生物活性分子的融合的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了融合蛋白，其包含與腸表面結(jié)合性結(jié)構(gòu)域連接的酶，優(yōu)選地飼料酶或食品酶。融合蛋白可用來(lái)促進(jìn)動(dòng)物中的飼料利用。在具體的實(shí)施例中，包含與植酸酶連接的腸表面結(jié)合性多肽區(qū)段的根據(jù)本發(fā)明的融合酶，在腸中顯示增加的停留時(shí)間，使得給予酶增加的時(shí)間來(lái)催化相應(yīng)反應(yīng)，最終導(dǎo)致改善的飼料利用。
【專利說(shuō)明】生物活性分子的融合
[0001]本發(fā)明涉及，基于具有如本文下面所討論的有黏附性質(zhì)的微生物的適應(yīng)特性，構(gòu)建用于增加動(dòng)物胃腸道中停留時(shí)間的多肽和酶的創(chuàng)新方法。
[0002]本發(fā)明尤其涉及與參考多肽或酶相比在動(dòng)物飼料中顯示改善性能的新型多肽和酶，例如飼料酶。
【背景技術(shù)】
[0003]農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，例如豬和家禽二者是通常被補(bǔ)充飼料酶以提高飼料利用的動(dòng)物。
[0004]例如，植酸酶是單胃動(dòng)物的常用飼料酶，用來(lái)改善動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并且減少對(duì)飼料進(jìn)行的磷補(bǔ)充，從而降低集中型家畜生產(chǎn)地區(qū)的環(huán)境污染。
[0005]就任何飼料酶而言，產(chǎn)生的產(chǎn)物(本文是磷)量是底物(本文是植酸鹽)濃度、酶活性和給予酶進(jìn)行催化反應(yīng)的時(shí)間量的函數(shù)，仍需要通過(guò)修飾酶制劑或通過(guò)開(kāi)發(fā)新型的酶來(lái)優(yōu)化飼料利用和酶活性。
_6]技術(shù)背景簡(jiǎn)述
[0007]乳酸菌屬(Lactobacillus)的成員以及其他細(xì)菌,特別是芽孢桿菌屬(Bacillus)的成員經(jīng)常出現(xiàn)在鳥類和哺乳動(dòng)物的胃腸道中。對(duì)于能夠定居在該開(kāi)放流動(dòng)環(huán)境中的細(xì)菌，對(duì)黏膜的黏附被認(rèn)為是必要條件。腸的上皮細(xì)胞由保護(hù)性粘液層覆蓋，所述保護(hù)性粘液層是糖蛋白和糖脂的復(fù)雜混合物，大的糖蛋白黏蛋白(mucin)是主要組分。定居在黏膜上的細(xì)菌可在粘液層中找到并且黏附在上皮細(xì)胞上。在大部分情況下，已經(jīng)報(bào)道，黏附由蛋白質(zhì)介導(dǎo)，但是也已經(jīng)描述了在乳酸桿菌(Iactobacilli)細(xì)胞表面上的糖類部分與黏膜組分相互作用。總結(jié)現(xiàn)有知識(shí)已知，微生物菌株黏附至胃腸組分上的能力，基于微生物菌株與胃腸粘液或其主要組分黏蛋白的親和力，以及微生物菌株與由于腸上皮細(xì)胞脫落而陷入粘液中的膠原或當(dāng)上皮細(xì)胞損傷時(shí)可獲取的膠原的親和力。還已知，天然腸生細(xì)菌(包括芽孢桿菌屬的成員)能夠形成生物膜并黏附到上皮細(xì)胞上，其比不能產(chǎn)生生物膜的細(xì)菌在腸道中明顯堅(jiān)持更長(zhǎng)時(shí)間。所以，自產(chǎn)的胞外生物膜基質(zhì)對(duì)于微生物菌株黏附至胃腸組分的能力而言也起必要的作用。
[0008]粘液結(jié)合蛋白已經(jīng)主要在乳酸桿菌中表征。已知來(lái)自Lactobacillisreuteri 1063的基因編碼命名為Mub的細(xì)胞表面蛋白，所述細(xì)胞表面蛋白黏附到粘液組分上。Mub是大的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(357kDa)，其作為黏蛋白結(jié)合性結(jié)構(gòu)域(MucBP，Pfam06458)共價(jià)地附著到細(xì)胞表面上。
[0009]膠原結(jié)合性結(jié)構(gòu)域可分為兩種類型:
[0010]Cna型蛋白，其原型是來(lái)自Staphylococcus aureus的蛋白A (Pfam05738),介導(dǎo)細(xì)菌黏附至膠原上
[0011]CBD結(jié)構(gòu)域，其是梭菌膠原酶的一部分。
[0012]TasA是由芽孢桿菌屬的成員產(chǎn)生的生物膜的主要蛋白質(zhì)組分。已經(jīng)檢測(cè)了與EPS (胞外聚合物質(zhì))和孢子二者相關(guān)的TasA，并且TasA被認(rèn)為對(duì)表面黏附而言是必需的。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明尤其涉及與多肽或酶，優(yōu)選飼料酶或食物酶連接的腸表面結(jié)合性多肽區(qū)段。本發(fā)明還涉及編碼由酶和腸表面結(jié)合性多肽區(qū)段組成的這種融合蛋白的DNA、包含該DNA的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)它們的方法，以及它們?cè)诶鐒?dòng)物飼料和動(dòng)物飼料添加劑中的用途。
[0014]本發(fā)明還涉及促進(jìn)動(dòng)物中的飼料消化率的方法，其包括給動(dòng)物施用根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明還提供了包含這種融合蛋白的飼料組合物或預(yù)混物。
[0015]包含與酶連接的腸表面結(jié)合多肽區(qū)段的融合蛋白，特別是融合酶顯示腸中增加的停留時(shí)間，這導(dǎo)致給予酶增加的時(shí)間量來(lái)進(jìn)行催化相應(yīng)，在飼料酶的情況下最終使得飼料利用改善。
