用于使多能干細(xì)胞分化為血管床細(xì)胞的方法
【專利摘要】本申請涉及用于使多能干細(xì)胞(PSC)分化為血管床細(xì)胞的方法。此外，本申請涉及用于使人胚胎干細(xì)胞(ESC)和誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)分化為血管床細(xì)胞的方法，其基于化學(xué)成分確知培養(yǎng)基誘導(dǎo)的連接步驟。
【專利說明】用于使多能干細(xì)胞分化為血管床細(xì)胞的方法
[0001]本申請涉及用于使多能干細(xì)胞(PSC)分化為血管床細(xì)胞(vascular bed cell,即內(nèi)皮細(xì)胞(EC))和/或血管平滑肌細(xì)胞(VSMG)的方法，此外，本申請涉及用于使人胚胎干細(xì)胞(ESC)和誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)分化為血管床細(xì)胞的方法，其基于化學(xué)成分確知培養(yǎng)基誘導(dǎo)的連接步驟。
[0002]人體的幾乎所有組織都依賴于血液供應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的襯里(lining)，并提供血液和組織之間的選擇性通透屏障。此外，血管平滑肌細(xì)胞見于血管壁內(nèi)，在控制血管的血管收縮中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞損傷、活化或功能障礙是許多疾病的病理生理學(xué)的主要特征。
[0003]因此，理解血管生物學(xué)的基本原理對發(fā)現(xiàn)用于治療許多患者的新方法具有極其重要的意義。例如，患有2型糖尿病的患者具有更高的冠脈疾病(CAD)和外周血管并發(fā)癥(如腎病和視網(wǎng)膜病)的發(fā)病率。因此，血管并發(fā)癥是此患者群中顯著提高的死亡率和發(fā)病率的主要原因。腎中內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞和系膜細(xì)胞增強(qiáng)的生長和血管收縮，引起彌漫性腎小球硬化癥，繼而引起嚴(yán)重腎衰竭。在糖尿病性視網(wǎng)膜病中，高血糖癥誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞死亡，導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和增加的生長，引起視網(wǎng)膜的病理生理性增生，其繼而引起視力受損或甚至完全喪失。因此，存在對患者特異性體外血管床細(xì)胞模型的需要，以在2型糖尿病患者中研究血管并發(fā)癥，并鑒定治療血管并發(fā)癥的適當(dāng)?shù)男掳袠?biāo)和策略。
[0004]內(nèi)皮細(xì)胞在例如響應(yīng)病理性病癥(如慢性缺氧或組織缺血)的血管發(fā)生和血管生成(vasculogenesis)中至關(guān)重要。諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的生長因子可以激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖和新管形成的內(nèi)皮信號級聯(lián)放大。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)目前作為血管再生醫(yī)學(xué)中潛在的治療性處理受關(guān)注:已在許多臨床前研究中，以及治療慢性和急性冠脈疾病中的缺血性心血管疾病的臨床試驗(yàn)中針對下肢、心肌和腦缺血評估了由EPC移植誘導(dǎo)的有效的新血管形成(Yamahara K, Itoh H., Ther Adv Cardiovasc Dis.2OO9 年 2 月；3(1) -.YJ-TJ ；Kawamoto A,Asahara T.,Catheter Cardiovasc Interv.2007年 10月 I 日；70(4):477_84 ；Marsboom G, Janssens S., Expert Rev Cardiovasc Ther.2008 年 6 月；6(5):687-701.)。自體EC/EPC在基于細(xì)胞的療法中的潛在應(yīng)用的主要缺點(diǎn)之一是它們受限的繁殖能力和可用性。
[0005]藥物誘發(fā)的毒性常引起主要器官(如肝和肺)的損傷。毒性藥物或其代謝產(chǎn)物直接影響靶細(xì)胞的生物學(xué)或在器官內(nèi)引起免疫反應(yīng)。在藥物誘發(fā)的毒性影響肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肺內(nèi)皮細(xì)胞時，出現(xiàn)嚴(yán)重的組織水腫，其可以引起肝衰竭或呼吸困難?；颊咛禺愋泽w外內(nèi)皮細(xì)胞模型的發(fā)展將允許評估體外藥物毒性和便于開發(fā)具有降低的引起組織水腫的風(fēng)險的藥物。
[0006]胚胎干(ES)細(xì)胞和患者特異性誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)是為再生血管醫(yī)學(xué)大規(guī)模產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的潛在來源。使用誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)技術(shù)(Takahashi, K.& Yamanaka, S., “Induction of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors，，，Cell 126,663-676(2006))，可以通過轉(zhuǎn)導(dǎo)四種確定的因子(Sox2、0ct4、Klf4、c-Myc)來將體細(xì)胞重新編程為iPSC。iPSC技術(shù)使得能夠產(chǎn)生患者特異性iPSC，其可以分化為患者特異性內(nèi)皮細(xì)胞。這些患者特異性內(nèi)皮細(xì)胞用于例如體外模擬與2型糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的病理生理學(xué)，或用于評估藥物毒性。
[0007]嘗試這種體外疾病模擬的一個重要先決條件是實(shí)施有效、可靠和可放大的分化系統(tǒng)(Grskovic等，2011 ;Tiscornia等，2011 ;21111等，2011)。之前使人PSC分化為血管床細(xì)胞的努力未達(dá)到對藥物發(fā)現(xiàn)活動或再生細(xì)胞療法相關(guān)的規(guī)模和功效。已公開了用于使人多能干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞和iPSC)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的幾種方法。衍生自多能干細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞通過表達(dá)表面標(biāo)記(如CD31和CD144)的最低要求及通過在基質(zhì)凝膠包被的平板中形成管的能力來定義。James等(Nature Biotech 28,161-167, 2010)從衍生自胚胎干細(xì)胞的胚狀體培養(yǎng)物分化內(nèi)皮細(xì)胞。其中依次用如骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、激活蛋白A、成纖維細(xì)胞生長因子2和VEGF-A的不同生長因子刺激胚狀體。為了提高內(nèi)皮細(xì)胞分化的產(chǎn)率和重復(fù)性，作者使用了 TGFb抑制劑小分子(例如SB431542)。但是，此方法具有主要的缺點(diǎn):首先，內(nèi)皮細(xì)胞的絕對產(chǎn)率僅為不到10%，其次，多能干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞所需的總體時間最少為10天。最近，Tatsumi等(Cell Transplantation, 2010)用分化人胚胎干細(xì)胞衍生的內(nèi)皮細(xì)胞的新方法防止了這些限制中的一些。使用由在補(bǔ)充5 μ M糖原合酶激酶-3b (GSK-3b)抑制劑((2' 1,V E)-6-溴靛玉紅-3'-肟，稱為“ΒΙ0”)的化學(xué)成分確知無血清培養(yǎng)基中孵育3天和在補(bǔ)充血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的培養(yǎng)基中孵育2天的逐步組合組成的分化方法，以通過表達(dá)表面標(biāo)記⑶144的內(nèi)皮細(xì)胞(還顯示為⑶144+細(xì)胞)測定的約20%的效率在5天內(nèi)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞。然后用磁激活細(xì)胞分選(MACS)分離來分選CD144+內(nèi)皮細(xì)胞，并在補(bǔ)充VEGF的培養(yǎng)基中繁殖不同代數(shù)。然后，針對內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志性特征中的一些測試分化的內(nèi)皮細(xì)胞:毛細(xì)管樣管形成、I' ,I1-雙十八烷基_3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花青標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(Di1-Ac-LDL)的攝取及標(biāo)記CD31、CD34、CD144和VEGFR-2的表達(dá)。使用此方法，分化內(nèi)皮細(xì)胞所需的總體時間僅為5天，但是，內(nèi)皮細(xì)胞的絕對產(chǎn)率(約20% )僅輕微提高。此方法具有其他缺點(diǎn):在起始步驟中，未分化的人胚胎干細(xì)胞結(jié)合為小細(xì)胞團(tuán)，并鋪在I型膠原包被的平皿上。小胚胎干細(xì)胞團(tuán)的使用較差地限定起始條件，其可以對重復(fù)性具有負(fù)面影響。
[0008]總的來說，所有已知的分化方法的主要缺點(diǎn)是需要不確定的因子，如血清、條件培養(yǎng)基、與小鼠0P9基質(zhì)細(xì)胞或飼養(yǎng)層共培養(yǎng)、細(xì)胞聚集體或胚狀體的異源性質(zhì)(James等，2010 ；Sumi 等，2008 ；Vodyanik 等，2005 ；ffang 等，2007 ；Levenberg 等，2002PNAS ；Kane 等，2010 ;Tatsumi 等，2010)。
[0009]仍存在對易于使用且可重復(fù)用于的方法的需要，該方法使多能干細(xì)胞分化為血管床細(xì)胞。本發(fā)明提供用于在減少的時間量(5天)之內(nèi)和以顯著提高的產(chǎn)率(至多85%，如通過表達(dá)標(biāo)記CD144的細(xì)胞來測定)使多能干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，且可以完整地重現(xiàn)的改進(jìn)的方法。新方法減輕了獲得胚狀體或小細(xì)胞團(tuán)的必要性，且去除了本領(lǐng)域已知的方法的低重復(fù)性和低標(biāo)準(zhǔn)化的主要缺點(diǎn)。此外,高效率(表達(dá)標(biāo)記CD144的內(nèi)皮細(xì)胞的至多85%產(chǎn)率)使得現(xiàn)在可能在制藥工業(yè)中將這些內(nèi)皮細(xì)胞大規(guī)模用于藥物發(fā)現(xiàn)和安全性、用于再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用及 用于體外疾病模擬。此外，新方法允許選擇性調(diào)節(jié)血管祖細(xì)胞的分化，其使得能夠?qū)⒆V系定型變換為主要分化為內(nèi)皮細(xì)胞(~85%)或分化為血管平滑肌細(xì)胞(~90% )。
[0010]本文提供用于使多能干細(xì)胞分化為血管床細(xì)胞的方法，該方法包括步驟:
[0011]a)提供多能培養(yǎng)基(pluripotency medium)中的單層多能干細(xì)胞；
[0012]b)在補(bǔ)充激活β-聯(lián)蛋白(鈣黏著蛋白結(jié)合蛋白，β I ;人基因名稱CTNNB1)途徑和/或Wnt受體信號傳導(dǎo)途徑和/或hedgehog (HH)信號傳導(dǎo)途徑的小分子的激發(fā)培養(yǎng)基(priming medium)中孵育該細(xì)胞；
[0013]c)通過在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育該激發(fā)的細(xì)胞來誘導(dǎo)分化。
[0014]優(yōu)選地，在各步驟之間更換培養(yǎng)基，其意指在向細(xì)胞加入第二培養(yǎng)基之前通過吸
出棄除第一培養(yǎng)基。 [0015]本文所用的“單層多能細(xì)胞”意指與其中多層中的細(xì)胞實(shí)體形成附著于黏性基底的多種三維結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)或胚狀體相反，以在單層膜中附著于黏性基底的單細(xì)胞提供多能干細(xì)胞。
[0016]在起始步驟中提供單層多能干細(xì)胞對該方法的重復(fù)性和效率至關(guān)重要，且之前未在用于分化血管床細(xì)胞的任何方法中描述過。在一個實(shí)施方案中，可以通過酶促解離細(xì)胞為單細(xì)胞，并使它們附著至黏性基底(例如來自BD Bioscience的BDMatrigel hESC-qualified、來自 Invitrogen 的 Geltrex hESC-qualified、來自 Corning的Synthemax)上來產(chǎn)生單層多能干細(xì)胞。適合用于解離為單細(xì)胞的酶的實(shí)例包括Accutase (Invitrogen)、膜蛋白酶(Invitrogen) >TrypLe Express (Invitrogen)。在一個實(shí)施方案中，將20000至60000個細(xì)胞/cm2接種在黏性基底上。本文所用的培養(yǎng)基是便于多能干細(xì)胞作為單層中的單細(xì)胞附著和生長的多能培養(yǎng)基。本文所用的“多能培養(yǎng)基”指用于使多能干細(xì)胞作為單細(xì)胞附著于單層上同時保持其多能性的任意化學(xué)成分確知培養(yǎng)基，且為本領(lǐng)域公知?！岸嗄芘囵B(yǎng)基”指含有以下生長因子中的至少一種的培養(yǎng)基:堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bEGF，也描述為成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2))和轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFii)。在一個實(shí)施方案中，多能培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基，其補(bǔ)充了 Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶(ROCK)家族的蛋白激酶的小分子抑制劑(本文稱為ROCK激酶抑制劑)。
