 1.M.等描述。
[0052]因此，上述方法提供了選擇性地檢測樣品中sTTV存在與否的方法，而不管所述TTV毒株的地理來源或基因型。
[0053]因此，本發(fā)明的第一個實施方案涉及檢測樣品中存在豬細環(huán)病毒(sTTV)的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟
a)使用引物組進行所述樣品的聚合酶鏈反應(PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物或結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及
b)檢測步驟(a)的PCR擴增結(jié)果
在該實施方案的優(yōu)選方式中，引物組的一條引物結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的全長，并且引物組的另一條引物結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的全長或具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2 的全長。
[0054]僅僅作為實例:結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的全長的引物組的一條引物例如是22個核苷酸長度的引物或具有序列cgaatggctg agtttatgcc
gCo
[0055]將注意的是例如在SEQ ID NO:1中，位置2處的核苷酸為S (即可以是G或C)。當涉及開發(fā)合適的引物時，位置2處的S沒有太大影響。它位于相對遠離引物延伸發(fā)生的點。引物將與在該位置上具有G的DNA和具有C的DNA退火。因此，具有序列cgaatggctgagtttatgcc gc的引物和具有序列ccaatggctg agtttatgcc gc的引物都是合適的。技術(shù)人員會知曉如何校正PCR步驟的溫度以補償可能的錯配。
[0056]或者,可以使用簡并引物,其包含具有序列cgaatggctg agtttatgcc gc的引物和具有序列 ccaatggctg agtttatgcc gc 的引物。
[0057]僅僅作為另一個實例:在位置18處的核苷酸R是更相關(guān)的，這是由于它位于靠近引物延伸發(fā)生的點。因此，將建議使用更短的引物諸如cgaatggctg agtttat,或者使用包含在位置18處具有A的引物和具有G的引物的簡并引物。
[0058]對于SEQ ID NO: 1、2、3、`4和5中給出的每一序列，存在明顯的共有序列。這從表I中直接可見。
[0059]SEQ ID NO:1 的共有序列為 cgaatggctgagtttatgccgc SEQ ID NO: 2 的共有序列為 ctgggcgggtgccggag
SEQ ID NO: 3 的共有序列為 cggagtcaaggggcctatcgggcagg SEQ ID NO: 4 的共有序列為 tgtctagccgcctgggcgggtgccggag SEQ ID NO: 5 的共有序列為 cggagtcaaggggcctatcgggcagg 當設(shè)計結(jié)合這些序列的引物時，共有序列是優(yōu)選的序列。
[0060]應注意以下內(nèi)容:在表1中分析和呈現(xiàn)的sTTV序列的38中，SEQ ID NO: 4的序列為ygtctarcmgmctgggcgggtgccgvag。然而,在表1中分析和呈現(xiàn)的sTTV序列的31中，由于一個核苷酸的缺口，SEQ ID NO: 4的序列為ygtctarcgmctgggcgggtgccgvag。所述缺口位于相對遠離引物延伸發(fā)生的點，所以當設(shè)計合適引物時，應該不必將它考慮在內(nèi)。
[0061]檢測PCR產(chǎn)物存在的更有效且選擇性的方法是基于探針的實時PCR。
[0062]該方法基本上依賴于上述的PCR方法，但它具有超出上述PCR反應的選擇性的選擇性水平。根據(jù)本發(fā)明，它依賴于使用引物組，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的探針。[0063]結(jié)合寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的探針與結(jié)合寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的引物的區(qū)別在于此探針是具有附于其上的熒光團及猝滅劑分子的寡核苷酸。當涉及所用的熒光團或猝滅劑或者探針/猝滅劑組合背后的工作機制時,存在幾個版本的此類探針。僅僅作為實例，此類探針作為TaqMan探針、Scorpions探針和Molecular Beacons探針是商品化的(見下文)。