[0016]基于蛋白質(zhì)的同源性,本發(fā)明人已經(jīng)在候選菌株益生菌Bacillus subtilis BSPl的基因組中鑒定了一種膠原結(jié)合性蛋白，所述膠原結(jié)合性蛋白參與前面提到的黏附現(xiàn)象。該蛋白質(zhì)是本文后面描述的腸表面結(jié)合性多肽區(qū)段的第一個(gè)例子。根據(jù)本發(fā)明可使用的另一腸表面結(jié)合性多肽區(qū)段是來(lái)自Staphyloccus aureus的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其已知為Cna(ProtA)。
[0017]本發(fā)明人已經(jīng)從與Citrobacter braakii的植酸酶基因appA融合的益生菌菌株B.subtilis BSPl 基因 bbspllOO 和 bbspllOl 或來(lái)自 S.aureus 的 cna基因的一部分構(gòu)建了含有膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融 合蛋白。
[0018]在融合蛋白的一些實(shí)施方式中，膠原結(jié)合性多肽區(qū)段是細(xì)菌膠原-結(jié)合多肽區(qū)段。在更具體的實(shí)施方式中，膠原結(jié)合性多肽區(qū)段是梭菌屬(Clostridium)膠原結(jié)合性多肽區(qū)段。
[0019]在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，膠原結(jié)合性多肽區(qū)段是膠原酶或細(xì)菌膠原酶或梭菌屬膠原酶的區(qū)段。優(yōu)選地，區(qū)段僅僅是膠原酶的一部分且膠原結(jié)合性多肽區(qū)段沒(méi)有膠原酶活性。
[0020]本發(fā)明還涉及TasA或來(lái)自生物膜胞外基質(zhì)的另一蛋白質(zhì)用作間接腸結(jié)合性肽的用途，所述間接腸結(jié)合性肽來(lái)自Bacillus subtilis并且靶向腸中細(xì)菌生物膜和孢子二者。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TasA蛋白的序列在如下所示的芽孢桿菌屬的成員中高度保守。
[0021]芽孢桿菌屬成員中TasA蛋白序列的保守性。
【權(quán)利要求】
1.一種組合物，其包含與多肽或酶，優(yōu)選飼料酶或食品酶連接的腸表面結(jié)合性多肽區(qū)段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述腸表面結(jié)合性多肽區(qū)段是細(xì)菌膠原結(jié)合性多肽區(qū)段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述腸表面結(jié)合性多肽區(qū)段是粘液結(jié)合性蛋白的區(qū)段。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酶是植酸酶。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述腸表面結(jié)合性多肽區(qū)段和酶是融合蛋白的部分。
6.一種經(jīng)分離的核酸序列，其包含編碼權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的組合物的核酸序列。
7.—種核酸構(gòu)建體,其包含與一種或多種控制序列可操作地連接的如權(quán)利要求6所述的核酸序列，所述控制序列指導(dǎo)在合適的表達(dá)宿主中生產(chǎn)所述融合蛋白。
8.—種重組體表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求7所述的核酸構(gòu)建體。
9.一種重組體宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求7所述的核酸構(gòu)建體和/或權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體。
10.生產(chǎn)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的組合物或融合蛋白的方法，其包括:(a)培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，以生產(chǎn)包含所述融合蛋白的上清液，和(b)回收所述融合蛋白。
11.一種動(dòng)物飼料組合物，其包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的至少一種組合物或融合蛋白，和 (a)至少一種脂溶性維生素； (b)至少一種水溶性維生素；和/或 (C)至少一種痕量礦物質(zhì)。
12.改善動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法，其中將權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的至少一種組合物或融合蛋白添加至所述飼料。
13.促進(jìn)動(dòng)物中飼料利用的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的組合物。
14.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的組合物用于促進(jìn)動(dòng)物中飼料利用的用途。
【文檔編號(hào)】C12N9/16GK103945704SQ201280028390
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月9日
【發(fā)明者】格赫斯蘭·舍恩斯, 史蒂芬娜·杜沃, 奧雷利·布海林 申請(qǐng)人:諾維信專利公司