[0017]因此，在一個實(shí)施方案中，上述方法的步驟a)包括提供多能培養(yǎng)基中的單層多能干細(xì)胞，其中該多能培養(yǎng)基是補(bǔ)充ROCK激酶抑制劑的無血清培養(yǎng)基。
[0018]適合用于附著的無血清培養(yǎng)基的實(shí)例是來自Stem Cell Technologies的mTeSRl或TeSR2、來自 ReproCELL 的Primate ES/iPS細(xì)胞培養(yǎng)基、來自 Invitrogen 的 StemPro hESCSFM、來自Lonza的X-VIVO。本文中所使用的ROCK激酶抑制劑的實(shí)例是法舒地爾(Fasudil)(1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪)、ThiazoVivin(N-芐基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)和Y27632((+)-(R)_反-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)環(huán)己烷甲酰胺二鹽酸鹽，例如來自Tocris bioscience的目錄號1254)。在一個實(shí)施方案中，該多能培養(yǎng)基是補(bǔ)充2-20μΜ ￥27632，優(yōu)選5-1(^11 Υ27632的無血清培養(yǎng)基。在另一實(shí)施方案中，該多能培養(yǎng)基是補(bǔ)充2-20 μ M法舒地爾的無血清培養(yǎng)基。在另一實(shí)施方案中，該多能培養(yǎng)基是補(bǔ)充0.2-10 μ M Thiazovivin的無血清培養(yǎng)基。
[0019]在一個實(shí)施方案中，上述方法的步驟a)包括提供多能培養(yǎng)基中的單層多能干細(xì)胞，并在該多能培養(yǎng)基中培養(yǎng)該單層I天(24小時)。在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟a)包括提供多能培養(yǎng)基中的單層多能干細(xì)胞，并在該多能培養(yǎng)基中培養(yǎng)該單層18小時至30小時，優(yōu)選23至25小時。
[0020]在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟a)包括提供多能培養(yǎng)基中的單層多能干細(xì)胞，其中該多能培養(yǎng)基是補(bǔ)充ROCK激酶抑制劑的無血清培養(yǎng)基，并在該多能培養(yǎng)基中培養(yǎng)該單層I天(24小時)。在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟a)包括提供多能培養(yǎng)基中的單層多能干細(xì)胞，其中該多能培養(yǎng)基是補(bǔ)充ROCK激酶抑制劑的無血清培養(yǎng)基，并在該多能培養(yǎng)基中培養(yǎng)該單層18小時至30小時，優(yōu)選23至25小時。
[0021]本文所用的“適合用于激發(fā)的培養(yǎng)基”(也描述為“激發(fā)培養(yǎng)基”)指用于將多能干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞激發(fā)的任意化學(xué)成分確知培養(yǎng)基。本文所用的“激發(fā)培養(yǎng)基”指包含至少一種因子的培養(yǎng)基，該因子如激活β-聯(lián)蛋白(鈣黏著蛋白結(jié)合蛋白，β?;人基因名稱CTNNB1)途徑和/或Wnt受體信號傳導(dǎo)途徑和/或hedgehogOffl)信號傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)中胚層的誘導(dǎo)活性的小分子。在激發(fā)培養(yǎng)基中孵育時，多能干細(xì)胞開始隨時間推移改變細(xì)胞形態(tài)，且細(xì)胞增殖增加?！凹ぐl(fā)”步驟定義為涉及中胚層轉(zhuǎn)換的特異性基因和標(biāo)記(例如GATA2、VMENTIN、SMA、HANDl、F0Xa2 (低表達(dá))、KDR)的表達(dá)及多能性相關(guān)基因和標(biāo)記(例如 0CT4 (P0U5F1)、NAN0G、S0X2、REX1(ZFP42)、LEFTYl、LEFTY2、TDGFl、DNMT3B、GABRB3、ffl)F3、TERT)的下調(diào)。
[0022]在一個實(shí)施方案中，該激活β_聯(lián)蛋白(鈣黏著蛋白結(jié)合蛋白，β I ;人基因名稱CTNNBI)途徑和/或Wnt受體信號傳導(dǎo)途徑和/或hedgehog (HH)信號傳導(dǎo)途徑的小分子選自糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制劑、⑶C樣激酶I (Clkl-2-4)的小分子抑制劑、促分裂原活化蛋白激酶15(Mapkl5)的小分子抑制劑、雙特異性酪氨酸(Y)磷酸化調(diào)節(jié)激酶(DyrkIa-b 4)的小分子抑制劑、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶16 (Pctkl-3 4)的小分子抑制劑、Smoothened(SMO)激活物，及β-聯(lián)蛋白(或Y-聯(lián)蛋白)與輔激活蛋白CBP(CREB結(jié)合蛋白)和p300(EIA結(jié)合蛋白p300)間相互作用的調(diào)節(jié)物。
[0023]優(yōu)選地，該糖原合酶激酶3 (Gsk3a-b)抑制劑是基于吡咯烷二酮的GSK3抑制劑。本文所用的“基于吡咯烷二酮的GSK3抑制劑”指GSK3 α和GSK3 β的具有低IC5tl值的選擇性細(xì)胞通透的ATP競爭性抑制劑。
[0024]在一個實(shí)施方案中，該基于吡咯烷二酮的GSK3抑制劑選自3-(2，4_ 二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1Η-吡咯-2，5- 二酮(SB216763)、3_[(3_ 氯 ~4~ 羥苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1Η-吡咯-2，5-二酮(SB415286)、N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-咪唑-1-基-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3_硝基-吡啶-2，6- 二胺2HC1、3-咪唑并[l，2-a]吡啶-3-基-4-[2-(嗎啉_4_羰基)-1，2，3，4-四氫-[1，4] 二氮雜革.并[6，7，l-hi] B引哚-7-基]-吡咯-2，5-二酮、9-溴-7，12-二氫-吲哚并[3，2_d] [I]苯并氮雜革-6(5H)_ 酮(Kenpaullone)、9_ 溴-7，12-二氫-吡啶并[3' ,1':2，3]氮雜
革并[4,5-b]吲哚-6(5H)_ 酮(CHIR99021)和(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲
哚-3-基)-吡咯-2，5- 二酮(CP21R7，本文中也稱為“化合物21” ；見例如L.Gong等；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 20(2010),1693-1696)。
[0025]在一個實(shí)施方案中，該⑶C樣激酶I (Clkl-2-4)抑制劑選自苯并噻唑和3-氟-N-[1-異丙基-6- (1-甲基-哌啶-4-基氧)-1，3- 二氫-苯并咪唑-(2E)-亞基]-5-(4-甲基-1H-吡唑-3-磺?；?_苯甲酰胺。
[0026]在一個實(shí)施方案中，該促分裂原活化蛋白激酶15(Mapkl5)抑制劑選自4_(4_氟苯基)-2-(4-甲基亞磺?；交?-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑(SB203580)和5-異喹啉磺酰胺(H-89)。
[0027]在一個實(shí)施方案中，該雙特異性酪氨酸(Y)磷酸化調(diào)節(jié)激酶(Dyrkla-b 4)抑制劑選自6- [2-氨基-4-氧-4H-噻唑-(5Z)-亞基甲基]-4-(四氫-吡喃-4-基氧)-喹啉_3_臆。
[0028]在一個實(shí)施方案中，該smoothened激活物是Purmorphamine (2-(1-萘氧基)-6- (4-嗎啉代苯胺基)-9-環(huán)己基嘌呤)。
[0029]β-聯(lián)蛋白(或Y-聯(lián)蛋白)與輔激活蛋白CBP(CREB結(jié)合蛋白)和ρ300(Ε1Α結(jié)合蛋白p300)間相互作用的調(diào)節(jié)物是IQ-1 (2- (4-乙酸基-苯偶氮基)-2-[3, 3- 二甲基-3，4-二氫-2H-異喹啉-(IE)-亞基]-乙酰胺)和ICG-001((6S，9aS)-6-(4-羥基-芐基)-8_萘-1-基甲基-4，7-二氧-六氫-吡嗪[l，2-a]嘧啶_1_羧酸苯甲酰胺)(W02007056593)。
[0030]在一個實(shí)施方案中，該激發(fā)培養(yǎng)基是補(bǔ)充胰島素、運(yùn)鐵蛋白和孕酮的無血清培養(yǎng)基。在一個實(shí)施方案中，該無血清培養(yǎng)基補(bǔ)充了 10-50 μ g/ml胰島素、10-100 μ g/ml運(yùn)鐵蛋白和10-50nM孕酮，優(yōu)選30-50 μ g/ml胰島素、20-50 μ g/ml運(yùn)鐵蛋白和10_30nM孕酮。適合用于激發(fā)的無血清培養(yǎng)基的實(shí)例是N2B27培養(yǎng)基(N2B27是補(bǔ)充了 N2和B27( 二者都來自 Gibco)的 DMEM/F12(Gibco, Paisley, UK)的 1:1 混合物)、N3 培養(yǎng)基(由 DMEM/F12 (Gibco, Paisley, UK) >25 μ g/ml 胰島素、50 μ g/ml 運(yùn)鐵蛋白、30nM 亞硒酸鈉、20nM 孕酮、IOOnM 腐胺(Sigma)組成)或 NeuroCult ? NS-A 增殖培養(yǎng)基(Stemcell Technologies)。在一個實(shí)施方案中，該激發(fā)培養(yǎng)基是補(bǔ)充胰島素、運(yùn)鐵蛋白、孕酮及激活β_聯(lián)蛋白(鈣黏著蛋白結(jié)合蛋白，β?;人基因名稱CTNNB1)途徑和/或Wnt受體信號傳導(dǎo)途徑和/或hedgehog(HH)信號傳導(dǎo)途徑的小分子`的無血清培養(yǎng)基。優(yōu)選地，該小分子選自3_(2,4_ 二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5- 二酮(SB216763)、3_[ (3-氯-4-羥基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1Η-吡咯-2，5-二酮(SB415286)、#-{2-[4-(2，4_ 二氯-苯基)-5-咪唑-1-基-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3_硝基-吡啶-2，6- 二胺2HC1、
3-咪唑并[l，2-a]吡啶-3-基-4-[2-(嗎啉-4-羰基)-1，2，3，4-四氫-[I，4] 二氮雜革并[6,7,1-hi] H引哚-7-基]-吡咯-2，5-二酮、9-溴-7，12-二氫-吲哚并[3，2_d] [I]苯并氮雜革-6(5H)_ 酮(Kenpaullone)、9_ 溴-7，12-二氫-吡啶并[3'，2': 2，3]氮雜[4，5_b]吲哚-6 (5H)-酮(CHIR99021)、3- (3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚 _3_ 基)-吡咯-2，5- 二酮(CP21R7，本文中也稱為“化合物21”)、苯并噻唑、3-氟_N_[1_異丙基-6-(1-甲基-哌啶-4-基氧)-1，3_ 二氫-苯并咪唑-(2E)-亞基]-5-(4-甲基-1H-吡唑_3_磺酰基)-苯甲酰胺、4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺?；交?-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑(SB203580)、5-異喹啉磺酰胺(H-89)、6_[2_氨基-4-氧-4H-噻唑-(5Z)-亞基甲基]-4-(四氫-吡喃-4-基氧)-喹啉-3-腈、2- (1-萘氧基)-6- (4-嗎啉代苯胺基)-9-環(huán)己基卩票呤(Purmorphamine)、2_ (4-乙酸基_苯偶?xì)饣?-2-[3，3- 二甲基-3，4- 二氫^ -2H-異喹啉-(IE)-亞基]-乙酰胺(IQ-1)和 ICG-001 ((6S，9aS) -6- (4-羥基-芐基)-8-萘-1-基甲基-4，7-二氧-六氫-吡嗪[l，2-a]嘧啶-1-羧酸苯甲酰胺)。
[0031]在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該激發(fā)培養(yǎng)基是補(bǔ)充0.5-4 μ M CP21R7(3-(3_氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮)的含有10-50 μ g/ml胰島素、10-100 μ g/ml運(yùn)鐵蛋白和10-50nM孕酮的無血清培養(yǎng)基。
[0032]在一個實(shí)施方案中，該激發(fā)培養(yǎng)基還包含重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP4)。