[0064]在使用探針的該方法中，例如可以通過使用本發(fā)明的探針來完成檢測。如上所述，該探針以選擇性的方式結(jié)合例如使用根據(jù)本發(fā)明的FDNA-TTV / RDNA-TTV-r2結(jié)合引物組在PCR反應中生成的cDNA的內(nèi)部序列。例如在毒株TTV2_(HM633239.1)/1-2797中(見表1)，探針例如將在步驟b)中與來自對比的位置380-396的cDNA RDNA-TTV_r2區(qū)退火。然而，這僅在擴增的DNA的確是sTTV來源的情況下發(fā)生。在不太可能的情況下，兩種選擇性引物將擴增非TTV DNA，由于探針將不會與它退火，因此這將在步驟b中被發(fā)現(xiàn)。因此，根據(jù)本發(fā)明的探針使得sTTV的檢測比僅PCR反應特異的多。而且，探針的使用避免了使用凝膠檢測PCR產(chǎn)物。并且最終，在實時PCR熱循環(huán)儀中檢測到的熒光水平與釋放的熒光團并因此在PCR中存在的DNA模板的量直接成比例(見下文)。因此該方法非常適合于實時PCR反應。
[0065]基于TaqMan的實時RT-PCR方法是由 Applied Biosystems, 850 Lincoln CentreDrive, Foster City, CA 94404, USA 發(fā)展來。
[0066]基于TaqMan的實時RT-PCR方法尤其描述在文獻參考8、10和33中。
[0067]基于Scorpions 和 Molecular beacons 的實時 RT-PCR 方法經(jīng) PREMIER BiosoftInternational, 3786 Corina Way, Palo Alto CA 94303-4504，USA 是商品化的。
[0068]基于Molecular Beacons的實時PCR的使用尤其詳細描述于:由Manganelli,R., Tyagi, S.和 Smith, 1.的 Molecular Beacons; A New Tool to Identify PointMutations and to Analyze Gene `Expression in Mycobacterium tuberculosis ,在:Methods in Molecular Medicine,第 54 卷:page 295-310 中，MycobacteriumTuberculosis Protocols,由:T.Parish 和N.G.Stoker 編輯? Humana Press Inc.,Totowa, NJ0
[0069]TaqMan探針由與寡核苷酸探針的5’端共價結(jié)合的熒光團和3’端的猝滅劑組成。幾種不同的熒光團(例如6-羧基熒光素，縮寫詞:FAM、或四氯二氫熒光素，縮寫詞:TET)和猝滅劑(例如四甲基羅丹明，縮寫詞:TAMRA、或二氫環(huán)吡咯并吲哚三肽小溝結(jié)合物，縮寫詞:MGB)是可用的。猝滅劑分子猝滅當由循環(huán)儀的經(jīng)FRET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的光源激發(fā)時熒光團發(fā)出的熒光。只要熒光團和猝滅劑接近，猝滅就能抑制任何熒光信號。
[0070]設(shè)計TaqMan探針從而使它們在由特異引物的組擴增的DNA區(qū)域內(nèi)退火。由于Taq聚合酶延伸引物并且合成新生鏈，所以聚合酶的5’至3’的外切核酸酶活性降解已經(jīng)與模板退火的探針。探針的降解將熒光團從其上釋放出并且破壞了與猝滅劑的緊密靠近，因此解除了猝滅效應并允許熒光團發(fā)熒光。因此，在實時PCR熱循環(huán)儀中檢測到的熒光與釋放的熒光團以及在PCR中存在的DNA模板的量直接成比例。
[0071]Taqman探針是用于根據(jù)本發(fā)明的方法和診斷工具中的優(yōu)選探針。
[0072]實際上，本文描述的Taqman探針Probe TTV_rl是結(jié)合如SEQ ID N0.: 2中所示的DNA序列的寡核苷酸，但是具有附于其上的熒光團和猝滅劑。但如同解釋的(見上文)，探針還可以是結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的更短或更長的寡核苷酸。
[0073]由于在該方法中引物和探針的退火均在同一過程中發(fā)生，所以顯色反應的發(fā)生實際上在DNA擴增的同一時刻發(fā)生。因此，此類反應也稱為實時PCR反應。
[0074]因此，該實施方案的另一個優(yōu)選形式涉及檢測樣品中存在豬細環(huán)病毒(sTTV)的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟
a)使用引物組進行所述樣品的聚合酶鏈反應(PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及b)使用結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的探針檢查步驟(a)的PCR擴增結(jié)果。
[0075]在該實施方案的更優(yōu)選方式中，引物組的一條引物結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的全長，并且引物組的另一條引物結(jié)合具有如SEQ ID N0.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的全長。
[0076]在該實施方案的另一個更優(yōu)選方式中，探針結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的全長。
[0077]如上所述，sTTV能夠存在于組織中并且在那里復制或不復制。已知TTV實際上發(fā)現(xiàn)于所有組織和器官中，但不知道發(fā)現(xiàn)它在組織中是否僅是由于通過血液將它運輸?shù)皆摻M織，或者是否它在那里活躍地 復制。
