序列特異性工程改造的核糖核酸酶h和用于確定dna-rna雜交物結(jié)合蛋白序列偏好的方法
【專利摘要】本發(fā)明的主題為切割DNA-RNA雜交物中RNA鏈的核糖核酸酶，其中核糖核酸酶包括含有RNA酶HI(RNA酶HI)的催化結(jié)構(gòu)域或其衍生物與鋅指DNA-RNA雜交結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，并且其中所述鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與DNA-RNA雜交物中的特異性序列結(jié)合。本發(fā)明還涉及用于確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白或其結(jié)構(gòu)域的序列偏好的新方法，并允許確定經(jīng)DNA-RNA雜交物中序列特異性結(jié)合蛋白識(shí)別的序列。
【專利說(shuō)明】序列特異性工程改造的核糖核酸酶H和用于確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白序列偏好的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及序列特異性核糖核酸酶H，其包含工程改造的核糖核酸酶HI (RNA酶HI)結(jié)構(gòu)域與鋅指結(jié)構(gòu)域的融合物。本發(fā)明可應(yīng)用于遺傳學(xué)。作用于DNA-RNA雜交物的序列特異性核糖核酸酶可用于任何應(yīng)用，其中DNA-RNA雜交物中RNA鏈的切割可例如在核酸、特別是帶有特定序列的DNA-RNA雜交物的體外操作中進(jìn)行。除體外用途之外，以序列特異性方式切割DNA-RNA雜交物的酶還可發(fā)現(xiàn)在某些RNA病毒感染(例如致癌病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎、流行性感冒)的治療中的用途，所述RNA病毒通過(guò)在RNA模板上瞬時(shí)形成DNA鏈來(lái)復(fù)制，或者切割在體內(nèi)形成的其他DNA-RNA雜交物。
[0002]本發(fā)明還涉及用于確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白或其結(jié)構(gòu)域的序列偏好的方法并借此確定經(jīng)DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白識(shí)別的序列。在此范圍內(nèi)的本發(fā)明可應(yīng)用于遺傳學(xué)。用于確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白的序列偏好的方法可應(yīng)用于確定與DNA-RNA雜交物中的特異性序列結(jié)合的任何蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域的序列偏好，并借此確定經(jīng)DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白或其結(jié)構(gòu)域識(shí)別的序列。所述方法可補(bǔ)充地用于這類蛋白質(zhì)的任何特異性工程改造技術(shù)。序列特異性DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白可用于某些RNA病毒(例如致癌病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎、流行性感冒)的診斷，所述RNA病毒通過(guò)將RNA模板轉(zhuǎn)換形成DNA鏈來(lái)復(fù)制。這樣的結(jié)構(gòu)域還可應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程以獲得具有新特異性的酶，例如DNA-RNA結(jié)合蛋白與酶促結(jié)構(gòu)域(例如核酸酶、RNA修飾酶或DNA修飾酶等)的融合物。
【背景技術(shù)】 [0003]在特定位置切割核酸常用于許多基因工程技術(shù)。有許多斷裂DNA分子的方法，包括廣泛使用的市購(gòu)可得的限制性酶。已知的RNA加工酶不多并且其大多數(shù)表征為低序列特異性或完全缺失序列特異性。