[0033]在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該激發(fā)培養(yǎng)基是補(bǔ)充0.5-4 μ M CP21R7(3-(3_氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮)和10-50ng/ml重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP4)的含有10-50 μ g/ml胰島素、10-100 μ g/ml運(yùn)鐵蛋白和10_50nM孕酮的無血清
培養(yǎng)基。
[0034]在一個實(shí)施方案中，上述方法的步驟b)包括在激發(fā)培養(yǎng)基中孵育該細(xì)胞至少3天(72小時)。
[0035]在一個實(shí)施方案中，上述方法的步驟b)包括在激發(fā)培養(yǎng)基中孵育該細(xì)胞2至4天(48至96小時)。
[0036]在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟b)包括在激發(fā)培養(yǎng)基中孵育該細(xì)胞，其中該激發(fā)培養(yǎng)基是補(bǔ)充CP21R7 (3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚_3_基)-吡咯-2，5-二酮)的無血清培養(yǎng)基。優(yōu)選地，該激發(fā)培養(yǎng)基補(bǔ)充了 0.5-4 μ M CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮)，最優(yōu)選 1-2 μ M CP21R7 (3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5- 二酮)。
[0037]在一個實(shí)施方案中，該激發(fā)培養(yǎng)基還包含重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)。
[0038]在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟b)包括在激發(fā)培養(yǎng)基中孵育該細(xì)胞，其中該激發(fā)培養(yǎng)基是補(bǔ)充CP21R7 (3-(3-`氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚_3_基)-吡咯-2，5- 二酮)的無血清培養(yǎng)基，并孵育該細(xì)胞3天(72小時)。
[0039]在一個實(shí)施方案中，該激發(fā)培養(yǎng)基還包含重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP4)。
[0040]在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟b)包括在激發(fā)培養(yǎng)基中孵育該細(xì)胞，其中該激發(fā)培養(yǎng)基是補(bǔ)充CP21R7 (3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚_3_基)-吡咯-2，5- 二酮)的無血清培養(yǎng)基，并培養(yǎng)該細(xì)胞2至4天(48小時至96小時)。
[0041]在一個實(shí)施方案中，該激發(fā)培養(yǎng)基還包含重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP_4)。
[0042]本文所用的“誘導(dǎo)培養(yǎng)基”指用于將激發(fā)的細(xì)胞誘導(dǎo)為單層上的CD144陽性(CD144+)內(nèi)皮細(xì)胞或I3DGF受體β陽性(CD140b+)血管平滑肌細(xì)胞或常見祖細(xì)胞類型的任意化學(xué)成分確知培養(yǎng)基。
[0043]對于主要誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞，用VEGF(=血管內(nèi)皮生長因子)或胎盤樣生長因子
I(PLGF-1)和小分子腺苷酸環(huán)化酶激活物補(bǔ)充該誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在一個實(shí)施方案中，該小分子腺苷酸環(huán)化酶激活物導(dǎo)致PKA/PKI信號傳導(dǎo)途徑的激活。在一個實(shí)施方案中，該小分子腺苷酸環(huán)化酶激活物選自Forskolin ((3R)-(6a α H)十二氫-6 β , 10 a , IOb α -三羥基_3 β ,4a β，7,7,10&3_五甲基_1-氧-3_乙烯基-1H-蔡并[2, l~b]吡喃-5 β -基乙酸鹽)、8-溴-cAMP (8-溴腺苷-3' ,5'-環(huán)單磷酸鹽)和腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin)。在一個實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基是補(bǔ)充人血清白蛋白、乙醇胺、運(yùn)鐵蛋白、胰島素和氫化可的松的無血清培養(yǎng)基。適合用于誘導(dǎo)的無血清培養(yǎng)基的實(shí)例是StemPro-34(Invitrogen,主要成分:人血清白蛋白、脂類物質(zhì)如HumanEx-Cyte ?和乙醇胺或其混合物、人鋅胰島素、氫化可的松、鐵飽和的運(yùn)鐵蛋白、2-巰基乙醇和D，L-生育酚乙酸鹽，或其衍生物或混合物)及X-VIVOlO 和 15(Lonza)。
[0044]在一個實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基是補(bǔ)充人血清白蛋白、乙醇胺、運(yùn)鐵蛋白、胰島素和氫化可的松及l(fā)-ΙΟμΜ Forskolin和5-100ng/ml VEGF-A的無血清培養(yǎng)基。在另一實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含補(bǔ)充了 VEGF-A30-70ng/ml或胎盤樣生長因子
I(PLGF-1) 30_70ng/ml 的 StemPro-34 (來自 Invitrogen)。
[0045]在一個實(shí)施方案中，上述方法的步驟c)包括通過在補(bǔ)充了 VEGF-A或胎盤樣生長因子I(PLGF-1)和小分子腺苷酸環(huán)化酶激活物的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育該激發(fā)的細(xì)胞來誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞，其中該小分子腺苷酸環(huán)化酶激活物選自ForskoliruS-溴-cAMP和腎上腺
髓質(zhì)素。
[0046]在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟c)包括通過在補(bǔ)充了 VEGF-A或胎盤樣生長因子I (PLGF-1)和小分子腺苷酸環(huán)化酶激活物的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育該激發(fā)的細(xì)胞I天來誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞。
[0047]在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟c)包括通過在補(bǔ)充了 VEGF-A或胎盤樣生長因子I(PLGF-1)和小分子腺苷酸環(huán)化酶激活物的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育該激發(fā)的細(xì)胞18小時至48小時，優(yōu)選22小時至36小時來誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞。
[0048]在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟c)包括通過在補(bǔ)充了 VEGF-A或胎盤樣生長因子I (PLGF-1)和小分子腺苷酸環(huán)化酶激活物的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育該激發(fā)的細(xì)胞I天來誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞，其中該小分子腺苷酸環(huán)化酶激活物選自ForskoliruS-溴-cAMP和腎上腺髓質(zhì)素。
[0049]使用本發(fā)明中提供的方法，現(xiàn)在可能以至多85%的產(chǎn)率從多能干細(xì)胞分化內(nèi)皮細(xì)胞(圖2)。步驟c)的產(chǎn)物可以容易地在細(xì)胞培養(yǎng)物中作為⑶144+細(xì)胞鑒定。
[0050]對于主要誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞，上述方法的步驟c)包括在VSMC誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育該激發(fā)的細(xì)胞18-48小時，優(yōu)選22-36小時。VSMC誘導(dǎo)培養(yǎng)基是補(bǔ)充了生長因子和/或增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞的形成和存活的小分子的化學(xué)成分確知培養(yǎng)基。
[0051]在一個實(shí)施方案的步驟中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基是化學(xué)成分確知的血清替代品培養(yǎng)基(SR培養(yǎng)基)。SR培養(yǎng)基由補(bǔ)充了化學(xué)成分確知的血清替代品(2-15% )(例如來自Invitrogen的敲除血清替代品，目錄號10828028)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如RPMI培養(yǎng)基，Invitrogen,目錄號11835-063，或DMEM培養(yǎng)基)組成。它可以進(jìn)一步包含穩(wěn)定的谷氨酰胺、非必需氨基酸和β-巰基乙醇。
[0052]在另一實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基補(bǔ)充了 1-5 μ M范圍內(nèi)的IWRl (Wnt反應(yīng)I的抑制劑)。
[0053]在另一實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基由補(bǔ)充了 2_20ng/ml血小板衍生生長因子(roGF)信號傳導(dǎo)途徑的激活物和2-10ng/ml TGF^信號傳導(dǎo)途徑的激活物的無血清培養(yǎng)基組成。I3DGF信號發(fā)放 的激活物的實(shí)例包括例如I3DGF-AA、PDGF-BB (例如RnD，目錄號220-BB)和TOGF-AB。TGF β信號發(fā)放的一種示例性激活物是激活蛋白A (例如RnD，目錄號338-AC)。適合用于誘導(dǎo)的無血清培養(yǎng)基的實(shí)例是Ν2Β27培養(yǎng)基(Ν2Β27是補(bǔ)充7 Ν2 和 Β27( 二者都來自 Gibco)的 DMEM/F12 (Gibco, Paisley, UK)的 1:1 混合物)、StemPro-34 (Invitrogen,主要成分:人血清白蛋白、脂類物質(zhì)如Human Ex-Cyte ?和乙醇胺或其混合物、人鋅胰島素、氫化可的松、鐵飽和的運(yùn)鐵蛋白、2-巰基乙醇和D，L-生育酚乙酸鹽，或其衍生物或混合物)及X-VIVO 10和15 (Lonza)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該用于主要誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基是N2B27培養(yǎng)基。
[0054]在另一實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基由補(bǔ)充了 2_20ng/ml血小板衍生生長因子(roGF)信號傳導(dǎo)途徑的激活物和2-10ng/ml TGF^信號傳導(dǎo)途徑的激活物的無血清培養(yǎng)基組成，且進(jìn)一步包含人血清白蛋白、乙醇胺、運(yùn)鐵蛋白、胰島素和氫化可的松。
[0055]在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟c)包括通過在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育該激發(fā)的細(xì)胞I天來誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞。
[0056]在另一實(shí)施方案中，上述方法的步驟c)包括通過在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育該激發(fā)的細(xì)胞18小時至48小時，優(yōu)選22小時至36小時來誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞。
[0057]使用本發(fā)明中提供的方法，現(xiàn)在可能以90%的產(chǎn)率從多能干細(xì)胞分化血管平滑肌細(xì)胞。步驟c)的產(chǎn)物可以容易地在細(xì)胞培養(yǎng)物中作為⑶140b+細(xì)胞鑒定。 [0058]在另一實(shí)施方案中，該方法還包括步驟:
[0059]d)在適合用于增殖內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞的條件下孵育步驟c)的產(chǎn)物。