[0078]因此，能夠區(qū)分sTTV在例如組織中僅僅存在與所述病毒在該組織中活躍復制的測試是高度需要的。
[0079]這樣的檢測將還使得檢測細胞培養(yǎng)物中痕量的sTTV是否處于滅活的形式成為可能:確證不存在sTTV病毒復制將使在細胞培養(yǎng)物中的病毒疫苗生產(chǎn)更安全。
[0080]TTV的基因組復制經(jīng)滾環(huán)模型進行:復制過程中，使用負鏈基因組病毒DNA鏈作為模板產(chǎn)生正鏈的ssDNA，并且該正鏈DNA依次作為模板來產(chǎn)生新的負鏈DNA。原則上，正鏈DNA能夠用于檢測復制；使用特異性結(jié)合正DNA鏈的引物的鏈特異性PCR測試(ssPCR)能夠隨后用于顯示DNA復制。然而，當TTV進入非允許細胞(即不支持包括形成新病毒顆粒在內(nèi)的病毒的完整的、生產(chǎn)性的、復制周期的細胞)時，會產(chǎn)生問題。在此類非允許細胞中，細胞機制將仍然開始復制病毒ssDNA，并且隨后會形成正鏈DNA，錯誤地暗示生產(chǎn)性的病毒復制。因此，ssPCR不是確定生產(chǎn)性的病毒復制的可靠測試。
[0081]對病毒復制的更可靠的指標是存在sTTV mRNA，這是由于活躍的病毒復制經(jīng)mRNA’s的出現(xiàn)揭示了其自身?？梢噪S后通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(還稱為RT-PCR)檢測這樣的mRNA’ S。
[0082]然而，多種sTTV’ s基因組序列中的高度變異性使得其難于鑒定用于逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)的通用引物。
[0083]由于除了在多種sTTV’ s之間似乎存在剪切模式的顯著不同這一事實之外，關(guān)于sTTV’ s中RNA剪切模式所知不多的事實，所以產(chǎn)生了第二個問題。由于sTTV病毒復制的剪切特征，很可能的是某些引物可能根本無法使用，這是由于它們與RNA剪切后丟失的區(qū)域退火。mRNA剪切后，此類區(qū)域?qū)G失，并因此將不會發(fā)現(xiàn)RT-PCR產(chǎn)物。并且這隨后會導致沒有發(fā)生病毒sTTV復制的錯誤指示。
[0084]令人驚奇的是，目前發(fā)現(xiàn)PCR引物結(jié)合的區(qū)域RDNA-TTV-rl和RDNA-TTV_r2也存在于sTTV’ s的mRNA中。更為令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域位于在mRNA剪切過程中剪切掉的區(qū)域之外。因此，這些區(qū)域始終存在于sTTV’s的mRNA中，無論伴隨任何sTTV的mRNA剪切模式。
[0085]這表示區(qū)域RDNA-TTV-rl和RDNA-TTV_r2還能在用于在sTTV’ s (不管它們的地理來源或它們的基因型)的病毒復制過程中檢測mRNA的RT-PCR反應中用于開發(fā)正向引物。
[0086]因此該測試首次允許區(qū)分sTTV ssDNA在組織中僅僅存在與病毒在該組織中的活躍復制。
[0087]逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)包括兩個反應步驟。在第一步中，允許引物組的引物之一結(jié)合TTV-RNA，并且該復合體形成了在四種DNA結(jié)構(gòu)單元A、T、G和C存在的情況下經(jīng)酶逆轉(zhuǎn)錄酶(RNA依賴的DNA聚合酶)RNA鏈的cDNA鏈的合成的起始點。
[0088]在第二步中，將由此形成的RNA-DNA雜交物加熱以將雜交物變性，隨后冷卻以允許引物組的另一條引物結(jié)合cDNA鏈。該另一條引物隨后作為再次在DNA結(jié)構(gòu)單元存在的情況下經(jīng)DNA聚合酶的第二 DNA鏈的合成的起始點。
[0089]根據(jù)樣品中sTTV-RNA的量(假設(shè)它存在)，在存在可被檢測的足夠材料之前，將需要進行幾個PCR循環(huán)。平均30-45循環(huán)將是正常的。技術(shù)人員將能夠根據(jù)引物和探針的序列使用例如上文給出的和上述教科書中的公式來確定PCR循環(huán)的多個步驟的最佳溫度條件。(見上文)。
[0090]如上所述，合適的正向引物是與RDNA-TTV-rl和RDNA-TTV_r2互補的引物。
[0091]根據(jù)本發(fā)明的此類正向引物結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段或具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段。
[0092]作為反向引物，使用結(jié)合mRNAs的聚腺苷酸尾的引物。此類引物因此將包含聚T段。優(yōu)選此類引物由至少14個連續(xù)的T組成。
[0093]為了避免此類引物與聚腺苷酸尾的任何部分隨機結(jié)合，反向引物優(yōu)選在聚T段的3’端攜帶有核苷酸G、核苷酸C或核苷酸A。這會允許引物與聚腺苷酸尾的5’端的特異結(jié)合。如果從病毒序列中已知聚腺苷酸尾之前的最后一個核苷酸的特征，則可以使聚T段的3’端的核苷酸與該最后一個核苷酸互補。如果該特征是未知的，則可以成功使用三種聚T引物的混合物，每一種在聚T段的3’端具有G、C或A。