[0004]WO 2010076939 Al描述了使用嵌合的鋅指核酸酶實(shí)施定向遺傳重組或突變的組合物和方法。WO 03087341 A2描述了使用鋅指核酸酶定向編輯人囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子基因，從而提供用于囊性纖維化的潛在療法。WO 2009146179 Al描述了高效且易于實(shí)施的模塊化裝配方法的開發(fā)，其使用公開可得的鋅指制備能夠修飾人細(xì)胞中數(shù)個(gè)基因組位點(diǎn)的 DNA 序列的鋅指核酸酶。WO 2010076939 AUffO 03087341 A2 或 WO 2009146179 Al都未描述或表明RNA酶HI或其部分與鋅指、特別是與ZfQQR的融合物的用途，特別是它們也未公開或表明DNA-RNA雜交物的定向切割的可能性或者通過(guò)任何蛋白質(zhì)對(duì)DNA-RNA雜交物的任何類型的定向切割的可能性。從說(shuō)明書W02007014181A2和W02007014182A2中已知利于定向基因組編輯的許多鋅指結(jié)構(gòu)域與FokI核酸酶的融合物。然而，與前者情況不同，僅天然蛋白質(zhì)(RNA酶HI和鋅指)的融合物不產(chǎn)生序列特異性酶。
[0005]用于確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白或其結(jié)構(gòu)域的序列偏好并借此確定經(jīng)DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白識(shí)別的序列的方法為SELEX程序的改進(jìn)。SELEX代表通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化。此方法的原理是基于從很大差異的核酸序列文庫(kù)中反復(fù)篩選和富集對(duì)配體表現(xiàn)出高親和力的分子。富集步驟通過(guò)將核酸與配體結(jié)合并去除未結(jié)合的序列來(lái)完成。此方法目前用于獲得以高特異性結(jié)合配體的RNA和DNA適體(Ellington, A.D.，Szostak,J.ff., 1990.Nature 346, 818 - 822; Huizenga DE, Szostak Jff.1995.Biochemistry34(2):656-65),用于確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的序列偏好(Blackwell TK & Weintraub H.1990.Science 250:1104-1110)，但從未用于與DNA-RNA雜交物結(jié)合的蛋白質(zhì)。用于已知的SELEX改進(jìn)的所述寡核苷酸文庫(kù)由單鏈寡核苷酸(RNA、ssDNA、修飾的RNA或修飾的ssDNA、PNA)或者雙鏈DNA (dsDNA)組成，但未表征DNA-RNA雜交物文庫(kù)的用途。
[0006]WO 2010076939 Al描述了使用嵌合的鋅指核酸酶實(shí)施定向遺傳重組或突變的組合物和方法。WO 03087341 A2描述了使用鋅指核酸酶定向編輯人囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子基因，從而提供用于囊性纖維化的潛在療法。WO 2009146179 Al描述了高效且易于實(shí)施的模塊化裝配方法的開發(fā)，其使用公開可得的鋅指制備能夠修飾人細(xì)胞中數(shù)個(gè)基因組位點(diǎn)的DNA序列的鋅指核酸酶。前述出版物均未描述SELEX法在確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白的底物偏好中的用途或者鋅指在結(jié)合DNA-RNA雜交物中的特異性序列中的用途或者特別是ZfQQR在用于該目的中的用途。
[0007]Herskovitz Μ.A.等，Mol Microbiol.2000 Dec: 38 (5): 1027-33，“Endoribonuclease RNAase III is essential in Bacillus subtilis (在枯草芽抱桿菌{Bacillus subtilis)中內(nèi)切核糖核酸酶RNA酶III為必需的)。”描述了一種菌株的生長(zhǎng)，其中Bs-RNA酶III (rncS)表達(dá)依賴于rncS自溫度敏感型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄以及在非許可溫度下導(dǎo)致90-95%細(xì)胞死亡，并且事實(shí)上幸存的全部細(xì)胞均保留了 rncS表達(dá)質(zhì)粒。因此，作者推斷rncS在枯草芽抱桿菌{B.subtilis)中為必需的。Dasgupta S.等,Mol Microbiol.1998; 28 (3): 629-40, “Genetic uncoupling of the dsRNA-binding and RNA cleavageactivities of the Escherichia coli endoribonuclease RNAase III—the effect ofdsRNA binding on gene expression (大腸桿菌 iBscherichia coli)內(nèi)切核糖核酸酶RNA酶III的dsRNA結(jié)合活性和RNA切割活性的遺傳解偶聯(lián)——dsRNA結(jié)合對(duì)基因表達(dá)的影響)。”