[0060]優(yōu)選地，該適合用于增殖內(nèi)皮細(xì)胞的條件包括收獲該CD144+細(xì)胞，并在化學(xué)成分確知的繁殖(expansion)培養(yǎng)基中繁殖它們。本文所用的“收獲”指從黏性基底酶促解離細(xì)胞，隨后重懸在新培養(yǎng)基中。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，收獲后分選細(xì)胞。細(xì)胞分選可以通過本領(lǐng)域已知的方法，例如通過磁激活細(xì)胞分選(MACS)(圖3)或流式細(xì)胞術(shù)激活細(xì)胞分選(FACS)分離來達(dá)到。本文所用的“繁殖培養(yǎng)基”指用于在單層上繁殖和傳代CD144+內(nèi)皮細(xì)胞的任意化學(xué)成分確知培養(yǎng)基。在一個實(shí)施方案中，該繁殖培養(yǎng)基是補(bǔ)充VEGF-A的無血清培養(yǎng)基。適合用于繁殖內(nèi)皮細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基是補(bǔ)充了 8ng/mlFGF-2、50ng/ml VEGF 和 10 μ M SB431542 (4-(4-苯并[1,3] 二氧雜環(huán)戊烯 _5_ 基-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)的 StemPro-34 (Invitrogen)、EGM2 (Lonza)和 DMEM/F12 (Invitrogen)。優(yōu)選地，在貼壁培養(yǎng)條件中培養(yǎng)該內(nèi)皮細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，該繁殖培養(yǎng)基補(bǔ)充了 5-100ng/ml VEGF-A。在另一實(shí)施方案中，該繁殖培養(yǎng)基是補(bǔ)充了 5_100ng/ml VEGF-A 的 StemPro-34。
[0061 ] 通過本文所述方法獲得的內(nèi)皮細(xì)胞可以繁殖幾代，且培養(yǎng)已被良好地表征?？赡芸芍噩F(xiàn)地冷凍和融化通過本文所述方法獲得的內(nèi)皮細(xì)胞的整分試樣。
[0062]優(yōu)選地，該用于增殖VSMC的條件包括收獲該⑶140b+細(xì)胞，并在化學(xué)成分確知的繁殖培養(yǎng)基中繁殖它們。本文所用的“收獲”指從黏性基底酶促解離細(xì)胞，隨后重懸在新培養(yǎng)基中。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，收獲后通過針對⑶140b+ VSMC或⑶144+缺失的內(nèi)皮細(xì)胞的陽性選擇來分選細(xì)胞。細(xì)胞分選可以通過本領(lǐng)域已知的方法，例如通過磁激活細(xì)胞分選(MACS)(圖3)或流式細(xì)胞術(shù)激活細(xì)胞分選(FACS)分離來達(dá)到。本文所用的“繁殖培養(yǎng)基”指用于在單層上繁殖和傳代CD140b+ VSMC的任意化學(xué)成分確知培養(yǎng)基。在一個實(shí)施方案中，該繁殖培養(yǎng)基與所述VSMC誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。在另一實(shí)施方案中，繁殖培養(yǎng)基是補(bǔ)充了 EGF(5-20ng/ml)和FGF2 (5_20ng/ml)的無血清培養(yǎng)基。適合用于繁殖VSMC的無血清培養(yǎng)基的實(shí)例是 StemPro-34 (Invitrogen)、DMEM/F12 (Invitrogen)和 DMEM (Invitrogen),或之前所述的N2B27。在另一實(shí)施方案中，繁殖培養(yǎng)基是該SR培養(yǎng)基。優(yōu)選地，在貼壁培養(yǎng)條件中培養(yǎng)VSMC。[0063]通過本文所述方法獲得的VSMC可以繁殖幾代，且培養(yǎng)已被良好地表征。
[0064]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供用于產(chǎn)生患者特異性或健康個體特異性血管床細(xì)胞的方法。為此，將獲自患者或健康個體的人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)用于本文所述的方法。該患者特異性人iPSC可以通過將獲自患者或健康個體的體細(xì)胞重新編程為多能干細(xì)胞,來通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。例如,可以通過皮膚活組織檢查來從需要治療的個體或從健康個體獲得成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞或脂肪細(xì)胞，并通過本領(lǐng)域已知的方法重新編程為誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞。適合作為誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞的來源的其他體細(xì)胞是獲自血液樣品的白細(xì)胞或獲自尿液樣品的上皮細(xì)胞或其他細(xì)胞。患者特異性誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞然后通過本文所述的方法分化為患者特異性或健康個體特異性內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供通過任意前述方法產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞的群體。優(yōu)選地，該內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞的群體是患者特異性的，即衍生自獲自患疾病的個體的iPSC。在另一實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞的群體獲自健康個體 。
[0065]患者衍生的內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞代表研究如2型和I型糖尿病、代謝綜合癥和嚴(yán)重肥胖的疾病的血管并發(fā)癥的病理生理學(xué)的疾病相關(guān)體外模型。在一個實(shí)施方案中，將通過此方法獲得內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞用于篩選逆轉(zhuǎn)、抑制或阻止由內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙引起的血管并發(fā)癥的化合物，例如由2型和I型糖尿病、代謝綜合征、嚴(yán)重肥胖、高膽固醇血癥、高血壓、冠狀動脈疾病、腎病、視網(wǎng)膜病、腎衰竭、組織缺血、慢性缺氧、動脈粥樣硬化及藥物誘發(fā)的毒性引起的組織水腫引起的血管并發(fā)癥。優(yōu)選地，通過本文所述的本發(fā)明方法獲得的該內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞衍生自患疾病的個體。在另一實(shí)施方案中，通過此方法獲得的內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞用于篩查和評價藥物誘發(fā)的組織水腫。優(yōu)選地，通過本文所述的本發(fā)明方法獲得的該內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞衍生自受特應(yīng)性藥物誘發(fā)的組織水腫影響的個體。從患疾病的個體分化內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞代表了早期在人背景模式中評價藥物安全性的唯一機(jī)會。在另一實(shí)施方案中，通過此方法獲得的內(nèi)皮細(xì)胞用作血腦屏障的體外模型。
[0066]本發(fā)明提供供給患者特異性血管床細(xì)胞或來自具有適合用于移植的相同HLA類型的健康個體的相容細(xì)胞(二者都在無異源成分的條件中衍生)的高效方法?！盁o異源成分的培養(yǎng)條件”指僅包含人和重組來源的成分的培養(yǎng)基和附著基底。因此避開了受異源病原體污染的風(fēng)險，該內(nèi)皮細(xì)胞安全用于再生醫(yī)學(xué)。用本文所述的方法使患者特異性誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)分化為患者特異性內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞代表了產(chǎn)生自體來源的內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的易達(dá)到且可重復(fù)的技術(shù)。自體和/或相容細(xì)胞在細(xì)胞療法中的使用提供了優(yōu)于使用可能經(jīng)受免疫排斥的非自體細(xì)胞的主要優(yōu)勢。相反，自體細(xì)胞不可能引出顯著的免疫反應(yīng)。
[0067]在本發(fā)明的另一方面，設(shè)想產(chǎn)生患者特異性內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的生物樣本庫(BioBank)。在一個實(shí)施方案中，產(chǎn)生包含獲自健康個體和/或患者的內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的不同群體的生物樣本庫。本文所用的術(shù)語“生物樣本庫”意指取自不同個體或物種的生物樣品的文庫。標(biāo)本和相關(guān)數(shù)據(jù)的存檔收集預(yù)期用于以研究與血管并發(fā)癥相關(guān)的疾病為目的的研究目的。在另一實(shí)施方案中，該生物樣本庫用于血管再生醫(yī)學(xué)方法。
[0068]在另一方面，本發(fā)明提供包含通過任意前述方法產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞或包含任意前述細(xì)胞群體的治療組合物。優(yōu)選地，該治療組合物還包含生理學(xué)上相容的溶液，包括例如含5%人血清白蛋白的磷酸緩沖鹽溶液。該治療組合物可以用來治療、預(yù)防或穩(wěn)定與血管并發(fā)癥相關(guān)的疾病，例如由2型和I型糖尿病、代謝綜合征、嚴(yán)重肥胖、高膽固醇血癥、高血壓、冠狀動脈疾病、腎病、視網(wǎng)膜病、腎衰竭、組織缺血、慢性缺氧、動脈粥樣硬化及藥物誘發(fā)的毒性引起的組織水腫引起的血管并發(fā)癥，用來在中風(fēng)后恢復(fù)功能，或用作載體來分泌因子進(jìn)入血液。例如，可以通過皮膚活組織檢查來從需要治療的個體或從健康個體獲得成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞或脂肪細(xì)胞，并通過本領(lǐng)域已知的方法重新編程為誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞("Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors." Takahashi 等，2007, Cell 131,861-72)。適合作為誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞的來源的其他體細(xì)胞是獲自血液樣品的白細(xì)胞或獲自尿液樣品的上皮細(xì)胞或其他細(xì)胞。然后通過本文所述的方法使患者特異性誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，收獲，并引入個體來治療病癥。通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞可以用來取代或輔助患病或損傷的組織的正常功能。
[0069]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的生物樣本庫在與血管并發(fā)癥相關(guān)的疾病的療法中的用途。該生物樣本庫優(yōu)選包含獲自患者或具有幾種HLA類型的健康個體的內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞。將獲自健康供體的細(xì)胞移植至需要治療的具有相容HLA類型的個體避免了通常與異源細(xì)胞移植相關(guān)的排斥反應(yīng)的問題。通常，通過施用諸如環(huán)孢菌素的免疫抑制劑或抗排斥藥物來防止或減少排斥。但是，這類藥物具有明顯的不良副作用，例如免疫抑制、致癌特性、腎毒性以及非常昂貴。本發(fā)明消除或至少顯著減少了對諸如環(huán)孢菌素、imulan、FK-506、糖皮質(zhì)類固醇和雷帕霉素及其衍生物的抗排斥藥物的需要。
[0070]關(guān)于本發(fā)明的治療方法，預(yù)期對哺乳動物施用內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞不限于具體的施用方式、劑量或給藥頻率；本發(fā)明考慮所有施用方式，包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intrarticular)、病灶 內(nèi)、皮下或足以提供足以預(yù)防或治療疾病的劑量的任意其他途徑?？梢砸詥蝿┝炕蚨鄤┝繉Σ溉閯游锸┯脙?nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞。在施用多劑量時，劑量可以相互間隔例如一周、一個月、一年或十年?？梢栽谑┯眉?xì)胞之前、期間或之后施用一種或多種生長因子、激素、白細(xì)胞介素、細(xì)胞因子、小分子或其他細(xì)胞，以進(jìn)一步使它們偏向具體的細(xì)胞類型。
[0071 ] 本文所用的術(shù)語“分化的”、“分化”指使分化程度低的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)轶w細(xì)胞，例如使多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檠艽布?xì)胞的一個或多個步驟。通過本文所述的方法來達(dá)到使多能干細(xì)胞分化為血管床細(xì)胞，即分化為內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞。