[0094]因此，本發(fā)明的反向引物包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1的最5’末端核苷酸、具有如SEQ ID N0.: 7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14個連續(xù)核苷酸的一段。
[0095]僅僅作為實例；根據(jù)本發(fā)明的并結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1的至少14個連續(xù)的5’末端核苷酸的一段的反向引物例如可以具有核苷酸序列
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[0096]T/Α雙鏈體的解鏈溫度相對低。因此，如需要的話，結(jié)合聚腺苷酸尾的引物可以在5’端與例如15個核苷酸的已知但隨機序列延伸。如果使用這樣的5’延伸引物，引物的聚T部分與mRNA的聚腺苷酸尾之間的成功退火需要在僅一個PCR循環(huán)中成功。在隨后的循環(huán)中，由于可以使用與聚T引物的5’延伸互補的第二引物，因此退火反應將更為有效。
[0097]因此，本發(fā)明的另一個實施方案涉及檢測樣品中存在復制性sTTV的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟
a)使用引物組進行所述樣品的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物、或結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物、和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、具有如SEQ ID N0.: 7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14個連續(xù)的5’末端核苷酸的一段的反向引物，以及
b)檢測步驟(a)的RT-PCR擴增結(jié)果
作為正向引物，優(yōu)選使用結(jié)合寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的引物:這將允許使用結(jié)合寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的探針用于檢測實時RT-PCR反應中的RT-PCR產(chǎn)物。
[0098]因此，本實施方案的優(yōu)選形式涉及根據(jù)本發(fā)明的用于檢測復制性sTTV存在的方法，其特征在于所述正向引物結(jié)合如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段。
[0099]基本上結(jié)合如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA_b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的探針包含猝滅劑分子和熒光團。
[0100]因此，本實施方案的更優(yōu)選形式涉及根據(jù)本發(fā)明的檢測復制性sTTV存在的方法，其特征在于所述方法還包括使用結(jié)合如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的探針檢測步`驟(a)的PCR擴增結(jié)果的步驟。
[0101]理想狀態(tài)下，上述用于檢測sTTV DNA的方法和上述用于檢測sTTV病毒復制的方法將同時在一個小瓶中應用。這將允許sTTV DNA的存在和sTTV病毒復制的同時檢測。
[0102]然而，應該注意的是要正確選擇用于檢測DNA和RNA的引物。如果使用結(jié)合FDNA-TTV和RDNA-TTV-r2的引物檢測DNA，應該避免使用結(jié)合FRNA-b的引物檢測mRNA，這是由于在這種情況下，結(jié)合FRNA-b的引物會與結(jié)合RDNA-TTV-r2的引物退火。由于同樣原因，如果使用結(jié)合FDNA-TTV和RDNA-TTV-rl的引物檢測DNA，應該避免使用結(jié)合FRNA-a的引物檢測mRNA，這是由于在這種情況下，結(jié)合FRNA-a的引物會與結(jié)合RDNA-TTV-rl的引物退火。
[0103]由于同樣原因，如果使用結(jié)合RDNA-TTV-r2的引物檢測DNA，并且使用結(jié)合FRNA_a的引物檢測RNA，則隨后不能使用與RDNA-TTV-rl和FRNA-b互補的探針檢測DNA和RNA。因此，不能使用根據(jù)本發(fā)明的探針完成各個PCR產(chǎn)物和RT-PCR產(chǎn)物的同時檢測。因此，應該通過其他方法諸如凝膠電泳分析這些產(chǎn)物。
[0104]因此，本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于檢測樣品中復制性sTTV存在的方法，其特征在于所述方法包括以下同時的步驟