描述了在rnc中攜帶點(diǎn)突變的細(xì)菌表型，所述基因編碼RNA酶III。Karen Shahbabian等，The EMBO Journal (2009) 28, 3523-3533， “ RNAase Y, a novel endoribonuclease,initiates riboswitch turnover in Bacillus subtilis (一種新型內(nèi)切核糖核酸酶RNA酶Y在枯草芽孢桿菌中啟動(dòng)核糖開關(guān)轉(zhuǎn)換)”描述了鑒定為新型內(nèi)切核糖核酸酶的早期功能未知的必需蛋白質(zhì)YmdA(現(xiàn)在稱為RNA酶Y)，其能夠在體外優(yōu)先切割在SAM結(jié)合適體結(jié)構(gòu)域上游的5’-單磷酸化yitj核糖開關(guān)。Herskovitz Μ.A.等、Dasgupta S.等或KarenShahbabian等均未提及或表明SELEX法在確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白的底物偏好中的用途或與DNA-RNA雜交物結(jié)合的鋅指或者獲得DNA-RNA雜交物的任何方法。
[0008]US 2006057590描述了基本上涵蓋基因的全部轉(zhuǎn)錄區(qū)的雙鏈RNA分子的產(chǎn)生以及使用RNA內(nèi)切核酸酶切割此分子以生成小RNA分子,所述小RNA分子已標(biāo)記或可隨后標(biāo)記。JP54059392專利描述了一種新型核酸酶B-1，其攻擊雙鏈脫氧核糖核酸的一條DNA鏈的單鏈斷裂區(qū)，并在其互補(bǔ)區(qū)特異地裂解另一條DNA鏈。US 2006057590和JP54059392未提及SELEX法在確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白的底物偏好中的用途或者鋅指在與DNA-RNA雜交物的特異性序列結(jié)合中的用途或者特別是ZfQQR在用于所述目的中的用途。
[0009]因此，需要在特定位置切割DNA-RNA雜交物的RNA鏈的核糖核酸酶。還需要新的改進(jìn)方法來(lái)確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白的底物偏好或者鋅指在與DNA-RNA雜交物的特異性序列結(jié)合中的用途或者特別是ZfQQR在用于所述目的中的用途。
[0010]發(fā)明的公開內(nèi)容
根據(jù)所述的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目標(biāo)為克服所指出的缺點(diǎn)并提供在特定位置切割DNA-RNA雜交物的RNA鏈的核糖核酸酶。因此本發(fā)明目標(biāo)為提供基于RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域的組合的識(shí)別DNA-RNA雜交物中序列的工程改造的酶，并獲得僅切割DNA-RNA雜交物的RNA鏈的序列特異性酶。
[0011]本發(fā)明下一目標(biāo)為提供用于獲得含有隨機(jī)序列的DNA-RNA雜交物文庫(kù)的新型改進(jìn)方法及其在確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白的序列偏好(優(yōu)選用于鋅指結(jié)合、更優(yōu)選用于ZfQQR結(jié)合的DNA-RNA雜交物的序列偏好)中的用途。所述方法可有效用于篩選DNA-RNA雜交物文庫(kù)。本發(fā)明的下一目標(biāo)為提供獲得DNA-RNA雜交物文庫(kù)的新型改進(jìn)方法。
[0012]本發(fā)明人意想不到地發(fā)現(xiàn)，在特定位置切割DNA-RNA雜交物的RNA鏈的序列特異性工程改造的核糖核酸酶H可通過(guò)將RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域或其衍生物與鋅指DNA-RNA雜交物結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合來(lái)獲得，其中所述鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與DNA-RNA雜交物中的特異性序列結(jié)合。