[0072]本文所用的術(shù)語“干細(xì)胞”指具有自我更新的能力的細(xì)胞。本文所用的“未分化的干細(xì)胞”指具有分化為多種多樣的細(xì)胞類型的能力的干細(xì)胞。如本文所用，本文所用的“多能干細(xì)胞”指產(chǎn)生多種細(xì)胞類型的細(xì)胞的干細(xì)胞。多能干細(xì)胞(PSC)包括人胚胎干細(xì)胞(hESC)和人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(hiPSC)。人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞可以衍生自重新編程的體細(xì)胞，例如通過本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)四種確定的因子(SOX2、0Ct4、Klf4、C-MyC)。該人體細(xì)胞可以獲自健康個體或獲自患者。這些供體細(xì)胞可以容易地從任意適宜的來源獲得。本文優(yōu)選的是允許分離供體細(xì)胞而不存在人體上的侵入性方法的來源，例如人皮膚細(xì)胞、血細(xì)胞或可從尿液樣品獲得的細(xì)胞。雖然優(yōu)選人多能干細(xì)胞，但該方法也可適用于非人多能干細(xì)胞，如靈長類、嚙齒類(例如大鼠、小鼠、兔)和狗多能干細(xì)胞。
[0073]本文所用的“血管床細(xì)胞”是在體內(nèi)形成血管的細(xì)胞。血管由內(nèi)皮細(xì)胞形成的稱為內(nèi)膜層的內(nèi)襯(inner lacer)和平滑肌細(xì)胞形成的稱為中膜的相鄰層組成。血管床細(xì)胞的實(shí)例是內(nèi)皮細(xì)胞(⑶144+)和血管平滑肌細(xì)胞(⑶140b+)。
[0074]本文所用的“內(nèi)皮細(xì)胞”是下述細(xì)胞，其表達(dá)特異性表面標(biāo)記⑶144 (分化群144，也稱為鈣黏著蛋白5,2型或血管內(nèi)皮(VE) 鈣黏著蛋白，官方符號(official symbol)CDH5)，且具有內(nèi)皮細(xì)胞的特征(即毛細(xì)管樣管形成)和選自CD31(分化群31，官方符號PECAM1)、vffF(Von Willebrand 因子，官方符號 VffF)、CD34(分化群 34，官方符號 CD34)、CD105 (分化群105，官方符號ENG)、CD146 (分化群34，官方符號MCAM)和VEGFR-2 (激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(III型受體酪氨酸激酶),官方符號KDR)的一種或多種其他表面標(biāo)記的表達(dá)。
[0075]本文所用的“血管平滑肌細(xì)胞”是下述細(xì)胞，其表達(dá)特異性表面標(biāo)記⑶140b (分化群140b，也稱為TOGF受體β )，且具有血管平滑肌細(xì)胞的特征的細(xì)胞(即收縮和/或分泌功能)和選自SMA( α -平滑肌肌動蛋白)、SM22 α、平滑肌肌球蛋白重鏈、CRBPI和Smemb的一種或多種其他蛋白質(zhì)的表達(dá)。本文所用的“與血管并發(fā)癥相關(guān)的疾病”指由內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管平滑肌細(xì)胞的損傷、激活或功能障礙引起的任意疾病。與血管并發(fā)癥相關(guān)的疾病的實(shí)例是2型和I型糖尿病、代謝綜合征、嚴(yán)重肥胖、高膽固醇血癥、高血壓、冠狀動脈疾病、腎病、視網(wǎng)膜病、腎衰竭、組織缺血、慢性缺氧、動脈粥樣硬化及藥物誘發(fā)的毒性引起的組織水腫。
[0076]附圖簡述
[0077]圖1:用于使人多能干細(xì)胞(PSC)分化為內(nèi)皮細(xì)胞⑶144+的方法的示意圖。第O天:酶促解離人PSC，并用多能培養(yǎng)基(含Υ27631 10 μ M的mTeSR2)中的35000細(xì)胞/cm2的濃度接種在預(yù)包被的基質(zhì)凝膠平板上。第I天:用新鮮激發(fā)培養(yǎng)基(含化合物21(CP21R7)2yi^^N2B27)更換培養(yǎng)`基。第4天:用新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含F(xiàn)orskolin 5μΜ和VEGF-A50ng/ml的StemPro_34)更換培養(yǎng)基。第5天:顯示CD144+內(nèi)皮細(xì)胞，并通過MACS分選用于進(jìn)一步繁殖。
[0078]圖2:a)通過基于圖像的高內(nèi)涵分析(HCA)定量⑶144+干細(xì)胞衍生的內(nèi)皮細(xì)胞。已用不同的小分子在單層條件中分化人胚胎干細(xì)胞。上圖和中圖:第I天，含不同化合物的激發(fā)培養(yǎng)基；第4天，誘導(dǎo)培養(yǎng)基+VEGF-A50ng/ml。載體N2B27單獨(dú)(上圖，左)；Wnt3a 150ng/ml加至激發(fā)培養(yǎng)基(上圖，右)；SB216763 6 μ M加至激發(fā)培養(yǎng)基(中圖，左)；CHIR9902 2μΜ加至激發(fā)培養(yǎng)基(中圖，右)。下圖:第I天，含2 μ M化合物21 (CP21R7)的激發(fā)培養(yǎng)基；第4天，誘導(dǎo)培養(yǎng)基+VEGF-A50ng/ml (下圖，左)；第4天，誘導(dǎo)培養(yǎng)基+VEGF-A50ng/ml+Forskolin 5μΜ(下圖，右)。DAPI (細(xì)胞核)，CD144 (膜染色)。b)定量圖:百分比⑶144+陽性細(xì)胞。
[0079]圖3:多能干細(xì)胞衍生的⑶144+內(nèi)皮細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。在針對⑶144+表達(dá)的MACS分選之前和之后分析了在單層條件(激發(fā)培養(yǎng)基2μ M CP21R7，誘導(dǎo)培養(yǎng)基VEGF-A50ng/ml和Forskolin 5 μ M)中分化的內(nèi)皮細(xì)胞。MACS分選前有32.5% CD 144+內(nèi)皮細(xì)胞，MACS分選后有96.5%⑶144+內(nèi)皮細(xì)胞。
[0080]圖4:血管發(fā)生測定中的管形成。在單層條件(激發(fā)培養(yǎng)基2μ M CP21R7，誘導(dǎo)培養(yǎng)基VEGF-A 50ng/ml和Forskolin 5 μ Μ)中分化hESC和hiPSC，并在MACS分選后在血管發(fā)生測定中測試管形成。具有管結(jié)構(gòu)的孔的覆蓋率:hESC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞為90%，hiPSC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞為80% (定量圖)。管結(jié)構(gòu)的代表性圖片:hESC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞(左側(cè)照片)，hiPSC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞(右側(cè)照片)。
[0081]圖5:分選后單層分化的hPSC衍生內(nèi)皮細(xì)胞的表征。在單層條件(激發(fā)培養(yǎng)基2 μ M CP21R7，誘導(dǎo)培養(yǎng)基 VEGF-A 50ng/ml 和 Forskolin 5 μ M)中分化 hESC 和 hiPSC,并在MACS分選后通過免疫細(xì)胞化學(xué)分析和流式細(xì)胞術(shù)分析來測試內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31、vffF,CD144、VEGFR-2 (KDR)的表達(dá)。定量圖:hESC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞(黑條)，hiPSC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞(黑白條)。⑶31/vWF/DAPI免疫細(xì)胞化學(xué)代表性圖片:hiPSC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞(左側(cè)照片)，hESC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞(右側(cè)照片)。
[0082]圖6:B10和CP21R7使hESC分化為內(nèi)皮細(xì)胞CD144+的直接比較。在第I天用不同濃度(O μ Μ、0.5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ)的ΒΙΟ或化合物21 (CP21R7)作為載體培養(yǎng)基Ν2Β27的補(bǔ)充劑，然后在第4天將誘導(dǎo)培養(yǎng)基VEGF-A 50ng/ml和Forskolin 5 μ M用于所有條件，在單層條件中平行分化hESC。使用0.5μ M的B10，我們可以達(dá)到⑶144的最大表達(dá)(5%)，其他濃度對細(xì)胞有毒性。CP21R7在所測試的濃度下顯示關(guān)于⑶144表達(dá)(至多35% )和任意毒性的明顯的劑量反應(yīng)。
[0083]圖7:冷藏的PSC衍生內(nèi)皮細(xì)胞的生存力。在針對⑶144表達(dá)的MACS分選后第5天冷藏lxl06hESC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞。融化后8xl05hESC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞(總冷凍細(xì)胞數(shù)的80% )是活的。
[0084]圖8:內(nèi)皮細(xì)胞分化方法的重復(fù)性。在第6天流式細(xì)胞術(shù)定量⑶144+干細(xì)胞衍生的內(nèi)皮細(xì)胞。分化了兩個人胚胎干細(xì)胞系(來自Cellartis的SAOOl和SA167)和兩個誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞系(SBI System bioscience 和 Life technologies),產(chǎn)生 60%至 80%CD144+內(nèi)皮細(xì)胞之間的平均效率。
[0085]圖9:標(biāo)記 0ct4 (多能性)、Brachyury/T (全中胚層(pan-mesoderm))、CD31 和CD144(內(nèi)皮細(xì)胞)在整個分化時程中的表達(dá)分析。多能干細(xì)胞通過丟失0ct4(白條)并獲得Brachyury/T(灰條)表達(dá)來在激發(fā)培養(yǎng)基(第2_4天)中分化為中胚層祖細(xì)胞。在用EC誘導(dǎo)培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基時(第4天時)，中胚層祖細(xì)胞進(jìn)一步分化為上調(diào)CD31 (深灰條)和CD144(黑條)表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞。通過全基因組表達(dá)譜分析確認(rèn)了這些發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯不)O
[0086]圖10:分化方法第5天，內(nèi)皮細(xì)胞特異性(CD31)和血管平滑肌細(xì)胞特異性(⑶140b)標(biāo)記表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。此處顯示先用激發(fā)培養(yǎng)基，然后用EC誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含 VEGF 200ng/ml 和 Forskolin 2 μ M 的 StemPro-34)或 VCMC 誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含 10%敲除血清替代品的RPMI)分化的細(xì)胞的EC(黑條)和VSMC(灰條)的比例。可以通過微調(diào)分化系統(tǒng)來調(diào)節(jié)EC和VSMC的比例，其允許將譜系定型轉(zhuǎn)換為主要分化為內(nèi)皮細(xì)胞(~70% )或血管平滑肌細(xì)胞(~90% )。 [0087]圖11:用于使人多能干細(xì)胞(PSC)分化為內(nèi)皮細(xì)胞(A)或分化為血管平滑肌細(xì)胞(B)的方法的示意圖。從第O天直至第4天，用于兩種靶細(xì)胞的流程相同。第O天:酶促解離人PSC，并用多能培養(yǎng)基(含Υ2763110μΜ的TeSR2)中的35000細(xì)胞/cm2的濃度接種在預(yù)包被的基質(zhì)凝膠板上。第I天:用新鮮激發(fā)培養(yǎng)基(含化合物21 (CP21R7) I μ M和重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP4)25ng/ml的N2B27)更換培養(yǎng)基。A)第4天:用用于內(nèi)皮細(xì)胞的新鮮EC誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含F(xiàn)orskolin 2 μ M和200ng/mlVEGF的StemPro-34)更換培養(yǎng)基。在第6天，通過MAC制備來純化內(nèi)皮細(xì)胞(CD144+)。將分選的內(nèi)皮細(xì)胞接種在預(yù)包被的纖連蛋白板上，并維持在EC繁殖培養(yǎng)基(含50ng/ml VEGF的StemPro-34)中。B)第4天，用用于血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的新鮮VSMC誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%敲除血清替代品的RPMI)更換培養(yǎng)基。在第6天，酶促解離細(xì)胞，并在VSMC繁殖培養(yǎng)基(含EGF 10ng/ml和FGF2 IOng/ml的RPMI)中接種在預(yù)包被的纖連蛋白板上。
[0088]圖12:SC衍生的EC的表征。培養(yǎng)MACS純化的⑶144+細(xì)胞直至匯合，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析。細(xì)胞具有總體內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)模式:⑶31、⑶34、⑶105、⑶144、⑶146、KDR、vffF (von-ffiIIebrand因子)為陽性，造血系標(biāo)記CD43和CD45為陰性。[0089]圖13:血管床細(xì)胞的細(xì)胞相互作用測定。在管形成測定中共培養(yǎng)原代人腦周細(xì)胞(血管平滑肌細(xì)胞)和干細(xì)胞衍生的內(nèi)皮細(xì)胞。周細(xì)胞與SC衍生的EC形成的管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合。接種的周細(xì)胞數(shù)目的94%排列或包裹在SC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞周圍(定量圖)。