a)使用引物組進行所述樣品的聚合酶鏈反應(PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及b )使用引物組進行所述樣品的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中、SEQ ID N0.: 7中或SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、2或3的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及
c)檢測步驟a)和b)中的PCR擴增結(jié)果
并且本發(fā)明的又另一個實施方案涉及檢測樣品中復制性sTTV存在的方法，其特征在于所述方法包括以下同時的步驟a)使用引物組進行所述樣品的聚合酶鏈反應(PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及
b )使用引物組進行所述樣品的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中、SEQ ID N0.: 7中或SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及c)檢測步驟a)和b)中的(RT)-PCR擴增結(jié)果
如同對由上述分別結(jié)合FDNA-TTV和RDNA-TTV-r2的引物組產(chǎn)生的DNA PCR產(chǎn)物的討論，當使用例如包含結(jié)合FRNA-a的正向引物和結(jié)合RRNA-1的反向引物的引物組時，無法給出RT-PCR產(chǎn)物的準確長度。首先；由于引物之間區(qū)域的變異性高，甚至在sTTV組內(nèi)，也不可能預測這些產(chǎn)物的準確長度。并且此外，對于RT-PCR產(chǎn)物，由于對TTV’ s已知如此之多的剪切變體，因此這也是更為不可預知的。然而，同樣地，RT-PCR產(chǎn)物的準確長度并不重要:只有RT-PCR產(chǎn)物是否存在是相關(guān)的，而非它的準確大小。
[0105]可以通過加入所謂的內(nèi)部對照RNA (IC RNA)來進一步改善本發(fā)明依賴于RT-PCR的方法。實際上，內(nèi)部對照是平行實驗，其中向測試樣品中加入一定量的對照RNA以及對對照RNA (IC-RNA)特異的引物和探針。(或者，盡管不那么優(yōu)選，但可以分別在平行的RT-PCR試驗中檢測對照RNA和引物及探針)。此類引物和探針應該是非TTV相關(guān)的；如果它們是TTV相關(guān)的，則它們可能會干擾方法的TTV特異性部分。
[0106]明確的是TTV探針的熒光團和非TTV探針的熒光團的顏色必須不同，以區(qū)別TTV特異性熒光和IC-RNA特異性熒光。
[0107]由于顯示IC-RNA存在的成功反應的所有組分均存在，因此將存在特異性熒光，指示多個方法步驟是成功的。優(yōu)選地，在與sTTV檢測測試相同的試管中進行IC-RNA試驗。因此，如果檢測到IC-RNA特異性熒光團的熒光，則這樣的試驗是可靠的，并且如果檢測到TTV特異性熒光團的額外熒光，其證明存在TTV材料。
[0108]如果檢測到IC-RNA特異性熒光團的熒光，但沒有檢測到TTV特異性熒光團的熒光，其證明不存在TTV材料。
[0109]如果沒有檢測到IC-RNA特異性熒光團的熒光，則試驗是不可靠的并應該不予考慮。
[0110]因此，使用內(nèi)部對照對于排除由于例如無效的RNA分離、無效的逆轉(zhuǎn)錄酶反應或PCR的抑制的假陰性結(jié)果是重要的。
[0111]原則上,可以使用合成RNA作為內(nèi)部對照的起始材料。作為RNA合成片段的替代物，可以使用宿主的或來自不同病原體的持家基因或不同基因作為內(nèi)部對照。然而，它們未知且變化的濃度、不穩(wěn)定性和生物安全性考慮使得它們比體外轉(zhuǎn)錄的RNA更難于操作并整合到PCR測定中。
[0112]為此原因，優(yōu)選的內(nèi)部對照體系是由Hoffmann等設(shè)計的通用異源內(nèi)部對照體系。它基于RNA并且能容易地適應并整合到測定中以檢測成功的RNA提取和RT-PCR。
[0113]因此，該實施方案的還更優(yōu)選的形式涉及本發(fā)明的方法，其特征在于進行所述方法的實時RT-PCR反應的步驟還使用至少一個額外的非TTV相關(guān)的引物組和至少一種額外的非TTV相關(guān)的RNA模板。
[0114]如果需要PCR反應的定量，可以進行單獨的平行測試，其中存在已知量的TTV-DNA或TTV-mRNA和根據(jù)本發(fā)明的引物和探針。這將允許繪制標準曲線，其提供了平行測試中DNA或RNA的量與達到熒光檢測閾值所需的循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系。隨后這些標準曲線可以用于確定樣品中TTV-DNA或TTV-mRNA未知的量。
[0115]因此，將進行單獨的平行測試以生成隨后用于定量樣品中TTV-DNA或TTV-mRNA的量的標準曲線的根據(jù)本發(fā)明的方法稱為定量方法。
[0116]明確的是生物材料優(yōu)選進行進一步的純化步驟。
[0117]由于檢測sTTV的方法基于病毒ssDNA和/或mRNA，因此優(yōu)選從樣品中純化該ssDNA和RNA至某一范圍。該方面中的純化表示在將樣品進行本發(fā)明的方法之前，將樣品中除TTV-DNA或mRNA之外的材料從樣品中去除至某一范圍。此類純化例如可以包括去蛋白化作用、去除細胞碎片、DNA提取、RNA提取等。