[0013]在第一方面，本發(fā)明提供切割DNA-RNA雜交物中RNA鏈的核糖核酸酶，其中所述核糖核酸酶為包含RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域或其衍生物與鋅指DNA-RNA雜交物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，并且其中所述鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與DNA-RNA雜交物中的特異性序列結(jié)合。優(yōu)選的核糖核酸酶為包含缺失RNA酶HI雜交物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域的衍生物，優(yōu)選RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域來(lái)自耐鹽芽孢桿菌(Bacillus,更優(yōu)選包含由SEQ ID No:1所示raM基因的第175-588位核苷酸編碼的多肽。在核糖核酸酶中，優(yōu)選的RNA酶HI催化結(jié)構(gòu)域在底物結(jié)合區(qū)包含一個(gè)氨基酸的至少一個(gè)取代，所述取代選自:K81A、K89E和K123A，以及優(yōu)選包含全部取代K81A、K89E和K123A。
[0014]在優(yōu)選的核糖核酸酶中，鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)殇\指ZfQQR的衍生物，優(yōu)選為由SEQ IDN0.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸編碼的多肽。所述核糖核酸酶優(yōu)選包含如SEQID N0.4所示的融合蛋白catAEA-ZfQQR。所述核糖核酸酶優(yōu)選包含如SEQ ID N0.6所示的融合蛋白GQ。所述核糖核酸酶還優(yōu)選包含如SEQ ID N0.8所示的融合蛋白GGKKQ。
[0015]在下一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的核糖核酸酶的組合物。
[0016]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的核糖核酸酶或本發(fā)明的組合物在切割DNA-RNA雜交物的RNA鏈中的用途。在所述用途上，DNA-RNA雜交物中RNA鏈的優(yōu)選切割位于遠(yuǎn)離鋅指結(jié)合位點(diǎn)的2-16個(gè)核苷酸、優(yōu)選5-7個(gè)核苷酸。
[0017]本發(fā)明還提供獲得工程改造的RNA酶HI的方法，所述酶切割DNA-RNA雜交物中的RNA鏈，其包括以下步驟:
a)優(yōu)選通過(guò)去除結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或取代涉及底物結(jié)合的氨基酸，獲得不結(jié)合底物但保留催化活性的RNA酶HI催化結(jié)構(gòu)域；
b)通過(guò)制備融合蛋白獲得工程改造的RNA酶HI，所述融合蛋白包含在步驟a)中獲得的RNA酶HI催化結(jié)構(gòu)域與能夠結(jié)合DNA-RNA雜交物中特異性序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(優(yōu)選鋅指DNA-RNA雜交物結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。在獲得工程改造的RNA酶HI的優(yōu)選方法中，鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)殇\指ZfQQR的衍生物，優(yōu)選為由SEQ ID N0.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸編碼的多肽。在所述方法中，RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選來(lái)自耐鹽芽孢桿菌(β_ halodurans),優(yōu)選包含由SEQ ID No:1所示rnM基因的第175-588位核苷酸編碼的多肽。RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選包含在底物結(jié)合區(qū)上的改變，所述改變優(yōu)選選自至少一個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入。
[0018]本發(fā)明切割DNA-RNA雜交物的RNA鏈的核糖核酸酶，包含RNA酶HI或其衍生物和DNA-RNA雜交物結(jié)合鋅指的融合物，其中RNA酶HI來(lái)自耐鹽芽孢桿菌以及鋅指能夠與雜交物DNA-RNA中的特異性序列結(jié)合。優(yōu)選本發(fā)明的核糖核酸酶表征為來(lái)自耐鹽芽孢桿菌的RNA酶HI的衍生物、催化結(jié)構(gòu)域多肽，甚至更優(yōu)選包含由SEQ ID No:l所示raM基因的第175-588位核苷酸編碼的多肽。同樣優(yōu)選的是，本發(fā)明的核糖核酸酶表征為天然RNA酶HI的衍生物，其包含DNA-RNA雜交物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的缺失。優(yōu)選本發(fā)明的核糖核酸酶表征為催化結(jié)構(gòu)域衍生的RNA酶HI，其在底物結(jié)合區(qū)包含氨基酸取代:K81A、K89E和K123A。最優(yōu)選本發(fā)明的核糖核酸酶表征為由SEQ ID No:1所示raM基因的第175-588位核苷酸編碼的多肽和其為鋅指ZfQQR衍生物的鋅指結(jié)構(gòu)域的融合物，所述鋅指結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為由SEQ ID N0.2所示鋅指ZfQQR的第19-303位核苷酸編碼的多肽。