[0090]圖14:乙?；兔芏戎鞍?Ac-LDL)的細(xì)胞攝取測定。通過使用熒光體綴合的C(AlexaFluor594-Alexa Fluor 594)來監(jiān)測內(nèi)化作用。孵育后，98%的SC衍生的EC從生長培養(yǎng)基內(nèi)化熒光體綴合的Ac-LDL (定量圖)。
[0091]圖15:促炎癥細(xì)胞因子反應(yīng)測定。施用促炎癥細(xì)胞因子時，SC衍生的EC上調(diào)諸如ICAMl和E-選擇蛋白的黏附分子的表達(dá)。用基于細(xì)胞的ELISA來測量SC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)InM TNF α的激活。ICAMl和E-選擇蛋白都顯著上調(diào)(定量圖)。
[0092]圖16:白細(xì)胞-內(nèi)皮黏附測定。激活的內(nèi)皮細(xì)胞呈遞黏附分子用于招募白細(xì)胞。通過將鈣熒光素染色的HL60細(xì)胞與SC衍生的EC共培養(yǎng)來研究對InM TNFa的響應(yīng)。通過測量熒光強(qiáng)度來定量HL60細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。在用TNF-a刺激SC衍生的EC時，HL60白細(xì)胞的招募顯著增強(qiáng)(定量圖)。
[0093]圖17:劃痕測定。在遷移/創(chuàng)傷愈合中確定SC衍生的VSMC的壁細(xì)胞特性。隨著時間的推移，SC衍生的VCMC作為游離單細(xì)胞擴(kuò)展入創(chuàng)傷邊緣(照片圖)。在四個不同點(diǎn)(0、6、24和30小時)測量劃痕寬度，用平均值來測定劃痕封閉(定量圖)。
[0094]圖18:GSK3 β抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0095]圖19:化合物選擇。人PA-1報道細(xì)胞中的TCF/LEF報道分子測定(DeAlmeida等，2007)。按所示濃度用GSk3抑制劑處理報道(分子)細(xì)胞后，將β -聯(lián)蛋白介導(dǎo)的TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性測量為熒光素酶活性。化合物Cp21R7在3 μ M的濃度下誘導(dǎo)最高的熒光素酶活性。
[0096]材料和方法
[0097]細(xì)胞培養(yǎng):
[0098]多能培養(yǎng)基:補(bǔ)充Υ27632 ROCK激酶抑制劑(市售，例如來自Tocris bioscience的目錄號1254)的TeSR2。
[0099]激發(fā)培養(yǎng)基:補(bǔ)充化合物21(CP21R7)(基于吡咯烷二酮的GSK3抑制劑)的N2B27 (N2B27 是補(bǔ)充 N2 和 B27( 二者都來自 Gibco)的 DMEM/F12 (Gibco, Paisley, UK)的I: I混合物)。
[0100]CP21R7:3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮(本文中也稱為“化合物 21” ；見例如 L.Gong 等；Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters20(2010)，1693-1696)。
[0101]內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基:補(bǔ)充Forskolin和VEGF-A的StemPro-34SFM(Invitrogen)。
[0102]內(nèi)皮細(xì)胞繁殖培養(yǎng)基:補(bǔ)充VEGF-A的StemPro-34(Invitrogen)。
[0103]VSMC誘導(dǎo)培養(yǎng)基:補(bǔ)充10 %敲除血清替代品(Invitrogen)的RPMI培養(yǎng)基1640 (Invitrogen)。
[0104]VSMC繁殖培養(yǎng)基: 補(bǔ)充10%敲除血清替代品(Invitrogen)及EGF和FGF-2的RPMI 培養(yǎng)基 1640 (Invitrogen)。
[0105]人ESC:SA00U LOT CAOOl 于 2001 年 3 月 20 日在 G5teborg University 和Cellartis AB Arvid Wallgrens Backe20, SE-413 46 Goteborg, SWEDEN 分離，符合瑞典所有適用的法律，并由GSteborg University和Uppsala University的地方研究倫理委員會批準(zhǔn)。胚胎來源:冷凍，來自IVF的剩余。供體保密性:為了保護(hù)供體的隱私和機(jī)密，去除了與供體相關(guān)的所有標(biāo)識。因此，沒有關(guān)于供體的信息可用。尤其是，捐獻(xiàn)未給供體帶來任何經(jīng)濟(jì)收益。
[0106]人iPSC:來自 SBI System Biosciences 的目錄號 SClOlA-1 批號 110218-FF/來自 Life technologies Gibco ? Episomal hiPSC Line 的目錄號 A13777。
[0107]從hESC衍生人血管床細(xì)胞。我們有研究hESC和衍生不同細(xì)胞系(如血管床細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)的批準(zhǔn)。負(fù)責(zé)的倫理委員會(Ethikkommission beiderBasel)和聯(lián)邦公共健康辦公室已批準(zhǔn)了我們的研究項(xiàng)目。(Ref-No:R-FP-S-l-0002-0000)。
[0108]流程:
[0109]人多能干細(xì)胞在TeSR2培養(yǎng)基(Stem cell Technologies)中常規(guī)培養(yǎng)在 hESC-qualified Matrigel(BD Bioscience)上。每 4-6 天用 StemProAccutase (Invitrogen)傳代培養(yǎng)物。為了提高生存力，在酶促解離前一小時用10 μ M ROCK抑制劑補(bǔ)充TeSR2培養(yǎng)基。
[0110]1.用于使多能干細(xì)胞分化為血管床細(xì)胞的方法
[0111](i)PSC 的附著和激發(fā):在用 StemPro Accutase (Invitrogen)酶促解離 hPSC 集落前，用10 μ M ROCK抑制劑Υ27632預(yù)孵育細(xì)胞一小時。將35.000單hPSC/cm2在補(bǔ)充10 μ MROCK抑制劑的TeSR2培養(yǎng)基中接種在生長因子降低的Matrigel (BD bioscience)包被細(xì)胞培養(yǎng)板上。在第I天，將附著培養(yǎng)基換為補(bǔ)充(a) 2 μ M化合物21 (CP21R7)或(b) I μ M化合物 21(CP21R7)和 25ng/ml BMP4 (R&D Systems)的 N2B27 (Gibco)培養(yǎng)基。再培養(yǎng)細(xì)胞 3 天而不更換培養(yǎng)基。
[0112](ii)誘導(dǎo)EC:在第 4天,用補(bǔ)充(a) 50ng/ml VEGF和 5 μ M Forskolin或(b) 200ng/ml VEGF 和 2 μ M Forskolin 的 StemPro-34 SFM 培養(yǎng)基(Invitrogen)更換激發(fā)培養(yǎng)基。在第5天，棄除誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用細(xì)胞進(jìn)行CD144+細(xì)胞的MACS分離。
[0113]2.MACS 純化
[0114]在整個流程過程中，細(xì)胞保持冷卻，并使用預(yù)冷的溶液。棄除培養(yǎng)基后，用5mlPBS (無 Ca2+和 Mg2+)洗漆細(xì)胞。然后，在 3ml 預(yù)溫的 StemPro Accutase (Invitrogen)中 37°C孵育細(xì)胞2-4分鐘。通過輕輕吹吸來將細(xì)胞重懸在3ml StemPro-34培養(yǎng)基(Invitrogen)中。通過用錐蟲藍(lán)對染來測定細(xì)胞數(shù)目和生存力。
[0115]然后1000轉(zhuǎn)/分鐘離心細(xì)胞4分鐘。將細(xì)胞重懸在MACS緩沖液(含0.5%BSA+2mMEDTA 的 PBS)中，每 IxlO6 個細(xì)胞加入 20 μ I a -CD144-PE 抗體(BD bioscience)，并在 4°C孵育15分鐘。加入8ml StemPro-34培養(yǎng)基后，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心細(xì)胞4分鐘。將細(xì)胞沉淀重懸在MACS緩沖液(含0.5% BSA+2mM EDTA的PBS)中，每IxlO7個細(xì)胞加入100 μ I抗-PEMicrobeads (Miltenyie Biotech),并在4°C孵育 15 分鐘。然后，加入8ml StemPro-34培養(yǎng)基，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心細(xì)胞4分鐘。將細(xì)胞重懸在StemPro-34培養(yǎng)基LS中(至多l(xiāng)xl07/ml),并過濾細(xì)胞懸液。然后，用預(yù)分離濾器30ym(Miltenyi Biotech)過濾懸液。通過用3ml StemPro-34培養(yǎng)基漂洗來準(zhǔn)備LS柱(Miltenyi Biotech)。將過濾的細(xì)胞懸液加至柱上(約IxlO7細(xì)胞/柱)，用3ml StemPro-34培養(yǎng)基洗漆柱三次。用5ml StemPro-34培養(yǎng)基+50ng/ml VEGF(Preprotech)洗脫細(xì)胞。將細(xì)胞接種在人纖連蛋白(BD Bioscience)包被的組織培養(yǎng)皿上。
[0116]圖2顯示⑶144陽性的干細(xì)胞衍生內(nèi)皮細(xì)胞的定量，在第I天向激發(fā)培養(yǎng)基中加入不同的小分子；并在第4天換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基+VEGF-A 50ng/ml。對于激發(fā)培養(yǎng)基N2B27單獨(dú)，0.5%的核區(qū)面積為⑶144陽性；Wnt3a 150ng/ml加至激發(fā)培養(yǎng)基產(chǎn)生0.8%⑶144+細(xì)胞；SB216763 6 μ M加至激發(fā)培養(yǎng)基產(chǎn)生0.5% CD144+細(xì)胞；2 μ M的CHIR 9902加至激發(fā)培養(yǎng)基產(chǎn)生14.6%⑶144+細(xì)胞；2μΜ化合物21(CP21R7)加至激發(fā)培養(yǎng)基產(chǎn)生40.2%⑶144+細(xì)胞；2 μ M化合物21 (CP21R7)加至激發(fā)培養(yǎng)基，外加Forskolin 5 μ M加至誘導(dǎo)培養(yǎng)基第4天誘導(dǎo)培養(yǎng)基+VEGF-A 50ng/ml (下圖，左)和第4天誘導(dǎo)培養(yǎng)基產(chǎn)生54.6%CD144+細(xì)胞。
[0117]圖4顯示從hESC和hiPSC分化的細(xì)胞能夠形成毛細(xì)管樣管結(jié)構(gòu)(hESC衍生:90%/hiPSC 衍生:80% ) 。
[0118]圖5顯示從hESC和hiPSC分化的細(xì)胞為CD31、vWF、CD144、VEGFR_2陽性，因此是合格的內(nèi)皮細(xì)胞。
[0119]圖6顯示現(xiàn)有技術(shù)方法(Tatsumi等)和本發(fā)明的方法的比較。Tatsumi等的方法利用不同濃度的BIO抑制劑作為N2B27的補(bǔ)充劑。雖然Tatsumi等描述了多能干細(xì)胞以約20%的效率(通過表達(dá)表面標(biāo)記CD144的內(nèi)皮細(xì)胞來測定)分化為內(nèi)皮細(xì)胞，但我們未能重復(fù)這類結(jié)果。此外，在I μ M的濃度下就已經(jīng)觀察到BIO抑制劑的強(qiáng)烈細(xì)胞毒性。
[0120]25ng/ml BMP4 與 I μ M CP—起補(bǔ)充激發(fā)步驟(ii)及 200ng/ml VEGF 與 2 μ MForskolin—起補(bǔ)充誘導(dǎo)步驟(iii)的連續(xù)補(bǔ)充在第6天在至多85 %的細(xì)胞中快速誘導(dǎo)CD144表達(dá)。在不同的人ESC和iPSC細(xì)胞系中觀察了分化流程的總體可靠性和重復(fù)性(圖8)。
[0121]衍生高功能性內(nèi)皮細(xì)胞用于藥物發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目和臨床應(yīng)用需要大量質(zhì)量受控的細(xì)胞群體。為了解決這一點(diǎn)，用磁激活細(xì)胞分選(MACS)來將細(xì)胞分離為CD144+和00144_細(xì)胞級分。使用為高度嚴(yán)格分離陽性標(biāo)記細(xì)胞設(shè)計的分離設(shè)定，達(dá)到了大于95% CD144+細(xì)胞的純度(圖20)。
[0122]3.冷藏流程:
[0123]將IxlO6個細(xì)胞懸浮在Iml冷藏培養(yǎng)基(90% FBS和10% DMS0)中，并轉(zhuǎn)移至凍存管。將凍存管放入Nalgene Cryo 1°C Freezing Container,以在保存于_80°C時達(dá)到-1°C /分鐘的冷卻速度。將冷凍容器于-80°c保存24小時。為了長期保存，隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入液氮。
[0124]圖7顯示融化后8xl05個(總冷凍細(xì)胞數(shù)的80% )冷藏的PSC衍生EC是活的。絕大部分融化的細(xì)胞過夜附著至纖連蛋白包被的平皿，并在第二天貼壁生長。觀察到非常少的漂浮(死)細(xì)胞。就內(nèi)皮特異性標(biāo)記表達(dá)(⑶31、⑶34、⑶144、KDR)而言，保持了冷凍保持的PSC-EC的純度和同一性。