[0118]因此，本發(fā)明的還`更優(yōu)選的形式涉及本發(fā)明的方法，其特征在于所述方法在步驟
a)之前包括RNA和/或DNA純化步驟。
[0119]本發(fā)明的另一個實施方案涉及引物組，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物或結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物。
[0120]本發(fā)明的進一步的實施方案涉及引物組，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ IDN0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物、或結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物、和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、具有如SEQID N0.: 7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14個連續(xù)的5’末端核苷酸的一段的反向引物。
[0121]本發(fā)明還另一個實施方案涉及探針,所述探針結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段或具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段。
[0122]本發(fā)明的又另一個實施方案涉及用于檢測樣品中豬細環(huán)病毒(sTTV)存在的診斷測試試劑盒。此類試劑盒允許實施本發(fā)明的方法。
[0123]因此，本實施方案的第一種形式涉及用于檢測樣品中豬細環(huán)病毒(sTTV)存在的診斷測試試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含至少一個引物組，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物或結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物。
[0124]在本實施方案的優(yōu)選形式中，所述用于檢測存在sTTV的診斷測試試劑盒還包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的探針。
[0125]又另一個實施方案涉及用于檢測樣品中存在復制性sTTV的診斷測試試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含引物組，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物、或結(jié)合具有如SEQ ID N0.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物、和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、具有如SEQ ID N0.: 7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14個連續(xù)的5’末端核苷酸的一段的反向引物。
[0126]在本實施方案的優(yōu)選形式中，所述用于檢測存在復制性sTTV的診斷測試試劑盒還包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的探針。
[0127]這些不同的引物和探針可以存在于試劑盒中不同的小瓶內(nèi)。它們還可以存在于一個相同的小瓶內(nèi)。為了便于操作并避免污染的不必要風險，它們甚至可以存在于加入樣品的測試小瓶中。
[0128]它們將優(yōu)選以干燥形式存在，以便在室溫儲藏條件下使它們保持穩(wěn)定。
[0129]還另一個實施方案涉及用于同時檢測樣品中sTTV ssDNA存在和sTTV病毒復制的診斷測試試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含含有結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個`連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ IDN0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物的引物組、以及含有結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中、SEQ ID N0.: 7中或SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物的引物組。