[0019]序列特異性核糖核酸酶H可用于核酸的特異性和定位斷裂以用于RNA質(zhì)譜分析，包括用于研究RNA的修飾。本發(fā)明可用來(lái)產(chǎn)生用于第三代測(cè)序的RNA片段。序列特異性工程改造的RNA酶H可用于探測(cè)或繪制帶有特異性序列的病毒RNA，其中使單鏈RNA與DNA退火，并切割所得雜交物。本發(fā)明可通過(guò)改組片段和mRNA的連接而用于蛋白質(zhì)工程，其中片段通過(guò)使用特異性工程改造的核糖核酸酶H消化獲得。本發(fā)明可用于指導(dǎo)體內(nèi)持久性DNA-RNA雜交物的位點(diǎn)特異性切割。
[0020]具有新特征的酶可通過(guò)構(gòu)建具有不同功能性的數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)域的融合物來(lái)獲得。以序列依賴性方式切割DNA-RNA雜交物中RNA鏈的核糖核酸酶的工程改造基于以下兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的融合物:工程改造的RNA酶HI和DNA-RNA雜交物結(jié)合鋅指。來(lái)自耐鹽芽孢桿菌的RNA酶HI為以非序列依賴性方式水解DNA-RNA雜交物中RNA鏈的酶。鋅指ZfQQR能夠與DNA-RNA雜交物中明確確定的序列結(jié)合。在融合酶的一個(gè)實(shí)施方案中，表現(xiàn)出針對(duì)DNA-RNA雜交物中RNA鏈的核糖核酸酶活性的結(jié)構(gòu)域?yàn)閬?lái)自耐鹽芽孢桿菌的基因片段(稱為cat)，其編碼催化結(jié)構(gòu)域。其為raM基因第175-588位核苷酸的片段，對(duì)應(yīng)于來(lái)自耐鹽芽孢桿菌的天然蛋白質(zhì)RNA酶HI的第59-196位氨基酸殘基的區(qū)域。從所述天然基因中去除編碼雜交物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)的片段，因其能夠不依賴序列地結(jié)合DNA-RNA雜交物。催化結(jié)構(gòu)域與ZfQQR的融合物稱為cat-ZfQQR。工程改造的催化結(jié)構(gòu)域具有在底物結(jié)合區(qū)引入的三個(gè)氨基酸取代:K81A、K89E和K123A。所述取代涉及帶正電的賴氨酸，其定位靠近已知的底物結(jié)合區(qū)。并非意圖結(jié)合位點(diǎn)中的取代使酶失活，而是意圖導(dǎo)致酶的底物結(jié)合依賴于另外的DNA-RNA雜交物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在。賦予融合酶的序列特異性的結(jié)構(gòu)域?yàn)殇\指ZfQQR。在融合酶中，使用編碼鋅指ZfQQR的第19-303位核苷酸的基因片段，其對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的第7-101位氨基酸殘基的區(qū)域。此外，對(duì)融合酶的域間接頭區(qū)修飾以產(chǎn)生兩個(gè)變體，稱為GQ和GGKKQ0 GQ為具有在K81A、K89E和K123A的取代的催化結(jié)構(gòu)域與ZfQQR的融合物，其缺少編碼融合酶的第138-148位氨基酸的片段。GGKKQ為具有在K81A、K89E和K123A的取代的催化結(jié)構(gòu)域與ZfQQR的融合物，其缺少編碼融合酶的第138-139位和141-146位氨基酸的片段。產(chǎn)生的構(gòu)建體的描述在表1中概括。[0021]轟i構(gòu)建體的描述、其進(jìn)一步使用和用于實(shí)施例中的縮寫及其對(duì)SEQ ID NO的引用。
【權(quán)利要求】
1.一種核糖核酸酶，所述核糖核酸酶切割DNA-RNA雜交物中的RNA鏈，其中核糖核酸酶為包含核糖核酸酶HI (RNA酶HI)的催化結(jié)構(gòu)域或其衍生物與鋅指DNA-RNA雜交物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，并且其中所述鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與DNA-RNA雜交物中的特異性序列結(jié)八口 ο