[0125]表1:用于使多能干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法的重復(fù)性。
、 ^ hPSC數(shù)目MACS分選后的EC純度 買驗(yàn)日期
__第O天第5天__CD144+細(xì)胞
[0126]02.03.2011 3xl06 細(xì)胞2.4xl06 細(xì)胞 97%
18.04.20113xl06 細(xì)胞2,6xl06 細(xì)胞 85%
27.05.20113xl06 細(xì)胞1.9xl06 細(xì)胞 97%`[0127]4.通過GSK3 0的藥理學(xué)抑制誘導(dǎo)內(nèi)皮
[0128]評價了最廣泛使用的市售GSK3 β抑制劑和CP21R7在人PA-1報道細(xì)胞(DeAlmeida等,2007)中激活β聯(lián)蛋白介導(dǎo)的TCF/LEF轉(zhuǎn)錄的潛能。所用的化合物顯示在圖18中。劑量反應(yīng)測定揭示，所有最有效的GSK3抑制劑(即CP21R7 (CP)、6_溴靛玉紅-3'-肟(BIO)、CB36155和CHIR-99021 (CHIR))都顯示陡峭的激活曲線，表明協(xié)同結(jié)合(圖19)。用未修飾的PA-1細(xì)胞來通過ATP水平測量細(xì)胞生存力，GL1-熒光素酶反應(yīng)性報道PA-1細(xì)胞作為計數(shù)網(wǎng)線(counter screen)來監(jiān)測一般轉(zhuǎn)錄活性的變化?？傮w上,所分析的Gsk3i3抑制劑顯示一般轉(zhuǎn)錄活性的不顯著上升(數(shù)據(jù)未顯示)。用BIO處理觀察到了 GLI介導(dǎo)的熒光素酶活性提高三倍，BIO在10 μ M的濃度下具有高毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。CB361549和CB361556 (MeBIO)以及Forskolin (陰性對照)未誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)。CP的濃度依賴性施用顯示在3 μ M下具有最高熒光素酶活性的鐘狀曲線。最大提高566倍的熒光素酶活性僅伴隨著細(xì)胞增殖的適度增加和一般轉(zhuǎn)錄活性的較小提高。前述GSK3 3抑制劑SB216763的濃度依賴性施用導(dǎo)致微弱的β -聯(lián)蛋白介導(dǎo)的TCF/LEF熒光素酶表達(dá)。根據(jù)β_聯(lián)蛋白報道測定的結(jié)果，針對它們驅(qū)動人PSC的血管譜系定型的潛能，開發(fā)了三種GSk3i3抑制劑(即B10、CHIR和CP)。除所列的抑制劑外，由于其與CP的結(jié)構(gòu)相似性，我們還包括了 SB216763(SB)(見圖18)。按上文I (i)和(ii)下所列將多能干細(xì)胞⑴作為單細(xì)胞接種在補(bǔ)充了 Rho激酶抑制劑Y-27632 (Watanabe等，2007)的mTeSRl培養(yǎng)基上；(ii)在激發(fā)培養(yǎng)基(補(bǔ)充了 GSK30抑制劑的N2B27培養(yǎng)基)中孵育；和(iii)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(補(bǔ)充了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF ;Sumi等，2008)的StemPro SFM34培養(yǎng)基)中孵育。
[0129]使用了以下GSK3抑制劑:
[0130]CHIR99021 GSK3 抑制劑:來自 Merck Millipore 的目錄號 361559
[0131]SB216763 GSK3 抑制劑:來自 Merck Millipore 的目錄號 361566
[0132]BIO GSK3 抑制劑:來自 Merck Millipore 的目錄號 3 361550
[0133]CP21R7:3_ (3_ 氨基-苯基)_4_ (1-甲基 _1Η_ 吲哚 _3_ 基)-吡咯-2，5_—酮(本文中也稱為“化合物 21” ；見例如 L.Gong 等；Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters20(2010)，1693-1696)。
[0134]在第5天檢測到增殖為血管床細(xì)胞。通過血管內(nèi)皮-鈣黏著蛋白(VE-鈣黏著蛋白)的表達(dá)來確認(rèn)血管身份。通過第5天的VE-鈣黏著蛋白(⑶144)表達(dá)來測定誘導(dǎo)血管床細(xì)胞的能力(圖19)。流式細(xì)胞術(shù)分析將CP鑒定為最有效的GSK3 0抑制劑。濃度依賴性處理產(chǎn)生具有陡峭斜率的鐘形曲線，確認(rèn)了之前TCF/LEF熒光素酶報道測定的發(fā)現(xiàn)。顯著地，高達(dá)35%的細(xì)胞在I μΜ的最適濃度下從第5天起表達(dá)⑶144。小化合物BIO似乎對單細(xì)胞具有毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。比CP具有更多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)的CHIR也以拋物線曲線誘導(dǎo)⑶144表達(dá)，在6 μ M達(dá)到最佳。與TCF/LEF熒光素酶報道測定一致，對分化平臺施用SB后未觀察到CD144表達(dá)(圖19)。雖然SB和CP共有相同的化學(xué)主鏈，但多樣的部分可以影響化學(xué)性質(zhì)，例如細(xì)胞通透性或可溶性。在載體處理的細(xì)胞中，未檢測到VE-鈣黏著蛋白表達(dá)(圖19)。
[0135]5.分化動態(tài)
[0136]WNT/β -鈣黏著蛋白信號發(fā)放是誘導(dǎo)原始條紋形成的根本(Tam和Loebel，2007)。由于此原因，分析了中胚層祖細(xì)胞的暫時出現(xiàn)。
[0137]基因組范圍的基因表達(dá)分析揭示，組合CP和ΒΜΡ4處理24小時時，諸如NAN0G、UTFl和S0X2的多能性標(biāo)記下調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)。代表性標(biāo)記MIXLl、T/BRACHYURY、FGF4和EOMES的上調(diào)表明，細(xì)胞譜系決定在相同的時間范圍內(nèi)指向中胚層。在分化過程中，我們未觀察到與神經(jīng)外胚層和內(nèi)胚層匹配的標(biāo)記的提高的基因表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)?；騍0X17(起始內(nèi)胚層形成的標(biāo)記)從第5天起高表達(dá)。此發(fā)現(xiàn)與發(fā)育和成體脈管系統(tǒng)中S0X17的體內(nèi)表達(dá)模式一致(Engert等，2009)。未觀察到譜系定型為滋養(yǎng)外胚層或內(nèi)臟內(nèi)胚層，因?yàn)槲礄z測到諸如ESXl和S0X7的相關(guān)基因(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0138]S0X17、0CT4、T-BRACHYURY、PECAM-1和VE-鈣黏著蛋白的免疫染色支持轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(定量顯示在圖9中)。全中胚層標(biāo)記T-BRACHYURY的蛋白質(zhì)表達(dá)確認(rèn)了中間PS樣細(xì)胞階段。CP和BMP4處理在一天后快速誘導(dǎo)T-BRACHYURY表達(dá)。絕大多數(shù)細(xì)胞在第3天達(dá)到T-BRACHYURY峰值表達(dá)。在第4天，表達(dá)降低并消失，從而模擬其特異性胚胎表達(dá)模式(Tam和Loebel，2007)。通過0CT4表達(dá)的時間依賴性下降來監(jiān)測多能性的喪失。CP21單獨(dú)對GSK3 β的藥理學(xué)抑制使PSC在第3天分化為鹽和胡椒染色模式的S0X17+細(xì)胞；而CP和ΒΜΡ4的組合應(yīng)用阻止了內(nèi)胚層S0X17+細(xì)胞的出現(xiàn)(圖9)。通過血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1 (PECAMl)和VE-鈣黏著蛋白的共表達(dá)來測定內(nèi)皮細(xì)胞身份的誘導(dǎo)。施用VEGF時在第4天檢測到內(nèi)皮標(biāo)記表達(dá)(圖9)。通過內(nèi)皮標(biāo)記⑶34、PECAMl、⑶Η5和vWF (其分別通過VEGF在前24小時內(nèi)上調(diào)了超過100倍)的轉(zhuǎn)錄組分析完成了此發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。我們的分化系統(tǒng)使得能夠通過原始條紋細(xì)胞的瞬時出現(xiàn)在5天內(nèi)高通量衍生內(nèi)皮細(xì)胞。
[0139]6.用于使PSC分化為VSMC的流程
[0140]在使用上述分化流程時，在將未分選的細(xì)胞轉(zhuǎn)入補(bǔ)充VEGF的StemPro培養(yǎng)基后出現(xiàn)兩種不同的細(xì)胞群體。細(xì)胞類型因形態(tài)以及標(biāo)記表達(dá)而不同。具有緊密的細(xì)胞間接觸的鵝卵石樣細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮特異性標(biāo)記VE-鈣黏著蛋白。扁平和紡錘樣形狀的細(xì)胞平滑肌肌動蛋白(aSMA)染色為陽性，表明血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)身份。在流式細(xì)胞術(shù)分析中，細(xì)胞分離為⑶31+/⑶140_細(xì)胞的主要級分和⑶31_/⑶140b+細(xì)胞的次要級分(圖10)。[0141]用含0.5 μ M IWR(ffnt反應(yīng)化合物I的抑制劑)的RPMI培養(yǎng)基更換步驟(ii)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基導(dǎo)致⑶31+/⑶140b-和⑶317⑶140b+細(xì)胞的顛倒分布。
[0142]修改的分化系統(tǒng)在高達(dá)90%的細(xì)胞中誘導(dǎo)TOGFRP表達(dá)。SM22a和a SMA的免疫染色確認(rèn)了⑶317⑶140b+細(xì)胞的VSMC身份(圖10)。
[0143]使用此新流程，現(xiàn)在可能主要誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞。不同流程的總結(jié)顯示在圖11中。
[0144]MACS純化的⑶144+細(xì)胞的進(jìn)一步表征核準(zhǔn)內(nèi)皮表型。⑶144+細(xì)胞具有均一的鵝卵石樣形態(tài)，且存在內(nèi)皮特異性表達(dá)模式；⑶31、⑶34、⑶105、⑶146、KDR、PECAMl、VE-鈣黏著蛋白、vffF (von-ffi I Iebrand因子)、ZOl (緊密連合I)為陽性，造血系標(biāo)記CD43和CD45為陰性(圖12)。干細(xì)胞衍生的EC (SC衍生的EC)仍具有至少高達(dá)5代的增殖能力，且IDl和c-Kit染色為陽性，表明細(xì)胞的前體狀態(tài)(數(shù)據(jù)未顯示)。培養(yǎng)CD144+純化的細(xì)胞直至匯合，然后冷藏。干細(xì)胞衍生的內(nèi)皮細(xì)胞庫順應(yīng)藥物發(fā)現(xiàn)活動所需的高通量方法。 [0145]7.干細(xì)胞衍生的血管床細(xì)胞的功能表征
[0146]Ac-LDL 攝取:在含有 2.5 μ g/mL 來自 Molecular Probes/Invitrogen 的 AlexaFluor 594乙?；兔芏戎鞍?AlexaFluor594-Ac_LDL)的培養(yǎng)基中37°C孵育細(xì)胞4小時。孵育后，洗滌細(xì)胞，并用4% PFA固定10分鐘。用熒光顯微鏡顯示Alexaf lor594-Ac-LDL的摻入。
[0147]周細(xì)胞結(jié)合測定:人腦血管周細(xì)胞(HBVP)購自ScienCell ResearchLaboratories ο 將 HBVP 培養(yǎng)在周細(xì)胞培養(yǎng)基(ScienCell Research Laboratories)中。對于功能性管形成和結(jié)合測定，用來自AMS biotechnology的體外血管發(fā)生試劑盒培養(yǎng)SC-EC和HBVP。剛好在接種用于功能性測定之前，按廠家的說明用來自Invitrogen的CellTracker染料將HBVP染為紅色，SC-EC染為綠色。對于功能測定，將同等數(shù)目(2xl04/cm2)的兩種細(xì)胞類型培養(yǎng)在EC繁殖培養(yǎng)基(含VEGF的StemPro-34)中。
[0148]基于細(xì)胞的ELISA流程:將20000個干細(xì)胞衍生的內(nèi)皮細(xì)胞/孔接種在96孔板上，并在EGM-2培養(yǎng)基(Lonza)中培養(yǎng)2天，直至匯合。用補(bǔ)充InM TNFa (R&D Systems)的EGM-2培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。孵育24小時后，用PBS短暫洗滌SC衍生的EC，并用PFA固定。人抗-1CAM和抗-E-選擇蛋白的一抗購自R&D Systems。抗-小鼠IgG/生物素化(Amersham)作為二抗，并使用鏈霉抗生物素蛋白/過氧化物酶復(fù)合物(Amersham)。在酶標(biāo)儀中定量發(fā)光。
[0149]白細(xì)胞黏附測定:將2xl04個干細(xì)胞衍生的內(nèi)皮細(xì)胞/孔接種在96孔板上，并在EGM-2培養(yǎng)基(Lonza)中培養(yǎng)2天，直至匯合。用補(bǔ)充InM TNFa (R&D Systems)的EGM-2培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。TNFa刺激SC衍生的EC4小時。然后，向每個96孔加入1.5x10s鈣熒光素標(biāo)記的HL60細(xì)胞。孵育一小時后，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌Sc-EC。用1% NP-40去垢劑溶液裂解平板15分鐘。將上清轉(zhuǎn)入optiplate中，并在酶標(biāo)儀中測量熒光。