[0130]還另一個實施方案涉及用于同時檢測樣品中sTTV ssDNA存在和sTTV病毒復制的診斷測試試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括含有結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ IDN0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物的引物組、以及含有結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中、SEQ ID N0.: 7中或SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物的引物組。
[0131]根據(jù)本發(fā)明的診斷測試試劑盒可以還包含逆轉(zhuǎn)錄酶和/或熱穩(wěn)定DNA聚合酶。這些酶對于進行實時RT-PCR是必需的，并且為了便于使用，因此它們可以已被整合入診斷測試試劑盒中。
[0132]如果需要實時RT-PCR的內(nèi)部對照，第二組引物和探針(在這種情況下為如上討論的非TTV引物和非TTV RNA模板和非TTV探針)以及IC-RNA可以包括在診斷測試試劑盒中。不言而喻四種DNA結(jié)構(gòu)單元和必要的緩沖液還可以包括在診斷測試試劑盒中。
[0133]如果需要(RT)-PCR反應的定量，可以進行平行測試，其中存在已知量的TTV-RNA和/或TTV-DNA和根據(jù)本發(fā)明的引物和探針。這將允許繪制標準曲線，其提供了平行測試中RNA和/或DNA的量與達到熒光閾值所需的循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系。然后這些標準曲線可以用于確定樣品中TTV-RNA和/或TTV-DNA的量。因此，優(yōu)選診斷測試試劑盒還包含允許進行定量的已知量的TTV-RNA和/或TTV-DNA。
[0134]在下文中，給出如何進行根據(jù)本發(fā)明的方法的實施例。不言而喻實施例不應理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0135]【專利附圖】

【附圖說明】。
[0136]圖1:用于豬TTV的廣譜qPCR的擴增曲線(圖1a)和標準曲線(圖1b)圖。在擴增圖中，灰色曲線代表標準稀釋度系列并且黑色曲線代表樣品。在標準曲線圖中，點代表標準稀釋度系列并且交叉代表樣品。
[0137]圖2:擴增子的解鏈峰?；疑€代表標準稀釋度系列并且黑色曲線代表樣品。所有樣品均顯示具有85.0 0C -86.5 °C的解鏈溫度的一個峰，說明測定到的熒光僅來源于PCR產(chǎn)物。
[0138]圖3:包含sTTV基因型2(sTTV2)病毒的323個堿基對的質(zhì)粒TTV008的示意圖。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測樣品中豬細環(huán)病毒(STTV)存在的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 a)使用引物組進行所述樣品的聚合酶鏈反應(PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及 b)使用結(jié)合具有如SEQID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的探針檢查步驟(a)的PCR擴增結(jié)果。
2.一種用于檢測樣品中復制性sTTV存在的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 a)使用引物組進行所述樣品的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物，或結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物，和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、具有如SEQ ID N0.: 7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14個連續(xù)的5’末端核苷酸的一段的反向引物，以及 b)檢測步驟(a)的RT-PCR擴增結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用于檢測復制性sTTV存在的方法，其特征在于所述正向引物結(jié)合如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段。
4.權(quán)利要求3的用于檢測復制性sTTV存在的方法，其特征在于所述方法還包括使用結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的探針檢查步驟(a)的PCR擴增結(jié)果的步驟。
5.一種用于檢測樣品中復制性sTTV存在的方法，其特征在于所述方法包括以下同時的步驟a)使用引物組進行所述樣品的聚合酶鏈反應(PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及 b )使用引物組進行所述樣品的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、具有如SEQID N0.: 7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及 c)檢查步驟a)和b)的(RT)-PCR擴增結(jié)果。