2.權(quán)利要求1的核糖核酸酶，其中所述RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域的衍生物包含RNA酶HI雜交物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的缺失。
3.權(quán)利要求1或2的核糖核酸酶，其中所述RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選來(lái)自耐鹽芽孢桿菌{Bacillus,優(yōu)選包含由SEQ ID No:1所不ιτ?Α基因的第175-588位核苷酸編碼的多肽。
4.權(quán)利要求3的核糖核酸酶，其中所述RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域在底物結(jié)合區(qū)包含一個(gè)氨基酸的至少一個(gè)取代，所述取代選自:Κ81Α、Κ89Ε和Κ123Α，以及優(yōu)選包含全部取代Κ81Α、Κ89Ε 和 Κ123Α。
5.權(quán)利要求1-4的核糖核酸酶，其中所述鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)殇\指ZfQQR的衍生物，優(yōu)選為由SEQ ID N0.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸編碼的多肽。
6.權(quán)利要求1-5的核糖核酸酶，其中其包含如SEQID Νο.4所示的融合蛋白catAEA-ZfQQR。
7.權(quán)利要求1-5的核糖核酸酶，其中其包含如SEQID N0.6所示的融合蛋白GQ。
8.權(quán)利要求1-5的核糖核酸酶，其中其包含如SEQID N0.8所示的融合蛋白GGKKQ。
9.一種組合物,所述組合物包含權(quán)利要求1-8的核糖核酸酶。
10.權(quán)利要求1-8的核糖核酸酶或權(quán)利要求9的組合物在切割DNA-RNA雜交物的RNA鏈中的用途。
11.權(quán)利要求10的用途，其中DNA-RNA雜交物中RNA鏈的切割位于遠(yuǎn)離鋅指結(jié)合位點(diǎn)的2-16個(gè)核苷酸,優(yōu)選5-7個(gè)核苷酸。
12.—種獲得工程改造的RNA酶HI變體的方法，所述變體切割DNA-RNA雜交物中的RNA鏈，所述方法包括以下步驟: a)優(yōu)選通過(guò)去除結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或涉及底物結(jié)合的氨基酸的取代，獲得不結(jié)合底物但保留催化活性的RNA酶HI催化結(jié)構(gòu)域； b)通過(guò)制備融合蛋白獲得工程改造的RNA酶HI，所述融合蛋白包含在步驟a)中獲得的RNA酶HI催化結(jié)構(gòu)域與能夠結(jié)合DNA-RNA雜交物中特異性序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選鋅指DNA-RNA雜交物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)殇\指ZfQQR的衍生物，優(yōu)選為由SEQIDN0.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸編碼的多肽。
14.權(quán)利要求12-13的方法，其中所述RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選來(lái)自耐鹽芽孢桿菌，優(yōu)選包含由SEQ ID No:1所示rnM基因的第175-588位核苷酸編碼的多肽。
15.權(quán)利要求12-14的方法，其中所述RNA酶HI的催化結(jié)構(gòu)域包含在底物結(jié)合區(qū)的改變，所述改變優(yōu)選選自至少一個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或插入。
16.一種確定DNA-RNA雜交物結(jié)合蛋白或其結(jié)構(gòu)域的序列偏好的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: a)使純化的蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域與DNA-RNA雜交物底物文庫(kù)的混合物接觸，其中DNA-RNA雜交物底物包含在中心部位的隨機(jī)序列、優(yōu)選在9或10個(gè)核苷酸位置的隨機(jī)序列，所述隨機(jī)序列具有固定的側(cè)翼序列并允許測(cè)試的蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域與對(duì)其具有親和力的序列結(jié)合； b)通過(guò)將帶有結(jié)合的DNA-RNA雜交物的蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域固定到樹脂、優(yōu)選谷胱甘肽瓊脂糖，分離未結(jié)合的DNA-RNA雜交物； c)去除未結(jié)合的雜交物； d)優(yōu)選通過(guò)加入含有谷胱甘肽的緩沖液，分離重組蛋白連同所締合的DNA-RNA雜交物； e)利用PCR、優(yōu)選RT-PCR擴(kuò)增分離的雜交物，其中在擴(kuò)增反應(yīng)中使用與位于隨機(jī)區(qū)域側(cè)翼的不變序列互補(bǔ)的引物，并且其中在PCR反應(yīng)期間，將RNA聚合酶啟動(dòng)子的序列加入到引物之一上以獲得用于以RNA聚合物體外轉(zhuǎn)錄的雙鏈DNA ； f)使用不具有RNA酶H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶和與RNA模板的3’末端互補(bǔ)的DNA引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以獲得DNA-RNA雜交物，并優(yōu)選重復(fù)步驟a) -f)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述啟動(dòng)子序列包含T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列并且RNA聚合酶為T7 RNA聚合酶。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中所述蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域?yàn)橹亟M蛋白或重組結(jié)構(gòu)域。
19.權(quán)利要求16-18的方法，其中所述蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域包含鋅指。
20.權(quán)利要求16-19的方法，其中所述蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域?yàn)殇\指結(jié)構(gòu)域和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(GST)的融合物，優(yōu)選為由SEQ ID No: 37編碼的鋅指結(jié)構(gòu)域和GST的融合物。
21.權(quán)利要求16-20的方法，其中所述蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域?yàn)镽NA酶HI或衍生物和鋅指的融合物，優(yōu)選RNA酶HI來(lái)自耐鹽芽孢桿菌，優(yōu)選包含由SEQ ID No:1所示rnAA基因的第175-588位核苷酸編碼的多肽。
22.權(quán)利要求16-19和21的方法，其中所述鋅指能夠與DNA-RNA雜交物中的特異性序列結(jié)合。
23.權(quán)利要求16-22的方法，其中所述鋅指為ZfQQR，優(yōu)選具有由SEQID N0.2所示序列ZfQQR的第19-303位核苷酸編碼的序列。
24.獲得DNA-RNA雜交物文庫(kù)的方法，所述方法包括以下步驟: a)DNA寡核苷酸文庫(kù)的PCR擴(kuò)增，所述寡核苷酸包含在中心位置的簡(jiǎn)并序列，所述簡(jiǎn)并序列的側(cè)翼為包含RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的不變序列， b)使用RNA聚合酶以在a)中獲得的雙鏈DNA用作模板合成RNA鏈， c)使用不具有核糖核酸酶H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶，將與存在于b)中所得RNA的3’末端的不變序列互補(bǔ)的引物逆轉(zhuǎn)錄，其中RNA鏈在逆轉(zhuǎn)錄期間未降解，并且獲得由互補(bǔ)的RNA和DNA鏈組成的雜交物核酸分子。
25.權(quán)利要求24的方法，其中寡核苷酸包含在中心位置的簡(jiǎn)并序列，所述中心位置包括隨機(jī)的9或10個(gè)核苷酸位置。
26.權(quán)利要求24或25的方法，其中所述啟動(dòng)子序列包含T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列并且RNA聚合酶為T7 RNA聚合酶。
【文檔編號(hào)】C12N9/22GK103764820SQ201280027647
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月8日
【發(fā)明者】J.M.布尼基, A.A.蘇勒, K.J.斯科羅內(nèi)克, M.諾沃特尼 申請(qǐng)人:國(guó)際生物分子和細(xì)胞研究所