[0150]HL60 白細(xì)胞(Collins 等，1977 ；Nature, 270, 347)培養(yǎng)在含 10% FCS 的 RPM1-1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中。
[0151]為了更深刻地限定內(nèi)皮表型，評估了血管發(fā)生潛能、攝取DiI乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL)的能力，并監(jiān)測了屏障功能的動態(tài)調(diào)節(jié)。對于管形成測定，將SC衍生的EC接種在Matrigel基質(zhì)上。[0152]SC衍生的EC快速形成與參考內(nèi)皮細(xì)胞具有相似模式的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)(數(shù)據(jù)未顯示)O
[0153]諸如蘿卜硫素和抗-VEGF單克隆抗體的血管發(fā)生抑制劑的處理擾亂管形成，并減少結(jié)節(jié)的數(shù)目以及管的長度(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣地，SC衍生的EC與壁的細(xì)胞相互作用將它們自身排列在高度有組織的管樣結(jié)構(gòu)中。
[0154]人腦血管周細(xì)胞(HBVP)主要與促成管狀結(jié)構(gòu)的SC衍生EC結(jié)合。HBVP細(xì)胞似乎通過將它們的胞體纏繞在管周圍來包封SC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞(圖13)。HBVP單獨(dú)不能在Matrigel基質(zhì)上形成管狀結(jié)構(gòu)。指導(dǎo)血管壁細(xì)胞的管形成需要存在SC衍生的EC或加入血小板衍生生長因子(TOGF)(數(shù)據(jù)未顯示)。用SC衍生的VSMC作為壁細(xì)胞來源時觀察到了相似的自排列(數(shù)據(jù)未顯示)。還在遷移/創(chuàng)傷愈合測定中確定了 SC衍生的VSMC的壁細(xì)胞特性，其中SC衍生的VCMC作為單細(xì)胞擴(kuò)展入創(chuàng)傷邊緣(Gottlieb和Spector，1981)(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0155]用xCeLLigence RT-CA 系統(tǒng)(Atienza 等，2006 ；Solly 等，2004)測量了單層形成和凝血酶誘導(dǎo)的通透性及隨后的屏障恢復(fù)的動態(tài)監(jiān)測。該系統(tǒng)提供了 SC衍生的EC的密度依賴性增殖和生存力的無標(biāo)記實(shí)時監(jiān)測。EC與微電極的相互作用導(dǎo)致與細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)以及細(xì)胞附著的緊密度成比例的阻抗變化(Atienza等，2006)。我們的數(shù)據(jù)顯示，對數(shù)生長期后，SC衍生的EC達(dá)到平臺，它們可以維持該平臺幾天而無大的波動(數(shù)據(jù)未顯示)。最初的附著、展開和增殖后，SC衍生的EC通過VE-鈣黏著蛋白及其他緊密/黏著連接蛋白以動態(tài)方式彼此相互作用來達(dá)到緊密的單層(數(shù)據(jù)未顯示)。觀察到的SC衍生的EC對血管活性劑凝血酶的快速和可逆的作用伴隨著細(xì)胞隆起和內(nèi)皮間縫隙形成(數(shù)據(jù)未顯示)。凝血酶刺激內(nèi)皮細(xì)胞引起VE-鈣黏著蛋白和相關(guān)聯(lián)蛋白的瞬時改變(Marie-Jodphe等，1996)，導(dǎo)致通透性特性的可逆破壞(數(shù)據(jù)未顯示)。除形成管樣結(jié)構(gòu)和緊密單層外，SC衍生的EC從生長培養(yǎng)基攝取Di1-Ac-LDL (圖14)。總體上，SC衍生的EC在所進(jìn)行的體外測定中顯示內(nèi)皮樣功能性。
[0156]8.SC衍生的EC功能性應(yīng)答促炎癥細(xì)胞因子
[0157]響應(yīng)促炎癥刺激，EC表達(dá)包括胞內(nèi)黏附分子-1 (ICAMl)和E-選擇蛋白的細(xì)胞黏附分子(CAM)。激活的EC使得能夠通過CAM捕獲白細(xì)胞并將它們拴在炎癥部位(Rao等，2007 ；Galkina等，2007)。血管炎癥在動脈粥樣硬化斑塊形成的起始和進(jìn)展中發(fā)揮中心作用(Losis，2000)。
[0158]為了確定該分化系統(tǒng)是否確實(shí)產(chǎn)生EC，我們用促炎癥細(xì)胞因子攻擊SC衍生的EC，并分析免疫細(xì)胞遷移的效應(yīng)物的激活表達(dá)。免疫熒光分析清楚地顯示，TNF-α處理時ICAMl的表達(dá)提高(圖15)。我們進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)了 TNF-α以及IL-1 β刺激時ICAMl和E-選擇蛋白的存在(圖16)。HLA-ABC表達(dá)作為對照來分析對促炎癥細(xì)胞因子的一般及細(xì)胞類型非特異性應(yīng)答。我們還進(jìn)行了基于細(xì)胞的ELISA來測量ICAMl和E-選擇蛋白在對TNF-α的劑量響應(yīng)中的激活。SC衍生的EC以與原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC ;數(shù)據(jù)未顯示)相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平呈遞ICAMl和E-選擇蛋白。我們隨后用與HL60白細(xì)胞共培養(yǎng)的SC衍生的EC來考查激活的SC衍生的EC的黏附分子是否顯示生物學(xué)功能。結(jié)果表明，在用TNF-a刺激SC衍生的EC時， HL60白細(xì)胞的黏附顯著增強(qiáng)(圖16)。為了評估該黏附是否是特異性介導(dǎo)的，我們用抗-1CAM單克隆抗體共處理SC-EC。實(shí)際上，ICAMl的抑制可以以依賴濃度的方式阻止HL60的黏附(圖16)。我們用HUVEC進(jìn)行了靜態(tài)黏附測定來將HL60白細(xì)胞黏附確認(rèn)為內(nèi)皮特異性特性，其可以通過抗-1CAMl抗體處理來抑制(數(shù)據(jù)未顯不)O
[0159]劃痕測定:培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的血管平滑肌細(xì)胞(SC衍生的VSMC)直至匯合。用200 μ I吸頭去除VSMC單層的劃痕。劃后采集相同區(qū)域的圖像來測定劃痕封閉。
【權(quán)利要求】
1.用于使多能干細(xì)胞分化為血管床細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟: a)提供多能培養(yǎng)基中的單層多能干細(xì)胞； b)在補(bǔ)充了小分子的激發(fā)培養(yǎng)基中孵育所述細(xì)胞，該小分子激活β_聯(lián)蛋白和/或Wnt信號發(fā)放和/或Hedgehog (HH)信號發(fā)放,選自糖原合酶激酶3 (Gsk3a_b)的小分子抑制劑、CDC樣激酶I (Clkl-2-4)的小分子抑制劑、促分裂原活化蛋白激酶15(Mapkl5)的小分子抑制劑、雙特異性酪氨酸(Y)磷酸化調(diào)節(jié)激酶(Dyrkla-b4)的小分子抑制劑、細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白依賴激酶16 (Pctkl-3 4)的小分子抑制劑、Smoothened (SMO)激活物,及β-聯(lián)蛋白(或Y-聯(lián)蛋白)與輔激活蛋白CBP(CREB結(jié)合蛋白)和p300(EIA結(jié)合蛋白p300)間相互作用的調(diào)節(jié)物； c)通過在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育所述激發(fā)的細(xì)胞來誘導(dǎo)分化。
2.權(quán)利要求1的方法，用于使多能干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，用于使多能干細(xì)胞分化為血管平滑肌細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)還包括在多能培養(yǎng)基中孵育所述細(xì)胞18小時至30小時。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)還包括在激發(fā)培養(yǎng)基中孵育所述細(xì)胞2至4天。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)還包括在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育所述細(xì)胞18小時至48小時。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)的所述多能培養(yǎng)基是補(bǔ)充了Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的蛋白激酶的抑制劑(ROCK激酶抑制劑)的無血清培養(yǎng)基。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述ROCK激酶抑制劑選自1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪)、N-芐基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺和⑴-(R)-反-4-(1-氨基乙基)-N- (4-吡啶基)環(huán)己烷甲酰胺二鹽酸鹽。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的所述激發(fā)培養(yǎng)基是補(bǔ)充了胰島素、運(yùn)鐵蛋白和孕酮的無血清培養(yǎng)基。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的所述激活β-聯(lián)蛋白和/或Wnt信號發(fā)放和/或Hedgehog (HH)信號發(fā)放的小分子是3_ (3_氨基-苯基)_4_ (1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的所述激發(fā)培養(yǎng)基還包含重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4ΦΜΡ4)。
12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是補(bǔ)充了VEGF-A(血管內(nèi)皮生長因子)或胎盤樣生長因子I(PLGF-1)和小分子腺苷酸環(huán)化酶激活物的無血清培養(yǎng)基。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述小分子腺苷酸激活物選自Forskolin((3R)_ (6a α H)十二氧 _6 β，10 α，IOb α - 二羥基-3 β , 4a β ,7,7, IOa β _ 五甲基 _1_ 氧 _3_ 乙烯基-1H-蔡并[2，l-b]吡喃-5β-基乙酸鹽)、8-溴-cAMP(8-溴腺苷-3'，5'-環(huán)單磷酸鹽)和腎上腺髓質(zhì)素。
14.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是補(bǔ)充了TGFii信號發(fā)放和roGF信號發(fā)放的激活物的血清替代品培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。
15.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述多能干細(xì)胞是誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞是人細(xì)胞。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞獲自患有與血管并發(fā)癥相關(guān)的疾病的個體。
18.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法，其還包括步驟: d)在適合用于增殖內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞的條件下孵育步驟c)的產(chǎn)物。
19.內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞，其通過權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的方法獲得。
20.內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞的生物樣本庫，其通過權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的方法獲得。
21.通過權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的方法獲得的內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞或權(quán)利要求20的生物樣本庫的用途，用作與血管并發(fā)癥相關(guān)的疾病的體外模型。
22.治療組合物，其包含通過權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的方法獲得的內(nèi)皮細(xì)胞或權(quán)利要求20的生物樣本庫。
23.方法和用途，其基本上如`本文中所述。
【文檔編號】C12N5/078GK103620024SQ201280028159
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月9日
【發(fā)明者】K·克里斯滕森, M·格拉夫, R·亞科內(nèi), C·帕奇, E·C·托馬 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司