6.一種用于檢測樣品中復制性sTTV存在的方法，其特征在于所述方法包括以下同時的步驟a)使用引物組進行所述樣品的聚合酶鏈反應(PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及 b )使用引物組進行所述樣品的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)，所述引物組包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、具有如SEQID N0.: 7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物，以及 c)檢查步驟a)和b)的(RT) -PCR擴增結(jié)果。
7.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其特征在于所述方法進行PCR和/或RT-PCR反應的步驟還包括至少一個額外的非TTV相關(guān)的引物組和至少一種額外的非TTV相關(guān)的模板。
8.權(quán)利要求1-7任一項的方法，其特征在于所述方法在步驟a)之前包括RNA和/或DNA純化步驟。
9.一種引物組，其包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物或結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物。
10.一種引物組，其包含結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少H個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物，或結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物，和至少一條結(jié)合具有如SEQID N0.: 6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、具有如SEQ ID N0.: 7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQ ID N0.: 8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14個連續(xù)的5’末端核苷酸的一段的反向引物。
11.一種探針，其結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段或具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段。
12.—種診斷測試試劑盒，其用于檢測樣品中存在sTTV，其特征在于所述試劑盒至少包含根據(jù)權(quán)利要求9的引物組。
13.—種診斷測試試劑盒，其用于檢測存在復制性sTTV，其特征在于所述試劑盒至少包含根據(jù)權(quán)利要求10的引物組。
14.一種診斷測試試劑盒，其用于同時檢測樣品中sTTV ssDNA存在和sTTV病毒復制，其特征在于所述試劑盒包括含有結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物的引物組、以及含有結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中、SEQ ID N0.: 7中或SEQ ID N0.:8中所示序列的寡核苷酸RRNA的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物的引物組。
15.一種診斷測試試劑盒，其用于同時檢測樣品中sTTV ssDNA存在和sTTV病毒復制，其特征在于所述試劑盒包括含有結(jié)合具有如SEQ ID N0.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-rl的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物的引物組、以及含有結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的正向引物和至少一條結(jié)合具有如SEQ ID N0.: 6中、SEQ ID N0.: 7中或SEQ ID N0.:8中所示序列的寡核苷酸RRNA的至少14個連續(xù)核苷酸的一段的反向引物的引物組。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15任一項的診斷測試試劑盒，其特征在于所述檢測試劑盒包含至少一個額外的非TTV相關(guān)的引物`組和至少一種額外的非TTV相關(guān)的模板。
【文檔編號】C12Q1/70GK103562411SQ201280025873
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月31日
【發(fā)明者】E.博恩范登, V.科內(nèi)里森-凱塞斯, T.科卡賴南, J.塞加勒斯, L.馬蒂內(nèi)茲-吉諾, M.巴勒斯特 申請人:英特維特國際股份有限公司